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$: 4 Bier 071121 IHK Technologie - DiagnostikNet \| BB · Analyse mit Bio-Chip (Microarrays) 1. Problemanalyse: -Auswahl der zu immobilisierenden Binder, z.B. Sequenzen der Oligomere,$
Technologieforum 2007, IHK Potsdam 21.11.2007

Technologieentwicklung:Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie

Frank F. Bier

Fraunhofer Institut für Biomedizinische Technik

Institutsteil Potsdam

Am Mühlenberg 13, 14476 Potsdam-Golm

www.ibmt.fraunhofer.de

und

Universität Potsdam, Institut für Biochemie und Biologie

Lehrstuhl für Angewandte Bioelektronik und Biochiptechnologie

In vitro Diagnostik - Wertschöpfung durch Zusammenarbeit in Berlin-Brandenburg

Technologieforum

IHK Potsdam

21.11.2007



1. Was sind und wozu braucht man BioChips?

2. Wie werden sie gemacht?

3. Wo kann man sie einsetzen?

4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven


1. Was sind Bio-Chips?

Werkzeuge zur

Simultanen Bestimmung vieler biochemischer und biologischer Parameter aus einer Probe

Gene Transkripte, Proteine, Metabolite...

Analyte, die biochemisch erkannt werden

„Biochip“ = „Microarray“?


ProteinProtein--ELISA CellELISA Cell--ELISAELISA DNADNA--HybridisationHybridisation PeptidePeptide--AssayAssay

surface for capture molecule coupling

capture

antibody

labeledprobing antibody

Analyte

capture probe

labeled DNA-probe

Microorganism

DNA/RNA

Molekulare Erkennung ist die Basis der in vitro Diagnostik

peptide

Serum antibody


1. ...und wozu braucht man Bio-Chips?

Hintergrund: in vitro molekulare Diagnostik

• Molekulare Marker• Genetische Disposition

Individualisierte Therapie→ in vivo Diagnostik → therapeutische Empfehlung→ Medikamentation

FunktionelleGenomforschung,Molekulare Medizin


1. ... und wozu braucht man Bio-Chips?

Mit Bio-Chips werden Aussagen möglich über

• Prädispositionen - prädiktive Diagnostik

• Medikamentenverträglichkeit - Pharmakogenomik

• Wirkung von Zytostatika z.B. an Gewebeproben - Krebsdiagnostik und Therapieunterstützung

• Antibiotikaresistenzen

• ...

• Alle Multiplexanalysen, die auf Bindungsereignissen beruhenMedizin, vet. Medizin, Lebensmittel, Umweltproben etc.

Bisher nur wenige BioChips auf dem Markt - Produktreife in 5 Jahren?


1. Was sind Bio-Chips? - DNA-Chips

Molekulare Grundlage: Hybridisierung

Sonde oder Probe auf der Oberfläche?

Mikroarray (Chip): Thermodynamisch ungünstige Situation

ACTGGCTAAGGCTACCCGTG

ACTGGCTAAGGCTACCCGTG

ACCGATTCCGATGGGC-

ACCGATTCAGATGGGC-


Oberfläche (Glas, Si-wafer, Polycarbonat etc.)

immobilisierte Sonde“capture probe”

markierte DNA-Sonde

DNAoderRNA(Analyt)


Parallele Detektion zahlreicher Hybridisierungsvorgänge> Multiparameteranalytik

oder markierter DNA-Strang



Mikroarrays aus Mikrospots auf Glas oder Si-Wafernmit >100 bis >100.000 Features

© IBMT Potsdam www.affimetrix.com


1. Was sind Bio-Chips?

Die Basis: Genomforschung

Genetische Variationen

SNPs

Mikrosatelliten

Deletionen

- Gesamtgenom

- Gemomemikrobieller Erreger

- Auch: „entgleiste Genome“ z.B. in Tumorgewebe

Genom Transkriptom Proteom Metabolom „Phenomenom“

TranskriptionelleVariationen

Umwelteinflüsse (Rauchen, Alkohol, Ernährung, Drogen, Medikamente)

Organ- und Gewebespezifische Variationen

Stärke der Expressionssignale

Expressions-variationen

PosttranslationaleDifferenzen

z.B. Immunantwort

Effektive Mengen und Konzentrationen Krankheits-relevanter Metabolite,

Stoffwechsel-störungen

Der ganze Patient

Vollständige Beschreibung der individuellen Krankheitsausprägung


Analyse mit Bio-Chip (Microarrays)

1. Problemanalyse:

-Auswahl der zu immobilisierenden Binder, z.B. Sequenzen der Oligomere, -Anpassung der Binder an gemeinsame Bindungsbedingungen auf dem Chip

2 .Probenvorbereitung:

-Probennahme,-Aufschluß-Reinigung -Amplifikation

5. Bindung der (markierten) Probe an die

Binder auf dem Chip:z.B. beim DNA-Mikroarray: Hybridisierung

6. Detektion

i.A. Chip-Reader erforderlich

7. Analyse

Bioinformatik, Datenbanken

3. Herstellung des Mikroarrays

-Aktivierung des Chips-Spotten-ggf. Blocken

4. Markierung

z.B. Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen oder Isotopen


Prozessschritte der Analytik mit Biochips

im Labor

• Probenvorbereitung

• RT-PCR

• Labelling, Markieren

• Chip-Herstellung

• Hybridisieren auf dem Chip

• Waschen, Trocknen

• Auswertung

• Datenanalyse, Interpretation

• Problemanalyse

• Binder-, Sondendesign

• Sondensynthese, Präparation

• Slidepräparation

• Spotten, Drucken, Koppeln

• Blocken

• Waschen, Trocknen

• Qualitätskontrolle


Transkriptionsanalyse

Heute: 95% aller Mikroarray-Anwendungen(F&E)


2. Wie werden Bio-Chips gemacht?

DNA-Chip Technologie (Microarrays)

Herstellungstechniken

Photoaddition Deprotektion Umlagerungen

Photochemisch Strukturierung

mittels Masken

Maskenlose

Strukturierung

Magnetventil-

pipette

Piezo-Pipette "Bubble Jet" Silica-Kapillare

kontaktlos

Nadeln und

Stifte

Stempel "Pin-Rings"

kontakten

"Plot"-Techniken Elektrochemisch "Micropainting" Laser-

Strukturierung

Strukturierung

über

AFM und SNOM

"Array-Techniken"

vorgefertigte Sonden, (Oligonukleotide oder aus natürlichen Quellen)

oder

Synthese auf dem Chip (nur Oligonukleotide und Peptide)


Typen von Mikroarrays

Single nucleotide polymorphism SNP

gene: Sulfotransferase SULT1, loc 1A1

DIfE - H.R. GlattSpecies identification B. c., B. a.

RKI - U. Nübel

Featuregröße

typ. 250 µm

~ 10 µm

10 nm ?

Proben-

volumen(100 Features)

20 µl

1 nl

1 al

Feature-

zahl

20-

20000

104 -106

?


www.affymetrix.com/wt/home


Herstellungstechniken

Synthese auf dem Chip: Photolithographie (Affymetrix)


OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm Affymetrix Pin-Rings

www.mwg-iotech.com/html/instruments/ arrayer/affymetrix_417_arrayer.shtml -27k

OmingridTM Microrrayerhttp://microarray.uc.edu/Resources/microarrayer.htm




Herstellungstechniken: Kontaktverfahren

(„Stempel“- oder Nadeltechniken, div. Hersteller)



Herstellungstechniken:


Mikroarray Produktionstechnologie

Kontaktfreies Spotten: Universelle Piezo-Dispensierung

< 1nL



TopSpot Technologie für R&D und Produktion

non-contact printing (multiple nozzle ink-jet principle )



TopSpot Technologie für R&D und Produktion


QualitätskontrolleAusschnitt aus einer Print-Serie der TopSpot M Maschine.Wässrige Lösungen auf einer hydrophoben Polymeroberfläche,

keine Vorprozesse nach der Reinigung.Direktes Kamerabild der integrierten Kamera, registriert jeden

Druckvorgang, und jeden Druck. Das Qualitätskontrollsystem ist mit zentralem LIMS verbunden.

BioChip Produktionstechnologie - Mikroarrays

TopSpot Technologie für F&E und Produktion von niedrig- bis mitteldichten Mikroarrays


Spotting Technologie Qualitätskontrolle

Spot quality Intra-Slide-Variation Inter-Slide Variation


Beispiel: Expressionsanalyse

Vergleichbar gut wie Affimetrix

95% corelation of identical genes foundto be expressed in

both methods

example: mRNA pattern of colon cancerpatient samples


� Vorteile von Peptiden als Fängermoleküle:

� Peptid-Chemie ist gut etabliert und vollständig automatisiert

� Leichte Reinigung und Qualitätskontrolle

� Chemisch und physikalisch robust

� Viele Proteine können durch Präsentation der linearen Epitope

ersetzt werden > Erhöhung der diagnostischen Potenz

ELISAPeptide microarray

Beispiel: Peptid-Chip

Peptide für serologische Untersuchungen


� Fluoreszenz basierter Sandwich-Assay

Direkte Inkubation mit Patientenserum

Cy5-goat anti-human IgG/A/M antiserum

Fluoreszenzmessung

(Scanning)


Peptide für serologische Untersuchungen


z.B. Epitopemapping mit Peptid-ArrayAnti-TSH-Receptor Screening

TSH-Rezeptor in 256 Peptiden als Array von

15meren repräsentiert alle Amionsäuren

Mit: Charité Berlin (Dr. C. Grötzinger)Heiko Andresen, Kim Zarse et al. Proteomics 2005


Peptide Immobilisierung - mittels Protein

Preinkubation der Peptide mit Streptavidin

• Ausgleich der phys.-chem. Differenzen

• alle Peptide in gleichem Puffer

• gleichmäßige Tropfenbildung

• gleichmäßige Spots


Mit Charité Berlin (Dr. C. Grötzinger)

Heiko Andresen, Kim Zarse et al. 2005

Puffer

Serum


Peptide für serologische Untersuchungen: Nachweis von viralen Infektionen


� Epitope-genaue Charakterisierung von Antikörpern gegen proteinische Antigene:

Multiparameter Analyse von mAbs gegen den humanen TSH-Rezeptor


Peptide für das Epitope-Mapping


Technologieentwicklung: Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie



3. Wo kann man sie einsetzen? 4. Entwicklungspotenziale - Perspektiven


Nervous SystemNormal retina/brain (0%)Retinoblastoma (50%)Glioblastoma multiforme (75%)Oligodendroglioma (100%)Anaplastic astrocytoma (10%)Meningioma

Ordinary (17%)Atypical (92%)Malignant (100%)

Adrenal. Neonate (0%)Ganglioneuroma (0%)Neuroblastoma (94%)Normal tissue adjacent to tumor (0%)

Head and NeckNormal oral mucosa (3%)Squamous cell carcimoma (86%)Normal adjacent tissue (4%)

HepaticNormal tissue (0%)Liver disease, nonmalignant (29%)Hepatocellular carcinoma (86%)Normal tissue adjacent to tumor (2%)

Reproductive Tract - FemaleFetal ovary (100%)Adult ovary (33%)Normal endometrium (0%)Leiomyoma (0%)Leiomyosarcoma (100%)Endometrial adenocarcinoma (100%)Cervical carcinoma (100%)Vaginal carcinoma (100%)Ovarian carcinoma (91%)

Reproductive Tract - MaleTestis (100%)Mature spermatozoa (0%)Normal prostate (0%)BPH without carcinoma (5%)BPH with carcinoma (11%)High grade PIN (60%)Prostate carcinoma (90%)

SkinNormal epidermis (44%)Squamous cell carcimoma (83%)

Basal cell carcinoma (95%)

Melanoma (86%)

Urinary TractNomal bladder endothelium (0%)Dysplastic bladder endothelium (43%)Bladder carcinoma (92

washings (73%)voided urine (29%)

Renal carcinoma (83%)Normal tissue adjacent to tumor (0%)Wilm‘s tumor (100%)Normal tissue adjacent to tumor(33%)

GastrointestinalGastric adenoma (27%)Gastric carcinoma (85%)Normal tissue adjacent to tumor (5%)Colorecta adenoma (45%)Colorecta carcinoma (89%)Normal tissue adjacent to tumor(25%)Pancreatic carcinoma (33%)

BreastNormal breast tissue (0%)Fibrocystic disease (0%)Fibroadenoma (28%)Carcinoma in situ (75%)Carcinoma, ductal and lobular (88%)Normal tissue adjacent to tumor (5%)FNA benign lesions (9%)FNA malignant lesions (81%)

LungSmall cell lung carcinoma (100%)Non-small cell carcinoma (78%)Normal tissue adjacent to tumor (4%)

nach: M.P. Granger, W.E. Wright, J.W. Shay (2002) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 41: 29-40

Biochips sind Hilfsmittel für die individualisierte Therapie

Molekulare Diagnostik


Motivation: Indikator für Bedeutung - Marktentwicklung

Infektionskrankheiten, Krebsdiagnostik, Pharmakogenomik, Genetischer Screen


Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnostik)

Infektionsdiagnostik: Bedarf: 1. Beschleunigung der Diagnostik

2. Bestimmung der Antibiotikaresistenzen

Keimidentifizierung: Bakterielles oder virales Genom

Species identification B. cerveus., B. anthracis

RKI - U. Nübel

Vorteil gegenüber mikrobieller Bestimmung• Zeitgewinn• differentielle Aussage möglich• ggf. Antibiotikaresistenzen frühzeitig bestimmbar > effizientere Therapie


Applikationsfelder für Mikroarrays (Labordiagnsotik)

Krebsdiagnostik: • Genomischer Screen des entarteten Gewebes• Transkriptionsmuster des entarteten Gewebes im Vergleich zum

Normalgewebe

Hoher Forschungsbedarf für die Charakterisierung der Transkriptionsmuster (Signaturen)Problem: Probennahme und Charakterisierung (>Biobanking)

Ziel: Vorhersage der Zytostatikaeffizienz > Therapieansprechen

Beispiel:

Onkogenchip für Coloncarcinom



Pharmakogenomik: • Genomischer Screen des Patienten

Ziel: Vorhersage der Arzneimittelverträglichkeit bzw. optimaler Dosierung aufgrund des individuellen Metabolisierungsmusters, das aus dem Genom besimmt wird.

Stand: Ein P450-Chip ist auf dem Markt

P450 Affimetrix-Roche diagnsotics



Humangenetik: Patienten/ Probandengenom

Multifaktorielle ErbkrankheitenPrädispositionen

Epidemiologische Studien erforderlich- aber:Was ist der Standard? - was ist Krankheit?


Technologieentwicklung: Multiparameteranalyse und Biochip-Technologie






„Die Wertschöpfungskette“ der molekularen Diagnostik

1. Risikogruppen Identifizierung

Identifizierung

molekularer Marker

in vivo DiagnostikaIndikation

DatenpoolGenom/Proteom

IVD, Biochips:1. DNA-Analyse,2. mRNA-Analyse3. Marker-Proteine

4. Prädiktive Diagnostik

3. Fühstadien Erkennung

2. Präsymptomatische Diagnose

5. Therapiekontrolle

Validierungmolekularer Marker

Klinische Studien

Probennahme (SOP)

Biobanking

Gesundheitsversorgung

Regularien

Markt


Die „Wertschöpfungsspirale“ der Molekularen Diagnostik

Analyse der Genomischen

Datenressourcen (Bioinformatik)

Identifizierung von

Risikogruppen(ggf. klin. Studie)

IdentifizierungMolekularer Marker

in vivo Diagnostik

Indikation

Genomik/ProteomikIVD, Biochips:

1. DNA-Analyse,

2. mRNA-Analyse

3. Marker-Proteine

TherapievorschlagMedikamentauswahl 3. Prädiktive Diagnostik

+ klinische Studien

2. Früherkennung

+ klinische Studien

1. Präsymptomatische

Diagnose + klin. Studie

4. Therapiekontrolle

Feed-Back: ValidierungMolekularer Marker


Integrierte Mikroarrays für die Point-of-Care Diagnose?

Stand der Entwicklungen und Forschung

Affymetrix;

Biacore;

Agilent; >> F&E-Markt, non diagnostics

i-stat, >> few parameters, not flexibel

QuickLab (SIEMENS)

• viele F&E-Projekte mit öffentlicher Förderung für Lab-on-Chip

• viele F&E-Projekte mit Ziel der Point of Care Diagnostik

>> bisher „proof of principles“- oder „proof of concepts“> Schwerpunkt auf Technologie ohne Produktionstechnik> ohne konkrete Anwendung

Bewertung:

Noch erheblicher Entwicklungsbedarf bis zur Routineanwendung


Ergebnis hoch-differentielle Diagnostik

> Therapie und Medikamentierung werden besser auf Patient und

Krankheit abgestimmt,

> höherer Therapieerfolg,

- Diagnose ohne Therapievorschlag?

Feststellung von Prädispositionen

> gesunde Lebensführung möglich

- wird der Patient erst durch die Diagnose zum „Leidenden“?

- wie geht der Patient mit Wahrscheinlichkeitsaussagen um?

Point of Care-Diagnostik

> schnellere Diagnose - früherer Therapiestart

- auch für den Patientenselbsttest?

Ohne ärztliche Beratung in den meisten Fällen unsinnig!

Missbrauch genomischer Daten - möglich?

- wie kann die ärztliche Schweigepflicht gesichert werden?

- wer bekommt Zugang?

Konsequenzen

4 bier 071121 ihk technologie - diagnostiknet \| bb · analyse mit bio-chip (microarrays) 1....

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