4a.- metabolomica (agilent).pdf

Metabolómica y comparación de muestras

07/07/2009

Bloque III: Análisis de moléculas.

Metabolómica y análisis comparativo

de muestras

Organizado por:

- Prof. Javier Abadía y Dra. Ana Mª AlvarezDept. Plant Nutrition, Estación Experimental Aula Dei (CSIC)

Zaragoza, 8 de julio de 2009

Isidro Masana Agilent Technologies

Especialista Productos LC/MS División Biociencia y Análisis Químico

Página 2 Metabolómica y comparación de muestras

07/07/2009

Mass Spec/tacular

La Espectrometría de Masas, unaHerramienta Esencial en Metabolómica y Análisis Comparativo de Muestras

Isidro Masana Agilent Technologies

Especialista Productos LC/MS División Biociencia y Análisis Químico

ICP-MSGC-MS

LC-MS


07/07/2009

PROGRAMA:

La Espectrometría de

Masas, una Herramienta

Esencial en

Metabolómica y

Análisis Comparativo

de Muestras

1.- Breve Introducción a la Metabolómica.

2.- Requisitos Analíticos e Instrumentación Requerida

3.- Fases de un Estudio Metabolómico por MS.

4.- Introducción al Software Requerido en un Estudio Metabolómico por MS

5.- Ejemplos de Resultados.


07/07/2009

1.- Introducción a la Metabolómica

La Espectrometría de Masas, una Herramienta Esencial en

Metabolómica y Análisis Comparativo de Muestras


07/07/2009

¿Qué es la Metabolómica?

¿Cuales son las diferencias en su composición química que se

correlacionan con lasdiferencias observadas?

Metabolómica es el estudio sistemático de las pequeñas moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico

Utiliza el análisis estadístico multivariante para correlacionar: - variaciones en la concentración de metabolitos. - con distintas propiedades de 2 o más grupos de muestras comparadas (organismo, órgano, tejido, célula, fluido,…).


07/07/2009

1.- Genoma- aCGH Arrays

ChIP on Chip Arrays

- GS GenotypingCGH AnalyticsChIP Analytics

Las 4 “Piedras Angulares” de una Célula VivaSoluciones Agilent en Hardware y Software

2.-Transcriptoma- Gene ExpressionArrays: Splicing-Arrays- GeneSpring GXResolver

3.- ProteomaTécnica análisis:

LC/MS Spectrum Mill yGeneSpring MS

DNA

RNA

CH2OH

Metabolitos

Metabolómica comparte:Instrumentación LC/MS con Proteómica

Bioinformática GeneSpring con Prot. & Genómica

Proteínas

4.- MetabolomaTécnica análisis:

LC/MS & GC/MS GeneSpring MS


07/07/2009

Aportaciones de la Metabolómica en Investigación Agroalimentaria

- Mejorar el Rendimiento de las Cosechas:

• Mejorar su producción.

• Mejorar su tolerancia a productos fitosanitarios

• Mejorar su resistencia a sequías, a pesticidas, …

• Mejorar su valor nutricional.

- Optimizar el tratamiento de Alimentos

• Mejorar su valor nutricional.

• minimizar la formación de tóxicos

• optimizar el uso de ingredientes, nutrientes y aditivos

- Mejorar las propiedades funcionales de alimentos

- Evaluar el impacto de la nutrición en los procesos biológicos y patológicos.- ……


07/07/2009

Objetivos en Investigación Biomédica

- Identificación de nuevos BIOMARCADORESpara diagnóstico precoz de enfermedades

- Evolucionar Medicina diagnóstico-curativa (basada en el tratamiento de la enfermedad)

Medicina que promueva la salud (evite la enfermedad)

- Requiere el desarrollo de una Medicina:

Predictiva, Preventiva, Personalizada, Participativa

- Requiere un detallado conocimiento de los procesos biológicos/ bioquímicos que tienen lugar en el organismo y como éstos están influenciados por:

- el desarrollo de una enfermedad

- la ingesta de un fármaco

- la alimentación/ dieta seguidas

- Se deberá estudiar el impacto de estos factores en el perfil del genoma, proteoma y metaboloma del organismo.

• ……


07/07/2009

Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis Comparativos de Muestras

Aplicando las mismas estrategias y herramientas analíticas

• Descubrimiento y Validación de Proteínas como Biomarcadores.

• Identificar los compuestos responsables de episodios de contaminación medio ambiental o alimentaria.

• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos anómalos de un lote de productos, con su origen, con tratamientos a que han sido sometidos,……

• Estudiar las similitudes y diferencias de composición entre sus productos y otros semejantes en el mercado.

• Estudiar el impacto del tratamiento de un alimento en su composición.

• Optimizar condiciones de procesos de Extracción / Síntesis (temperatura, pH, presión,….) para maximizar su eficiencia

• A partir de muestras de referencia, poder clasificar/AUTENTIFICAR muestras desconocidas, materias primas, según su origen, tipo, tratamientos a que han sido sometidas,….

• ….


07/07/2009

2.- Requisitos Analíticos e

Instrumentación Requerida en

Metabolómica




07/07/2009Month ##, 200XPage 11

Gran diversidad de propiedades químicas y concentraciones:

Muy diferentes estructuras químicasMuy distintas concentraciones y reactividades. Distintas volatilidad (mayoría de analitos NO volátiles)

Amplio rango de Pesos moleculares entre 50 y 1600 Da

Elevado número de metabolitos a estudiar:

Mamíferos ~ 2.500 a 15.000Plantas ~ 50.000 a 200.000

Los metabolitos pueden ser:

conocidos (admiten “target analysis”)

desconocidos (NO admiten “target analysis” – requieren métodos de análisis genéricos)

Complejo fondo químico de las matrices biológicas.

Características de los MetabolitosEl Reto para el investigador


07/07/2009

Requisitos Analíticos de la Metabolómica

Pes

o M

ole

cula

r

Polaridad del analito/Solubilidad en Agua

LC/MSAPI-Electrospray

LC/MS-APCI1.000

100,000

10,000

no polar muy polar

LC/MS-APPI

GC/MS

• Requiere técnicas con un muy amplio rango de aplicabilidad.

• Muy elevada selectividad, especificidad y sensibilidad

• Poder cuantificar relativamente MILES de compuestos des/conocidos

• El acoplamiento Cromatografía / Espectrometría de Masas (LC/MS y GC/MS) es la técnica que ofrece mejores prestaciones para estudios metabolómicos (componentes minoritarios y mayoritarios).

Las mismas herramientas (hardw. & soft) y estrategias aplican a análisis comparativos de muestras en todo

tipo de industria


07/07/2009

Instrumentación Típica LC/MS, CE/MS & GC/MS utilizada en Metabolómica:

Ion Traps LC/MS

TOF LC/MS(LC-) ICP/MS

Q-TOF LC/MS

QqQ LC/MS

Quads LC/MS

LC/MS

GC/MS-QqQ

HPLC-Chip

Metabolitos volátiles Todo tipo de metabolitos

Metalo-metabolitos

CE/MS

GC/MS

GC/MS-Q


07/07/2009

¿Qué es un Espectrómetro de Masas?: Componentes y Funciones de un Sistema LC/MS, GC/MS o CE/MS

HPLC

(LC)

GC

CE

Fuente de

Iones

Sistema de Filtrado de

Iones según su Masa

Detector de Iones

Espectrómetro de MASAS (MS)

PCpara Control del instrumento y

Procesado de la Información

• HPLC, GC o CE: separará los diferentes componentes de la muestra para que estos lleguen al detector a distinto tiempo.

• MS: ionizará* los compuestos procedentes del HPLC, GC o CE y determinará su masa (m/z: masa/carga).

*Para poder ser detectadas las moléculas necesitan ser ionizadas.

Cromatogramas & Espectros

Presión Atmosférica

Alto vacío

Espectrómetro: Detección

D

Cromatógrafo:Separación

TOF


07/07/2009

TIC (Total Ion Chromatogram)

IC (Ion Chromatogram)

m/z 300.0-300.2

IC: CROMATOGRAMA SELECTIVO

Utilizados para cuantificación relativa en metabolómica

1

4

Información cuantitativa:- Área pico

(TIC: no selectiva - IC: selectiva)

Información cualitativa (ID):

-Tiempo Retención - Espectro de Masas

Información Proporcionada por LC-GC-CE /MS.Ejemplo Drogas de Abuso mediante LCMS-TOF

Nota aplicación 5989-0667EN

Isómeros => igual m/z exacta

Se requerirá su separación

cromatográfica


07/07/2009

Espectros LC/MS, CE/MS (Ionización a Presión Atmosférica – API )

“versus” GC/MS (Ionización por Impacto Electrónico - EI)

Clenbuterol PM = 276 Da

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance#103730: Clenbuterol

276

86

5712741

19071 24399 166154140 259

Espectro GC/MS(EI) NH

NH2

Cl

Cl

OH

CH3

CH3CH3

1.0e51.5e52.0e52.5e53.0e53.5e54.0e54.5e55.0e55.4e5

Intensidad +TOF MS: 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

277.087

279.084[M+H]+=277.0874

m/z (masa/carga)

Contribución del Cl(37) de aprox. 2/3 2 átomos Cl

Espectro LC/MS(API-ESI)

Clenbuterol


07/07/2009

¿Cómo Obtener Información Estructural en LC/MS de Compuestos No Aislados?: LC/MS/MS

Filtro Masanº 1

Filtro Masa nº 2

Celda Colisión

MS/MS del ión aislado (m1) en Q1

m1

m2

m1

+

+

+

+Sistemas LC/MS/MS (QqQ / Q-TOF / TRAP):se fragmenta en celda de colisión o en la trampa de iones. Muy útil cuando existe coelución de compuestos (p.e. en matrices complejas)

+TOF MS: Experiment 2, 5.688 to 5.849 min from lowhigh03.wiff Agilent

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 2900.01.0e42.0e43.0e44.0e45.0e46.0e47.0e48.0e49.0e41.0e51.1e51.2e51.3e51.4e51.5e51.6e51.7e51.8e51.9e5 132.0624 168.0385 203.0076

205.0046

170.0359149.0898133.0675140.0202

[M+H]+=277 (Clenbuterol totalmente

fragmentado)

NHNH2

Cl

Cl

OH

CH3

CH3CH3

2Cl1Cl0Cl

Clenbuterol

QTOF


07/07/2009

3.- Fases de un Estudio Metabolómico para Descubrimiento de

Nuevos Biomarcadorespor MS e Instrumentación

Requerida




07/07/2009

Fases Analíticas en un Estudio Metabolómico por MS

1ª Fase: Comparación de Perfiles de Metabolitos

– Objetivo: localizar metabolitos diferenciales o correlacionados con

propiedades de determinadas poblaciones de muestras biológicas.

– Requiere automatizar la comparación estadística de la

concentración de miles compuestos des/conocidos en un nº

relativamente reducido de replicados de diversas poblaciones.

- La comparación cuantitativa es relativa (sin patrones)

- Se trabaja con métodos genéricos (MS en modo “scan”)

2ª Fase (opcional): Identificación de los metabolitos de

interés (¿Qué metabolito es? sólo necesario saber si hay que

interpretar las rutas metabólicas).


07/07/2009

Fases Analíticas en un Estudio Metabolómico por MS

3ª Fase: Validación de de los metabolitos de interés

- Para evaluar la variabilidad biológica natural, se trabaja con un nº elevado de replicados de las diversas poblaciones sujetas a estudio.

- Se trabaja con métodos específicos y muy selectivos (MS/MS).

4ª Fase: Interpretación Resultados.

- Requiere la identificación de los metabolitos de interés

Metabolómica: Trabajo muy multidisciplinar; requiere de la colaboración de médicos, biólogos, químicos,

estadísticos, informáticos,…..


07/07/2009

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e55.4e5

Intensidad +TOF MS: 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

277.087

279.084

M+1

Tipos de GC/MS según la Fase del Estudio Metabolómico

NHNH2

Cl

Cl

OH

CH3

CH3CH3

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance

#103730: Clenbuterol86

57

12741

19071 243

99 166154 276140 259

M

Clenbuterol C12H18Cl2N2O[M+H]+= 277.0874

m/z (masa/carga)

Contribución del Cl(37) de aprox. 2/3 2 átomos Cl

Espectro LC/MSClenbuterol

Espectro GC/MSClenbuterol

• 3ª Fase: Validación de los metabolitos de interés

- QQQ (modalidad MRM) o Q (modalidad SIM)

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time, min

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

5.0e6

6.0e6

7.0e6

8.0e6

Intensity, cps

• 1º y 2ª Fase: Comparación Perfiles e Identificación de Metabolitos:- GC/MS-Q en modo barrido “Scan” (y software de deconvolución).

“Identificación” de compuestos a comparar automáticamente entre muestras:

- GC/MS utiliza su identificación en bibliotecas universales de espectros. - LC/MS requiere la especificidad y selectividad de la “masa exacta”.(Los espectros LC/MS/MS dependen de las condiciones y equipo NO existen bibliotecas universales).


07/07/2009

Tiempo de retención Masa (m/z)

Abundancia

Tipos de LC/MS según la Fase del Estudio Metabolómico

1ª Fase: Comparación Perfiles

- TOF (o QTOF en modo MS) que proporcionen “masa exacta” e “independiente” de la concentración del metabolito con buena sensibilidad.

2ª Fase (opcional): Identificación de los metabolitos de interés

- TOF o QTOF en modo MS buscando en bases de datos de masa exacta de metabolitos (p.e. MetLIN).

- QTOF confirmar identificación mediante MS/MS con masa exacta. RMN puede ayudar a identificar metabolitos mayoritarios.

3ª Fase: Validación de los metabolitos de interés

- Ideal QqQ en modo MRM (MS/MS).

- QTOF en modo MS/MS

- TOF y QTOF modo MS extrayendo cromatogramas de iones con ventanas de rango de masa muy pequeñas (20-30mDa) gran selectividad.


07/07/2009

Fase Comparación Perfiles. Requisitos en LC/MS: “Masa Exacta”

LC/MS en Metabolómica (perfilado)

• Requiere “Masa Exacta” para:

– Especificidad en la comparación.

– Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extracción de información específica de cada metabolito/compuesto con métodos de adquisición genéricos (modo barrido).

• “Masa Exacta” independiente de la concentración del analito.

• Buena Sensibilidad en modo barrido (métodos genéricos MS-SCAN).

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

TOF /Q-TOF22 ppm75 ppm1310ppm

QUAD/TRAP209165 ppm

TecnologíaNº posibles

fórmulas empíricas

Exactitud Masa (ppm)

x107

1234567

Counts vs. Acquisition Time (min)10 20 30 40 50

x107

1234567


07/07/2009

Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 DaClenbuterol S/N = 14

Rango extracción típico Cuadrupolo

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm S/N = 102

LC/MS-TOF Agilent 6210


07/07/2009Page 25

Fipronil peak from 7.37 – 7.46 minutes. Instrument was run in 4 GHz mode foroptimum resolution, mass accuracy and sensitivity

Robustez Masa Exacta Agilent QTOF & TOF: m/z independiente de la concentración

0.4ppm

1.8ppm

Disponer de “masa exacta robusta” es

clave para laespecificidad y

selectividad en la comparación de resultados por

LC/MS


07/07/2009Page 26

Mass spectrum @ RT = 7.379 min Signal height: 320.000 countsMass deviation: 0.4 ppm

Annotations show m/z and resolution

Exactitud de Masa y Resolución QTOF & TOF: m/z independiente de la concentración


07/07/2009Page 27

Mass spectrum @ RT = 7.461 min Signal height: 500 countsMass deviation: 1.8 ppm

Annotations show m/z and resolution

Exactitud de Masa y Resolución QTOF & TOF: m/z independiente de la concentración

La INDEPENDENCIA de la masa exacta con respecto a la concentración facilita la comparación entre compuestos con gran diferencia de concentración entre las distintas poblaciones.


07/07/2009

4.- Introducción al Software Requerido

en un Estudio Metabolómico por MS



x107

123456

7


x107

12

345

67


07/07/2009

LC/MS Análisis

PreparaciónMuestra

GC/MS Análisis

Análisis Estadístico Comparat.

“Peak Finding”

Normalizaciónde Datos

Identificar Metabolitos

Softwares Estudios Metabolómicos por MS

Validación Metabolitos

Potenciales Metabolitos

Diferenciales

Interpretación Resultados

Extraer automáticamente la información para cuantificar

relativamente MILES de compuestos desconocidos

Soft. Deconvolución

Soft. InstrumentosSoft. Comparación

Estadística Multivariante

Objetivo: descubrir y cuantificar todos

los metabolitos ionizados

Soft. Identificación Metabolitos y ayuda

interpretación resultados


07/07/2009

Deconvolución 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass HunterMolecular Feature Extractor”(LC/MS)

TIC (suma de los 3)

Componente 1Componente 2

Componente 3

“Deconvolución”

Picos deconvolucionados y espectros

Componente 1

Componente 2

Componente 3

TIC & Espectro

En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo

[M+H]+

[M+Na]+

[M+H]+

[M+Na]+ [2M+H]+

[M+H]+

E.C.C.: Suma de intensidades de sus

iones específicos

Ejemplo con espectros de LC/MS API-LC/MS apenas produce fragmentación


07/07/2009

1ª Fase: Extracción Información Metabolitos por Deconvolución del 3D (tr, m/z, Intensidad)

1. Determinar las masas (m/z) de todos los compuestos ionizados.

2. Determinar las áreas de los cromatogramas específicos de cada compuesto (ECC’s: “Extracted Compound Chromatograms” – suma de las respuestas de los iones característicos de cada compuesto).

3. Comparar las áreas normalizadas específicas de cada compuesto entre todas las muestras.

La identificación para comparar el mismo metabolito se realiza por igualdad de

- Tiempo de Retención normalizados

- LC/MS: masa exacta del compuesto GC/MS: identificación biblioteca

TICECC’s0

x107

1

2

34

56

7


x107

12

34

5

6

7

Countsvs. AcquisitionTime (min)10 20 30 40 50

ECC: Datos Deconvolucionados con Agilent M.F.E.


07/07/2009

Ejemplo Listado de Compuestos Detectados por el Algoritmo “Mass Hunter Molecular Feature Extractor”

+ 20 “compuestos” en

1 minuto

Listado Compuestos

Ionizados

Metabolómica: Información comparada entre muestras: tiempo, abundancia y masa

Las estadísticas se efectuarán comparando intensidades de señal específicas de compuestos con “igual”

-Tiempo de retención

- Masa exacta (LC/MS) o identificación espectro EI en GC/MS


07/07/2009

5.- Ejemplos de Resultados




07/07/2009

Ejemplo 1: Estudio Metabolomico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales

• TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje

• TP309-Xa21 arroz transgénico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada genéticamente: PXO99 (RaxST-).

• PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasacapaz de generar el péptido AvrXa21.

• PXO99 RaxST- : bacteria modificada genéticamente para eliminar el gen raxST quepermite generar el péptido AvrXa21.

• Péptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genéticamente (TP309-Xa21)

PX099

Péptido AvrXa21+

PX099 RaxST -Bacteria salvaje Bacteria transgénica

PXo99

RaxST-

Blanco control tratado

6 (D)

6

6

6 (C)

NA(B)

6

6

6 (A)PXo99

Transgenic

TP309-Xa21

Salvaje

TP309

Condition

(Class)

2 Tipos de Arroz (TP...)

2 ti

pos

deb

acte

ria

(PX

…)

Blanco control

SIN tratar

TP309 TP309-Xa212 tipos arroz (TP…)

(A) (B) (C) (D)

Resistente a la plaga2 tipos bacterias

Los replicados de muestras de la población son importantes

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)


07/07/2009

Deconvolución de Cromatogramas LC/MS de Arroz mediante “Agilent Molecular Feature Extractor (MFE)”

MFE deconvoluciona cromatogramaspara localizar los tiempos de retención / masa /abundancia de todos los compuestos ionizados. Evalúa isotópos, aductos y coeluciones.

Parámetros utilizados:

– Máx. carga iones = 1– Umbral Detección en altura (o S/N)

• Iones Positivos: 1000• Iones Negativos: 500

Número típico de “molecular features”(/compuestos) encontrados:

• Iones Positivos ~ 1500• Iones Negativos ~ 400

Aprox. 1900 compuestos/muestra(la gran mayoría desconocidos)

Muestra adquirida con LC/MS-TOF (o QTOF)

MFE Tr, m/z, Int.


07/07/2009

GeneSpring MS: Análisis Estadístico Multivariante. Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA

Proporciona una mucha mejor diferenciación

de clases

3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico12

3-INF

45

6-RES7-INF

3-INF

7-INF 6-RES

5

2

3-INF7-INF

6-RES

5

2

mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta

ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables


07/07/2009

GeneSpring MS: ANOVA de 1-vía con Datos de ArrozFiltrados mediante “Tukey Post-hoc Test”: modoIones Positivos

Azul: estadísticamente equivalentes

Rojo: estadísticamentediferentes

----- Arroz Salvaje ------

7 C

on

dic

ion

es B

ioló

gic

as

Co

mp

arad

as7 Condiciones Biológicas Comparadas

Infección

ArrocesResisten.

----- Arroz Transgénico ------A

rro

zS

alva

jeA

rro

zT

ran

gén

ico

Bact. Modif. Gen.

Ba

ct.

Mo

dif

. G

en

.

Bact. Salvaje

Ba

ct.

Sal

vaje

Ba

ct.

Sal

vaje

Bact. Salvaje

Arroces

Resisten.

Infección

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables


07/07/2009

GeneSpring MS: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-víacon Datos de Arroz Filtrados: modo Iones Positivos

La comparación mediante ANOVA de 1-vía se realizó para encontrar “molecular features” (/compuestos) de interés biológico.

• Se evaluan 7 condiciones biológicas. De la comparación de resultados se concluye:

– Immunity features: (42) – metabolitos relacionados con la resistancia

– Infected features (22) – metabolitos relacionados con la infección

– Bacterial features (25) – metabolitos producidos por las bacterias

– Rice line features (170) – metabolitos relacionados con diferencias en las líneas de arroz

Diagrama de Venn ComparandoArroz Infectado Vs. Resistente


07/07/2009

Ejemplo 2: Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos

PARÁMETROS INFLUENCIAN RENDIMIENTO EXTRACCIONES LÍQUIDO/LÍQUIDO:

• pH fase acuosa (parámetro estudiado en este ejemplo)

• Proporciones fase acuosa/orgánica

• Adición de sales / modificadores orgánicos fase acuosa

• Temperatura

• ...

PREPARACIÓN MUESTRA:

1.- Centrifugar sangre (con citrato como anticoagulante) y eliminación del sobrenadante.

2.- Lavado con PBS (solución salina de tampón fosfato) para eliminar los metabolitos del exterior de los glóbulos.

3.- “Quenching” y lisado de la membrana de los glóbulos para liberar los metabolitos de su interior.

4.- Adición modificador fase acuosa (metanol).

5.- Adición fase orgánica (cloroformo).

6.- Extracción líquido-líquido a diferentes pH’s fase acuosa.

7.- Evaporación a vacío y reconstitución fase acuosa.


07/07/2009

Influencia pH en nº Metabolitos ExtraídosDistribución 1211 metabolitos distintos identificados en MetLin DB por su masa exacta con <10ppm error

(LC/MS-TOF)

Incluye compuestos no identificados en MetLin DB

+ inf. en nota aplicación: Maximizing Metabolite Extraction forComprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN


07/07/2009

Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios Metabolómicos

• LC/MS-QTOF & QqQ: “Changes in phopholipase expression in the CNS of SIV-infected macaques”.

• Gary Siuzdak & others. The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 118 Number 7 July 2008

• CE/MS-TOF: “Ophthalmic Acid as an Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption”

• Tomoyoshi Soga & others. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 24, pp. 16768–16776, June 16, 2006

LC/MS-TOF: Biomarcadores de bajo peso molecular de Cáncer Pancreático

Poster ASMS: Mayo Proteomics Research Center, …Mayo Clinic

- La fracción de bajo peso molecular del plasma es una fuente viable de potenciales biomarcadores de cáncer pancreático y mediante unos 20 metabolitos permiten discriminarlo en pacientes diabéticos vs. no diabéticos


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Típicos Análisis de Metabolopatías mediante MS

Típicos compuestos a seguir

- Aminoácidos

- Acyl carnitinas

- Ácidos orgánicos

- Ácidos grasos

- ……

Fenilcetonuria (PKU): se controla con la relación de PHE / Tyr, donde Tirosina es el producto natural del metabolismo de la fenilalanina. Niveles elevados de Phe en relación con Tyr indica problemas en la conversión natural de este metabolito. PKU es una enfermedad que se puede tratar (sólo por el control de la dieta) y es importante tratarla lo antes posible, ya que puede conducir a daño cerebral y retraso mental.

LC/MS-QQQ


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Conclusiones

- La Espectrometría de Masas acoplada a cromatografía proporciona una excelente herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores.

- En LC/MS la disponibilidad de una “masa exacta” robusta e independiente de la concentración del analito es clave para el éxito del estudio.

- Se requiere del uso de potentes herramientas de software para:

- Extraer la información cuantitativa específica de cada compuesto ionizado.

- Automatizar la cuantificación relativa y comparación de miles de compuestos mediante un potente software de análisis estadístico multivariante que ofrezca análisis de componentes principales (PCA).

- Todas estas herramientas son aplicables a todo tipo de empresas que requieran estudios comparativos.


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Selection Guide

• Choosing Instrument Systems for Metabolomics Analyses - 5989-6328EN

Webcasts

• An Introduction to Metabolomics Analysis using Mass Spectrometry - Steve Fischer, Agilent Technologies

• Novel Mass-Based Approaches to Global Metabolomics - Gary Suizdak, Scripps Institute, CA

• More coming…….

Offers

• GeneSpring MS Trial CD Plus Tutorial Data

www.metabolomics-lab.com40m

Metabolomics Brochure

• Agilent Metabolomics Laboratory: The breadth of tools you need for successful metabolomics research - 5989-5472EN

Application Note

• Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice - 5989-6234EN

Product Note

• Agilent Software for Metabolomics: Software tools for each step in metabolomics data analysis - 5989-6172EN

Tech Note

• Biological sample preparation for successful metabolomic analysis - 5989-6326EN

• Considerations for Choosing GC/MS or LC/MS for Metabolomics - 5989-6327EN


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Estamos a su disposición entel.: 901.11.6890 www.agilent.com/[email protected]

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