Molekuláris biológiai technikák a szövettanban és patológiában

A molekuláris biológiai technikák fejlődése új távlatokat nyitott a patológiai diagnosztikában is. Bár a

különböző daganatok osztályozása jelentősen változott az immunhisztokémia alkalmazásával, azonban

egyes esetekben változatlanul kétségek merültek fel a tumorok osztályozásával, szöveti eredetével

kapcsolatban.

A szemléletváltozáshoz nagyban hozzájárult a Human Genome Project sikere, az emberi genom

szekvenciájának megismerése. Némileg módosult ezen lelkesedés, amikor a génszekvencia ismerete és

a funkció nem haladt mindig párhuzamosan. Az ezzel kapcsolatos kutatások viszont alapját adták

annak, hogy a géntechnológiai módszerek, a funkcióváltozást is nyomon kísérve számos területre, így a

patológiába is bevonuljanak.

A molekuláris biológia adatai alapján átalakult szemléletünk azon struktúrákkal kapcsolatban, amelyek

a korábban elmondottak alapján a diagnózisunk alapjául szolgáltak. A gének jobb megismerésével

lehetőség van génszinten, illetve fehérjeexpresszió szintjén is megismerni az egyes betegségekben

létrejövő molekuláris változásokat.

Kezdetben csaknem kizárólag friss műtéti anyagokból, ill. közvetlenül a vérből, csontvelőből vagy

szövetekből nyert sejteket, szöveteket használtak molekuláris patológiai vizsgálat céljaira. Újabban már

formalinban fixált és archivált mintákból is értékes vizsgálatokat végezhetünk génanalízis céljából.

Jelenleg a molekuláris patológiai módszereket elsősorban a tumorok diagnosztikájára, egyes fertőző

ágensek (baktériumok, vírusok stb.) kimutatására, génhibák feltárására alkalmazzák. A következőkben

a molekuláris patológiában jelenleg leggyakrabban alkalmazott módszereket tekintjük át.

• Citogenetika

E módszer lényegében kromoszomális diagnosztikai eljárás, mely az örökítő anyag strukturális és

funkcionális szerveződésével és működésével foglalkozik. A módszer megjeleníti a kromoszómákat, és

detektálja azok számbeli eltérését (monoszómia, triszómia) és/vagy szerkezeti átrendeződését

(transzlokáció, inzerció, deléció, inverzió).

A „rutin” kariotipizáláson túl érzékenyebb módszereket, így ma leggyakrabban a fluorescens in situ

hibridizációt (FISH, lásd később) alkalmazzák, melynek számos módosítása (például dual-color FISH)

ismert. Ezen technika csúcsa az M-FISH (spektrális kariotipizálás), amikor az összes kromoszómát

festjük.

• In situ hibridizáció – Az in situ hibridizáció során specifikus DNS-szakaszokat mutatunk ki a

kromoszómális vagy az interfázisban lévő sejtmagok DNS-ében. E módszer során a mintában jelen

lévő, egyszálúvá tett DNS a komplementer, a próbában lévő jelölt DNS-sel hibridizál. Az eljárást mind

friss, mind beágyazott szövettani metszeteken, citológiai preparátumon, csontvelőből, vérmintából is

elvégezhetjük. Az immunhisztokémiához némileg hasonló irányelveket követve, megfelelő jelölő

anyaggal láthatóvá tehető a hibridizációs reakció, és az mikroszkópban vizsgálható. A jelölés a korábbi

években izotóppal történt, azonban erre manapság már ritkán kerül sor, különböző hisztokémiai

reakciókkal vagy fluorescens jelöléssel (fluorescens in situ hibridizáció – FISH) detektáljuk a

hibridzáció bekövetkeztét. Ezen vizsgálatok eredménye igen informatív lehet, például

emlődaganatokban a már korábban említett Her2 gén amplifikáció vagy Helicobacter pylori

antibiotikum rezisztenciájának kimutatásában, mely során a mutált gént tudjuk detektálni.

• Komparatív genomikus hibridizáció (CGH) – a FISH-hez nagymértékben hasonlít. A próba

alapvetően normális és tumoros (teszt) DNS keveréke, ahol a normális és tumoros DNS különböző

fluorochrommal van jelölve (pl. sárga és piros). Ha ezzel a keverékkel citogenetikai eltérést nem

mutató normális szövetet nézünk, akkor a két szín kombinációját (rózsaszínt) fogunk látni, de ha pl.

deléció van, akkor a kromoszóma azon helyén a szín közelebb lesz a normálishoz (sárga), viszont ha

génamplifikáció vagy extra DNS van jelen, akkor a szín eltolódik a teszt tumoros DNS irányába, tehát

piros lesz. Bár igen költséges eljárás és szinte kizárólag kutatási célokra használják, mégis ma a szolid

tumorok citogenetikai vizsgálatának egyik kedvelt formája, különösen, ha a tumort nehéz

kariotipizálni, vagy komplex kariotípusról van szó, esetleg kiegyensúlyozatlan

kromoszómaátrendeződéseket kell vizsgálni.

• Polimeráz láncreakció (PCR) – A friss vagy már fixált és paraffinba ágyazott anyagból DNS-t

izolálunk. A vizsgálandó DNS-szakaszokat speciális polimeráz enzim (Taq-polimeráz) és ún. primerek

segítségével felszaporítjuk (amplifikáljuk). Minden ciklus után duplázódik a kiválasztott DNS-szakasz,

így a „reakciólánc” végére a kiindulási DNS-szakasz jelentősen, a kívánt mennyiségre felszaporodhat.

A kvalitatív PCR-reakció csak arra képes választ adni, hogy jelen van-e a mintában a kérdéses DNS-

szakasz.

A PCR-technikát kiterjedten alkalmazzák az egyes kórokozók, baktériumok, vírusok kimutatására.

Ugyancsak alkalmas egyes daganatokban, például emlőrákban a HER2/neu amplifikáció kimutatására,

valamint génátrendeződések, pontmutációk stb. azonosítására. Egyes esetekben in situ PCR-reakció

végzésére is lehetőség adódik (Lotz et al., 2002).

A kvantitatív vizsgálat a DNS-szakaszok mennyiségét is képes mérni. A fluorescens festékkel jelölt

alkotórészek intenzitása alapján, a jelet detektálva, minden ciklus végén mérhetjük a képződött DNS

mennyiségét. Ezen technikát nevezzük „valós idejű” (real-time) PCR-módszernek .

A PCR-technika alkalmas az RNS vizsgálatára is, mely számos esetben igen lényeges egyes sejtek,

szövetek funkciójának megítélése szempontjából – elsősorban a messenger RNS (mRNS) kimutatása

lényeges. A mintából izolált RNS-t reverz transzkriptáz segítségével cDNS-formába írjuk át, majd

végrehajtjuk az amplifikációt (rt-PCR). Jelenleg a tumordiagnosztikában ezt a módszert alkalmazzuk

legelterjedtebben. Mindezen módszerek igen érzékenyek, és rendkívüli gondos kivitelezést igényelnek.

A molekuláris patológiai technikákat végző laboratóriumoknak különösen magas szintű minőségi

követelményeknek kell eleget tenniük.

• Szöveti chip technológia – E módszer lényege, hogy megfelelő berendezéssel (vagy akár egyszerű

vékony tűvel) kicsiny hengert emelnek ki a szövetblokkokból. Mindezt megfelelő módon

paraffinblokkba helyezve, egyszerre akár 50–300, vagy ezt is meghaladó mintasor vizsgálható

egyidejűleg. Ezen módszer segítségével például többféle szöveti szerkezetű daganat vagy egy

daganatnak többféle stádiuma hasonlítható össze. Értékes technika lehet új antitestek kipróbálására,

illetve gyógyszerhatások vizsgálatára.

• DNS-chip (DNS array, microarray) – A DNS-chip technológia rendkívül ígéretes módszer, mely

során lehetővé válik számos, akár több ezer vagy tízezer gén expressziós profiljának a vizsgálata. A

módszer lényege, hogy különböző hosszabb-rövidebb DNS-szálakat, illetve oligonukleotid szakaszokat

viszünk fel, „nyomtatunk” egy kicsiny, vékony lapra. Nagyon lényeges, hogy a felvitt szakaszok

mindegyikének szekvenciája egyértelműen tisztázott legyen. Ezt követően az in situ hibridizációhoz

hasonló módon a kérdéses, vizsgálni kívánt DNS-t visszük fel a több száz, illetve több tízezer gént

tartalmazó chipre. Komplementer, kiegészítő szekvencia esetén a kötődést megfelelő színreakció jelzi.

A rendkívül nagyszámú mintakapcsolás kiértékelése bonyolult programokkal és igen fejlett

számítógépes technikával történik. Az eljárással képet kaphatunk egyes gének föl-, illetve

alulexpresszálódásáról. Egyes daganatokban expresszálódó gének, az ún. génmintázat, a normálissal,

illetve különböző daganattípusok egymással hasonlíthatók össze. Ennek eredményeképpen a daganatok

a génexpressziós profil alapján egymástól elkülöníthetők. A számítógéppel elemzett adatokat tovább

kell analizálni. Megfelelő módon összehasonlítva ún. hierarchikus csoport- (cluster) analízis végezhető,

vagy „önszerveződő térképek” (Self-organizing maps – SOM). Egy-egy kézjegy olyan gének clusterét

mutatja, amelyek egymáshoz hasonló funkciójú fehérjéket kódolnak (Eisen, 1998).

FISH

A fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) technikák előtérbe törésével nagy fokban növekedett a

citogenetikai diagnózisok biztonsága, pontossága, valamint nem csak metafázisú, hanem interfázisú

sejtek is könnyen, gyorsan és egyszerűen vizsgálhatók. Az in situ hibridizációs technika lényege, hogy

specifikus nukleinsav-szekvenciákat tudunk detektálni többnyire keneteken, de metszeteken is.

A technikát magát már 30 évvel korábban leírták és alkalmazták, ekkor azonban radioizotóppal

jelölt nukleinsavakat használtak és a detektálás autoradiográfiával történt. Az új és különböző

fluorochromok megjelenése és az érzékeny detektáló szisztémák kifejlesztése mára már a FISH

technikát igen népszerüvé tették és egyben széles körben alkalmazzák.

FISH-hez használt próbák

„Painting probes”: azok a próbák, melyek egy kromoszóma teljes hosszában hibridizálnak, azaz a

teljes kromoszómát „festik”. Ezen próbák használata igen alkalmas strukturális abnormitások ki-

mutatására (pl. transzlokációk). A painting próbákat különböző fluorochromokkal jelölhetjük,

így egyszerre több kromoszómát vizsgálhatunk. Ezen technika csúcsa az ún. M-FISH vagy

más néven spektrális kariotipizálás, amikor az összes kromoszómát „festjük” egyidejüleg, ami

természetesen mindenfajta DNS-szakasz-átrendeződést, citogenetikai abnormitást kimutathat.

Amíg a néhány kromoszómát érintő kromoszóma “festés” ma már igen elterjedt (pl. dual-color

FISH technika), addig az M-FISH technikát csak erősen specializált citogenetikai laboratóriumok

használják, szinte kizárólag kutatási célokra.

Dual FISH: pirossal és sárgával jelölt kromoszómák. Transzlokáció esetén megjelennek a kétszínű

(piros és sárga) kromoszómák. Reciprok transzlokáció esetén (mint a képen) páros számú kétszínű

kromoszóma található.

M-FISH festés számítógépes"fals színes" képe, amin a fluoreszcencia hullámhosszban levő kismértékű

eltéséréseket különböző alapszínekké növelték.

Centromerikus és ismétlődő szekvencia próbák: minden kromoszóma centromerikus régiójában (α és β

satellit) a kromoszómára jellemző ismétlődő szakaszok, szekvenciák vannak (100-5000 kópia) és

ugyanilyen ismétlődő szekvenciák (TTAGGG) vannak a telomerikus régiókban. Minthogy az ismétlődő

szakaszok miatt hosszú DNS-szakaszokról van szó, a repetitív próba is nagy (több 100 kb), ezért a

hibridizációs jel kompakt, intenzív fluoreszcens szignálként jelentkezik. Bár az említett centromerikus

régiók specifikusak az egyes kromoszómákra, mégis vannak kivételek, ugyanis pl. a 13-as és 21-es

kromoszómák olyan hasonlóak, hogy a próbáik keresztreakciót adnak. A centromerikus próbák

ideálisak a különböző numerikus kromoszómaeltérések (kromoszómaaneuploiditás) kimutatására meta

és interfázisú sejtekben is.

Piros jelölés akrocentrikus kromoszómák: 13, 14, 15, 21, és 22. Kék: 13 és 21-es kromoszómák

centromer régiójával hibridizál. Zöld: ß-satellit probe akrocentrikus kromoszómák rövid karján.

(nagyobb kép alább)

Kromoszóma 3 centromer specifikus

jelölés

Unikális szekvencia-próbák: egyes specifikus kromoszómaszegmensek feltüntetésére alkalmas.

Ezek lehetnek cDNS-ek (nincs repetitív elem) vagy genomikus klónok (többnyire van repetív elem). A

különböző vektorok a megfelelő hosszúságú DNS-sel a következők lehetnek: plasmidok (1–10 kb),

bakteriofágok (25 kb-ig), cosmidok (35–45 kb), bakteriális arteficiális kromoszóma (BAC) (300 kb-ig),

élesztő (yeast) arteficiális kromoszóma (YAC) (100 kb–2 Mb). Ezen unikális szekvencia-próbákkal

lehetőség van arra, hogy feltüntessük: a kérdéses szakasz elveszett (deléció) vagy áthelyeződött (saját

kromoszómán belül vagy más kromoszómára), azaz finomabb strukturális átrendeződéseket

vizsgálhatunk.

1-es kromoszóma terminális szakaszainak jelölése

A különböző próbák gyakorlati alkalmazását és a szignálok megjelenése:

FISH szenzitivitás

A kis területek (targets) detektálásának lehetősége igen jelentősen megnőtt az ún. hütött CCD kamerák

alkalmazásával. Ebben az esetben a -20 oC-on müködő kamera olyan fluoreszcens szignálokat is

érzékelni tud, ami az emberi szem számára láthatatlan. A hullámhossz 400 és 1000 μ m között van,

ezért gyakorlatilag bármilyen fluorophor használható. A már korábban említett M-FISH és az ehhez

hasonló multikolor SKY technikák igen szofisztikált felszerelést igényelnek (hütött CCD kamera,

interferométer, igen szük sávú filterek, bonyolult software csomag stb.), de ezek segítségével a

géntérképezéstől az ismeretlen genetikai anyag kimutatásán keresztül az egy „csip”-ben 50–100 féle

onkogén kimutathatóságáig minden lehetséges. A FISH felbontási képessége (2 elkülönülő

fluoreszcens szignál) kb. 1–2 Mb a metafázisú kromoszómákat illetően. Az interfázisú sejtekben

azonban a kromatinszálak kevésbé kondenzáltak, így a felbontás 50 kb-ig csökkenhet. A magból a

kromatinszálak kinyerése pedig további metodikai lehetőségeket ad, ezek közül legismertebb az

ún. Fiber-FISH (1, 24), ami nagy felbontású és pl. kromoszómaátrendeződések feltérképezésére

szolgál.

Fluoreszcens in situ hibridizáció gyakorlati kérdései

Alapvetően kétféle metódus ismert, a direkt és az indirekt.

A direktben a próba már eleve fluoro chrommal jelölt. A legtöbb kommerciálisan beszerezhető

próba direkt jelölt, előnye, hogy egyszerübb metodikát igényel, alacsony a háttérszignál, a szignálok

erősek, viszont a próbák drágák és a szenzitivitás nem olyan jó, mint az indirekt metódusnál. Az

indirekt metódusban a próbát egy hapténnel jelöljük (a két leggyakrabban használt haptén a biotin és a

digoxigenin, újabban pedig az oestradiol), ehhez kapcsolódhatnak a különböző színü fluorochromok

nagy variációban (FITC; rhodamin; TexasRed stb.). A magfestés általában DAPI-val (kék) vagy

propidiumjodiddal (piros) történik. A detektáláshoz egy epifluoreszcens mikroszkóp szükséges,

általában legalább 2-es szürővel, de ideális a 3-as szürő (3 szín különíthető el) és jó, ha ezen kívül több

1-es szürő is rendelkezésre áll.

A fenti technikák alkalmazása egyre kiterjedtebb. Leggyakrabban a következő területen képezik a

diagnózisalkotás részét:

Daganatok: Számos daganatban észleltek eltéréseket fenti technikák segítségével. Ezen eltérések

felismerésének a daganat pontos diagnózisának, osztályozásának, fokozatának megállapításában, a

prognózis, a terápiás célpontok lehetséges megállapításában és a kezelés hatásosságának lemérésében

egyaránt szerepe van.

A leggyakrabban a következő daganatok esetén alkalmazunk jelenleg molekuláris patológiai

módszereket: leukémia, limfóma, emlőrák, lágyrészdaganatok, neuroblasztóma, vese- és

hólyagdaganatok, tüdőrák, kolorektális daganatok, gasztrointesztinális sztromális tumorok stb.

Fertőző ágensek: Igen ígéretes alkalmazási terület, mely már számos baktérium, vírus kimutatása

céljából bevonult az eszköztárba. A patológiában a leggyakrabban a következő kórokozók kimutatását

végezzük molekuláris patológiai módszerrel: humán papilloma vírus (HPV) tipizálás (magas és

alacsony kockázatú típusok), Helicobacter pylori antibiotikum (elsősorban clarithromycin)

érzékenységének meghatározása, Epstein–Barr-vírus (EBV), Cytomegalovírus (CMV), Mycobacterium

tuberculosis kimutatás.

Feladatok:

1. Melyik képeken lát M-FISH festést?

2. Mely képek ábrázolnak transzlokációt?

3. Mely képeken készült a festés unikális szekvencia próbával?

4. Mely képen jelölték a kromoszómák centromer regióját?

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.