5. biotransformation khaoula

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Diapositive 1

Facult de medecine de ConstantineLaboratoire de toxicologie CHUCCours de 1e anne rsidanat anne 2013/2014

Khaoula KOULOUGHLI Le 16 Dcembre 2013BIOTRANSFORMATION1Plan : I. Introduction ; II. Gnralit ;III. Phase I ;IV. Phase II ;V. Pase III ; V. Facteurs variabilit de la biotransformation;VI. Rsultats de la biotransformation et bioactivation ; VII. Interet de la connaissance de la biotransformationVIII. Exploration de la biotransformation IX. Conclusion. bibliographie

2Le mtabolisme des xnobiotiques est invitable. L'accumulation sans fin xnobiotiques mme non toxiques est incompatible avec la survie des organismes vivants.

Des stratgies de protection sont mis en eouvre, dont le mtabolisme des xnobiotiques (6). I. Introduction : 3Le mtabolisme des xnobiotiques comme un domaine de recherche est n au cours de la premire moiti du 19e sicle: Dcouverte de l'acide hippurique (le conjugu de la glycine de l'acide benzoque) dans l'urine de cheval.

Dans les annes 1950 ltude du mtabolisme a vraiment dcoll en raison de la prise de conscience progressive des scientifiques sur la varit et l'importance des ractions mtaboliques. I. Introduction : 45II. Gnralits : La biotransformation est un ensemble de processus biochimiques mis en oeuvre pour former des composs :

plus polaires, hydrophiles, moins toxiques facilement excrtables par le rein ou la bile (dtoxification : dans la majorit des cas).

Parfois la biotransformation peut conduire des produits plus toxiques (toxification).

II. Gnralits : 6Le lieu principal de la biotransformation est le foie. En raison de son flux sanguin lev 1.5L/min + sa richesse en enzymes de mtabolisation.

Peut se produire dans dautres organes : Poumon, estomac, placenta, intestin, peau, et rein. I. Introduction :

II. Gnralits : 7Les ractions de biotransformation se divisent en deux types : Raction de phase I / Dgradation/ Fonctionnalisation:

Ractions de phase II/synthse / Conjugaison : La molcule-mre ou les mtabolites (produit de phase I) se conjuguent avec une substance endogne.

Phase III la phase dans laquelle les mtabolites quittent la cellule grce a des protines, pour tre limins (Glycoprotine P par exemple) (2).

I. Introduction : Oxydation RductionHydrolyse

II. Gnralits : 8Role la phase III cest de diminuer la charge cellulaire en xnobiotique. 8Figure 1. Biotransformation

910II. Ractions de phase I : Cest la raction de biotransformation la plus importante (2). Les mtabolites qui en rsultent sont nombreux.Loxydation est catalyse par des systmes enzymatiques :=> Monooxygnase cyt P450. flavine. => Amine oxydase. => dhydrognase II. Ractions de phase I : 1. OxydationMicrosomaleNon Microsomale11Tu dois partager dans le plan du cours : oxydation microsomale, non microsomale.

Phase I : Cette phase de mtabolisme prcde souvent, mais pas systmatiquement, diverses tapes de conjugaison regroupes sous le terme de Phase II de mtabolisme et catalyses entre autres par les enzymes de la famille des UDP-Glucuronosyltransfrases (UGT).11121.a.Oxydation microsomaleLes monooxygnases sont des oxydorductases catalysant le transfert dlectrons.

Monooxygnation : Lincorporation dun groupement hydroxyl sur le substrat. Au cours de cette raction : => Deux atomes doxygnes sont rduits en un groupement hydroxyl; => Une molcule deau sera libre par oxydation concomitante du NADPH.

II. Phase I131.a Oxydation microsomaleCyt P450 : Les CYP constituent une famille dhmoprotines initialement identifies comme des pigments dans des microsomes de foie de rat.

Ils sont caractriss par une bande d'absorption intense 450 nm en prsence de monoxyde de carbone.

Impliqus dans le mtabolisme de substances endognes (tel que les stroides) et exognes. II. Phase I1.a Oxydation microsomale

a. Cyt P45014Appels aussi : hmo-thiolate. 14CYP450 sont composs de : hme (Fe3+) (groupement prosthtique) + apoprotine + cystinate+Site actif de CYP450.

Localisation: Prsents en grande quantit dans les hpatocytes, dans les entrocytes de lintestin grle.

En plus faible quantit dans dautres tissus comme le rein, le poumon,le cerveau, la peau (5).

Se trouve dans la partie externe du REL. Et au niveau des mitochondries (9).

II. Phase Ia. Cyt P450

151.a Oxydation microsomaleCod par 115 gne dont 57 actifs et 58 pseudognes.Incorpore un atome dOxygne au subsrat.Pourquoi a absorbe 450nm : La raison de labsorption spcifique 450 nm provient de la nature particulire du ligand li lhme: il sagit dun ligand thiolate issu dune cystine (dite proximal par opposition au sixime ligand -distal- port par lion fer) de lapoprotine qui entoure lhme et la fixe ainsi la paroi membranaire de la cellule). Absorption trs prononce quand le fer est rduit et complex avec le monoxyde de carbone.

Localisation : les CYP eucaryotes sont associs la membrane externe du rticulum endoplasmique ou se trouventdans les mitochondries (membrane interne, externe ou matrice).15Le systme P450 des microsomes eucaryotes contient deux composantes: NADPH CYP450 rductase, une flavoprotine contenant la fois FAD et FMN, et P450.FMN et cytochrome b5, assure les transport des lectrons depuis FAD au CYP450.

II. Phase Ia. Cyt P450

161.a Oxydation microsomaleExplication de cette figure depuis la thse dAmlie : la transformation dun compos chimique par le CYP P450 a lieu lasurface externe du rticulum endoplasmique o est encre lenzyme. Le site actif du CYPP450 contient un atome de fer (Fe) fix par des liaisons de coordinance. Deux lectrons, provenant dune molcule de NADPH, sont transfrs lhmoprotine par uneflavoprotine (FAD-FMN) en prsence dune molcule organique (R-H) et dun atomedoxygne. Le compos organique est oxyd et un atome doxygne molculaire estincorpor au produit chimique (R-OH). R=mdicaments, acides gras, strodes, polluants.16Les CYP450 ont besoin de deux lments :

>> Une source dlectrons : la NADP cytochrome P450 rductase (flavoprotine donneuse dlctrons)(3).

>> Phospholipide (PL) CYP450 (de la mbr du RE) : assure la cohsion monooxygnase-rductase.

II. Phase Ia. Cyt P450171.a Oxydation microsomaleStructure du CYP450 : 18

Enfin un shma explicite illustrant la position du CYP450 de la reductase du FAD et Du FMN ^^

Pourquoi la mbr du REL hberge les enzyme de phase I et II ? Le RE est en effet une structure lipidique particulire, trs favorable aux changes et disposant dune surface tonnamment large (comprenant 7 11 m2/g du poids du foie) compar son volume, ce qui fait de lui la structure idale pour hberger les enzymes de phase I et II de mtabolisme(Lewis and Pratt, 1998). Sachant que 12 a 15% du RE est compos de CYP, on peut estimer approximativement que les CYP comptent pour un peu moins de 1% du poids total dun hpatocyte (Ruckpaul and Rein, 1984).18Des familles de gnes de CYP450 ont t identifies chez lHomme.

Trois familles sont impliques dans la plupart des biotransformations de drogues sont CYP1, CYP2 et CYP3.

Ils sont diviss sur la base de similarits de squences d'acides amins, et chaque famille peut tre divise en sous-familles, qui sont dsigns par des lettres majuscules aprs la dsignation de la famille (par exemple, CYP3A).

Enzymes individuels sont ensuite indiqus par des chiffres arabes (par exemple, CYP3A4). II. Phase Ia. Cyt P450191.a Oxydation microsomaleII. Phase Ia. Cyt P450

201.a Oxydation microsomaleII. Phase Ia. Cyt P45021

1.a Oxydation microsomaleUn seul hpatocytes peut contenir une varit de CYP450.

Sa spcificit peut tre : Relative :un isoforme va mtaboliser des substrats diffrents. Chevauchante :un mme substrat est mtabolis par plusieurs isoformes.

II. Phase Ia. Cyt P450Homologie de la squence dacide aminMme famille40%Mme sous-famille59%Mme iso-fomre97%221.a Oxydation microsomale

Relative :un isoforme va mtaboliser des substrats diffrentsChevauchante :un mme substrat est mtabolis par plusieurs isoformes.

Un CYP450 peut tre capable de mtaboliser de nombreux mdicaments diffrents, mais un mdicament peut tre mtabolis principalement par une seule enzyme. Spcifit du cyp450, chevauchemrnt ajouter.

22Tableau montrant les substrats des CYP450 (11) :

23

2324

Raction gnrale :

Oxydation par CYP450 est une source physiologique de stress oxydant (libration dun o au cours du cycle catalytique).

II. Phase Ia. Cyt P450

251.a Oxydation microsomaleSource : socit chimique de France :

1. Interaction substrat site actif => modification de la conformation => changement de ltat dion fer de lhme de bas spin haut spin. 2. Ce changement favorise le transfert dun lectron partir NAD(P)H par lintermdiaire dune rductase ramenant le fer ferrique ltat ferreux.3. Dans cet tat rduit, il y a fixation du dioxygne en position axiale distale du fer(II).4. Le ligand thiolate fournit par une cystine est un meilleur donneur dlectrons que lhistidine, qui est lamino-acide le plus frquemment rencontr dans hmoprotines.5. Un deuxime lectron est transfr par lintermdiaire du systme transporteur dlectrons (cytochrome P450 rductase, ferredoxine, ou cytochrome b5), conduisant la formation dun ligand peroxo de courte de courte dure de vie.6. Ce ligand peroxo est proton deux reprises par transfert partir de leau ou daminoacides environnants de la protine, librant une molcule deau, et formant un ractif, appel compos I. ** Cette espce, rcemment observein situ, serait un fer(IV) oxo, espce ferryle lie un ensemble hme-thiolate comportant une charge ngative dlocalise.7. cette espce ferryle qui assure lhydroxylation du substrat RH. Aprs libration de du produit hydroxyl, lenzyme revient son tat initial par coordination dune molcule deau occupant cette position distale de lion Fe(III) de lhme.

Conclusion : Ce mcanisme montre la complexit des mcanismes mis en jeu, puisque pour fonctionner les CYPs requirent toute une machinerie dlivrant loxygne, les lectrons (lnergie ultime), les protons et leau.Source www.societchimiquedefrance.fr

Thse de Amlie Mathis :

25Cycle catalytique du CYP450 (5) :

II. Phase Ia. Cyt P450

261.a Oxydation microsomaleLe cycle doxydation du cytochrome P450 comprend plusieurs tapes :-Tout dabord, il se forme un complexe entre une molcule (substrat endogne ou exogne)et le fer ltat ferrique de lhmoprotine.-Ce complexe est ensuite rduit par un lectron fourni par le NADPH grce au coenzymeNADPH-CYP rductase (le fer passe ltat ferreux).-Loxygne molculaire se fixe sur le fer ferreux et un deuxime lectron apport par leNADPH grce au coenzyme NADPH CYP rductase ou NADH-NADH cytochrome b5 rduit cenouveau complexe. Il y a alors formation dun hydroperoxyde.-La molcule doxygne est ensuite transfre sur la molcule mtaboliser (13). Thse Amlie. 26Monooxygnase flavine oxydase : Un groupe d'enzymes qui catalysent des ractions chimiques par l'intermdiaire du cofacteur li la flavine.

Ces protines microsomales catalysent l'oxygnation de l'azote , de soufre , de phosphore et slnium atomes nuclophiles dans une gamme de composs de structures diverses .

L'utilisation d'un cofacteur NADPH et groupement prosthtique FAD.II. Phase Ib. Monooxygnase flavine oxydase271.a Oxydation microsomale27FMOs ont t impliqus dans le mtabolisme d'un certain nombre de produits pharmaceutiques, de pesticides et de substances toxiques . Cinq formes de la FMO sont maintenant connus et ont t dsigns de FMO1 - FMO5

II. Phase Ib. Monooxygnase flavine oxydase281.a Oxydation microsomale28Une certaine comptition peut exister entre les CYP et les FMO vis--vis de certains substrats.

dans le foie on observe 85 % de CYP pour seulement 15 % de FMO.

dans la peau seulement 33 % de CYP pour 66 % de FMO.II. Phase Ib. Monooxygnase flavine oxydase291.a Oxydation microsomale29301.b.Oxydation non microsomaleLes amine oxydases sont des enzymes largement distribues dans lorganisme. Catalysent la dsamination oxydative.

Classes en deux groupes :

FAD amine oxydase : Monoamine oxydase, polyamine oxydase.

Amine oxydases carbonyles dpendentes : diamine oxydase... (8).

II. Phase I1.b Oxydation non microsomalea. Amine oxydase 31La MAO fut isole pour la premire fois par Mary Hare en 1928. Elle la nomme tyramine oxydase pour sa capacit catalyser la dsamination oxydative de la tyramine. Cette enzyme est capable doxyder dautres monoamines dont les catcholamines (adrnaline,dopamine et la noradrnaline) ou la srotonine pour cela elle fut appele plus tard monoamine oxydase. (Thse)

Les amines oxydases sont des enzymes largement distribues chez les organismesvivants (Mondovi et al. 1984). Elles catalysent la damination oxydative des amines (mono-,di- et polyamines) et sont classes en deux groupes : i) les FAD-amine oxydases tels queles monoamines, les polyamines oxydases, les monoamine oxydases (MAOs) et ii) lesamines oxydases carbonyls dpendantes tels que les di-amine oxydases (DAOs), la lysyloxydaseet les amine-oxydases sensibles au semicarbazide (SSAOs).31Les MAO sont localisation mitochondriale, DAO : enzyme soluble (8).

Isoformes : Les monoamine oxydases (MAO-A et MAO-B) sont diffrencies selon leur spcificit vis vis des substrats et selon leur sensiblit aux inhibiteurs . Elles diffrent aussi par leur poids molculaire (MAO A=60kDa, MAO B= 58kDa)(8).

II. Phase I1.b Oxydation non microsomalea. Amine oxydase 32La MAO fut isole pour la premire fois par Mary Hare en 1928. Elle la nomme tyramine oxydase pour sa capacit catalyser la dsamination oxydative de la tyramine. Cette enzyme est capable doxyder dautres monoamines dont les catcholamines (adrnaline,dopamine et la noradrnaline) ou la srotonine pour cela elle fut appele plus tard monoamine oxydase. (Thse)

Les amines oxydases sont des enzymes largement distribues chez les organismesvivants (Mondovi et al. 1984). Elles catalysent la damination oxydative des amines (mono-,di- et polyamines) et sont classes en deux groupes : i) les FAD-amine oxydases tels queles monoamines, les polyamines oxydases, les monoamine oxydases (MAOs) et ii) lesamines oxydases carbonyls dpendantes tels que les di-amine oxydases (DAOs), la lysyloxydaseet les amine-oxydases sensibles au semicarbazide (SSAOs).32Fonction des MAO :

Elles vitent la pntration de ces amines vasoconstrictives ou toxiques dans lorganisme comme la tyramine (3).

II. Phase I1.b Oxydation non microsomalea. Amine oxydase 33La MAO fut isole pour la premire fois par Mary Hare en 1928. Elle la nomme tyramine oxydase pour sa capacit catalyser la dsamination oxydative de la tyramine. Cette enzyme est capable doxyder dautres monoamines dont les catcholamines (adrnaline,dopamine et la noradrnaline) ou la srotonine pour cela elle fut appele plus tard monoamine oxydase. (Thse)

Les amines oxydases sont des enzymes largement distribues chez les organismesvivants (Mondovi et al. 1984). Elles catalysent la damination oxydative des amines (mono-,di- et polyamines) et sont classes en deux groupes : i) les FAD-amine oxydases tels queles monoamines, les polyamines oxydases, les monoamine oxydases (MAOs) et ii) lesamines oxydases carbonyls dpendantes tels que les di-amine oxydases (DAOs), la lysyloxydaseet les amine-oxydases sensibles au semicarbazide (SSAOs).33Les monoamine oxydases sont prsentes dans le systme nerveux central, qui participent au catabolisme des amines endognes.

Leau oxygne produite au cours de cette raction est dtruite par la catalase ou une peroxydase (3).II. Phase Ia. Amine oxydase 34

1.b Oxydation non microsomale34Enzymequioxydeunsubstratpar le transfert d'un ou plusieursions(H+) un accepteur, gnralement un coenzymetype NAD+/NADP+ouflavinecomme leFADou leFMN.

Laldhyde dhydrognase ;Lalcool dhydrognase.II. Phase Ib. Dhydrognases 351.b Oxydation non microsomale351. Aldhyde dhydrognase (ALDH) :

Enzyme polymorphe responsable de l'oxydation des aldhydes en acides carboxyliques.

Localises dans de nombreux tissus, principalement au niveau du foie.

Il existe trois types diffrentes de ces enzymes chez les mammifres:ALDH 1 : cytosolyque,ALDH 2 : mithochondrial, ALDH 3 : tumeurs, l'estomac et la corne.

ALDH1 et ALDH2 (ttramriques) sont les plus importantes.II. Phase Ib. Dhydrognases:36Il existe des formes constitutives et inductibles

1.b Oxydation non microsomale1. Les acides carboxiliques forms par laldhyde dhydrognase quittent le foie et sont mtaboliss par les muscles et le cur. 2. Km (constante de michaelis) est faible pour ALDH 1 et 2. Elle est leve pour ALDH 3. Km est une constante caractrisant une raction enzymatique reflte l'inverse de l'affinit de l'enzyme pour son substrat:Les enzymes peu actives possdent une Km relativement leve (ex : protase). Dans ce cas ALDH 3 est moins active que 1 et 2. Ex Km faible : peroxydase.

362. Alcool dhydrognase ADH : Lalcool dshydrognase (ADH) est une enzyme dimrique, hpatique et cytoplasmique.

Lenzyme est aussi prsente dans le rein et le tube digestif.

LADH catalyse loxydation dun alcool en aldhyde en transportant les hydrognes sur le coenzyme NAD+.

II. Phase Ib. Dhydrognases:37

1.b Oxydation non microsomalecodes par des gnes plusieurs allles ce qui donne des isoenzymes (ADH, et ). Il existe des variants rares plus actifs que les normaux. Lenzyme est aussi prsente dans le rein et le tube digestif.

372. Alcool dhydrognase ADH : Spcificit : Spcifique des alcools primaires, particulirement lalcool ethylique.

NB : Le foie peut aussi oxyder partiellement lalcool par des hydroxylases cyt p450 (CYP 2E1) inductibles (MEOS =Microsomal Ethanol Oxidizing System).

Il existe aussi une trs faible oxydation par des catalases.II. Phase Ib. Dhydrognases:381.b Oxydation non microsomalecodes par des gnes plusieurs allles ce qui donne des isoenzymes (ADH, et ). Il existe des variants rares plus actifs que les normaux. Lenzyme est aussi prsente dans le rein et le tube digestif.

38Classification de lADH (13):

39

Les enzyme avec Km la plus petite sont les plus actives.

ADH 2*1 : sauvage la plus active. 3940Exemples doxydations microsomales:II. Phase I1. Oxydation1.Exemples doxydations microsomales:41Oxydation aliphatique ;Oxydation aromatique ; Epoxydation ; O. Dsalkylation ; N. Dsalkylation ; S. Dsalkylation ; Dsamination oxydative ;N. Oxygnation ; Sulfoxydation; N. Hydroxylation;Dsulfuration oxydative ; Dshalognation.

41II. Phase I1. OxydationExemples doxydations microsomales:421. Oxydation aliphatique : La plus frquente ; Donne des alcools primaires et secondaires qui vont eux mme subir dautre oxydation.

Tolbutamide : hypoglicmiant par voie orale de la famille de sulfonylure : premire gnration des bloqueur canaux potassium : augmente la synthse de linsuline. utilis en cas de diabte de type II. Le tolbutamide hypoglycmiants est couramment utilis comme un mdicament de la sonde pour valuer l'activit de l'enzyme CYP2C9 en termes de production de 4'-hydroxytolbutamide.

Acide Laurique : acide n dodcanoique : acide gras satur 12 atome de carbones. 42II. Phase I1. OxydationExemples doxydations microsomales:432. Oxydation aromatique :Deux mcanismes : hydroxylation/par intermdiare epoxyde :

Phnobarbital => P hydroxy phnobarbital : 43II. Phase I1. OxydationExemples doxydations microsomales:

443. Epoxydation : Ex : Epoxydation des alcnes: formation despces ractives potentiellement toxiques.

mtabolise au niveau hpatique par les isoenzymes CYP3A4 (principalement), CYP2D et CYP2C8. Ces isoenzymes forment le systme ducytochrome p450qui transforme la carbamazpine en son mtabolite: la10,11 poxycarbamazpinepuis en10,11-dihydroxycarbamazpine, inactive. La 10,11 poxycarbamazpine a des proprits anticonvulsivante chez l'animal mais son intrt thrapeutique chez l'tre humain n'est pas clair4.La carbamazpine est un inducteur enzymatique influenant l'effet de nombreux mdicaments et mme sa propre mtabolisation.

44II. Phase I1. OxydationExemples dox:454. O-dsalkylation :

Exemples doxydations microsomales:

Dxtrometorphane est utilis dans les sondes comme substrat pour CYP 2D6 pour une raction de O. Dmthylation. 45II. Phase I1. OxydationExemples dox:465. N. Dsalkylation :

Exemples doxydations microsomales:

Le diazpam est N-dmthyl par le CYP3A4 et le 2C19 en N-dmthyldiazpamet est hydroxyl par le CYP3A4 en tmazpam. Le N-dmthyldiazpam et le tmazpam,mtabolites actifs, sont ensuite tous deux mtaboliss en oxazpam. Par la suite, loxazpam et letmazpam sont conjugus lacide glucuronique.46II. Phase I1. OxydationExemples dox:476. S-Dsalkylation : Exemples doxydations microsomales:

Autre exemple thioridazine (neuroleptique) donne dmthyl thioridazine. Lamercaptopurine(dnomination commune internationalede la6-mercaptopurine[rf.souhaite]) est unantimtabolitedu groupe desanalogues de la purine. C'est unmdicamentaux propritsimmunosuppressivesetcytostatiquesutilises dans le traitement desleucmies.

47II. Phase I1. OxydationExemples dox:487. Dsamination oxydative :

Exemples doxydations microsomales:

48II. Phase I1. OxydationExemples dox:498. N. Oxygnation :

Peut tre une tape prliminaire de la N. Dsalkylation.

Les flavine oxydase interviendraient aussi dans ce mcanisme. Exemples doxydations microsomales:

Autre exemple : nicotine => nicotine 1 N oxyde.

Un exemple important : il illustre le fait quune molcule peut tre mtabolise par CYP450 et par les flavines aussi. 49II. Phase I1. OxydationExemples dox:509. Sulfoxydation : Processus mtabolique gnral des phnothiazines.

Aboutit la formation du sulfoxide correspondant puis de la sulfone.

Les flavines oxydases prendraient par aussi ce mcanisme(2).Exemples doxydations microsomales:

50II. Phase I1. OxydationExemples dox:5110. N. Hydroxylation :

Exemples doxydations microsomales:

51II. Phase I1. OxydationExemples dox:5211. Dsulfuration oxydative : Exemples doxydations microsomales:

Remplacement dun soufre par un oxygne. Thiopental : cest un barbiturique : La dgrdation en mtabolites inactifs est hpatique, leur limination est rnale.52II. Phase I1. OxydationExemples dox:5312. Dshalognation oxydative : Exemples doxydations microsomales:

DDT : insecticide lipophile.

Oxydation par les MFOs. Devient DDD non toxique aux insectes mais demeure lipophile aprs la dhalognation : dpart dune molcule de chlore. 53II. Phase I1. OxydationExemples dox:5412. Dshalognation oxydative :

Le chloroforme peut former loxychlorure doxygne (phosgne) toxique (2).

Exemples doxydations microsomales:

5455Exemples doxydations non microsomales:II. Phase I1. OxydationExemples dox:56Oxydation des amines : Les amines oxydases les transforment en aldhydes.

Dhydrognation des alcools : Par ALDH et ADH.Exemples doxydations non microsomales:Les ractions sont dtailles dans la partie d. Dhydrognases. 56572. Reduction :II. Phase I2. ReductionExemples dox:58Les ractions de rduction sont peu courantes. peuvent impliquer des enzymes microsomales CYP450.

Ces ractions sont beaucoup plus intenses chez les bactries intestinales que dans les tissus des mammifres.

La rduction du prontosil en sulfanilamide en est un exemple remarquable.

Rductions microsomales:58II. Phase I2. ReductionExemples dox:591. Rduction des drivs nitrs en une amine :Assure par la nitrorductase.

Rductions microsomales:

59II. Phase I2. ReductionExemples dox:602. Rduction des drivs azoiques en amines:

Assure par lazorductase.

Azobenzne => aniline.

R-N=N-R => R-NH2 + R-NH2.

Rductions microsomales:

60II. Phase I2. ReductionExemples dox:61 Cest la raction reverse des dshydrognase. Rductions non microsomales:61623. Hydrolyse :II. Phase I3. Hydrolyse:63De nombreux xnobiotiques peuvent subir des hydrolyses sous leffet destrases et damidases.

Ces enzymes se trouvent dans les tissus, et le plasma des mammifres.

63II. Phase I3. Hydrolyse:64A. Estrases (2): Regroupes en 4 catgories:1. Aryl estrases: hydrolysant les esters aromatiques.2. Carboxyl estrases: les esters aliphatiques.4. Actyl estrase : hydrolyse les esters dont la moiti acide est lacide actique. 5. Choline estrases: les esters dont le rsidu est un alcool.

64II. Phase I3. Hydrolyse:65B. Amidases (2): Contrairement aux estrases, les amidases ne peuvent tre classes en fonction de leur spcificit pour leur substrat. De plus, l'hydrolyse enzymatique des amides se produit beaucoup plus lentement que celle des esters, probablement par manque de spcificit. 65II. Phase I3. Hydrolyse:66Exemples dhydrolyse (2) :

66II. Phase I3. Hydrolyse:67Linhibition ou lactivation de ces enzymes peut entrainer une toxicit :

Ex : Les OP agissent par inhibition de lAch Esterase. 6768III. Phase IIIII. Phase II69Dfinies par la liaison covalente dune molcule endogne (polaire) un groupement fonctionnel dune molcule substrat (hydrophobe).

Certains substrat contenant un groupement fonctionnel appropri puisse directement subir la phase II du mtabolisme.

Mais la conjugaison se produit souvent conscutivement une raction de phase I.69III. Phase II70C'est la forme de conjugaison la plus courante et la plus importante.

1. Glucuroconjugaison:Molcule endogneAcide glucuronique.Forme active : l'UDPGA (acide uridine-5'-diphospho-a-D-glucuronique).

Enzyme et localisationUDP-glucuronyltransfrase (UGT): localise dans le rticulum endoplasmique. Foie, rein , intestin.Deux familles: UGT1,2. Les UGT sont impliques dans la dtoxification des endobiotiques (ex. bilirubine, thyroxine, strodes) et des xnobiotiques .SubstratAlcools aliphatiques ou aromatiques,Acides carboxyliques,Composs soufrs ,Amines.

70III. Phase II71La raction aboutira la formation de S, O, N glucuronides polaires, limins dans la bile et les urines.

Lhydrolyse du conjugu cause du PH urinaire ou cause des Bta-glucoronidases des bactries intestinales gnrent des molcules toxiques. Ex : 2-naphtyl amine ; libration dion nitrnium lectrophile cancrogne (2-naphtyl hydroxyl amine). 1. Glucuroconjugaison:

71III. Phase II72Devenir des glucuronides :

PM < 250 : limination urinaire.PM > 250 : excrtion biliaire, limination fcale ou hydrolyse par les -Glucoronidases intestinales.

1. Glucuroconjugaison:2 naphtyl amine : Ar-NOH glucuronide Ar-NHOH Ar-N+ OH- ion nitrnium lectrophile cancer.

Ce toxique a t aborder dans le cours facteur influenant.72III. Phase II732. Sulfoconjugaison:Molcule endogne Sulfate.Forme active: PAPS (3-phosphoadnosine-5'-phosphosulfate).

Enzyme et localisationSulfotransfrase : localises dans le cytosol du foie, rein, intestin.03 familles (SULT 1,2,3) : 16 isoformes/ Substratsles phnols, les alcools aliphatiques et les amines aromatiques.

Mtabolisme du paractamol : production de mtabolites ractifs : Le paractamol peut suivre deux voies mtaboliques(figure 1). La premire (voie mtabolique prdominante aux doses thrapeutiques) consiste en une conjugaison (glucuroconjugaison ou sulfoconjugaison) et la seconde (voie mtabolique accessoire aux doses thrapeutiques) en une oxydation par les cytochromes P450. Cette oxydation aboutit la formation de mtabolites lectrophiles. Des arguments exprimentaux suggrent que l'un de ces mtabolites, la N-actyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), est responsable de l'hpatotoxicit du paractamol [7].L'ingestion de fortes doses de paractamol dpasse rapidement les capacits de conjugaison et s'accompagne donc d'une saturation de la voie mtabolique principale. Le paractamol est alors largement mtabolis par la voie mtabolique accessoire (dpendant des cytochromes P450). La production de quantits importantes de mtabolites ractifs par cette voie est responsable de lsions hpatocytaires.Mcanismes de l'hpatotoxicit des mtabolites ractifsPlusieurs mcanismes, habituellement associs, peuvent expliquer la toxicit hpatique des mtabolites ractifs du paractamol.Le premier correspond la fixation covalente des mtabolites ractifs (lectrophiles) des protines cytosoliques et microsomales [8] qui s'accompagne d'altrations fonctionnelles de ces protines. Elle semble contribuer l'hpatotoxicit du paractamol sans en tre la seule responsable [9].Le deuxime mcanisme correspond une dgradation (peroxydation) des lipides membranaires. Les altrations membranaires qui en rsultent peuvent aboutir la ncrose des hpatocytes.Le troisime mcanisme correspond une inhibition des calcium translocases (lie l'oxydation des thiols protiques). Les calcium translocases de la membrane plasmique rejettent en permanence du calcium hors de la cellule, maintenant ainsi une concentration faible de calcium intracellulaire. Leur altration aboutit une importante lvation de la concentration cytosolique de calcium, elle-mme responsable de l'activation d'endonuclases, de phospholipases et de protases calcium-dpendantes. Ces enzymes ainsi actives induisent des lsions des composants cellulaires. L'inhibition des calcium translocases est favorise par la dpltion en glutathion intracellulaire [7]. Enfin, une autre consquence de l'oxydation des thiols protiques par des mtabolites ractifs est une permabilisation de la membrane mitochondriale interne, responsable de perturbations des fonctions mitochondriales.

73III. Phase II743. Mthylation :Molcule endogneCH3Forme active s adnosyl mthionine. Enzyme et localisation N. Mthyltransfrases. S. Met transfraseO. Met transfrase.06 isoformes.SubstratPhnol, amine, thiol, As.

O. Met trans : COMT cathcol met transfrase. s. Met trans : TPMT thiopurine mthyl transfrase. 74III. Phase II75Les produits mthyls ne sont pas ncessairement plus hydrosolubles. 3. Mthylation :75III. Phase II764. Actylation :Molcule endogneActyl : CO-CH3Forme active Actyl CoA.Enzyme et localisationN-actyltransfrases : cytosoliquefoie ,intestin ,rein ,poumon. 2 isoformes :NAT1 et NAT2SubstratDes amines aromatiques primaires, Des hydrazides, Des sulfonamides, Certaines amines aliphatiques primaires.

76III. Phase II77A cause du polymorphisme gnrique, certains individus sont des actyleurs rapides, dautres des actyleurs lents.

Les actyleurs lents seraient plus sensibles lapparition de cancer dus aux amines aromatiques.

Les mtabolites actyls sont limins de lorganisme par excression rnale.

4. Actylation :77III. Phase II78Mais pour lisoniaside lactylation produit des composs moins hydrosolubles, qui se cristalisent au niveau rnal : nphrotoxicit (!).

Les effets secondaires neurologiques seraient plus importants chez les actyleurs lents (12). 4. Actylation :Lisoniazide (INH), hydrazide de lacide isonicotinique : Le mtabolisme de lINH est hpatique et aboutit descomposs pour la plupart inactifs. La voie principaleest lactylation, essentiellement hpatique et plus faiblementintestinale. Celle-ci aboutit la formation toutdabord dactylisoniazide qui sera ensuite scind enmonoactylhydrazine et acide isonicotinique. La monoactylhydrazinesera aussi actyle en diactylhydrazine.Une faible partie de lINH est transformedirectement en hydrazone.

78III. Phase II795. Conjugaison au glutathion:Molcule endogneGlutathion tripeptide : ac glutamique cystine-glycineEnzyme et localisationglutathionS-transfrases . Au moins 5 sous-familles, 20 isoformes :A1 ,A2 M1 ,M2. cytosol (A,M P T )+ RE (Z) + noyausurtout foie ,reins ,poumon ,intestinSubstrat grande varit de composs environnementaux (carcinognes (ex :benzo[a]pyrne) mdicaments :Paractamol ,anticancreux (alkylants).= les lectrophiles

Le glutathion est un nuclophile pigeant les lectrophiles.79III. Phase II80De nombreux mtabolites lectrophiles se forment au cours de la biotransformation des toxiques:

Certains de ces mtabolites peuvent ragir avec des constituants cellulaires et causer la mort de la cellule ou induire la formation de tumeurs.

La fonction du glutathion (nuclophile) est de ragir avec ces mtabolites lectrophiles et de prvenir ainsi leurs effets nocifs sur les cellules.

5. Conjugaison au glutathion:80III. Phase II81L'exposition de grandes quantits de ces mtabolites ractifs peut diminuer la quantit de glutathion disponible et provoquer des effets toxiques marqus.

Ex : Le 3-mthylindole est bioactiv principalement dans les poumons, et aprs avoir abaiss la teneur en glutathion, produit des lsions pulmonaires (1). 5. Conjugaison au glutathion:Lescatolou 3-mthylindole est uncompos organiquelgrementtoxique. Il est naturellement prsent dans les excrments (c'est un mtabolite dutryptophanedans le tube digestif des mammifres) ainsi que dans legoudron de houilleet a une forte odeur fcale. une pneumotoxine qui affecte la synthse des phospholipides ncessaires pour la production membranaire. 81III. Phase II82Certains conjugus du glutathion peuvent tre toxiques (1).

5. Conjugaison au glutathion:82III. Phase II83 Conjugaison desacidesamins. Cette conjugaison est catalyse par des acides amins dj conjugus et le coenzyme A.

Les acides carboxyliques aromatiques, Les acides arylactiques, Les arylacides aryl-substitus,

Peuvent former des conjugus avec desaaminoacides, principalement la glycine, mais aussi avec la glutamine(1).

6. Conjugaison aux acides amins :

Liason entre le groupemet carboxylique du xnobiotique et 83III. Phase II847. Conjugaison thiocyanique (15):Molcule endogneThiosulfate Na2S2O3.Enzyme et localisationRhodanse = transulfurase. Mitochondrie.Substrat Cyanure : assure leur dtoxification en thiosulfate. Raction Na2S2O3+ CN-SCN-+ Na2SO384IV. Phase III85Les transporteurs membranaires facilitent la capture ou lefflux des composs endognes, dions et de xnobiotiques travers la membrane cellulaire.

Ils influencent par consquent la biodisponibilit des xnobiotiques dans lorganisme en participant leur absorption, leur distribution et leur limination (10).

85IV. Phase III86Les transporteurs sont diviss en deux catgories:La superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette) :

Des pompes defflux qui dpendent de lhydrolyse de lATP afin dactiver le passage des substrats au travers des membranes biologiques.

Limitent laccumulation de composs cytotoxiques.

Les transporteurs ABC incluent larchtype P-glycoprotine (P-gp ou Multidrug resistance protein 1 [MDR1] (10).

86IV. Phase III87La superfamille des transporteurs de soluts (solute carriers [SLC]):

Assurent gnralement la capture cellulaire des nutriments comme le glucose ou les acides amins, soit par mcanisme de transport passif ou actif.

Jouent un rle prononc dans la pharmacocintique (absorption, distribution et limination) dun large panel de mdicaments, toxines, composs endognes et de leurs mtabolites (10).87IV. Phase III88Les transporteurs defflux rduisent la charge locale cellulaire de composs toxiques, renforant ainsi la protection de la cellule contre les effets toxiques.

Ces transporteurs sont essentiellement exprims dans la membrane apicale des cellules pithliales (comme les entrocytes) qui sont exposes aux xnobiotiques. => phase III : transport de lefflux, ou extrusion (10). 8889V. Facteurs de variabilit de la biotransformation :Causes de variation du mtabolisme (5): 1. Polymorphisme: Le niveau dactivit enzyamtique est soumis une rgulation gntique.

Les mutations des gnes codant pour une enzyme peuvent donner lieu des variations : lactivit de lenzyme peut tre plus leve, plus basse ou nulle.

V. 1. Facteurs modifiant les ractions de Phase ICyt P45090Le polymorphisme divise la population en deux catgories de mtaboliseurs : Les mtaboliseurs lents;Les mtaboliseurs rapides ou extensifs.

Cyt P45091V. 1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IMtaboliseurs lents : En cas de dtoxification : Il se produit une accumulation de la molcule.

Pour les mdicaments a entrainera lapparition deffets indsirables, voir de surdosage.

En cas de toxification : Absence deffets.

II. Phase I1. OxydationCyt P45092V. 1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IMtaboliseurs rapides :

En cas de dtoxification : pas de rponse.

En cas de toxification : Accumulation du mtabolite toxique dans lorganisme.

II. Phase I1. OxydationCyt P45093V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IRponse absente dans le cas ou le mtabolisme est une dtoxification. Leffet des pro-drogues est augment, avec un risque de majoration de leffet.

932.ge : A. Nouveau n : A la naissance, la concentration totale des cytochromes P450 hpatiques reprsente 30% du niveau adulte.Le CYP 3A7 chez le feotus, joue le role du CYP 3A4 chez ladulte.

B. Personne age : Linfluence de lge sur les cytochromes reste controverse. De plus, elle est difficile tudier en raison des variations interindividuelles non dpendantes de lge.Cyt P45094V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I3. Sexe : La diffrence dactivit enzymatique entre les hommes et les femmes peut sexpliquer par la prsence dhormones strodes, comme les oestrognes et la progestrone en plus grande quantit chez la femme.

Les hormones strodes semblent activer les CYP 3A4 (substrat endogne).

De plus, il a t prouv que les contraceptifs oraux peuvent influencer le mtabolisme de certains mdicaments en inhibant par un mcanisme suicide les cytochromes P450, et en particulier le CYP 3A4.Cyt P45095V. 1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I4. Obsit : Les tudes ont montr que leffet de lobsit sur les cytochromes P450 tait fonction des isoenzymes.

Les rsultats les plus concluants ont t rapports pour le CYP 3A4 et pour le CYP 2E1 :

Pour le CYP 3A4, lactivit est diminue.

A linverse, lactivit du CYP 2E1 est augmente.Cyt P45096V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase ICYP450 3A4 : activit diminu en cas dobsit :

Des doses usuelles de mdicaments administres des patients obses peuvent entraner une toxicit, alors que des doses usuelles de prodrogues peuvent entraner une absence deffet thrapeutique.

965. Pathologies hpatiques : Les effets sont plus marqus avec la cirrhose quavec une hpatite chronique et une cholestase.

Les maladies hpatiques rduisent lactivit des cytochromes de faon spcifique.

Ex : en cas de cirrhose quelque soit sa gravit 1A diminue. Le cyp 2C semble tre moins affect par les pathologies hpatiques. Cyt P45097V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. Inhibition du CYP450 :

Certaines substances ont la capacit dinhiber le CYP450.

Linhibition est gnralement spcifiques dune isoenzyme .Phnomne plus dangereux que linduction.Cyt P45098V. 1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions :

Essentiellement 3 tapes au niveau du cycle du cytochrome sont particulirement vulnrables linhibition :

Ltape 1 quand le substrat se fixe sur lenzyme.Ltape 3 quand loxygne molculaire se fixe sur le fer ferreux. Ltape 6 quand la molcule doxygne est transfre sur le substrat.Cyt P45099V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : Mcanismes de linhibition :

Rduction de synthse ou augmentation du catabolisme;

Lintroduction dans la membrane du REL de substances dsorganisant les structures de la mbr.

De la fixation sur le groupement hme du CYP450 de molcules bloquant le cycle catalytique.Cyt P450100V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : Types dinhibitions :

Rversible

Irreversible.

Cyt P450Comptitive. NON Comptitive. 101V. 1.Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition rversible : Les plus puissants inhibiteurs rversibles ont dans leur structure chimique des groupements :

imidazoles, pyridines ou quinoliques.

La fonction du cytochrome est restaure aprs limination par lorganisme de linhibiteur (il t li par une liaison faible).Cyt P450102V. 1.Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition rversible : Comptitive : La liaison de linhibiteur empche la fixation du substrat sur le site actif de lenzyme car linhibiteur a une plus forte concentration au niveau du site actif.

Une substance inhibitrice dune enzyme nest pas ncessairement le substrat de cette enzyme.

Se produit et sestompe rapidement car aucune synthse enzymatique nest requise. Cyt P450103V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition rversible : Non comptitive : La liaison se fait sur un site diffrent du site actif et ne bloque pas la fixation du substrat.

Entrane une modification de la conformation tridimensionnelle de lenzyme la rendant ainsi non fonctionnelle.Cyt P450104V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition rversible :

Exemples dinhibition rversible : Cimtidine.Antifongiques azols (CYP3A).Jus de pamplemousse (CYP3A intestinale).

Cyt P450105V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I6. CYP450 et interactions : 1. B. Inhibition irreversible :

Certains agents peuvent tre oxyds par le cytochrome en intermdiaire ractif qui va provoquer une inactivation irrversible (destruction).

Substrat suicide: intermdiaires ractifs se lient de faon covalente lhme, la protine ou aux deux.

Un phnomne rapide, dose et temps dpedant.

La synths de nouvelle enzymes est ncessaire pour restaurer lactivit. Cyt P450106V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IEn gnral la modification de lhme inactive le cytochrome alors que laltration de la protine diminue lactivit catalytique, seulement si ce sont des acides amins essentiels pour la liaison du substrat, le transfert de llectron et lactivation de loxydation (15).

Cette interaction a t dcouverte par hasard il y a une quinzaine danne, alors que leschercheurs tudiaient linteraction entre la flodipine, un antagoniste calcique, avec lalcool.Le jus de pamplemousse tait utilis pour masquer le got de lthanol. A la surprise deschercheurs, la concentration sanguine de la flodipine fut trs fortement augmente. Depuisla dcouverte en 1989, de la premire interaction du jus de pamplemousse avec unmdicament, de nombreuses tudes ont t menes. Malgr limportance clinique de cetteinteraction, elle demeure encore mconnue.

Du a des flavonoides et des furanocoumarine. 1066. CYP450 et interactions : 1. B. Inhibition irreversible :

Exemples dinhibition irreversible : Ethymyloestradiol : (3A4).Chloramphnicol : (2B, 2C). Cyt P450107V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IEn gnral la modification de lhme inactive le cytochrome alors que laltration de la protine diminue lactivit catalytique, seulement si ce sont des acides amins essentiels pour la liaison du substrat, le transfert de llectron et lactivation de loxydation (15).

Cette interaction a t dcouverte par hasard il y a une quinzaine danne, alors que leschercheurs tudiaient linteraction entre la flodipine, un antagoniste calcique, avec lalcool.Le jus de pamplemousse tait utilis pour masquer le got de lthanol. A la surprise deschercheurs, la concentration sanguine de la flodipine fut trs fortement augmente. Depuisla dcouverte en 1989, de la premire interaction du jus de pamplemousse avec unmdicament, de nombreuses tudes ont t menes. Malgr limportance clinique de cetteinteraction, elle demeure encore mconnue.

Du a des flavonoides et des furanocoumarine. 1076. CYP450 et interactions : 2. Induction enzymatique/Mcanisme : Cyt P450TranscriptionelPost-transcriptionnelAugmentation de la transcription d'un gne (ADN) en ARNm codant la synthse des CYPs Plus rare, se fait en ralentissant la dgradation et llimination des CYPs. 108V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase ILes inducteurs ne sont pas gnralement spcifiques dune isoenzyme donne, mais ils activent de trs nombreux systmes enzymatiques.

1086. CYP450 et interactions : 2. Induction enzymatique :

En cas de dtoxification : La concentration plasmatique du substrat est notablement rduites ( de la tox).

En cas de toxification : Le mtabolite actif saccumule dans lorganisme ( de la tox).

Cyt P450109V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I1096. CYP450 et interactions : 1. Induction enzymatique :

Linduction enzymatique est un phnomne:

Non spcifique (activent de trs nombreux systmes enzymatiques); Progressif (dans son apparition et sa disparition), Non immdiat ;Rversible.Cyt P450110V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I1106. CYP450 et interactions : 1. Induction enzymatique : Ex : Millepertuis: lhyperforine: acclre la synthse CYP3A4.Phnobarbital : (2C ,2D6 ,3A). Ethanol : (2 E1). Fume de cigarette : (1A).

Cyt P450111V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I111Figure. Exemples dinducteur et dinhibiteur des isoforme CYP450 (11)Cyt P450112V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I

1122. variabilit alcool dhydrognase ADH :

ADH2 :3 variants : => 1 forme sauvage ADH2*1.=> 2 formes atypiques ADH2*2 ,ADH2*3 : activit.

Dhydrognases:113V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase I113 Dhydrognases:114

V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase IChez les Caucasodes, lADH2*1 est prdominant alors que cest lADH2*2 chez les Asiatiques. Les Caucasodes partagent frquence gale les ADH3*1 et ADH3*2 alors que lallle ADH3*1 prdomine chez les sujets asiatiques ou afro-amricains.

114 Dhydrognases:115V.1. Facteurs modifiant les ractions de Phase ISi les deux allles sont muts, une accumulation dactaldhyde va se produire; Apparition du syndrome de Flushing :

raction dintolrance = effet antabuse (vasodilatation, tachycardie, sueur, nause, vomissement, intolrance alcool, protection contre alcoolisme )

Chez les Caucasodes, lADH2*1 est prdominant alors que cest lADH2*2 chez les Asiatiques. Les Caucasodes partagent frquence gale les ADH3*1 et ADH3*2 alors que lallle ADH3*1 prdomine chez les sujets asiatiques ou afro-amricains.

1151. glucuroconjugaison : Espces : les chats nont pas dUGT. Age : elle est faible la naissance (ictre du n.n)Environnement:Induction par HAP ,phnobarbital ,thanolPolymorphisme gntiqueNB : bilirubine UGT1homme :mutation sur UGT1A1 : hyperbilirubinmiesyndrome de Gilbert et syndrome de crigler Najar (mortel la naissance)116V.2. Facteurs modifiant les ractions de phase II2. Glutathion :

Induction :HAP ,phnobarbital...Polymorphisme gntique :M1 ,P1 ,T1 ,M3117V.2. Facteurs modifiant les ractions de phase II3. Actylation : Espces : chien :pas pour amines I.

souris :3 isoformes.

Polymorphisme gntique :NAT2 :9 mutation dtectes dont 4 ont une activit trs faible :phnotype actyleur lent118V.2. Facteurs modifiant les ractions de phase II4. Sulfoconjugaison :

porc : pas de sulfconjugaison.Polymorphisme gntique. 119V.2. Facteurs modifiant les ractions de phase II5. Mthylation :

polymorphisme sur TMPT.caucasiens : 11% mthyleurs lents.1 personne/300 :activit nulle.120V.2. Facteurs modifiant les ractions de phase II121VI. Rsultats de la biotransformation et Bioactivation:VI. Rsultats de la biotransformation et Bioactivation:122Dans la majorit des cas le mtabolisame aboutit une dtoxification, et une limination.

Les produits forms sont pharmacologiquement moins efficaces et de toxicit diminue. 122VI. Rsultats de la biotransformation et Bioactivation:123Pour les mdicaments, il est possible que le mtabolite form soit plus actif que la molcule mre.

Ex : Dsipramine (forme par N-dmthylation de limipramine) de plus forte proprit antidpressive (2).

123VI. Rsultats de la biotransformation et Bioactivation:124Mais, certains composs chimiquement stables peuvent tre convertis en mtabolites ractifs.

Ces ractions sont gnralement catalyses par des monooxygnases cytochrome P-450, mais d'autres enzymes, y compris ceux de la flore intestinale, interviennent dans certains cas (1). 124IV. La Bioactivation:125Les ractions de bioactivations :

Autres voies Epoxydation N. HydroxylationRadicaux libres et ions superoxydesVI. Rsultats de la biotransformation et Bioactivation:125VI. La Bioactivation:126Les CYP 450 peuvent produire la conversion de nombreux composs aromatiques en epoxydes.Ex : Aflatoxine B1 ; Benzne ; Benzo [a] pyrne ; Furosmide ; Polychlorobiphnyl ; Trichlorthylne ; Chlorures de vinyl. 1. Epoxydation :126VI. La Bioactivation:127Lepoxydation se produit principalement au niveau hpatique.

Les mtabolites forms contractent des liaisons covalentes avec les macromolcules cellulaires : provoquent des ncroses et des cancers (2). 1. Epoxydation :127VI. La Bioactivation:128Certains mtabolites hydroxyls forment aussi des liasons covalentes peuvent tre lorigine de cancers et de ncrose tissulaires.

Les mtabolites N.Hydroxyls des amines aromatiques peuvent induire une hmolyse ou une mthmoglobinmie (2). 2. N. Hydroxylation:128VI. La Bioactivation:129Au cours du mtaboisme rductif de certains xnobiotiques (nitrobenzne, aniline, anticancreux de de la classe des anthraquinone), se forment des structures intermdiaires radicalaires.

Anions superoxydes, peroxyde dhydrogne, radical hydroxyl.

Les radicaux se lient de faon covalente avec les protines et les lipides insaturs=> peroxydation des lipides et une srie de phnomnes toxiques (2). 3. Radicaux libres et ions superoxydes:Anticancreux la classe des anthraquinones : 129VI. La Bioactivation:130Dsulfuration : Parathion => paraoxon : OP inhibiteurs plus puissant de la choline estrase.

La dhydrognation de lthanol entraine la formation de lactaldhyde impliqu dans certaines manifestations toxiques de lthanol.

4. Autres voies : Toxicit du thalidomide. 130VI. La Bioactivation:131 Certains composs peuvent subir une activation dans le tube digestif:

Ex: les nitrites et certaines amines peuvent former des nitrosamines.

les nitrates, qui peuvent tre convertis en nitrites et induire de la mthmoglobinmie.

4. Autres voies : Toxicit du thalidomide. 131VI. La Bioactivation:132La glucuroconjugaison est une raction de dtoxification,

Les substances glucuroconjugues sont facilement xcrts, et ont moins dactivit biologique ou chimique par rapport la molcule mre.

Cependant certains glucuronides ayant une ctivit chimique lectrophile peuvent tre impliqus dans des ractions pharmacologiques ou toxicologiques (14).

Ex : N-O glucuronide de lacide hydroxamique (N-hydroxy-N-acetyl-arylamines) et les acyl glucuronides de lacide carboxylique (14).

4. Autres voies : Larticle (14) : The potentially wide scope will be limited to glucuronides with intrinsic activity, excluding those that contribute to toxicity indirectly through their hydrolysis and subsequent bioactivation by other enzyme systems (e.g. O-glucuronides of polycyclic aromatic hydrocarbons dihydrodiols, and N-glucuronides of arylamines).132VI. La Bioactivation:Figure : (6) Rpartition des ractions formant des mtabolites ractifs et/ou toxiques pour les mdicaments. Bernard Testa & al. Foundation review: Reactions and enzymes in the metabolism of drugs and other xenobiotics. Drug Discovery Today Volume 17, Numbers 11/12 June 2012.

133The colour code is as follows: Redox reactions blue; hydrolyses yellow; conjugations red. Alternating dark and light fields are used simply for graphical clarity.133134VII. Interet de la connaissance de la biotransformation :VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :135AnalytiqueThrapeutiqueToxicologique135VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1361. Thrapeutique :

Permet dviter les interactions mdicamenteuses (inhibition/induction enzymatique).

=> Minimiser les risques de toxicit et dechec thrapeutique.

ADH plus daffinit pour lthanol que pour le mthanol, ce dernier est toxiques par ses mtabolites. 136VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1371. Thrapeutique :

mdicamentMtaboliteactifinactifprodrogueactifactifactifactiftoxique137VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1381. Thrapeutique : Elle permet aussi de choisir les traitements efficaces en cas dintoxication :

Ex : thanol en cas dintoxication par mthanol.

ADH plus affine pour lethanol que le mthanol, en plus les mtabolites issus de son action sur lthanol(acide actique) sont moins toxique que ceux du mthanol (acide formique).

Phnobabital : ictre du n n, maladie de Gilbert.

ADH plus daffinit pour lthanol que pour le mthanol, ce dernier est toxiques par ses mtabolites. 138VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1391. Thrapeutique :

Les tudes biochimiques pour la conception de nouvelles molcules mdicamenteuses doivent tre plus attentives quant la formation de mtabolites chimiquement ractifs (dsipramine ) ou toxiques (paractamol en PAQI) au cours de essais cliniques et mme en post-commercialisation (6). 139VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1402. Analytique : Quantification des mtabolites :

La mtabolisation de la molcule mre va rendre difficile sa dtection dans les liquides biologiques.

La recherche des mtabolites trouve alors tout son intret. 140VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1412. Analytique : En analyse chromatographique :

Ex : limipramine donne plusieurs mtabolites. Sa chromatographie est complexe.

En cas dabsorption massive lors dune intoxication aigue, on trouve :

un spot produit absorb.une srie de taches dintensit variable divers mtabolites.

141VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1422. Analytique :

Les liquides daspiration ou de lavage gastrique offre un avantage car ils renfrment les molcules non mtabolises. 142VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1433. toxicologique :

Permet de dterminer les ractions de toxification et de dtoxification des substances toxiques. 143VII. Intret de la connaissance de la biotransformation :1443. toxicologique : Bioactivation : Paractamol en NAPQI (oxydation).2-naphtylamine en 2 naphtylhydroxylamine responsable de cancer vsical (oxydation).

Dtoxification (la plus frquente) : Paraoxon en paranitrophnol (hydrolyse). Phnol en phnol glucuronide (glucuroconjugaison).Cyanure en thiocyanate. 144145VIII. Exploration de la biotransformation :VIII. Exploration de la biotransformation :146In vivoIn vitroIn silico146VIII. Exploration de la biotransformation :147Ligne directrice de lOCDE N417 toxicocintique-mtabolisme (7) :

Permet didentifier les mtabolites produits aprs ladministration du substrat.

In vivo147VIII. Exploration de la biotransformation :148Protocole : Espce : les meme espces utilises dans les autre essai de toxicit: rat;

ge et souche: jeune adulte sain 6 a 12 semaines au moment de ladministration de la dose.

Nombre et sexe des animaux: au minimum 4 animaux du mme sexe. (il convient de justifier le sexe des animaux employs).

In vivoLutilisation danimaux des deux sexes (quatre mles et quatre femelles) est envisage sil existe des lments attestant de diffrences de toxicit notables en fonction du sexe.

148VIII. Exploration de la biotransformation :149Hbergement: Placs dans des cages individuelles pendant la priode dessai*. Substance dessai : radiomarque au 14C**.

Choix des doses : Etude pilote : dose orale unique, non toxique, sufisamment leve pour permettre lidentification des mtabolites dans les excrta.Etude principale : au minimum deux doses de prfrence***. Lorsque deux doses sont administres, elles sont toutes deux suffisamment leves pour permettre lidentification des mtabolites dans les excrta.

In vivo*Lencagement collectif se justifie dans des situation particulire.

**On peut se passer de la radioactivit sil peut tre dmontr:Il est possible de le faire avec une substance non radioactive. Si la spcificit et la sensibilit de la substance sont gale ou suprieure celle des substances radiomarques.

***car les informations runies partir dau moins deux groupes de dose peuvent faciliter la dtermination des doses pour dautres tudes de toxicit .ainsi que lvaluation de la relation dose-effet dessais de toxicit dj disponibles.

149VIII. Exploration de la biotransformation :150On recueille les excrta (et, le cas chant, le plasma) afin didentifier et de quantifier la substance dessai et ses mtabolites.

Identifier tous les mtabolites prsents hauteur de 5 % ou plus de la dose administre et pour fournir un schma mtabolique de la substance dessai.

In vivo150VIII. Exploration de la biotransformation :151Identification des mtabolites : Chromatographie gazeuse/spectromtrie de masse (CG-SM), Chromatographie liquide/spectromtrie de masse (CL-SM), Chromatographie liquide/spectromtrie de masse en tandem (CL-SM/SM), Spectromtrie par RMN, Peuvent fournir une identification non ambigu.In vivo151VIII. Exploration de la biotransformation :152La ligne directrice OCDE estime que ltude de linduction et de linhibition enzymatique est ncessaire dans certaines situations particulires. In vivo*1. lorsque des lments indiquent une relation entre la biotransformation de la substance dessai et laugmentation de la toxicit; 2. lorsque les donnes de toxicit disponibles indiquent une relation non linaire entre la dose et le mtabolisme; 3. si les tudes sur lidentification des mtabolites rvlent un mtabolite potentiellement toxique qui pourrait tre le produit dune voie enzymatique induite par la substance dessai; 4. pour expliquer des effets a priori lis des phnomnes dinduction enzymatique; 5. si lon observe des modifications toxicologiques importantes dans le profil mtabolique de la substance dessai, dans le cadre dexpriences in vitro ou in vivo menes sur diffrentes espces ou dans diffrentes conditions, il peut tre ncessaire de caractriser lenzyme ou les enzymes impliques (par exemple, des enzymes de phase I comme les isoenzymes constituant le systme des mono-oxygnases cytochrome P 450, des enzymes de phase II comme les isoenzymes de la sulfotransfrase ou de luridine diphosphate glucuronosyltransfrase, ou tout autre enzyme pertinente). Ces informations peuvent servir valuer la pertinence des extrapolations interespces.

152VIII. Exploration de la biotransformation :153Permettent de dterminer la voie mtabolique implique dans la biotransformation dune substance. In vitro153VIII. Exploration de la biotransformation :1541. Les enzymes recombinates : Obtenue partir de lADNc, exprimes sur diffrents types cellulaires.

Offre un systme enzymatique individuel permettant dtudier le mtabolisme de la substance et les interactions.

Toutefois, en raison de l'absence de voies mtaboliques comptitives dans ces systmes, il est impossible d'obtenir des donnes sur la contribution relative de l'isoforme en question sur le mtabolisme global in vivo.

In vitro154VIII. Exploration de la biotransformation :155On trouve maintenant sur le march des prparations recombinantes purifies pour la plupart des enzymes du mtabolisme :

CYP co-exprims avec cytochrome P450 rductase et optionnellement cytochrome b5, UGT, mono-oxygnases flavine, poxyde hydrolase et glutathion S-transfrases.

In vitro155VIII. Exploration de la biotransformation :1562. Fraction cellulaire : Englobe les microsomes, dautres organelles cellulaires.

Comporte : les microsomes, fraction S9 (contient des enzymes microsomiales et des enzymes cytosliques), la fraction cytosolique S100 (comporte 3 enzymes solubles de la phaseII).

3. Culture cellulaire et organes perfuss, etc. In vitroS100 : les N-actyltransfrases, gluthathion-S-transfrases et sulfo-transfrases.156VIII. Exploration de la biotransformation :157In vitro

S100 : les N-actyltransfrases, gluthathion-S-transfrases et sulfo-transfrases.157VIII. Exploration de la biotransformation :158Identification des enzymes responsables des ractions de biotransformation (10) :

Plusieurs approches existent pour tudier le mtabolisme in vitro (phnotypage), et une combinaison de mthodes est souvent ncessaire.In vitro158VIII. Exploration de la biotransformation :1591. test de comptence (enzyme recombinantes): Determiner lisoforme responsable du mtabolisme de la molcule.

Par incubation de la substance avec des isoformes diffrents et une seule concentration.In vitro159VIII. Exploration de la biotransformation :1602. Test dinhibition: Une seconde approche implique des incubations menes dans des fractions subcellulaires ou ventuellement en culture cellulaire, et lutilisation dinhibiteurs chimiques et/ou des dimmuno-inhibiteurs slectifs de voies enzymatiques spcifiques.

Incubations avec diffrents inhibiteurs en comparant les taux relatifs de mtabolisme, permet didentifier quel inhibiteur rduit significativement le mtabolisme global et ainsi dcouvrir la voie mtabolique. In vitro160VIII. Exploration de la biotransformation :1613. Test de correlation:

En utilisant la mme banque de microsomes, le test de corrlation se fait entre des activits spcifiques dtermines pour chaque enzyme et les activits obtenues pour la sustance tester.

Une corrlation significative dmontre limplication de lisoforme. In vitro161VIII. Exploration de la biotransformation :162Extrapolation in vivo in vitro:

Extrapolations restent semi-quantitatives compte tenu des difficults de la prise en considration des facteurs de variabilits physiologiques (flux sanguin hpatique, fixation aux protines plasmatiques, mtabolisme extrahpatique )(10).

162VIII. Exploration de la biotransformation :163Anticiper la biotransformation de tout compos donn (6).

Expertise humaine reste certainement irremplaable, mais son efficacit peut tre grandement amliore par des mthodes in silico visant fournir des prvisions fiables mais ne sont pas ncessairement infaillibles (6).

In silico163La biotransformation des xnobiotiques est un phnomne majeur de dtoxification, mais qui peut aussi entrainer la formation dentit plus ractive.

Sa connaissance est primordial pour tout xnobiotique. 164IX. CONCLUSION : 165

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166BIBLIOGRAPHIE : 166