5-fluorouracil (my5-fu™) assay - mycare tests

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My5-FU™ Reagents © 2017 Saladax Biomedical, Inc. English 1 My5-FU™ is a trademark of Saladax Biomedical, Inc. Printed in USA PI 5FU-RGT, 18 October 2017, revision 09 5FU-RGT 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay This package insert must be read carefully prior to product use. Package insert instructions must be followed accordingly. Reliability of assay results cannot be guaranteed if there are any deviations from the instructions in this package insert. Customer Service: Telephone: +1 610 419-6731 Fax: +1 610 849-5001 Key to Symbols Used in vitro Diagnostic Device Consult Instructions for Use Batch Code (Lot) Temperature Limitation Catalog Number Use By Caution: Consult accompanying documents Authorized Representative in the European Community Reagent 1 Manufacturer Reagent 2 EMERGO EUROPE Prinsessegracht 20 2514 AP The Hague The Netherlands Saladax Biomedical, Inc. 116 Research Drive Bethlehem, PA 18015 USA www.saladax.com R1 R2

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Page 1: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

My5-FU™ Reagents

© 2017 Saladax Biomedical, Inc. English 1

My5-FU™ is a trademark of Saladax Biomedical, Inc. Printed in USA

PI 5FU-RGT, 18 October 2017, revision 09

5FU-RGT

5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay

This package insert must be read carefully prior to product use. Package insert instructions must be

followed accordingly. Reliability of assay results cannot be guaranteed if there are any deviations

from the instructions in this package insert.

Customer Service:

Telephone: +1 610 419-6731

Fax: +1 610 849-5001

Key to Symbols Used

in vitro Diagnostic Device

Consult Instructions for Use

Batch Code (Lot)

Temperature Limitation

Catalog Number

Use By

Caution: Consult

accompanying documents

Authorized Representative

in the European Community

Reagent 1

Manufacturer

Reagent 2

EMERGO EUROPE

Prinsessegracht 20

2514 AP The Hague

The Netherlands

Saladax Biomedical, Inc.

116 Research Drive

Bethlehem, PA 18015 USA

www.saladax.com

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Intended Use

The Saladax 5-Fluorouracil (My5-FU) Assay is an in vitro diagnostic medical device intended for the

quantitative determination of 5-FU in human plasma using automated clinical chemistry analyzers as

an aid in the management of 5-FU therapy.

Summary and Explanation of the Test

5-FU (Adrucil, among others) is a chemotherapeutic agent used in the treatment of several solid

tumor cancers, especially in colorectal, stomach, breast, pancreatic and head and neck cancers.1-2

Since its development in 1957, it has been the mainstay of colorectal cancer treatment.3 The metabolic

pathways of 5-FU have been extensively investigated. Several studies have reported high inter-

individual variability of 5-FU metabolism. Blood concentrations of 5-FU can vary by over 10-fold

despite equal dose administration by Body Surface Area (BSA).4-8

5-FU is routinely administered by infusion or orally as a prodrug. In plasma it has a half-life of

approximately ten to fifteen minutes and achieves steady state concentrations in two hours with

continuous infusion. Severe side effects, including gastrointestinal, neurological, hematological and

mucosal toxicity, have been encountered during conventional 5-FU treatment.9 Studies have shown

that over 30% of treated patients exhibit dose-limiting toxicity. Recent studies also reported severe

toxicity (grade 3/4) and death following treatment with 5-FU. Research has suggested that only 40%

to 50% of patients with severe toxicity display partial or profound dihydropyrimidine dehydrogenase

(DPD) enzyme deficiency, demonstrating that there are other factors besides a genetic DPD defect

that can affect 5-FU levels.10-15

Clinical studies have consistently reported that the majority of patients are not in the target

therapeutic range when dosed by BSA and indeed most of those are underdosed.16-23 Clinical data

also demonstrate that pharmacokinetically (PK) guided dose adjustment of blood levels of 5-FU can

result in lowered toxicity, improved overall response, and increased survival.4-8,16,17,19,20,22,24-38

In combination with other clinical information, monitoring 5-FU levels provides physicians with an

effective tool to aid in dose management in order to achieve optimal therapeutic effect while avoiding

sub-therapeutic or toxic drug levels.4-8,16,17,19,20,22,24-38 With reduced toxicity, patients are able to

maintain treatment for longer periods of time. Today, PK assessment of 5-FU in patients can only be

performed by physical analytical methods such as high performance liquid chromatography

(HPLC)39-41 or liquid chromatography-tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS).34,42 These physical

techniques are time-consuming, expensive, involve sample preparation and require full-time

technicians, all of which hinder widespread adoption of a PK-guided dose management approach.

Page 3: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

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By contrast, a homogenous immunoassay for determining levels of 5-FU provides rapid quality

results correlated to physical methods utilizing routine clinical analyzers, comparable to other

therapeutic drug monitoring determinations that have been routinely used for more than thirty years.

The My5-FU Assay provides a convenient, cost-effective, and timely tool to aid oncologists in 5-FU

dose management.

Principles of the Procedure

The My5-FU Assay (US Patent No. 7,205,116) is a homogeneous two-reagent nanoparticle

agglutination immunoassay used for detection of 5-FU in human plasma. It is based upon the

principle of measuring changes in scattered light or absorbance which result when nanoparticles

aggregate. This aggregation is measured at wavelengths between 400 and 650 nm using automated

clinical chemistry or immunoassay analyzers. Multivalent drug-conjugates serve as a binding

partner to antibodies selective for 5-FU which are covalently attached to the surface of nanoparticles.

In the absence of free 5-FU, this reaction creates large aggregates, resulting in a solution that scatters

incident light and leads to an increase in the observed absorption of the solution. When a sample

containing 5-FU is introduced, the agglutination reaction is partially inhibited. Antibody bound to

sample drug is no longer available to promote nanoparticle aggregation, resulting in less scattering of

incident light and lower observed absorption of the solution. Thus, a classic inhibition curve with

respect to 5-FU concentration is obtained with the maximum absorption occurring with low levels of

drug and minimum absorption occurring with high levels of drug. Monitoring the changes in

scattered light or absorbance as a function of drug levels results in a concentration-dependent

curve.43-44

Reagents

My5-FU Assay ( 5FU-RGT) includes:

1. Reaction Buffer : Contains agglutination enhancers, protein, and buffer.

2. Nanoparticle Reagent : Contains monoclonal antibody bound to nanoparticles in a

buffered solution.

Additional Materials Required But Not Provided:

5FU-CAL – My5-FU Calibrator Kit

5FU-CON – My5-FU Control Kit

5FU-STB – My5-FU Sample Stabilizer Packs (20 kits) OR 5FU-STB-V– My5-FU Sample

Stabilizer Vial

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Page 4: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 4

Precautions and Warnings

For In Vitro Diagnostic Use Only.

Exercise the normal precautions required for handling all laboratory reagents.

Materials of human origin were tested for HIV1 and HIV2, Hepatitis B and Hepatitis C by FDA-

approved methods and the findings were negative. However, as no test method can rule out the

potential risk of infection with absolute certainty, the material must be handled just as carefully as a

patient sample. In the event of exposure, the directives of the responsible health authorities should

be followed.

All components of the My5-FU Assay contain less than 0.1% sodium azide. For specific listing, refer

to the reagent section of this package insert. Avoid contact with skin and mucous membranes. Flush

affected areas with copious amounts of water. Seek immediate medical attention if reagents are

ingested or come into contact with eyes. When disposing of such reagents, always flush with large

amounts of water to prevent accumulation of azide.

Handling and Storage Instructions

Store reagents, calibrators and controls refrigerated at 2-8°C (35-46°F). Do not freeze.

Before use, mix the Nanoparticle Reagent (R2) by gently inverting the R2 reagent vial three to five

times, avoiding the formation of bubbles.

Indications of Stability

Reagents are stable until the expiration date when stored and handled as directed.

Sample Collection and Handling

Plasma (EDTA or heparin) specimens may be used with the My5-FU Assay. Draw the sample

towards the end of the infusion, preferably 2 – 4 hours before the end, but ensure that the pump still

contains solution during the sample draw. For 46-hour infusions draw the sample at least 1818 hours

after the start of the infusion. Start time of continuous infusion and actual sampling time should be

recorded.

Collect a minimum of 2 mL of blood into an EDTA or heparin tube. Collect the blood sample by

venipuncture or through a peripheral IV line. This is to avoid contamination by the infusing drug.

DO NOT collect the blood sample from the infusional IV line.

Page 5: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 5

Sample Stabilizer

Inject collection tube with the My5-FU sample stabilizer immediately after draw and gently invert 3

times. Do not place sample on ice and do not refrigerate when using the stabilizer. Centrifuge

sample within 24 hours of draw. Draw off plasma from the top of the tube, avoiding the cell layer

and transfer to a capped secondary tube. Plasma must be free of cells. Store the plasma sample at 2-

8°C or room temperature for up to one week or freeze (at ≤ -20°C) if storing the sample longer.

Samples may be shipped at ambient temperature. Provide the laboratory with the times of infusion

start and finish. Refer to the My5-FU sample stabilizer package insert for complete instructions for

use of the sample stabilizer.

No Sample Stabilizer

Use of the sample stabilizer is strongly recommended. If the sample stabilizer is not used, samples

should be centrifuged within twenty minutes of collection to isolate the plasma. Alternatively, place

sample on ice immediately upon collection and centrifuge within one hour of collection. Draw off

plasma from the top of the tube, avoiding the cell layer (contamination of plasma with blood cells can

cause 5-FU degradation), and transfer to a capped secondary tube. Store the sample at 2-8°C for up

to one week or freeze (≤ -20° C) if storing for a longer period. If the sample will be shipped to an

outside testing laboratory, freeze (≤ -20°C) plasma sample for a minimum of 16 hours before

shipment to decrease sample degradation. Samples may be then shipped to the laboratory at ambient

temperature.

Assay Procedure

Refer to the instrument specific Application Sheet for instructions and parameters before performing

the assay.

Specimen Dilution Procedure

Samples containing 5-FU in concentrations greater than 1,800 ng/mL can be diluted 1:5 to give an

upper range of 9,000 ng/mL. Refer to the instrument specific operation manual for an automatic

dilution protocol (by cuvette only) of 5-FU samples with water. Alternatively, specimens out of

range can be manually diluted 1:10 or 1:100 with deionized water or 1:5 in the 0 ng/mL Calibrator and

placed in the sample rack for analysis.

Calibration

The My5-FU Assay produces a calibration curve with a 0 to 1,800 ng/mL range using the My5-FU

Calibrator Kit. The minimum detectable concentration of 5-FU in plasma for the My5-FU Assay is 52

ng/mL.

Validate the assay calibration by testing My5-FU Controls.

Page 6: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 6

Calibration Frequency

Calibration is recommended:

• After a calibrator or reagent (kit) lot change,

• After performance of monthly instrument maintenance,

• As required following quality control procedures.

Quality Control

The My5-FU Control Kit contains three levels of controls at low, medium and high concentrations of

5-FU.

Each laboratory should establish its own control ranges and frequency. Good laboratory practice

suggests that at least two concentrations of quality control be tested each day patient samples are

assayed and each time calibration is performed. Reassess control targets and ranges following a

change of reagent (kit) or control lot.

Results and Expected Values

The instrument software calculates a best fit non-linear curve equation that is used to generate a

calibration curve that ranges from 0 to 1,800 ng/mL of 5-FU concentration. This curve is stored on the

analyzer and concentrations of drug in the unknown samples are calculated from this curve using

absorbance values generated for each sample.

Limitations of the Procedure

As with all analyte determinations, the My5-FU Assay should be used in conjunction with

information available from clinical evaluation and other diagnostic procedures.

Performance characteristics for the My5-FU Assay have not been established for body fluids other

than human plasma containing EDTA or heparin.

No significant interferences were observed from samples with the following conditions:

Level

Rheumatoid Factor 500 IU/mL

Total Protein Matrix Effect 12 g/dL 120 g/L

Icteric Interference 95 mg/dL 1624 µmol/L

Lipemic Interference 1700 mg/dL 19 mmol/L

Hemolysate 1000 mg/dL

5-FU is not stable in whole blood. Hemolysis should be avoided.

Page 7: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 7

Theophylline, when tested at 10,000 ng/mL, has a 4.6% cross reactivity in the My5-FU Assay.

Elevated 5-FU levels may be seen in samples from patients taking theophylline. Theobromine, when

tested at 20,000 ng/mL has a cross-reactivity of 2.2%. 5-FU levels may be elevated in samples from

patients who have eaten chocolate during or shortly before their infusion.

As with any assay utilizing mouse antibodies, the possibility exists for interference by human anti-

mouse antibodies (HAMA) in the sample. Samples containing such antibodies can potentially

produce erroneous 5-FU results, which are inconsistent with the patient’s clinical profile. If you

suspect this occurrence, please contact Saladax Technical Service for assistance.

Expected Values

No precise relationship between 5-FU plasma levels and antineoplastic efficacy has been established.

Recent clinical studies in colorectal cancer have used target 5-FU AUC ranges from 20 to 24 or to 30

mg·h/L.18-21,23 AUC levels greater than 25 mg·h/L have been associated with increased risk of toxicity

in the form of diarrhea, hand-foot syndrome, mucositis, stomatitis, and leucopenia.4,17,24-37

Use of 5-FU plasma area under the curve (AUC) calculations in which AUC is determined from the

concentration of 5-FU at steady state (Css) multiplied by the duration of the 5-FU infusion cycle has

been shown to be useful in determining optimal individual doses of 5-FU. The AUC can be

calculated by multiplying the Css by the time (hours) of infusion:

Css x Time of infusion = AUC

5-FU drug concentrations should not be the only means of therapeutic drug management. The assay

should be used in conjunction with information available from clinical evaluations and other

diagnostic procedures. The patient’s current and past medical condition, the complexity of the

clinical state, individual differences in sensitivity to 5-FU and toxic effects of 5-FU, co-administration

of other drugs, and a number of other factors may result in different optimal blood concentrations of

5-FU for any individual. Each patient should undergo comprehensive clinical assessment prior to

modification of the treatment plan and clinicians should carefully monitor patients during therapy

initiation and dose adjustments. Given the heterogeneity of the patient’s clinical state, clinicians

should establish a desired therapeutic management range based on their own experience as well as

each patient’s clinical requirements. 5-FU concentrations for individual patients should be

determined using a single, consistent method to minimize confounding effects associated with cross-

reactivity and recognition of metabolites.

Specific Performance Characteristics

Typical performance data for the My5-FU Assay obtained on a Beckman (formerly Olympus) AU400

are shown below. Results obtained in individual laboratories may differ from these data.

Page 8: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 8

Precision

Precision was determined as described in CLSI Guideline EP5-A2.

Low, medium and high 5-FU controls and 4 patient sample pools containing varying 5-FU levels

were assayed in duplicate twice a day for twenty days at two sites using 2 assay lots. The means

were determined and within run, total SD and % CVs were calculated.

The following are representative results from one assay lot at one site.

Sample

Type

Assigned

Value

(ng/mL) N

Mean

(ng/mL)

Within Run Total

SD %CV SD %CV

Controls

225 80 223 5.5 2.5 11.5 5.2

450 80 450 6.5 1.4 9.7 2.1

900 80 910 10.4 1.1 14.7 1.6

Human

Plasma

240 80 238 11.6 4.9 13.2 5.5

470 80 475 8.5 1.8 12.1 2.6 700 80 705 13.2 1.9 15.1 2.1

1300 80 1341 18.6 1.4 27.0 2.0

Lower Limit of Quantitation (LLoQ)

This is defined as the lowest drug concentration that can be measured with acceptable accuracy and

precision. It is considered the measured drug concentration at which the assay coefficient of variation

is not greater than 15%, and the recovery is 90 to 110%. To determine the LLoQ, 3 negative plasma

samples were spiked with a known amount of 5-FU and the amount of drug was quantified by the

assay using two lots of reagents over five runs (n = 5/run). The LLoQ was determined to be 85

ng/mL.

Limit of Detection (LoD)

This is defined as the lowest drug concentration that can be detected with 95% confidence. To

determine the LoD, 3 negative plasma samples were spiked with a known amount of 5-FU and the

amount of drug was quantified by the assay using two lots of reagents over five runs (n = 5/run). The

LoD was determined to be 52 ng/mL.

Specificity

5-FU metabolites and Structurally Related Compounds

Unless otherwise indicated, 10,000 ng/mL of each of the following 5-FU metabolites or structurally

related compounds were added to 5-FU free plasma and were assayed using the My5-FU Assay. The

% cross-reactivity in the assay for each compound is given below.

Page 9: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 9

Compound % Cross-Reactivity

Dihydro-5-fluorouracil <0.1

Dihydrouracil* 0.4

Eniluracil 0.9

Uracil 11.1

Thymidine <0.1

5-Fluorouridine <0.1

Uridine <0.1

Pseudouridine* <0.01

Tegafur <0.1

Capecitabine* <0.01

5’-deoxy-5-fluorouridine <0.1

5’-deoxy-5-fluorocytidine <0.1

*100,000 ng/mL concentration tested

Common Co-Administered Drugs

Unless otherwise indicated, 100,000 ng/mL of each compound was spiked into 5-FU free plasma or

plasma spiked with 1,000 ng/mL 5-FU. With the exception of theophylline, with 4.6% cross-reactivity

in the assay and theobromine, with 2.2% cross-reactivity, all compounds cross-reacted ≤1% in the

assay.

Acetaminophen Irinotecan* Prednisone

N-Acetylprocainamide Kanamycin A Procainamide

Allopurinol Kanamycin B Prochlorperazine

Amikacin Leucovorin* Quinidine Sulfate

Ampicillin Lidocaine Rifampicin

Azathioprine Methotrexate Salicylic Acid

Caffeine Methylprednisolone Spectinomycin

Carbamazepine Morphine sulfate* Streptomycin Sulfate

Ceftriaxone Oxaliplatin* Theobromine**

Cephalosporin Paraxanthine** Theophylline*

Erythromycin Penicillin G Tobramycin

Gemcitabine Phenobarbital Valproic Acid

Gentamycin Phenytoin Vancomycin

Hydrocortisol Prednisolone Xanthine

*10,000 ng/mL concentration tested

**20,000 ng/mL concentration tested

Page 10: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 10

Recovery

To assess recovery, 5-FU was spiked into normal 5-FU free plasma samples and into patient samples

containing a known concentration of 5-FU. The percent recovery was determined by dividing the

observed concentration of each sample by the expected concentration of added 5-FU plus original 5-

FU present in the sample. The percent recovery ranged from 96 to 108%.

Linearity by Sample Dilution

To assess assay linearity, 11 samples with 5-FU concentrations covering the range of the assay were

prepared by using the dilution scheme in CLSI Approved Guideline EP6-A vol. 23 No. 16 and were

tested (n = 10) with 2 assay lots. Linearity at specific dilutions was considered acceptable if the

percent deviation was within ± 10% of expected value for concentrations ≥ 150 ng/mL or ± 15% for

concentrations < 150 ng/mL. The assay was found to be linear over the reportable range of the assay.

Method Comparison

A comparison between the Saladax My5-FU Assay and LC-MS/MS was performed using 57 human

plasma samples obtained from patients receiving 5-FU therapy. The range of 5-FU concentration by

the My5-FU Assay was 122-1,801 ng/mL with a mean of 816 ng/mL. The 5-FU concentration range

for the validated LC-MS/MS reference method was 141-1,810 ng/mL with a mean of 796 ng/mL.

Results of the Deming regression analysis are below.

0

500

1,000

1,500

2,000

0 500 1,000 1,500 2,000

My

5-F

UT

MB

eck

man

AU

400

[ng

/mL

]

LC-MS/MS [ng/mL]

Deming Regression

1:1 LineSlope = 1.017

y-intercept = 6.78

Correlation Coefficient (R) = 0.9925

Page 11: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

English 11

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Page 14: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

My5-FU™-Reagenzien

© 2017 Saladax Biomedical, Inc. Deutsch 1

My5-FU™ ist eine Marken von Saladax Biomedical, Inc. Gedruckt in USA

PI 5FU-RGT, 18.10.2017, Revision 09

5FU-RGT

5-Fluorouracil (My5-FU™)-Assay

Dieser Beipackzettel ist vor dem Gebrauch des Produkts sorgfältig zu lesen. Die Anleitung auf dem

Beipackzettel muss entsprechend befolgt werden. Die Zuverlässigkeit der Testergebnisse kann nicht

gewährleistet werden, wenn die Anleitung auf dem Beipackzettel nicht genau befolgt werden.

Kundendienst:

Telefon: +1 610 419-6731

Fax: +1 610 849-5001

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Bethlehem, PA 18015 USA

www.saladax.com

R1

R2

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Deutsch 2

Verwendungszweck

Der Saladax 5-Fluorouracil (My5-FU)-Assay ist ein In-vitro-Diagnosesystem, das zur quantitativen

Bestimmung von 5-FU in Humanplasma vorgesehen ist, wobei automatisierte klinische

Analysegeräte verwendet werden, um die Anwendung einer 5-FU-Therapie zu unterstützen.

Zusammenfassung und Erläuterung des Tests

5-FU (u. a. Adrucil) ist ein Chemotherapeutikum, das zur Behandlung verschiedener solider

Karzinome eingesetzt wird, insbesondere bei Kolorektal-, Magen-, Brust-,Pankreaskrebs und Patienten

mit Kopf-/Hals-Tumoren.1-2 Seit der Entwicklung im Jahr 1957 ist es der Grundpfeiler der Behandlung

von kolorektalen Karzinomen.3 Die Stoffwechselwege von 5-FU wurden umfassend untersucht, und

mehrere Studien haben eine hohe inter-individuelle Variabilität des 5-FU-Metabolismus gezeigt. Die

Blutkonzentrationen von 5-FU können um über das Zehnfache variieren, selbst wenn die gleiche

Dosis nach Körperoberfläche (KOF) verabreicht wird.4-8

5-FU wird häufig als Infusion oder oral als Prodrug verabreicht. Im Plasma weist es eine

Halbwertszeit von ca. zehn bis fünfzehn Minuten auf und erreicht bei kontinuierlicher Infusion

innerhalb von zwei Stunden stationäre Konzentrationen. Bei konventioneller 5-FU-Therapie werden

schwere Nebenwirkungen beobachtet, darunter gastrointestinale, neurologische, hämatologische und

Schleimhaut-Toxizität.9 Studien zeigen, dass über 30% der behandelten Patienten eine

dosislimitierende Toxizität aufweisen. Neuere Studien berichten außerdem von schweren

Toxizitäten (Grad 3/4) und dem Tod von Patienten im Anschluss an eine Behandlung mit 5-FU. Laut

Studienergebnissen weisen nur 40% bis 50% der Patienten mit schwerer Toxizität einen teilweisen

oder schweren DPD- (Dihydropyrimidin-Dehydrogenase)-Enzymmangel auf, was zeigt, dass außer

einem genetischen DPD-Defekt andere Faktoren den 5-FU-Spiegel beeinträchtigen können.10-15

Zahlreiche klinische Studien haben gezeigt, daß die Mehrheit der Patienten, die eine KOF-Dosierung

erhielten, nicht im Zielbereich waren, die meisten der Patienten wurden unterdosiert.16-23 Ebenso

konnten klinische Studien zeigen, dass eine pharmakokinetisch (PK) gesteuerte Dosisanpassung der

5-FU-Konzentration im Blut zu reduzierter Toxizität, verbessertem allgemeinem Ansprechen und

einem Anstieg der Überlebensrate führen kann.4-8, 16, 17, 19, 20, 22-38

In Kombination mit anderen klinischen Informationen bietet die Überwachung der 5-FU-Spiegel

Ärzten eine effektive Möglichkeit zur Anpassung der Dosierung, um eine optimale therapeutische

Wirkung zu erzielen und sub-therapeutische oder toxische Arzneimittelspiegel zu vermeiden.4-8, 16, 17,

19, 20, 22-38 Mit reduzierter Toxizität kann die Behandlung der Patienten länger aufrecht erhalten werden.

Derzeit kann die PK-Bewertung von 5-FU in Patienten nur mit Hilfe von physikalisch-analytischen

Methoden wie HPLC (High Performance Liquid Chromatography)39-41 oder LC-MS/MS (Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy) durchgeführt werden.34,42 Diese physikalischen

Methoden sind zeitaufwändig, kostspielig und erfordern die Vorbereitung von Proben und den

Page 16: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 3

Einsatz von Vollzeitkräften; alle diese Faktoren schränken die allgemeine Anwendbarkeit eines PK-

geleiteten Dosierungsansatzes ein.

Im Gegensatz dazu liefert ein homogener Immunoassay zur Bestimmung der 5-FU-Konzentration,

unter Verwendung klinischer Analysegeräte, schnelle Ergebnisse in Korrelation mit physikalischen

Methoden, die mit anderen Methoden zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung, die seit über

dreißig Jahren routinemäßig eingesetzt werden, vergleichbar sind. Der My5-FU-Assay bietet

Onkologen eine praktische, kostengünstige und effiziente Methode zur Anpassung der 5-FU-

Dosierung.

Verfahrensgrundsätze

Der My5-FU-Assay (US-Patent-Nr. 7,205,116) ist ein homogener, aus zwei Reagenzien bestehender

Nanopartikel-Agglutination-Immunoassay zur Bestimmung von 5-FU in Humanplasma. Er basiert

auf dem Prinzip der Messungsänderungen durch Streulicht oder Absorption, die bei der Aggregation

von Nanopartikeln auftreten. Diese Agglutination wird im Wellenlängenbereich zwischen 400 und

650 nm mit automatisierten klinischen Chemie- oder Immunoassay-Analysegeräten gemessen.

Multivalente Arzneimittelkonjugate dienen als Bindungspartner für 5-FU-selektive Antikörper, die

kovalent mit der Oberfläche von Nanopartikeln verbunden sind. Bei Abwesenheit von freiem 5-FU

erzeugt diese Reaktion große Aggregate die Auflicht streuen und zu einer Zunahme der

beobachteten Absorption führen. Wenn eine 5-FU-haltige Probe hinzugegeben wird, wird die

Agglutinationsreaktion teilweise inhibiert. Antikörper, die an das 5-FU der Probe gebunden sind,

stehen nicht zur Verfügung , um die Aggregation der Nanopartikel zu fördern, was die Streuung des

Auflichts und die beobachtete Absorption der Lösung mindert. Somit wird eine klassische

Inhibitionskurve im Hinblick auf die 5-FU-Konzentration erzeugt, wobei maximale Absorption bei

niedrigen Arzneimittelkonzentrationen und minimale Absorption bei hohen

Arzneimittelkonzentrationen auftritt. Die Änderungen von Streulicht oder Absorption als Funktion

der Arzneimittelkonzentration ergibt eine konzentrationsabhängige Kurve.43-44

Reagenzien

Der My5-FU -Assay ( 5FU-RGT) enthält:

1. Reaktionspuffer : Enthält Agglutinationsverstärker, Protein und Pufferlösung.

2. Nanopartikelreagenz : Enthält an Nanopartikel gebundene, monoklonale Antikörper in

einer Pufferlösung.

Weitere erforderliche Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind:

5FU-CAL – My5-FU-Kalibrator-Kit

5FU-CON – My5-FU-Kontroll-Kit

R1

11 R2

Page 17: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 4

5FU-STB – My5-FU Probenstabilisator-Paket (20 Kits) ODER 5FU-STB-V– Flasche mit

My5-FU Probenstabilisator

Vorsichts- und Warnhinweise

Nur zur Verwendung in der In-Vitro-Diagnostik.

Bei der Arbeit mit Laborchemikalien sind die üblichen Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.

Materialien menschlichen Ursprungs wurden mit von der FDA zugelassenen Methoden auf HIV1

und HIV2, Hepatitis B und Hepatitis C getestet, alle Ergebnisse waren negativ. Da jedoch keine

Testmethode das potentielle Risiko einer Infektion völlig ausschließen kann, muss das Material

ebenso vorsichtig wie Patientenproben gehandhabt werden. Sollte ein Kontakt stattgefunden haben,

sind die Richtlinien der zuständigen Gesundheitsbehörde zu befolgen.

Alle Komponenten des My5-FU-Assays enthalten weniger als 0,1% Natriumazid. Für eine genaue

Übersicht lesen Sie bitte den Reagenzabschnitt in dieser Packungsbeilage. Kontakt mit Haut und

Schleimhäuten vermeiden. Betroffene Bereiche mit reichlich Wasser spülen. Bei Verschlucken der

Reagenzien oder Kontakt mit den Augen ist sofort ein Arzt aufzusuchen. Beim Entsorgen dieser

Reagenzien immer mit viel Wasser nachspülen, um eine Azidansammlung zu vermeiden.

Anweisung zur Handhabung und Lagerung

Die Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollen gekühlt bei 2 - 8°C aufbewahren. Nicht einfrieren.

Das Nanopartikel-Reagenz (R2) vor der Verwendung durch vorsichtiges Umdrehen (3 bis 5 Mal) der

R2-Reagenzflasche mischen; dabei Blasenbildung vermeiden.

Indikationen für Stabilität

Bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung sind die Reagenzien bis zum Verfallsdatum

stabil.

Entnahme und Handhabung der Proben

Mit dem My5-FU-Assay können Plasmaproben (EDTA oder Heparin) verwendet werden. Die Probe

gegen Ende der Infusion, am besten 2 – 4 Stunden vor Infusionsende, entnehmen; dabei sicherstellen,

dass die Pumpe während der Probenahme noch Lösung enthält. Bei Infusionen über 46 Stunden,

entnehmen Sie die Probe frühestens 18 Stunden nach Infusionsstart. Die Anfangszeit der

kontinuierlichen Infusion und die tatsächliche Entnahmezeit sollten aufgezeichnet werden.

Entnehmen Sie ≥ 2 ml Blut in einem EDTA- oder Heparinröhrchen. Die Blutprobe durch

Venenpunktion oder eine periphere Infusionsleitung entnehmen. Hierdurch soll jegliche

Page 18: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 5

Kontamination durch das Infusionsmedikament vermieden werden. Die Blutprobe darf NICHT von

der Infusionsleitung entnommen werden.

Probenstabilisator

Den My5-FU-Probenstabilisator sofort nach der Entnahme in das Entnahmegefäß injizieren und 3

Mal vorsichtig schwenken. Bei Verwendung des Stabilisators die Probe nicht auf Eis oder im

Kühlschrank lagern. Die Probe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme zentrifugieren. Plasma

unter Vermeidung der Zellschicht oben vom Röhrchen abnehmen und das Plasma in ein

verschließbares Sekundär-Röhrchen übertragen. Das Plasma muss frei von Zellen sein. Für eine

Messung innerhalb von einer Woche, Probe bei 2-8°C oder Raumtemperatur lagern; für längeres

Aufbewaren, Probe bei ≤ -20°C einfrieren. Die Proben können ungekühlt verschickt werden. Das

Labor über die Zeiten von Infusionsstart und -ende informieren. Eine vollständige

Gebrauchsanweisung für den Probenstabilisator ist der Packungsbeilage für den My5-FU-

Probenstabilisator zu entnehmen.

Kein Probenstabilisator

Die Verwendung des Probenstabilisators wird dringend empfohlen. Wenn der Probenstabilisator

nicht verwendet wird, müssen die Proben innerhalb von 20 Minuten nach der Entnahme zentrifugiert

werden, um das Plasma abzutrennen. Alternativ dazu kann die Probe sofort nach Entnahme auf Eis

gelagert und innerhalb einer Stunde nach Entnahme zentrifugiert werden. Plasma unter

Vermeidung der Zellschicht oben vom Röhrchen abnehmen (Kontaminierung des Plasmas mit

Blutzellen kann 5-FU-Degradierung verursachen), und das Plasma in ein zweites Röhrchen mit

Stopfen übertragen. Die Probe zur Messung innerhalb von einer Woche bei 2-8oC lagern; für

längeres Lagern einfrieren (≤ -20°C). Wenn die Probe an ein externes Testlabor versendet wird, muss

die Plasmaprobe vor dem Versand für mindestens 16 Stunden eingefroren werden (≤ -20°C), um eine

Degradierung der Probe zu vermeiden. Die Proben können dann bei Umgebungstemperatur ins

Labor geschickt werden.

Testverfahren

Eine gerätespezifische Anleitung und die Testparameter sind vor Verwendung des Tests dem

Anwendungsblatt für das jeweilige Instrument zu entnehmen.

Probenverdünnungsverfahren

Proben mit 5-FU Konzentrationen höher als 1.800 ng/ml können 1:5 verdünnt werden, um die obere

Messbereichsgrenze auf 9.000 ng/ml zu erhöhen. Ein automatisches Verdünnungsprotokoll (nur

durch Küvette) von 5-FU-Proben mit Wasser ist der Gebrauchsanleitung für das jeweilige Instrument

zu entnehmen. Alternativ dazu können Proben, die außerhalb des Meßbereichs liegen, manuell mit

deionisiertem Wasser im Verhältnis von 1:10 oder 1:100 oder mit dem Nullkalibrator im Verhältnis

von 1:5 verdünnt und zur Analyse in den Probenhalter gestellt werden.

Page 19: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 6

Kalibrierung

Der My5-FU-Assay erzeugt unter Verwendung des My5-FU-Kalibrator-Kits eine Kalibrationskurve

für den Bereich von 0 bis 1.800 ng/ml. Die untere Nachweisgrenze von 5-FU in Plasma für den My5-

FU-Assay beträgt 52 ng/ml.

Die Assay-Kalibrierung durch Messen der My5-FU-Kontrollen validieren.

Häufigkeit der Kalibrierung

Folgender Kalibrierungsplan wird empfohlen:

• Nach dem Wechsel einer Kalibrator- oder Reagenz- (Kit)-Charge,

• Nach der Durchführung der monatlichen Instrumentenwartung,

• Entsprechend den Anforderungen der Qualitätskontrollverfahren.

Qualitätskontrolle

Das My5-FU-Kontroll-Kit enthält drei Level an Kontrollen mit niedriger, mittlerer und hoher 5-FU-

Konzentration.

Jedes Labor sollte seine eigenen Kontrollbereiche und -frequenz festlegen. Gemäß guter Laborpraxis

sollten an jedem Tag, an dem Patientenproben getestet werden, und bei jeder Kalibrierung,

mindestens zwei Konzentrationen der Qualitätskontrolle getestet werden. Nach dem Wechsel von

Reagenzien (Kit) oder Kontrollchargen sollten die Kontrollzielwerte und -bereiche neu festgelegt

werden.

Ergebnisse und Erwartungswerte

Die Geräte-Software berechnet eine nicht lineare Best-Fit-Kurvengleichung, die verwendet wird, um

eine Kalibrierungskurve im 5-FU-Konzentrationsbereich von 0 bis 1.800 ng/ml zu erzeugen. Diese

Kurve wird auf dem Analysegerät gespeichert und benutzt, um Arzneimittelkonzentrationen in

unbekannten Proben unter Verwendung deren Absorptionswerten zu berechnen.

Begrenzungen des Verfahrens

Wie bei allen Analytbestimmungen muss der My5-FU-Assay zusammen mit Informationen aus

klinischen Untersuchungen und anderen diagnostischen Verfahren verwendet werden.

Leistungsmerkmale für den My5-FU-Assay für andere Körperflüssigkeiten als Humanplasma mit

EDTA oder Heparin wurden nicht etabliert.

Bei Proben mit den folgenden Zusätzen wurden keine signifikanten Störungen beobachtet:

Page 20: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 7

Konzentration

Rheumafaktor 500 IU/ml

Gesamtprotein-Matrixeinfluß 12 g/dl 120 g/l

Ikterische Störungen 95 mg/dl 1624 µmol/l

Lipämische Störungen 1700 mg/dl 19 mmol/l

Hämolysat 1.000 mg/dL

5-FU ist in Vollblut nicht stabil. Hämolyse muss vermieden werden.

Theophyllin weist bei einer Konzentration von 10.000 ng/ml im My5-FU-Assay eine Kreuzreaktivität

von 4,6% auf. Bei Patienten, die Theophyllin einnehmen, kann eine erhöhte 5-FU-Konzentration

gefunden werden. Theobromin, getestet in einer Konzentration von 20.000 ng/ml, zeigt eine

Kreuzreaktivität von 2,2%. Bei Patienten, die vor oder während der Infusion Schokolade verzehrt

haben, können erhöhte 5-FU Konzentrationen gefunden werden.

Wie bei allen Assays, die Mausantikörper verwenden, besteht die Möglichkeit von Störungen durch

humane Anti-Mausantikörper (HAMA) in der Probe. Proben mit solchen Antikörpern können

inkorrekte 5-FU-Ergebnisse erzeugen, die mit dem klinischen Profil des Patienten nicht vereinbar

sind. Falls Sie einen solchen Fall vermuten, kontaktieren Sie den technischen Kundendienst von

Saladax.

Erwartungswerte

Es wurde bisher keine genau definierte Beziehung zwischen 5-FU-Plasmaspiegeln und

antineoplastischer Wirksamkeit etabliert. Kürzlich veröffentliche Studien mit Kolorektalkarzinom-

Patienten verwendeten einen AUC Zielbereich von 20 bis 24 oder bis 30 mg·h/L.18-21,23 AUC-Levels

oberhalb 25 mg·h/l wurden mit erhöhtem Toxizitätsrisiko in Form von Durchfall, Hand-Fuß-

Syndrom, Schleimhautentzündung, Mundhöhlenentzündung und Leukopenie in Zusammenhang

gebracht.4,17,24-37

Die Verwendung von 5-FU-AUC-Berechnungen, bei denen die AUC anhand der stationären 5-FU-

Konzentration (Css), multipliziert mit der Dauer des 5-FU-Infusionszyklus, bestimmt wird, ist bei der

Festlegung optimaler 5-FU-Einzeldosen nachweislich von Nutzen. Der AUC-Wert kann durch

Multiplizieren der stationären Konzentration (Css) mit der Dauer der Infusion (in Stunden) berechnet

werden:

Css x Infusionsdauer = AUC

5-FU-Arzneimittelkonzentrationen dürfen nicht das einzige Mittel im therapeutischen Arzneimittel-

Management sein. Der My5-FU-Assay muss zusammen mit Informationen aus klinischen

Untersuchungen und anderen diagnostischen Verfahren verwendet werden. Die Patientenhistorie

und der derzeitige Gesundheitszustand des Patienten, die Komplexität des klinischen Bildes, die

individuellen Unterschiede bei der Empfindlichkeit gegenüber 5-FU und der toxischen Wirkungen

von 5-FU, die gleichzeitige Verabreichung anderer Arzneimittel und eine Reihe anderer Faktoren

Page 21: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 8

können bewirken, dass die optimalen Blutkonzentrationen von 5-FU für jede Person anders ist. Jeder

Patient muss vor Änderungen des Behandlungsplans einer umfassenden klinischen Untersuchung

unterzogen werden. Außerdem müssen Ärtze ihre Patienten beim Start der Therapie und bei

Dosisanpassungen aufmerksam überwachen. Angesichts der Heterogenität des klinischen Zustandes

eines Patienten muss der Arzt den gewünschten Bereich des therapeutischen Managements

basierend auf den eigenen Erfahrungen und den Bedürfnissen des Patienten festlegen. 5-FU-

Konzentrationen für einzelne Patienten müssen anhand einer einzigen, konsistenten Methode

bestimmt werden, um unklare Effekte zu minimieren, die durch Unterschiede in Kreuzreaktivität

und der Erkennung von Metaboliten verursacht werden können.

Spezifische Leistungsmerkmale

Nachfolgend sind typische, mit dem Beckman (vormals Olympus) AU400 erzielte Leistungsdaten für

den My5-FU-Assay aufgelistet. Individuelle Ergebnisse eines Labors können von diesen Daten

abweichen.

Präzision

Die Präzision wurde gemäß der Beschreibung in CLSI Richtlinie EP5-A2 bestimmt.

Niedrige, mittlere und hohe 5-FU-Kontrollen und 4 Patientenprobenpools mit unterschiedlichen 5-

FU-Spiegeln wurden 20 Tage lang an zwei Testzentren zweimal täglich mit 2 Assay-Chargen

zweifach getestet. Die Mittelwerte wurden bestimmt, und die SA und der VK (%) innerhalb eines

Laufs berechnet.

Die nachfolgenden Ergebnisse sind typische Ergebnisse von einer Reagenzcharge an einem

Testzentrum.

Probentyp Zugewiesener

Wert (ng/ml) N

Mittelwert

(ng/ml)

Innerhalb

eines Laufs Gesamt

SA %VK SA %VK

Kontrollen

225 80 223 5,5 2,5 11,5 5,2

450 80 450 6,5 1,4 9,7 2,1

900 80 910 10,4 1,1 14,7 1,6

Humanplasma

240 80 238 11,6 4,9 13,2 5,5 470 80 475 8,5 1,8 12,1 2,6

700 80 705 13,2 1,9 15,1 2,1

1300 80 1341 18,6 1,4 27,0 2,0

Unteres Quantifizierungslimit (LLoQ)

Dies wird als die geringste Konzentration des Medikaments definiert, die mit akzeptabler

Genauigkeit und Präzision gemessen werden kann. Dieser Wert gilt als die gemessene

Arzneimittelkonzentration, bei der der Assay-Variationskoeffizient nicht größer als 15% ist und die

Page 22: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 9

Wiederfindung 90 bis 110% beträgt. Um das LLoQ zu bestimmen, wurden 3 negative Plasmaproben

mit einer bekannten Menge an 5-FU gespikt, und die Arzneimittelmenge wurde mit zwei

Reagenzlosen über fünf Durchläufe vom Test quantifiziert (n = 5/Durchlauf). Als untere

Bestimmungsgrenze wurden 85 ng/ml festgelegt.

Nachweisgrenze (LoD)

Wird als die niedrigste Arzneimittelkonzentration definiert, die mit einer Sicherheit von 95% erkannt

werden kann. Um das LoD zu bestimmen, wurden 3 negative Plasmaproben mit einer bekannten

Menge an 5-FU gespikt, und die Arzneimittelmenge wurde mit zwei Reagenzlosen über fünf

Durchläufe vom Test quantifiziert (n = 5/Durchlauf). Die LoD wurde auf 52 ng/ml festgelegt.

Spezifität

5-FU-Metabolite und strukturell verwandte Verbindungen

Soweit nicht anderweitig angegeben, wurden 10.000 ng/ml jeder der nachfolgenden 5-FU-Metabolite

oder strukturell verwandter Verbindungen zu 5-FU-freiem Plasma hinzugegeben und mit dem My5-

FU-Assay gemessen. Die Kreuzreaktivität (%) des Assay für jede Verbindung ist unten angegeben.

Substanz Kreuzreaktivität (%)

Dihydro-5-Fluorouracil <0,1

Dihydrouracil* 0,4

Eniluracil 0,9

Uracil 11,1

Thymidin <0,1

5-Fluorouridin <0,1

Uridin <0,1

Pseudouridin* <0,01

Tegafur <0,1

Capecitabin* <0,01

5’-Deoxy-5-Fluorouridin <0,1

5’-Deoxy-5-Fluorocytidin <0,1

*100.000 ng/ml getestete Konzentration

Page 23: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 10

Häufig mitverabreichte Arzneimittel

Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden 100.000 ng/ml jeder Zusammensetzung in 5-FU-freies

Plasma oder in mit 1.000 ng/ml 5-FU gespiktem Plasma gespikt. Mit Ausnahme von Theophyllin mit

einer Kreuzreaktivität von 4,6% im Assay und Theobromin mit einer Kreuzreaktivität von 2,2%

wiesen alle Zusammensetzungen im Assay eine Kreuzreaktion von ≤ 1% auf.

Acetaminophen Irinotecan* Prednison

N-Acetylprocainamid Kanamycin A Procainamid

Allopurinol Kanamycin B Prochlorperazin

Amikacin Leucovorin* Quinidinsulfat

Ampicillin Lidocain Rifampicin

Azathioprin Methotrexat Salicylsäure

Koffein Methylprednisolon Spectinomycin

Carbamazepin Morphinsulfat* Streptomycinsulfat

Ceftriaxon Oxaliplatin* Theobromin**

Cephalosporin Paraxanthin** Theophyllin*

Erythromycin Penicillin G Tobramycin

Gemcitabin Phenobarbital Valproinsäure

Gentamycin Phenytoin Vancomycin

Hydrocortisol Prednisolon Xanthin

*10,000 ng/ml getestete Konzentration

**20,000 ng/ml getestete Konzentration

Wiederfindung

Zur Beurteilung der Wiederfindung wurde 5-FU in normale 5-FU-freie Plasmaproben und in

Patientenproben mit einer bekannten 5-FU-Konzentration gegeben. Die prozentuale

Wiederfindungsrate wurde durch Dividieren der beobachteten Konzentration jeder Probe durch die

erwartete Konzentration des hinzugefügten 5-FU plus dem ursprünglich in der Probe vorhandenen

5-FU bestimmt. Die prozentualen Wiederfindungsraten betrugen 96 - 108%.

Linearität nach Probenverdünnung

Zur Beurteilung der Assay-Linearität wurden 11 Proben mit 5-FU-Konzentrationen, die den Assay-

Bereich abdecken, vorbereitet; hierzu wurde das Verdünnungsschema in CLSI Richtlinie EP6-A Vol.

23 Nr. 16 verwendet und mit 2 Assay-Chargen (n = 10) getestet. Die Linearität bei bestimmten

Verdünnungen wurde als akzeptabel erachtet, wenn die prozentuale Abweichung innerhalb ± 10%

des Erwartungswerts für Konzentrationen von ≥ 150 ng/ml oder innerhalb von ± 15% für

Konzentrationen von < 150 ng/ml lag. Das Assay wurde über den Messbereich des Assay als linear

befunden.

Page 24: 5-Fluorouracil (My5-FU™) Assay - MyCare Tests

Deutsch 11

Methodenvergleich

Ein Vergleich zwischen dem Saladax My5-FU-Assay und LC-MS/MS wurde mit 57

Humanplasmaproben von Patienten, die 5-FU-Therapie erhalten, durchgeführt. Der Bereich der 5-

FU-Konzentration gemessen mit dem My5-FU-Assay betrug 122 - 1.801 ng/ml mit einem Mittelwert

von 816 ng/ml. Der Bereich der gemessenen 5-FU-Konzentration für die validierte LC-MS/MS-

Referenzmethode betrug 141-1.810 ng/ml mit einem Mittelwert von 796 ng/ml. Die Ergebnisse der

Deming-Regressionsanalyse sind unten gezeigt.

0

500

1,000

1,500

2,000

0 500 1,000 1,500 2,000

My

5-F

UT

MB

eck

man

AU

400

[ng

/mL

]

LC-MS/MS [ng/mL]

Deming Regression

1:1 LineSteigung = 1,017

y-Schnittpunkt = 6,78

Korrelationskoeffizient (R) = 0,9925

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