Универзитет "Св.Климент Охридски" – Битола

Технолошко – технички факултет – Велес

Нутриционизам

Предмет: Аналитика на храна

Тема: Методи за одредување на витамини

Ментор: Изработиле:

Доцент д-р. Горица Павловска Кристина Трајкоска, 46

Вера Костовска, 26

Содржина:

1.Вовед ..........................................................................................................................3

2.Главен дел

Одредување на витамин А ............................................................................................4

Одредување на витамин Д ............................................................................................7

Одредување на витамин Б1 ........................................................................................12

Одредување на витамин Б2 ........................................................................................17

3.Заклучок ..................................................................................................................22

4.Користена литература .......................................................................................23

2

Вовед

Витамините (латински: vita-живот; amin-амин, органско соединение со

азот) се комплексни соединенија од различна хемиска природа кои се важни за

нормалното биолошко функционирање на многу живи суштества. Поточно,

тие во многу мали количини се потребни за растењето, нормалното

функционирање на клетките и ткивата и општо, за одржување на здравјето.

Растенијата и некои микроорганизми се способни сами да ги синтетизираат

сите потребни витамини, додека животните одредени витамини ги создаваат

сами, а други мора да ги внесат преку исхраната. Витамините се делат на

витамини растворливи во вода и витамини растворливи во масти.

Витамините се среќаваат во две основни форми: активна (дејствуваат

веднаш во организмот) и неактивна (за да дејствуваат, треба да се

активираат). Повеќето витамини, животните ги внесуваат во активна

форма, но има и такви, како витамините A и D кои се внесуваат во организмот

во неактивна форма. Витамините во неактивна форма се означуваат како

провитамини. Сите витамини растворливи во вода, освен витаминот C,

влегуваат во структурата на одредени ензими како коензими.

3

Витамин А

Витаминот А (или ретинол) е првиот откриен витамин, па затоа е именуван

со првата буква од латиницата. За првпат бил препознаен во 1913 година. Тој е

особено важен за одржување на видот (на очите), за добрата состојба на коските,

кожата, косата, забите и непцата. Без доволно витамин А, организмот е посклон

кон инфекции. Овој витамин е еден од најактивните антиоксиданси, а помага и во

заштитата на кожата од штетните сончеви зраци. Особено е важен во лекувањето

на акни и мали брчки. Докажано е дека витаминот А дејствува профилактично кај

некои видови рак, помага за намалување на нивото на лош холестерол и го

намалува ризикот од срцеви заболувања.

Одредување на витаминот А

Одредувањето на витаминот А се извршува спектрофотометриски или

колориметриски. Спектрофотометриските методи се брзи и точни, но можат да се

применат само ако материјалот за анализа не содржи други супстанци кои на

истата бранова должина имаат максимална апсорпција. Со овој метод се

одредува витаминот А во масло или суви концентрати, фармацевтски препарати,

мултивитамински препарати и слични производи.

За одредување на витаминот А во намирници од животинско потекло, како

на пример во млеко, маргарин, месни производи, а исто така и во сточната храна

се користат калориметриски методи.

4

Колориметриска (фотометриска) метода по Carr Price

Антимон – трихлорид метода

Принцип:

Методата се заснова на мерење на нестабилната плава боја, која настанува

со реакција на витаминот А со раствор на антимон трихлорид во хлороформ на

620 nm. За да се изведи Carr Price – ова реакција, витаминот А од испитуваниот

материјал се екстрахира по постапка, која во принцип се состои од повеќе фази

(екстракција масти, нивна сапунификација и екстракција на витаминот А од

неосапунетиот дел). Во пречистениот (после хроматографското раздвојување на

витаминот А од останатите материи) елуат витамин А, се изведува рекација со

SbCl3 и на основа на интензитетот на резултатот од обоеноста се одредува

витаминот А.

Реагенси:

1. Етар без пероксид (Rg. 71)

2. Петролетар, чист дестилат (tk. 300 – 400 C)

3. Боца со азот

4. Натриум сулфат, безводен

5. Хидрохинон (во прав)

6. Калиум – хидроксид

7. Калиум – хидроксид, раствор во метанол (Rg. 124)

8. Етанол, 96 %

9. Фенолфталеин, 1% раствор (Rg. 74)

10. Хлороформ, без вода, алкохол и фосген (Rg. 93)

11. Петролетар, чист дестилат (tk. 900 – 1150 C)

12. Алуминиум – оксид, базен или неутрален, припреман за

хроматографска анализа (Rg.5)

13. Смеша за елуирање: 15 цм3 етер без пероксид се дополнува до 100

цм3 петролетер (300 – 400 C)

5

14. Антимон – трихлорид, раствор во хлороформ (Rg.22)

15. Витамин А – ацетат, кристален

Постапка: Одредување на витамини

Во 2 цм3 се раствора витамин А во хлороформ, со специјална бирета за

дозирање реагенс антимон трихлорид, се додава 10 цм3 SbCl3 и се мери

екстинкцијата на 620 nm, спрема чистиот хлороформ или спрема смешата 2 цм3

хлороформ и 10 цм3 раствор на антимон – трихлорид. Читањето мора да се

изведи во текот на 5 секунди. На база на прочитаната екстинкција, спрема

стандардната крива се одредува содржината на витаминот А во пробата и се води

сметка за евентуалното можно разредување и одмерената количина на

резултатот од примерокот се изразува во mg ( или во интернационални единици)

витамин А на 100 гр. (или 1кг. Или 1 dm3) примерок.

За конструирање на стандардната крива се користи раствор на витамин А1 –

ацетат ( ретинол и витамин А1 – ацетат даваат ист интензитет на боење по Carr

Price). Одредена количина кристален витамин А1 – ацетат се раствора во

петролетер (900 - 1150 C) и се упарува во вакуум додека не се исуши. Во сувиот

остаток се додава толку хлороформ за да во 2 цм3 раствор ќе се наоѓа 0.5-50 IJ

витамин А1 – ацетат. Со 2 цм3 раствор на хлороформ и 10 цм3 раствор на SbCl3 се

изведува Carr – Price – овата реакција.

6

Одредување на витамин Д

Витаминот Д се создава по природен пат во човечкото тело, кога тоа е

изложено на сонце. Поради тоа, познат е и како “сончевиот” витамин. На сите ни е

познато дека витаминот Д е особено важен за коските. Тој помага за полесно

апсорбирање на калциумот. Недостатокот на калциум води до рахитис

(омекнување и деформирање на коските) кај децата и остеопороза кај возрасните.

Витаминот Д помага за побрзо зараснување на повредите на коските кај

повозрасните луѓе.

Одредување на витаминот Д

Одредувањето на витаминот Д се врши спектрофотометриски,

колориметриски или со биолошки методи.

Спектрофотометриското одредување, кое се состои во мерење на

апсорпцијата во UV – областа, на 265 nm, е погодно само за одредување на

содржината на витаминот Д во концентрати, чисти раствори на витамин Д и

препарати од овој витамин. При анализа на намирници од животинско потекло не

се користи.

Колориметриските методи се засонаваат на мерење на интензитетот на

обоеноста, настанати во реакција на витамин Д со антимон – трихлорид во

присуство на ацетилхлорид.

7

Биолошките методи се најпогодни. Меѓутоа, кај овие методи, како и кај

хемиските, потешкотија претставува присуството на провитамин Д, соединенија

кои настануваат од витаминот Д при термичка обработка на намирниците, а не

можат аналитички да се раздвојат од витаминот Д.

За одредување на витаминот Д во намирниците од животинско потекло,

најсоодветни се биолошките методи, како најпрецизни. Во аналитичката пракса се

користат и колориметриските методи, но во ограничен опсег ( главно во

маргаринот и рибино масло).

Фотометриска метода по Brockman I Chen, модификована по Nield

Принцип:

Витаминот Д со раствор од SbCl3 во хлороформ даваат портокалово –

жолта боја, чиј максимум на апсорпција е 500 nm. Наспроти витаминот А, кој со

истиот реагенс дава моментно интензивна плава боја, кај витаминот Д целосното

раздвојување на боите трае од 5 – 15 минути. Со додавање на ацетилхлоридот во

растворот SbCl3, методата значајно се подобрува, а најинтензивното обојување се

постигнува за 1-2 минути, на 200 С.

8

За да се добие точна содржина на витаминот Д во испитуваниот материјал,

мора да се води сметка за присуството на другите супстанции кои сметаат за

правилно изведување на оваа метода, бидејќи реагираат со споменатите

реагенси. Покрај витаминот А, со SbCl3 реагираат и провитамините на Д, а во

извесни случаи и други супстанции кои се додаваат во маслата за корегирање на

вкус и мирис, како на пример: анхидрид малеинска киселина, деривати на

лимонска киселина и др. , во зависност од примерокот, се применуваат и различни

претходни процедури со кои се отстрануваат супстанциите кои сметаат при

одредувањето на витаминот Д.

Одредувањето на витаминот Д во оние намирници кои содржат и витамин

А, се опишува со методата за одредување на витамин Д во присуство на витамин

А. Раздвојувањето на витамин А од витаминот Д се изведува или со примена на

адсорпциони хроматографии или поделена хроматографија (на хратија или

колона).

Одредување на витамин Д во присуство на витамин А

Принцип:

Раздвојувањето на витаминот А и Д се врши со поделена хроматографија

на колона ( по O. Wiss и U. Gloor.).

Како носач на стационарна течна фаза се употребува полиетиленски прав

Hostalen W.Ekstrakt на витаминот А и Д, растворен во мобилната фаза, се

пренесува во колоната. Помошта на мобилната фаза се врши со испирање на

колоната се додека не се испере витаминот А, што се гледа по престанување на

флуоросценцијата во UV – светлости на колоната. Екстракцијата на витаминот Д

се врши со петролетер и неговата содржина се одредува со методот на антимон –

трихлорид – ацетилхлорид – реагенс.

9

Реагенси:

1.Hostalen W.

2.Песок – измиен и ижарен

3.Реагенс за поделена хроматографија

4.Етанол

5.Калиум – хидроксид, 33% раствор

6.Боца со азот

7.Етар

8.Натриум – сулфат, безводен

9.Хлороформ, заситен со вода и без алкохол

10.Антимон – трихлорид – ацетилхлорид, реагенс

11.Анхидрид оцетна киселина

12.Витамин Д2

13.Витамин Д3

14.Петролетер

10

Постапка одредување

Одмерена количина на примерокот која треба да содржи најмалку 100mg

витамин Д се сапонифицира со 400 цм3 апсолутен етанол и 5 цм3 свежо

припремен 33% раствор KOH, во водена бања за 30 минути.

Смесата потоа се лади, се мие вкупно со 50цм3 вода во инка за одвојување

и 4 пати се екстрахира по 50цм3 етер. Соберените етарски екстракти се перат со

вода до исчезнување на алкалните реакции и водата се отстранува со додавање

на безводен Na2SO4. Етарот се дестилира и во остатокот се додава мала количина

на мобилната фаза. Од тоа се пипетира 1 цм3 и се пренесува директно на

припремената колона и одма се пушта да протече со отворање на прскалките.

Понатаму на колоната се нанесува два пати по 1 цм3 мобилната фаза, а потоа се

врши елуирање со 50 цм3 од мобилната фаза. Протокот се подесува така што,

брзината на протекување на капките да биде: 1 капка за две секунди. Во текот на

овој процес се прати одвојување на витаминот А со краткотрајно осветлување UV

– ламба, 2-3 пати. Кога ќе се појави жолта флуоросценција на крајот на колоната,

се прекинува елуирање и се издувува колоната со помош на азот или јаглерод

диоксид од боцата во тиквицита од 300 цм3. Останатите честички се плакнат

квантитативно со малку петролетер. Се додава 30 цм3 петролетер, силно се

протресува, се остава прашината да слегне и да се декантира, односно

профилтрира преку филтер хартија и инка за одвојување. Екстракцијата се

повторува уште 3 пати со по 30 цм3 петролетер. Собраните петролетерски

есктракти се плакнат два пати со по 20 цм3 вода, се сушат со безводен Na2SO4 и

се упаруваат, при што последните 5-10 цм3 петролетер се предестилираат во

вакуум или со воведување на азот. Остатокот се раствора во 5 цм3 хлороформ. На

1 цм3 раствор се додава 1 цм3 хлороформ и 3 цм3 реагенс SbCl3. После 1-2 минути

се врши фотометриско одредување на витаминот Д на бранова должина од 500

nm, или колориметриско одредување со соодветни филтер (главна проба).

11

Од главната проба се изведува и слепа проба на следниот начин: 1 цм3

екстракт од хлороформ се промешува со 1 цм3 смеша која се состои од еднакви

делови на хлороформ и анхидридна оцетна киселина, во тоа се додава 3 цм3

реагенс SbCl3. Екстинкцијата на слепата проба се одредува на ист начин како и кај

главната проба. Разликата во екстинкцијата на главната и слепата проба служи за

пресметување на количината на витаминот Д спрема стандардната крива.

Одредување на витамин Б1

Најважните природни претставници на соединенијата кои го поседуваат

дејството на витаминот Б1 се тиамин и неговите деривати: тиамин - монофосфат,

тиамин – пирофосфат, тиамин – дисулфид и алитиамин. Тиаминот е широко

распространет во намирниците и од растително и животинско потекло, но само

мал број на намирници го содржат во нешто поголеми количини. Рафинираните

прехранбени производи (шеќер, масло, масти) не содржат тиамин.

Тиаминот и неговите деривати (природни или синтетски) лесно се

раствораат во вода, а практично се нераствроливи во масти и органски

растворувачи, освен алитиаминот кој лесно се раствора во метанол и етанол.

Чистите супстанции на витаминот од оваа група се безбојни кристали, кои

при разложување се топат на 248 – 2500С.

12

Методи за одредување на тиаминот

За одредување и докажување на тиаминот може да се користат бројни

методи: колориметриски, флуорометриски и поларографски. Флуорометриската

метода е најспецифична и во пракса исклучиво се користи при анализа на

животински намирници. Поларографската метода се користи само при анализи на

фармацевтските производи. Во намирниците освен слободен тиамин, се наоѓаат и

неговите деривати: фосфатни естри и тиамин дисулфид. Овие соединенија со

оксидација не се преведуваат во тиохром, па така вкупната содржина на

тиаминот, мора да се применат постапки за ослободување на тиаминот од

неговите деривати.

13

14

Одредување на тиаминот со тиохром – метод

Принцип:

Тиаминот од намирниците се екстрахира во кисела средина, а потоа во

алкална средина оксидира во тиохром, соединение со интензивна плава боја со

изразена флуоросценција. На основа на интензитетот на флуоросценцијата се

одредува содржината на тиаминот.

Реагенси:

1. Сулфурна киселина

2. Парафинско масло

3. Натриум ацетат

4. Катјонски изменувач, активиран

5. Калиум – хлорид, кисел раствор

6. Бром-цијан раствор

7. Натриум – хидроксид, 30% раствор

8. Изобутанол, за одредување тиамин

9. Етанол, 96% дестилиран

10. Натриум – бисулфит, прашкаст

11. Тиаминхлорид – хидрохлорид, стандарден раствор

Постапка:

Екстракција

25 гр. На примерокот се меша со 125 цм3 0,1 М , H2SO4 и се загрева 15

минути во автоклав на 105-1100С. После загревањето , се лади на собна

температура, квантитативно се пренесува во одмерена тиквица од 250 цм3, со

испирање во дестилирана вода (тиквицата не се дополнува).

15

Преведување на дериватите на тиаминот во слободен тиамин

Соединенијата на тиаминот со протеините се хидролизираат уште при

самата екстракција. Тиамин – фосфатните естри се хидролизираат со ензимско

третирање на екстрактот, по следната постапка:

Киселиот екстракт во одмерена тиквица се доведува на температура од

450С и се додава раствор од натриум – ацетат. Тогаш се додава 0,5 гр. Ензим и се

остава 20 минути на температура од 450С во водена бања во темнина. После

стоењето, се лади на собна температура, се додава уште еднаш 20 цм3 2,5 М

раствор натриум – ацетат, се дополнува со дестилирана вода до 250 цм3, силно се

протресува и се филтрира низ обичен филтер хартија, при што првите 15 цм3

филтрат се исфрлаат, а останатиот филтрат служи за понатамошната работа. Од

тиаминот-дисулфидот и неговите естери тиаминот се извлекува на следниот

начин: Слабиот кисел екстракт се додава 0,1 гр хидрохлорид и се загрева на

водена бања за време од 30 минути, потоа се лади и се пропушта заради

пречистување.

Оксидација на тиаминот во тиохром

10 цм3 елуат се пренесува во кивета за центрифугирање, се додава 3 цм3

раствор бром-цијан, добро се промешува и се додава 2 цм3 30% раствор NaOH.

Смешата со 15 цм3 изобутанол се меша околу 1 минута и потоа се центрифугира 3

минути. Од изобутаналниот слој се зема 10 цм3, се пренесува во одмерена

тиквица од 25 цм3 и се дополнува со етанол до ознаката.

Припрема на слепата проба

10 цм3 протечениот раствор се мери во кивета за центрифугирање, се

додава 20-50 мг натриум – бисулфит и се остава да стои 15 минути во водена

бања. Се лади на собна температура и потоа се додава раствор на бром – цијан и

во потполност се спроведува опишаната постапка на оксидацијата на тиаминот.

16

Методи за одредување на Рибофлавинот – Б2

За одредување на рибофлавинот се користат повеќе методи, во зависност

од видот на испитуваниот материјал: мерење карактеристична жолто – зелена

флуросценција на рибофлавинот, лумифлавин – метода, фотометриско мерење

на интензитетот на жолтата боја на својствениот рибофлавин, поларографска

метода. За одредување на рибофлавинот во животинските намирници се користат

флуорометриска и лумифлавинска метода.

Флурометриска метода – по Strohecker I Henninд

Интензитетот на жолто – зелената флуросценција на рибофлавинот во UV –

светлост, зависи од концентрацијата и pH растворот. Максималниот интензитет

флуросценција лежи измеѓу pH 6 и 7. Меѓутоа, флуорометриските мерења главно

не се изведуваат во оваа област на pH, туку при pH 3 и 5, со обзир на тоа дека во

таа област интензитетот на флуросценцијата е константет и зависи само од

концентрацијата на рибофлавинот, а не од концентрацијата на соли и другите

пратечки материја.

17

Реагенси:

1.Хлороводородна киселина

2.Метанол – хлороводородна киселина

3.Ацетон – оцетна киселина

4.Натриум – хидроксид, 0,5 раствор

5.Диастаза, ензимски препарат

6.Хлороводородна киселина, 1 М раствор

7.Калиум – перманганат, 4 % раствор

8.Рибофлавин, стандарден раствор

9.Хидроген пероксид, 3 % раствор

10.Натриум – дитионат

Екстракција на рибофлавинот и неговиот фосфатен естер

Материјалот претхнодно се иситнува, а по потреба се обезмастува, потоа

се загрева со 0,1 М HCl во водена бања од половина до еден час при јако

мешање. Рибофлавинот може да се екстрахира во автоклав во време од пола час

на 1210С.

Влажниот растителен материјал, се иситнува со вода во соодветен млин и

потоа се загрева уште пола сат со 0,1 М HCl во водена бања. Материјалот кој што

содржи повеќе скроб подобро се екстрахира со смеша метанол-хлороводородна

киселина или смеша ацетон- оцетна киселина, во повратен ладилник. Органски

растворувач, метанол или ацетон, после екстракцијата се дестилира.

18

Пречистувањето на екстрактот се постигнува со додавање на метанол или ацетон.

Бистриот филтрат или центрифугат се подесува така да содржи 0,5 – 5,0 мг

рибофлавин.

Мерење на флуросценцијата

Во кивета со фотоелектричен флуорометар се става раствор P1.

Флуоросценцијата на овој раствор се подесува на мерен инструмент на вредност

на скалата 30, 35 или 40. Тогаш содржината од киветата повторно се враќа во

садот во кој се наоѓа растворот P1. Потоа со ред се мери флуоросценцијата на

растворите P1, Z1 и Z2 на ист начин, така што при тоа не се промени подесената

вредност на главанометар. Растворот од киветата повторно се враќа во

соодветниот сад.

За да се изгасни флуоросценцијата во сите 4 раствори се додава по 20 мг

натриум – дитионат (N2, S2, O4) силно се протресува, се става во киветата и се

одредува флуорометриски.

19

Лумифлавинска метода

Оваа метода е специфична за одредување на рибофлавинот, бидејќи

останатите флавини директно не сметаат на флуорометриското или

фотометриското одредување не се преведуваат во лумифлавин. Лумифлавинот

после зрачење се издвојува од повторно закиселениот раствор на хлороформот и

се одредува фотометриски на 450 nm или флуорометриски.

Реагенси:

1.Реагенси за екстракција и ензимско третирање

2.Хлороформ – безводен

3.Пепсин – ензимски препарат

4.Натриум – сулфат, безводен

5.Рибофлавин, стандарден раствор

6.Натриум – хидроксид, 15 % раствор

7.Оцетна киселина

Постапка:

Екстракцијата на риофлавинот и неговите фосфатни естери од

животинските намирници се врши како што е опишано во претходните методи.

При што рибофлавинот со загревање се издвојува од соединенијата каде е

поврзан со протеините, растворот се доведува до pH 4,5 и се третира со

дијастазата, како што веќе е наведено. Растворот се лади на собна температура,

се дополнува до ознаката во соодветната одмерена тиквица и се филтрира.

Првите неколку цм3 филтрат се исфрлуваат. Потоа се центрифугира додека не се

одвојат двете фази. На бистрата водена фаза се додава NaOH до јасно алкална

реакција и во одмерената тиквица се разблажува до 4 проби од 1 мг до 10 мг

20

рибофлавин. 4 проби на одбраната запремнина се преместуваат во шолја за

кристализација. Во две шолји се додава толку стандарден раствор на рибофлавин

колку што концентрацијата на витаминот се обезбедува во пробата, а во другите

две се додава соодветна количина на вода. Потоа една по друга или сите заедно

се озрачуваат на пример со ламба од 100 вати, на растојание од 10цм , во рок од

10 минути. Озрачените раствори потоа се закиселуваат со оцетна киселина и еден

со друг се екстрахираат 3 пати со по 6 цм3 хлороформ. Хлороформните екстракти

потоа се соединуваат и се дополнуваат со хлороформ до 20 цм3 и се сушат со

безводен Na2SO4. Потоа следува флуорометриско мерење како што е претставено

во другите методи.

21

Заклучок

Квантитативните и квалитативните анализи за витаминска концентрација во

прехранбените производи се значајни поради диететските препораки и извори на

специфичните витамини. Од нивната застапеност во одреден вид на храна може

да се укаже на тоа за која тип на диета и за кој вид на болести би можеле да си

искористат различните витамини. Делумниот недостиг на определен витамин во

организмот се нарекува хиповитаминоза, додека целосниот недостиг-

авитаминоза. Меѓутоа, и преголемата застапеност на одреден витамин во

организмот е штетна, состојба означена како хипервитаминоза. При различните

хипо-, а- или хипервитаминози, доаѓа до различни нарушувања на организмот.

22

Користена литература

http://www.biolab.cn/plus/view-241637-1.html

Анализа на животните намирници, Ј.Трајкович; М. Мирич

http://www.dionex.com/en-us/images/page-cgram/old-cgram/img-80219-

img41088-determination-vitamins-b1-b2-b3-b6-290nm.jpg

23