银杏雌雄株性别鉴别的研究进展

程勤贤程勤贤

2004.12.212004.12.21

银杏雌雄异株 ,实生苗定植后一般需要 20～ 30 年才能开花结果 ,分出雌雄。由于银杏种子在成熟时具有一种特殊的臭味 ,因此 ,城市绿化需要雄株 ,而以生产白果为目的的银杏栽培主要需要雌株。因此银杏实生幼苗的性别早期鉴定 ,不仅具有理论意义 ,同时也具有实用价值。国内外学者曾在其形态学、生理生化指标、同工酶谱、染色体核型和分子标记鉴定等方面进行了研究 , 为进一步研究、开发和利用银杏这一珍贵资源提供依据和参考。

     1. 形态学鉴定研究外观形态 雄株 雌株

种籽 种籽具尖头三棱 种籽近圆形二棱

苗期 侧枝与主干间夹角内有一些较大的叶片

侧枝与主干间夹角内无叶片

树冠 同龄树植株高大 , 形成树冠时间早 , 枝多而乱 , 呈广卵圆形

同龄树植株矮小

叶片 叶片大 , 锯齿缺刻深 叶小 , 叶端多为浅裂

花 雄花花序为柔荑状花序 ,外形似桑椹

雌花长在花梗顶端 , 分作两叉 , 外形如火柴梗

花芽 雄花花芽大而饱满 , 顶部稍平

雌花花芽瘦而稍尖

树枝成龄树 , 雄株主枝与主干夹角较小 , 多在 30 度左右较挺直 , 生长势强 , 短枝较短 ,一般仅１～２厘米

雌株主枝与主干的夹角大 ,可达 50 度 , 向四周扩展 , 生长势弱 , 短果枝因连年结果 ,枝条延伸较长 , 可达 10 厘米物候期 雄株比雌株发芽早、落叶迟

2. 生理生化研究

许多的研究表明 , 雌雄的代谢差异集中表现在氧化还原能力方面。一般说来 , 雌性器官或个体处于较还原状态 , 而雄性的处于相对氧化状态。赵云云等对银杏雌雄株氨基酸组分及含量进行了研究 , 发现银杏雌雄株的氨基酸平均含量有差异 , 雄株高于雌株 , 其中胱氨酸和酪氨酸含量较为突出。对银杏雌雄株的代谢差异检测发现雌雄株叶绿素和维生素Ｃ的含量有差异。以高效液相色谱 ( ＨＰＬＣ ) 法分析银杏树种中酸性醇溶性酚类物质的结果表明 , 不同性别的植株之间存在明显的性别相关峰 , 这些树种叶片水溶性酚类物质总量的测定结果是雌株普遍高于雄株 , 经检验这种差异达到极显著水平。

王双明等分别对两种不同树龄的雌雄银杏植株叶片进行了多项生理生化的比较分析 , 结果表明（表 1 ， 2 ） : 雄株叶片的叶绿素、可溶性糖、蛋白质含量及 CAT 、 POD 活性均大于雌株叶片。这表明不同性别的银杏叶片在一系列生理生化特性上均存在较明显的差异。

注：样品 1 为 9 年生雄株 ; 样品 2 为 9 年生雌株 ; 样品 3 为 4 年生雄株 ; 样品 4 为 4 年生雌株

王白坡等分析了银杏雌雄株芽尖及叶片中内源激 素 含 量 , 结 果 表 明（右图） , 在整个生长季节雌株芽尖中ＧＡ 3

和ＺＴ的平均含量比雄株 高 20% 以 上 ; 而 ＩＡＡ和ＡＢＡ相反 , 雄株高于雌株 , 证实了成年银杏不同性别间内源激素水平存在着一定差异 ,但未对幼龄银杏实生树进行系统研究。

图 1 银杏生长期内源激素含量变化

蔡汝等作了银杏雌雄株叶片光合特性、蒸腾速率及产量的比较研究 , 结果表明（表3、4、5） , 银杏雌雄株叶片的光合能力、蒸腾速率及构成叶片产量的部分因子存在明显差异。银杏雄株叶片光合速率高于雌株 15.19% ～ 20.88%,蒸腾速率高于雌株 41.91% ～ 52.92%, 雄株的叶面积与鲜质量均高于雌株。除此之外 , 对一些雌雄异株植物还进行了胡萝卜素含量和呼吸强度等生理指标比较研究 , 发现雌雄株之间存在一定的差异性。

表 3 　银杏雌雄株的净光合速率单位 :μmol(CO2)/(m

2·s)表 4 　银杏雌雄株蒸腾速率

单位 :mmol(H2O)/(m2·s)

表 5 　银杏雌、雄株叶片性状比较

以上生理生化指标大多力求从不同侧面寻找已知性别的成年植株之间的差异性 ,尽管有些差异在苗期也有反映 ,但多表现在量的方面 , 能否用于苗木早期性别鉴定有待于进一步研究。

3. 染色体核型研究 染色体形态特征是进行银杏雌雄性别鉴定的重要方法之一 ,也是最直接的遗传学证据。国内外有关银杏染色体组成及性染色体的研究已有报道。 Tanaka 等描述了叶片的染色体组成 ,并发现第 1对大染色体的短臂上及第 8 对染色体的长臂上有随体 ,但没有报道性染色体存在的证据。 Newcomer通过观察发现大染色体存在二型性 , 在大约一半的小孢子中表现为中部着丝粒染色体 , 而在另一半小孢子中出现次中部着丝粒染色体 ,推测这种二型染色体与银杏的性别决定有关。 C.L.Lee( 李正理 ) 及 Pollock 的研究结果表明 ,银杏雌雄株的染色体具有形态上的不同 , 雌株 4 条染色体上有随体 ,而雄株只有 3 条染色体上有随体。在雄株中的 1 对最短的次端部着丝粒染色体中 ,只有其中的 1 条染色体上出现随体 , 因此认为这1 对染色体即为性染色体 ,并提出银杏的性别决定机制属ＸＹ型 ,雌株为ＸＸ型 , 雄株为ＸＹ型。这与陈瑞阳认为银杏的性别决定机制属ＷＺ型 , 雄株为ＺＺ型 , 雌株为ＷＺ型的结论不尽一致。

陈学森等研究发现 , 银杏雌雄株染色体数目及核型一致 ,唯一区别是雌株 4 条染色体上有随体 , 而雄株仅有 3 条染色体上有随体 , 与李正理的结论完全一致 , 因此他认为第 10 对亚中部着丝粒染色体可能为性染色体 ,并给出了银杏雌雄株的核型为 2n=2x=24=4m(2sat)+8sm(2sat)+12st 。

第 1 、 2 对为具中部着丝粒染色体，其中第 1 对大染色体的短臂上各有一个随体；第 4 、 8 、 9 、 10 对为具亚中部着丝粒染色体，其中第10 对染色体的长臂上雄株仅一条染色体具随体，而雌株两条染色体 上都有随体；第 3 、 5 、 6 、 7 、 11 、 12 对为具亚端部着丝粒染色体，最长染色体与最短染色体之比为 2.07 ，属 3B型，相对长度在 6.72%~13.88% 之间。

4. 同工酶谱研究

钟诲文等经过 4ａ对 2 株已知雌雄性别的银杏采用不同提取液提取、不同电泳方法和不同的显色方法进行鉴定 ,所得的过氧化物酶图谱基本相同 , 雌雄株间存在有规律性的差异 ,即雌株幼叶较雄株有较多的过氧化物酶区带 ,并利用这一区带对 12 株已知性别的银杏植株进行了过氧化物同工酶的普查 , 显示出与定点观察同样的结果 , 在对 9 株未知性别的银杏植株进行鉴定中 ,取得了与雌雄株一致的 2 种类型的过氧化物同工酶的图谱 ,从而说明了银杏苗木之间过氧化物同工酶的差异 , 可能成为银杏性别鉴定的生理生化指标。

杜希华等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对已知性别的银杏成年大树 ( 树龄 40 年以上 ) 、在形态上尚未分化出雌雄的实生苗 ( 苗龄2 ～ 3 年 ) 、实生幼苗 ( 苗龄 40天 ) 以及雌雄树叶诱导的愈伤组织进行过氧化物酶同工酶的测定（表7），上述酶带差异不一定是雌雄性别造成的 , 有可能与其他性状的变异有关 ,诸如叶片性状等 , 这些变异在银杏雌雄株内普遍存在 ,且由于在早期鉴定时 , 可选择的酶种类较少 , 显色的酶带不多 , 有时并不能区分开雌雄株。

表 7 　银杏过氧化物同工酶相对泳动率

成年树雌雄株的酶谱存在着差异 , 雌株较雄株有较多的酶带 ,且有两条酶带的电泳迁移率相同 ,但活性不同。实生苗和实生幼苗酶带比成树的明显减少 ,且在不同株中的活性趋于相同。而对已知性别成年树叶片诱导的愈伤组织进行检测 , 其酶谱与成树、实生苗和实生幼苗的明显不同 ,但均出现了雌雄成树共同具有一条酶带 ,且活性极强。

5. 分子生物学研究

80 年代发展起来的分子标记技术是一组可以检测出大量ＤＮＡ位点差异性的分子生物学技术 ,它是在遗传信息的载体———ＤＮＡ水平上研究不同生物个体间的差异 , 不受环境条件、发育阶段、不同器官和组织的影响 , 而且基因组ＤＮＡ的变异非常丰富 , 分子标记的数目几乎是无限的。

目前用于植物种质资源研究的分子遗传标记技术主要有两大类 :一类是以分子杂交为基础 RFLP(Restriction Fragment Leng

th Polymorphism ) 限制性片段长度多态性另一类是以聚合酶链式反应 (ＰＣＲ )为基础的标记 ,包括

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs) 随机扩增多态性ＤＮＡAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 扩增片段

长度多态性SSR(Simple Sequence Repeats) 简单序列重复亦称微卫星ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 锚定微卫星SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性

目前报道用于银杏性别鉴定的分子标记主要有 RAPD。王晓梅等应用 RAPD 技术，通过 300个随机单引物及 200对随机双引物组合，检测雌雄异株银杏基因组 DNA的多态性，结论为雌雄基因组间的相似性为 99.98%，仅获得 1个与银杏雄性基因组相关的 RAPD标记，其引物序列为 TGATCCCTGG。姜凌等也利用 RAPD 技术寻找银杏中与性别相关的分子标记，得出一条大小为 682bp、雄性特异的分子标记。黄代青等采用玻璃针分离法 ,通过显微操作系统成功地分离了随体较为明显的那条第 1染色体。并将分离到的单条染色体去蛋白 ,Sau3A酶切 ,并在染色体 DNA 片段两端加上 Sau3A人工接头 ,进行 2轮 PCR 扩增 ,得到了大小为 300-3000bp 的扩增片段。用第 2轮 PCR产物构建质粒文库 ,得到了约含有 75000 个重组子的该染色体 DNA文库。随机挑取 66 个重组子进行分析 , 发现插入片段大小主要分布在 500-2000bp, 平均为 800bp 。该文库为银杏第 1染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆以及性染色体的鉴别等研究提供了基础。

6. 展望

银杏雌雄株之间的差异归根结底是ＤＮＡ分子之间的差异 ,利用分子标记在ＤＮＡ分子水平上去研究雌雄株之间的差异性 ,从中找到鉴别雌雄株的特异性ＤＮＡ片段 , 对此进行测序 , 进而制备ＤＮＡ探针或试剂盒 ,使得人们在幼苗期就能够对银杏雌雄株的性别进行鉴定。随着分子生物学技术的日益发展 , 分子生物学鉴定已成为一种可靠的鉴别途径 ,也可能是最终解决银杏雌雄株鉴定的最好方法。

谢谢