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男性不育诊疗进展陈振文

国家人口计生委科研所

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男性不育诊疗的新进展： 诊断 常规治疗 辅助生殖技术

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男性不育诊疗的基本规范： 病史、体格检查（一般检查和专科检

查）、实验室检查及其他辅助检查

药物治疗、手术治疗、辅助生殖技术

WHO 男性不育标准化检查和诊疗手册

（英文版 2000 ，中文版 2007 ）

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男性不育的诊断 病史 体格检查 实验室检查 影像学及其他检查

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病史采集 原发还是继发不育？自然不育的时间？ 既往的诊疗情况？ 可能影响生育的病史？

发热、药物、手术、外伤、泌尿生殖系炎症、性传播疾病以及全身性疾病（ DM 、 TB 、甲亢、肾衰）等；其他因素如环境职业因素、不良生活习惯等。

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体格检查

一般检查： 身高、体重、血压、毛发分布、乳房等

专科检查： 阴茎、阴囊、睾丸、附睾、输精管、精索静脉、腹股沟

区、前列腺及精囊等。

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实验室检查 精液常规分析 性激素： FSH 、 T 、 PRL 、 LH 以及抑制素 B 等

遗传学分析：染色体核型分析、 Y 染色体微缺失、 CF

基因突变等

其他：血常规、血沉、 HIV 、尿常规、性高潮后尿液、前列腺液等

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其他辅助检查

生殖系 B 超

超声多普勒

下丘脑垂体 CT / MRI

睾丸活检

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男性不育诊断的进展

精液常规分析—— WHO 第 5 版手册

评估精子功能的新指标：

精子 DNA 完整性、精子凋亡等

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精液常规分析—— WHO 第 5 版手册

精液常规分析是男性不育实验室检查的重要内容。

2010 年， WHO 制定出版了“人类精子检查与处理实验室手册”，重新对精液常规分析的技术操作、结果判断等方面进行了规范。

2011 年 2 月，该手册中文版正式由人民卫生出版社出版发行。

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在新版手册中，关于“精液分析”的修订主要涉及： 精液的采集和初步肉眼观察； 精子浓度和精子总数的测定； 精子活动力分级； 精子形态学评估； 精液参考值范围。

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精液采集和体积测定

在收集精液的容器中

直接测量

根据重量间接计算精液体积，假定精液比重为 1 g/ml （实际为实际为 1.014 g/ml1.014 g/ml

）来计算 。（首选方法）1 、秤取容器的重量，2 、秤取装有精液的容器的重量，3 、计算重量之差（ g = ml ）

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精子浓度和总数的测定

WHO4 WHO5

精子密度 精子浓度 精子总数 /每次射精：更能准确反应睾丸生精功能和输

精管道通畅程度。 精液质量的评估要检测 2~3次精液标本，获取基线数

据。

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精子浓度和总数的测定

简化精液稀释方法

增加计数池的面积

每份标本均采用两次取样、两次稀释和两次计数，每次计数

至少 200个精子，且两次计数在 95% 可信区间内。

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精子浓度和总数的测定

稀释

个数 / HP

观测

WHO4 更多更高

1+49 1+19 1+9 1+4

>200 40-200 15-40 <15

中央格 (#5)5, 10, 25小正方形

WHO5更少更低

1+19 1+4 1+1>100 16-100 2-

153 个格 (#4, 5, 6) 1 排 (20 nl)

12 factors

很少有 200个精子3 factors

总是有 200个精子

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精子数低的标本的检测 当精子浓度过低时，精子的计数常常存在很大的抽样误差，而且需要检测很多个显微视野，尤其是检测离心后的充满碎片杂质的片子往往不够清晰，因此“无精子症”的诊断容易受到影响。

新版本建议：根据检测目的和要求的不同，对“少精子症”和“可疑无精子症”的标本分别采用不同的处理方法。

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精子数低的样本：不必精确测定时 粗略估计

如果 <4/×400 HPF ( 或 <16/×200 HPF) ，则说明浓度为 “ < 2×106 /ml”

存在精子吗？取 1 ml 精液，离心 3000g×15 min ；弃上清，留下 50μl 液体；取 2 份 10μl 沉淀加于载片，分别加盖 22mm×22mm盖片 (20μm

深 ) ；观察整个盖片，如果发现精子，则为“隐匿精子症”。

存在活动精子吗？将 40 μl 精液置于 24mm×50mm 盖片下 (33μm 深 ) ；观察整个盖片 ，如发现活动精子，则计数活动精子的个数。

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精子数低的样本：需要精确评估时减少稀释倍数、测定更大的体积

福尔马林 1:1稀释，相差显微镜检测

福尔马林 1:1稀释， Hoechst 33342 染色，荧光显微镜检测

如果观察到 <25 个精子 , 表明“ <56,000/ ml” 或 “ <2,000 /ml”

计数所有 9 个格子 =900 nl

计数所有计数池= 25,000 nl

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精子前向运动的情况与受孕具有密切的关联；新版手册对精子活动力的分类方法进行了修订。

精子活动力的分类 前向运动（ Progressive motility ， PR ） 非前向运动（ Non-progressive motility ， N

P ） 不运动（ Immotility ， IM ）

精子活动力评估

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精子活动力分级 按以下标准评估： WHO4 WHO5 不动 d 级 IM 非前向运动 c 级 NP 前向运动 PR 慢速 b 级 快速 a 级（ >25um/s ， 37℃ ）

以往将前向运动精子分为快速和慢速，以 37℃ 时速度>25μm/sec 作为a 级。但是对于技术员来说，很难如此精确无误地判断前向运动，新的分类方法更具有可操作性。

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精子形态学：染色方法 推荐采用 Papanicolaou 、 Shorr 或 Diff-Quik 染色法。

使用光学显微镜观察，精子头部顶体区为浅蓝色、顶

体后区为深蓝色，中段略呈红色，尾部为蓝色或红色。

残余的胞浆小滴染成粉红色或橙红色。

采用Kruger’s严格形态学标准评估。

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精液的参考值范围 新版手册对正常生育男性额精液参考值范围进行了修订。 为此，采纳了多个国家的千余份精液标本的原始数据，提供这些标本的男性均在最近曾使女方生育。

在数据统计方面，采用了单侧参考值区间、以第 5百分位数作为参考值下限。

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精液常规分析参考值范围（第 5版）

参数 参考值下限

精液体积（ml） 1.5 （ 1.4-1.7）

精子总数（ 106 / 次射精） 39 （ 33-46）

精子浓度（ 106/ml） 15 （ 12-16）

总活动率（ PR+NP ， %） 40 （ 38-42）

前向活动率（ PR ， %） 32 （ 31-34）

存活率（存活精子，%） 58 （ 55-63）

精子形态学（正常形态，%） 4 （ 3.0-4.0）

其他参数

pH ≥7.2

过氧化物酶阳性白细胞（ 106/ml） <1.0

MAR试验（附着粒上的活动精子，%） <50

免疫珠试验（附着珠上的活动精子，%） <50

精浆锌（ μmol/射精） ≥2.4

精浆果糖（ μmol/射精） ≥13

精浆中性葡糖苷酶（mU/射精） ≥20

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精子功能的新指标 精子 DNA 完整性

精子细胞核 DNA 是遗传信息的载体，对于受精和胚胎发育至关重要。随着 ART 的广泛应用，精子浓度和活力不足对生殖的影响均可得到一定程度的克服， DNA 的重要性就更为突出。

检测技术有 TUNEL 、精子染色质结构分析（ SCSA ）、精子染色质扩散（ SCD ）、彗星试验（ Comet ）等。

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精子 DNA损伤图像（ SCD试验和 Comet试验）引自 Actas Urol Esp.2007;31(2):120-131

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精子功能的新指标 研究提示，精子 DNA碎片化水平增高可能与男性不育、复发性流产相关，并可导致 IVF/ICSI 治疗周期中的受精率、妊娠率降低，流产率增高。

男性不育：谷龙杰 , 陈振文等（中国男科学杂志 ,2009 ）报道，一组不育男性精子

TUNEL阳性率为 16% ，显著高于对照组的 9.6% 。 复发性流产： Carrell DT 等（ Arch Androl,2003 ）报道，复发性流产患者男方精子

TUNEL阳性率显著高于已生育的男性或一般人群对照。 ART 不良结局： IVF 后获得临床妊娠的夫妇精子 SCD阳性率显著低于未获得妊娠的夫妇（谷龙杰 , 陈振文等 .Fertil Steril,2009 ）； Zini A 等（ Hum Reprod, 2008 ）对11项相关研究进行 meta 分析，显示精子 DNA碎片化与 IVF/ICSI 后流产有关。

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对照，精子 DNA碎片化为 10.3%

(+)

不育患者，精子 DNA碎片化为19.7%

TUNEL法检测精子 DNA碎片化谷龙杰 , 陈振文等（ 2009 ）

(+)

(-)

(-)

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森林图——精子 DNA损伤与 IVF/ICSI 后流产有关Zini A, et al. Hum Reprod 2008;23(12):2663-2668

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精子功能的新指标

目前在精子 DNA碎片化检测与自然或助孕的妊娠率之间的相关性还不能完全确立，有待进一步的研究，所以尚未被列为男性不育的常规检测项目；但随着研究的不断深入，该指标日益得到广泛的关注，有望在不久成为精液质量评估的又一个重要参数。

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精子功能的新指标

精子凋亡 研究显示，精液中部分精子具有细胞凋亡的特征性改变；

在不育男性的精液中，凋亡精子所占百分比显著增高。（张浩波等 . Asian J Androl; 2008,10:227-235. ）

检测方法： TUNEL 、 Annexin-V 等。

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凋亡精子的 Annexin-V/PI 染色图片 绿色箭头所指为 Annexin-V着色精子（ AV+/PI- ），具有凋亡的早期特征；红色箭头所指为两种染色同时着色精子（ AV+/PI+ ），提示细胞膜完整性已经丧失。

引自 J Membr Biol. 2011; 240(3): 165–170.

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药物治疗和手术 男性不育常规用药

抗雌激素药物：他莫西芬、克罗米芬 促性腺激素： hCG 、 hMG

抗氧化剂：维生素 E 、维生素 C

其他药物：左卡尼汀、己酮可可碱、微量元素

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药物治疗和手术 新药： rhFSH （果纳芬，重组人类促卵泡

素） 辅助生殖治疗中常用的促排卵药物 用于男性低促性腺性性腺功能减退

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为评估 rhFSH 在男性 IHH患者中的有效性和安全性，在澳大利亚、欧洲、日本及美国开展了 III期开放性临床研究。 治疗方法：先以 hCG 1000IU 每周 3次或 2000IU 每周 2

次治疗 3-6个月使血清睾酮水平达到正常，再联合使用rhFSH 150IU 每周 3次， 每 3个月评估精液参数，至精子数达到 1.5×106/mL ，最长治疗时间为 18个月。 结果： 69% 的患者精子数达到 1.5×106/mL ，平均治疗9个月； 84% 的患者有精子生成，平均治疗 6个月。 1/3

的患者增加了 rhFSH剂量至 225IU 或 300IU 每周 3次。

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研究还显示：睾丸体积大、 BMI低于 30kg/m2 、性成熟晚，可能预示患者对rhFSH 治疗的反应良好。

安全性研究：不良事件发生率低，仅在日本的研究数据显示有血清碱性磷酸酶水平升高以及体重增加等不良反应。

rhFSH 的临床研究

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药物治疗和手术

中药新药： 近年来，随着中医药研究的进步，多种针对男性不育的

中药新药走出实验室，开始为患者服务。

如生精胶囊、玄驹胶囊、仙鹿口服液等，多是在中医经典方剂基础上，结合现代科技加以改良创新，对某些少弱精子症或性功能障碍导致的不育具有一定的疗效。

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药物治疗和手术 手术治疗

显微外科输精管附睾吻合术：将显微外科技术引入输精管道重建手术中，可望提高手术后复通率及妊娠率。

张国喜、白文俊等（ Asian J Androl,2009 ）报道 49例输精管附睾吻合术，术后复通率为 71.4% ，妊娠率 26.3% 。

Ho KL 等 （ Hong Kong Med J,2009 ）报道 22例梗阻性无精子症患者的输精管附睾吻合术，复通率 57% ，自然妊娠率13.6% 。

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三角端 -侧输精管附睾显微外科吻合术

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三角端 -侧输精管附睾显微外科吻合术

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三角端 -侧输精管附睾显微外科吻合术

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Groups

8 weeks 12 weeks 16 weeks 24 weeks

T G P T G P T G P T G P

C-VE 66.7

66.7

66.7

62.5

25 10081.

775 0

60

66.7

50

T-VE 61.7

0 10056.

716.

783.

365

33.3

100

80

33.3

83.3

C-VE ：传统端侧输精管附睾显微外科吻合术 T-VE ：三角端侧输精管附睾显微外科吻合术

T(min) ：手术时间 G(%) ：精子肉芽肿发生率 P(%) ： 复通率

两种输精管 -附睾显微外科吻合术结局比较

T-VE: 65.8 20.8 91.7

C-VE: 67.7 58.4 54.2

复通率（ % ）

精子肉芽肿发生率（ % ）手术时间（ min）

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男性不育手术治疗结局 输精管显微外科吻合术复通率可高达 90％，复孕率随着结扎时间延长而降低。

年限 复通率 复孕率 *

<3 年 97％ 76％3 ～ 8 年 88％ 53％9 ～ 14 年 79％ 44％>15 年 71％ 30％

---Belker ， 1469例输精管显微外科吻合术

•术后复孕率高于 ICSI 、费用低，并可避免女方促排卵的并发症和取卵的风险。

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辅助生殖技术

辅助生殖技术的发展，特别是 ICSI 的出现，使男性不育治疗的现状发生了革命性的变化。

随着新技术的不断涌现，以往难以治疗或根本无法治疗的不育症有了治愈的希望。

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辅助生殖技术

荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization ， FISH ）检测精子染色体

对存在某些染色体异常的男性，在开展 ART 治疗前采用 FISH 检测，可了解携带正常染色体的精子所占的百分比，预测 ART成功的机会。

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精子荧光原位杂交图像

精子细胞核被 DAPI 染成蓝色，红色信号为 Y 染色体着丝粒，绿色信号为 X染色体着丝粒，箭头所指为异常精子。

引自 : 同济大学学报 ;2011,32:24-27.

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辅助生殖技术经形态学选择的精子卵细胞浆内注射（ Intracytoplasmic

morphologically selected sperm injection ， IMSI ）

更高的放大倍数、更清楚显示精子的形态学 可望改善 ART 的结局参数 Reprod Biol Endocrinol. 2011;9:99. ）

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传统 ICSI放大倍数 ×200-400 ； IMSI放大倍数可达 ×6000 。据报道，采用 IMSI选择形态正常精子治疗不育，可显著改善治疗结局。

ICSI IMSI

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　正常形态和异常形态

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活动精子的显微照片：

a – 正常核外形和内容物；

b – 正常核外形和小的核空泡；

c– 正常核外形和大的核空泡。

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组别 结果

IMSI VS ICSIIMSI (n=80)

VS ICSI (n=80)

60.0% VS

25.0%*

正常核形态 VS 无正常核形态 Best (n=39) VS

Second best (n=39)

58.0%VS

25.7%*

正常核形态 VS 有空泡的核Normal (n=28)

VSVacuoled (n=28)

50.0%VS

18.0%*

* P<0.01

妊娠率（ clinical pregnancy ）

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组别 结果

IMSI VS ICSIIMSI (n=80)

VS ICSI (n=80)

14.0% VS

40.0%*

正常核形态 VS 无正常核形态

Best (n=39) VS

Second best (n=39)

9.8%VS

33.3%*

正常核形态 VS 有空泡的核

Normal (n=28)VS

Vacuoled (n=28)

7.0%VS

80.0%*

* P<0.01

早期妊娠失败

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IMSI 后临床妊娠结果数据ICSI（末次结果） IMSI P 值

移植周期（ n ） 125 125 --

胚胎移植（ n ） 265 261 ＞ 0.05

总妊娠（ n ） 8 51 ＜ 0.001

临床妊娠（ n ） 3 47 ＜ 0.001

分娩（ n ） 0 42 ＜ 0.001

有心跳的孕囊（ n ） 2 53 ＜ 0.001

出生婴儿（ n ） 0 46 ＜ 0.001

妊娠率（%） 6.4 40.8 ＜ 0.001

临床妊娠率（ %） 2.4 37.6 ＜ 0.001

临床植入率（ %） 0.8 20.3 ＜ 0.001

分娩率（ %） 0 33.6 ＜ 0.001

出生率（ %） 0 17.6 ＜ 0.001

受试人群：施行 ICSI 2~3次失败人群。

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辅助生殖技术 ART需要人工对精子进行优选，如何从众多精子中选择最优质的精子，是一个很值得研究的问题。

上游、密度梯度离心等方法适用于质量较好的精液，但对于质量不佳的精液，存在很大的局限性。为此，开发了一些新的精子优选技术。

Effects of advanced selection methods on sperm quality and ART outcome: a

systematic review. Hum Reprod Update. 2011;17(6):719-33.

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辅助生殖技术 透明带可以与 DNA 结构完整的精子相对特异性地结合（ Liu

DY, Baker HW. Hum Reprod. 2007;22(6):1597-602. ）；另据报道显示，使用结合于透明带的精子行 ICSI ，受精及胚胎发育显著改善。

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透明质酸也可相对特异性地结合 DNA 完整的精子，提高 ART 的成功率。

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辅助生殖技术

Annexin-V磁珠分选 早期凋亡的精子细胞膜表面带有磷脂酰丝氨酸，可特异

性结合 Annexin-V ，使用 Annexin-V磁珠处理精子悬液，

可将早期凋亡的精子从与正常精子分离（ Lee TH, et al. Hum

Reprod; 2010,25:839-846. ） ，并有利于改善 ART 结局（ Rawe

VY, et al. Reprod Biomed Online. 2010;20(3):320-3. ）

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辅助生殖技术此外，流式细胞术 (Hoogendijk CF, et al. Fertil Steril;2009:1285-

92.) 、 zeta 分选 (Kheirollahi-Houhestani M, et al. Hum Reprod; 2009:2409-16.)

等新兴技术，各自利用不同的原理，试图将存在功能缺陷的精子与正常精子分离，以达到改善结局的目的，均有一些成功的案例报道。

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辅助生殖技术显微外科在手术取精中的应用—— micro-TESE

手术取精是无精子症 ART 治疗的关键步骤，采用显微外科技术可望提高取精成功率，同时减低对患者睾丸的损伤。

( Microsurgical TESE versus conventional TESE for ICSI in non-obstructive

azoospermia: a randomized controlled study. Reprod Biomed

Online. 2009;18(3):315-9. )

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辅助生殖技术通过micro-TESE ，甚至非嵌合体克氏症患者也有成功获得妊娠的机会。 (J Clin Endocrinol Metab 90: 6263–6267, 2005)

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辅助生殖技术 NOA患者的睾丸穿刺、活检标本，常常难以找到可用的精

子，如何提高找到精子的机会、提高使用这种精子的成功率，有学者进行了有益的探索。 HOS ： The use of the modified hypo-osmotic swelling test for the selection

of immotile testicular spermatozoa in patients treated with ICSI: a randomized controlled study. Hum Reprod. 2005;20(12):3435-40.

药物（己酮可可碱）处理： Clinical use of pentoxifylline for activation of immotile testicular sperm before ICSI in patients with azoospermia. J Androl. 2006;27(1):45-52.

激光： Use of a laser to detect viable but immotile spermatozoa. Andrologia. 2004;36(6):366-9.

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辅助生殖技术 微量精子冷冻保存

玻璃化冷冻保存 载体：人类透明带、冷冻环、细麦管等

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辅助生殖技术 睾丸组织保存

青春期前男性生育能力的保存，无法通过精液冷冻保存来实现，为此对睾丸组织冷冻保存进行了探索。

Gouk SS 等报道小鼠睾丸组织玻璃化冷冻后可保持存活，并可从中收集生精细胞，提示玻璃化冷冻有望成为男性生育力保存的方法（ Fertil Steril, 2011;95:2399-40

3. ）； Curaba M 等报道 2例准备化疗的儿童的睾丸组织冷冻复苏结果，显示复苏后精

原细胞和 Sertoli细胞保持存活（ Fertil Steril,2011;95:2123. ）。

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谢谢！