肠道病原菌的分离与鉴定一

培养基的制备及常用培养基 细菌的培养法 EMB 培养基的制备 肠道病原菌的分离与鉴定（一） 血清学检测 - 肥达氏反应

培养基的制备( 一 ) 肉汤培养基 材料：鲜牛肉、蛋白胨、氯化钠、 pH 试纸、 10 ％碳酸氢钠、

试管、三角烧瓶、蒸馏水等。 方法 1 ．将新鲜牛肉 500g 切碎或搅碎，加水 1000ml ，放 4℃ 冰箱

或冷处浸泡过夜，然后煮沸 30min ，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量。 2 ． 1000ml 肉水中加入蛋白胨 10g 、氯化钠 5g ，加热溶解。

3 ．用精密 pH 试纸测酸碱度，用 10 ％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2左右。过碱时，可用 10 ％醋酸校正之。

4 ．分装于试管中或三角烧瓶中， 15 磅 (121 )℃ 高压蒸气灭菌20 ～ 30min 。

高压蒸汽灭菌器

( 二 ) 普通琼脂培养基 材料：肉水、蛋白胨、氯化钠、琼脂、无菌平皿、灭菌试管、

三角烧瓶等。 方法 1 ．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧

瓶中，加热溶化。 2 ．用 pH 试纸测酸碱度，用 10 ％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2

左右。 3 ． 15 磅高压蒸气灭菌 20 ～ 30min 。 4 ．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约 1

5ml ，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。

( 三 ) 血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长

不良，可用血液琼脂培养基进行培养。 材料 ① 普通琼脂培养基 ② 血液 ( 脱纤维羊血或兔血 ) 方法 1 ．加热溶化普通琼脂培养基。 2 ．待冷至 50℃ 左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀

( 注意勿使产生泡沫 ) 。 3 ．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养

基。

E.M.B 琼脂培养基的制备 成分 蛋白胨 10g

磷酸氢二钾 2g

琼脂 20g

乳糖溶液 (20 ％ ) 50ml

伊红溶液 (2 ％ ) 20ml

美蓝溶液 (0.5 ％ ) 20ml

蒸馏水 1000ml 制法 ① 将蛋白胨和磷酸氢二钾加温溶化于蒸馏水中 ② 校正 pH 值为 7.6 加入琼脂 ③ 煮沸溶化过滤后分装三角瓶中，每瓶定量分装 ④15 磅 30min 高压灭菌 ⑤ 以无菌操作法按量加入经 10 磅 20min 高压灭菌的乳糖、伊红美兰

液，混匀后倾注平皿备用。

E.M.B 培养基 原理 大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基 pH 值下降，

伊红与美蓝相结合成一种复合物，酸性环境中，菌体带正电，易与伊红结合，故菌落呈紫黑色或紫红色，并有金属光泽。碱性环境中伊红与美蓝不结合，病原菌不分解乳糖，不产酸故菌落为无色半透明。其次，伊红、美蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。

用途 用于分离肠道致病菌，是一种鉴别培养基。并有弱

的选择作用。

肥达氏反应 肥达氏反应通常用已知的伤寒杆菌“ O” 、“ H” 菌液和甲、乙型副伤寒杆菌“ H” 菌液与病人血清作定量凝集试验 ( 试管法 ) ，以检测病人血清中有无相应抗体存在，根据抗体含量多少及增长情况用于伤寒、副伤寒病的辅助诊断。

材料 ① 待检可疑伤寒病人血清 (1:10稀释 )

②诊断菌液：伤寒杆菌“ O” (O)

伤寒杆菌“ H” (OH)

甲型副伤寒杆菌“ H” (PA)

乙型副伤寒杆菌“ H” (PB)

③ 生理盐水 ④吸管，小试管等。

方法 本实验四人一组，每人取 6只小试管，排成一列，计四列

为一完整试验。分别标明每列管号和诊断菌液如“ O” 、“ OH” 、“ PA” 、“ PB” 。按下表先向每管加生理盐水 0.5ml ，再加 10倍稀释病人血清 0.5ml 于第 l 管，做顺序的等倍稀释，最后加入等量的诊断菌液，充分混匀，置 37 2~4h℃ ，再放室温 24小时后观察结果。

试 管 1 2 3 4 5 6

生理盐水（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

病理血清 10X（ml） 0.5↘

0.5↘

0.5↘

0.5↘

0.5↘

0.5→弃去

诊断菌液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5