6. anÁlisis y discusiÓn de resultadoscatarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lqf/... · 6.2.2.3...
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6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 EXTRACCIÓN DEL PIGMENTO
La extracción se basó en la metodología de Wrolstad et al (2001) con algunas
modificaciones. No se utilizó nitrógeno líquido ya que aunque éste minimiza la
degradación del pigmento puesto que se utilizan bajas temperaturas, es caro y su manejo
requiere mucho cuidado. Tampoco se uso acetona para la extracción, ya que está prohibida
en la industria de los alimentos puesto que es tóxica. Ésta misma situación se presentó para
el uso de cloroformo, el cual ayuda a la purificación de las antocianinas; sin embargo, es
tóxico también por lo que no se puede ingerir.
Debido a las razones anteriormente mencionadas, se utilizó etanol acidificado para la
extracción ya que éste presenta la ventaja de no ser tan tóxico para el hombre en caso de
quedar remanentes al evaporar. A pesar de la ventaja que posee, el punto de ebullición del
etanol es de 78°C, con lo que al evaporarlo muchas veces se produce al mismo tiempo
cierta degradación térmica de la antocianina (Acevedo, 2003).
La purificación subsiguiente del pigmento se llevó a cabo utilizando una resina de
polivinilpirrolidona, con lo que se logra retener compuestos fenólicos anfipáticos de los
extractos crudos de antocianina. A continuación se hizo uso de cartuchos C18 de fase
sólida, que retienen compuestos orgánicos hidrofóbicos como antocianinas y algunos
compuestos fenólicos debido al carácter hidrofóbico de la cadena de dieciocho carbonos del
cartucho, eliminando así interferentes tales como azúcares y ácidos (Saona y Wrolstad;
2001).
6.2 PRIMERA PARTE EXPERIMENTAL: TRABAJO EXPLORATORIO
Lo primero que se realizó fue un trabajo exploratorio, cuya finalidad era la de probar
diversos copigmentos con la antocianina de la ciruela (Prunus domestica) en proporción de
1:1 antocianina:copigmento con la finalidad de determinar cual de ellos podría funcionar
mejor en cuanto a parámetros colorimétricos y espectrofotométricos se refiere para causar
un efecto de copigmentación.
6.2.1 CONCENTRACIÓN DE ANTOCIANINAS
Como primer punto se estudió el cambio en la concentración de antocianinas con respecto
del tiempo (9 días). Se realizó almacenando los sistemas a 50°C, conteniendo cinco
copigmentos y antocianina de ciruela (Prunus domestica). A continuación se presentan los
resultados de lo anteriormente mencionado en la figura 6.1:
Figura 6.1 Gráfica de concentración versus tiempo para control y sistemas modelo
10
11
12
13
14
15
16
0 1 3 6 9
días
con
cen
trac
ión
(mg
/L)
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
En la figura se puede observar que los sistemas con ácido cafeico, vainíllico y ascórbico
presentan un incremento ligero en la concentración de pigmento en el tercer día, sin
embargo, disminuye después hasta el último día del estudio. No obstante, los sistemas que
presentan los valores mayores para concentración de antocianinas al final del experimento y
que se mantuvieron más estables fueron los que contenían al ácido benzoico y al ácido
cafeico en proporción 1:1.
Se puede observar que los sistemas que se encuentran con una menor concentración de
pigmento al término de los nueve días son el control, que únicamente contiene la
antocianina y, el sistema que contiene ácido ascórbico y antocianina en una proporción 1.1.
Por lo que se puede concluir que en cuanto a éste parámetro se refiere, se eligen a los
sistemas con ácido benzoico y cafeico como aquellos sistemas que pueden funcionar como
copigmentos para los sistemas modelo de bebidas que se formularán.
Además de que se puede confirmar lo dicho por Fennema (1996) que el ácido ascórbico en
presencia de oxígeno contribuye a la degradación de las antocianinas, ya que menciona que:
La degradación por ácido ascórbico de las antocianinas resulta indirectamente de la
formación de peróxido de hidrógeno que se forma durante la oxidación del ácido ascórbico.
6.2.2 PARÁMETROS COLORIMÉTRICOS
6.2.2.1 LUMINOSIDAD
La luminosidad es una medida de claridad de un objeto, y su rango se encuentra desde cero
(negro) hasta el cien (blanco). En el sólido de Hunter la luminosidad se ubica en el eje
vertical: el negro se encuentra abajo, y subiendo hasta el tope se encuentra el blanco. Por lo
que con éste parámetro podemos describir cualquier objeto como claro u oscuro.
En la Figura 6.2 se puede observar el cambio en la luminosidad de los sistemas al paso de
los días (9 días), almacenados a 50°C, con cinco copigmentos y la antocianina de la ciruela
(1:1). De lo que se puede observar en la figura, los sistemas inician en una luminosidad de
entre 80 y 83. Al finalizar los nueve días, se puede observar que todos incrementan su
luminosidad. Sin embargo, los sistemas que presentaron una menor diferencia en su
luminosidad desde el día cero hasta el día nueve fueron aquellos que contienen ácido
benzoico, ácido cafeico y ácido vainillico.
De la misma manera se puede observar que los sistemas que al finalizar el estudio
presentan una mayor diferencia en su luminosidad desde el día cero hasta el día nueve son:
el que contiene ácido ascórbico y el control que contiene solo antocianina. Por lo que se
puede intuir que el copigmento puede estar estabilizando la luminosidad de la antocianina,
excepto en el caso del ácido ascórbico quien parece contribuir al aumento en la
luminosidad. De aquí que podemos considerar a los sistemas con ácido benzoico, cafeico y
vainíllico para formular posteriormente las bebidas modelo.
Figura 6.2 Luminosidad con respecto al tiempo para el estudio de cinco sistemas modelo y un control
8080.5
8181.5
8282.5
8383.5
8484.5
85
0 1 3 6 9
días
Lu
min
osi
dad
(L)
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.2 “a” y “b”
En colorimetría de CIELab se definen “a” y “b” como dos de las percepciones humanas
junto con la luminosidad que producen la idea de un color en la persona. “a” es una medida
de lo rojo (cuando es positiva) o de colores verdes (cuando es negativa). “b” es la medida
de colores amarillos (cuando ésta es positiva) o de colores azules (cuando es negativa).
Las Figuras 6.3 y 6.4 son una representación del cambio en “a” y en “b” respectivamente
con respecto al tiempo almacenados a 50°C, con cinco copigmentos diferentes y la
antocianina de la ciruela.
Como se mencionó “a” es un parámetro para medir el rojo mientras va aumentando, por lo
que se puede ver de la gráfica que “a” va disminuyendo con los días para todos los
sistemas, por lo que va disminuyendo el color rojo. Sin embargo, hay que tomar en cuenta
que los sistemas se mantuvieron almacenados a 50°C y que la temperatura tiene efecto en la
degradación del color. Los sistemas que menos disminuyeron en “a” fueron aquellos que
contienen ácido gálico y ácido benzoico; mientras que el control que contiene únicamente
antocianina y el sistema que contien ácido ascórbico presentaron una mayor disminución
“b” es la medida de colores amarillos mientras aumente, y en la Figura 6.4 se advierte que
“b” presenta un aumento al paso de los días, por lo que los sistemas con ácido gálico,
benzoico y cafeico van incrementando en color amarillo. Mientras que el control, y los
sistemas con ácido vainíllico y ascórbico disminuyen en “b” al término de los nueve días.
Figura 6.3 Evolución de “a” con respecto al tiempo
16
17
18
19
20
21
22
0 1 3 6 9
días
a
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
Figura 6.4 Evolución de “b” con respecto al tiempo
8
8.5
9
9.5
10
0 1 3 6 9
días
b
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.3 PUREZA (C)
La pureza (‘chroma’) es una medida de la saturación del color. Es el grado de repartición de
un color desde un color neutro del mismo valor. Los colores de baja pureza se denominan
débiles, mientras que los que poseen una pureza alta se dice que están altamente saturados,
son fuertes y vívidos. La pureza se obtiene de la interacción de los tonos rojos (a) y
amarillos (b) en la escala de Hunter siguiendo la ecuación 8 (p.43).
En la Figura 6.5 se observa el cambio en la pureza de los sistemas con respecto al tiempo (9
dias), almacenados a 50°C, con cinco copigmentos y la antocianina de la ciruela. Aquellos
sistemas que redujeron en menor proporción su pureza después de los nueve días de estudio
fueron los que contienen ácido gálico, ácido benzoico y ácido cafeico; lo que quiere decir
que se presentaron al final del estudio con una mayor saturación de color, se presentan más
vividos. Mientras que los sistemas que presentaron mayor cambio en la pureza, es decir,
que fueron los que disminuyeron más sus niveles de pureza son el control y el sistema con
ácido ascórbico. Por lo que se puede decir que éstos dos últimos son menos saturados y se
ven más opacos y oscuros, no tan vívidos.
Con lo que se mencionó anteriormente se puede decir que se toma en consideración para la
formulación de sistemas de bebida modelo en la segunda parte experimental a los sistemas
que contienen ácido benzoico, gálico y cafeico ya que es muy posible que en estos sistemas
el copigmento esté participando en la estabilidad de la pureza.
Figura 6.5 Cambio en la pureza con respecto al tiempo en sistemas modelo con cinco copigmentos y un control
18
19
20
21
22
23
24
0 1 3 6 9
días
pu
reza
(C)
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.5 TONO (h)
El tono es aquel atributo de un color con el que se nombra a un color. Se representa como
un ángulo que va desde 0° hasta los 360°. Los ángulos entre 0° y 90° reflejan los colores
rojos, naranjas y amarillos. De 90° a 180° son los colores amarillos, amarillo-verde y
verdes. Entre los 180° y los 270° se observan los colores verdes, azul-verde y azules.
Finalmente de 270° a 360° representan los azules, morados, magentas, y de regreso a los
rojos.
Éste parámetro se obtiene de una relación entre “b” y “a” según la ecuación 7 (p.43). En la
figura 6.6 se muestra gráficamente el cambio en el tono con respecto al tiempo (9 días), de
los sistemas de antocianina de ciruela y cinco copigmentos almacenados a 50°C.
En cuanto al tono se refiere, lo único que se puede mencionar es que todos los sistemas
incrementaron su tono desde el día cero hasta el día nueve. El tono inicial de todos los
sistemas se ubica en los rojos y al finalizar el estudio se sigue ubicando el tono en los rojos,
aunque con una tendencia a aumentar.
No existe una diferencia significativa en el tono, ni se puede definir que sistemas presentan
un mejor tono, ya que todos presentan valores similares tanto al inicio como al final del
estudio, por lo que no consideraremos al tono como un parámetro para elegir un
copigmento para formular las bebidas modelo; además cabe destacar que el tiempo de
estudio fue muy corto por lo que probablemente esa sea la razón por la que no se aprecian
los cambios todavía.
Figura 6.6 Evolución del tono con el tiempo en sistemas modelo con cinco copigmentos y el control
2323.5
2424.5
2525.5
2626.5
2727.5
0 1 3 6 9
días
tono
(h)
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.6 DIFERENCIA NETA DE COLOR (∆E)
Éste parámetro nos expresa la diferencia entre el color a un tiempo t1 con respecto a t0. La
figura 6.7 representa gráficamente el cambio en la diferencia neta de color con respecto al
tiempo, para sistemas modelo con cinco copigmentos y un control almacenados a 50°C.
Como se puede apreciar de la figura, los sistemas que presentan un menor cambio en la
diferencia neta de color, y por tanto mantienen más la estabilidad del color inicial son los
que contienen: ácido gálico, ácido benzoico y ácido cafeico. La presencia de copigmento
puede incrementar la estabilidad de estos sistemas en la diferencia neta de color.
Los sistemas que presentan un mayor cambio en la diferencia de color son el control que
contiene solo antocianina y el sistema que contiene ácido ascórbico. Por lo que también se
puede reiterar que el ácido ascórbico junto con la antocianina y en presencia de oxígeno,
contribuye a la degradación de pigmento y por tanto una mayor diferencia en el color.
Por lo anterior se puede tomar en consideración como copigmentos al ácido cafeico, al
ácido gálico y al ácido benzoico para formular las bebidas modelo en la segunda parte, pues
fueron los que menor diferencia de color tuvieron.
Figura 6.7 Cambio en la diferencia neta de color para sistemas modelo con cinco copigmentos y el control
0
1
2
3
4
5
6
0 1 3 6 9
días
dif
eren
cia
net
a co
lor
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.7 DENSIDAD DE COLOR
Éste parámetro expresa el color impartido por las antocianinas monoméricas (cianidina-3-
glucósido principalmente), antocianinas copolimerizadas y de los productos de reacción de
oscurecimiento. (Aguilar, 2002).
El comportamiento de la densidad de color con respecto del tiempo se muestra en la Figura
6.8, para sistemas que contienen cinco copigmentos y un control en propoción 1:1, en
condiciones de almacenamiento a 50°C.
Aquellos sistemas que presentaron menor densidad de color fueron: el control con
antocianina sola y el sistema con ácido ascórbico con lo que se puede intuir que
probablemente sea los que menor cantidad de antocianina monomérica contengan.
Los sistemas que presentaron una densidad de color aumentada al finalizar los nueve días
de estudio fueron los que contienen: ácido benzoico, ácido gálico y ácido cafeico. Aunque
hay que recordar que esta densidad de color es debida tanto por las antocianinas
monoméricas, como por polímeros y otros productos de reacción, así que no se puede
tomar en cuenta como parámetro para elegir copigmentos para la formulación de bebidas
modelo.
Figura 6.8 Evolución de la densidad de color para sistemas modelo con cinco copigmentos y el control
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 1 3 6 9
días
dens
idad
col
or
S1 (control) S2(ácido gálico) S3(ácido benzoico)
S4(ácido cafeico) S5(ácido vainillico) S6(ácido ascórbico)
6.2.2.8 COLOR POLIMÉRICO
El color polimérico expresa el color de las antocianinas copolimerizadas y de las reacciones
de oscurecimiento. Es el color resistente al blanqueamiento por bisulfito de sodio.(Aguilar,
2002.) Los valores de color polimérico se calculan de acuerdo a la ecuación 4 (p.42).
En la Figura 6.9 se muestra el comportamiento del color polimérico frente al tiempo de
análisis para el control y para cinco sistemas modelo antocianina-copigmento en una
proporción 1:1 almacenados a 50°C.
De manera general, todos los sistemas muestran un incremento en el primer día de
medición. A partir de ese día, la mayoría de los sistemas disminuyen con excepción del
sistema que contiene ácido vainíllico y el control. El control siempre muestra un
incremento en color polimérico presentándose al final del estudio como aquel sistema que
contiene mayor cantidad de antocianinas copolimerizadas y reacciones de oscurecimiento.
En particular, el sistema que al finalizar el análisis presentó una menor cantidad de color
polimérico fue el que contiene ácido cafeico, por lo que se puede proponer que este
copigmento este actuando de tal manera que la protege de la formación de antocianinas
copolimerizadas y por tanto existe una mayor proporción de antocianina monomérica
proporcionando color, y no tanta copolimerizada. Se puede considerar al sistema que
contiene ácido cafeico como un buen copigmento para la posterior formulación de bebidas
modelo.
Figura 6.9 Evolución de color polimérico para sistemas mode lo Con cinco copigmentos y el control
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 1 3 6 9
días
colo
r p
olim
éric
o
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S4(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.9 PORCENTAJE DE TANINOS
El porcentaje de taninos indican el color impartido por los polímeros que incluyen a la
antocianina dentro de la estructura y que por tanto confiere un color (Aguilar, 2002). La
tonalidad marrón de los vinos añejos es el resultado de la polimerización exhaustiva de las
antocianinas y otros flavonoides, denominados taninos, (Coultate, 1989 ).
En ocasiones, como en el caso de vinos tintos con un alto contenido de taninos, se produce
grandes agregados poliméricos de tamaño y características coloidales que pueden llegar a
sedimentar al cabo de un largo almacenamiento; cuando esto ocurre, se reduce la intensidad
del color y se observa u precipitado algo oscuro (Gross, 1987 ).
El porcentaje de taninos se expresa como la fracción porcentual formada entre el color
polimérico y la densidad de color. Como se puede observar, aquel sistema que siempre
presentó una creciente formación de taninos, fue el control, después de éste, se puede ver,
que el sistema con ácido ascórbico presenta al final del análisis el más alto porcentaje de
taninos formados.
Mientras que el sistema el sistema que tiene de copigmento al ácido cafeico fue aquel que
al finalizar los nueve días de estudio presentó un menor porcentaje de taninos. Así que en
cuanto a porcentaje de taninos se refiere, se puede tomar en consideración a S4 que
contiene ácido cafeico como copigmento para la formulación de bebidas modelo.
Figura 6.10 Evolución del porcentaje de taninos para sistemas modelo Con cinco copigmentos y el control
00.050.1
0.150.2
0.250.3
0.350.4
0.450.5
0 1 3 6 9
días
% d
e ta
nin
os
S1(control) S2(gálico) S3(benzoico)S5(cafeico) S5(vainillico) S6(ascórbico)
6.2.2.10 ELECCIÓN FINAL DE COPIGMENTO
Finalmente, se eligió a un copigmento para la elaboración de sistemas modelo de bebidas,
tomando en consideración todos los parámetros medidos anteriormente. Aquellos sistemas
que mejores resultados dieron para casi todas las medidas tomadas fueron los que
contienen ácido benzoico, ácido cafeico y el que contiene ácido gálico.
El sistema que contiene ácido benzoico fue el mejor sistema para: concentración de
antocianinas, luminosidad, diferencia neta de color y densidad de color; mientras que el que
contiene ácido cafeico resultó ser el mejor sistema para: concentración de antocianinas,
luminosidad, diferencia neta de color, densidad de color, porcentaje de taninos y color
polimérico. El sistema que contiene ácido gállico resultó ser uno de los mejores sistemas
para: pureza, diferencia neta de color, densidad de color.
Por lo que se eligió al ácido cafeico como el copigmento para seguir monitoreando en
sistemas modelo de bebidas. No se eligió al ácido benzoico, pues éste además de ser
copigmento funciona como conservador, y tiene limitación en cuanto a la concentración
máxima permitida. No se eligió tampoco al ácido gálico pues es caro y no es utilizado
normalmente en la industria de alimentos y bebidas; mientras que el ácido cafeico sí se
utiliza en alimentos.
6.3 SEGUNDA PARTE: MONITOREO DE BEBIDAS MODELO
6.3.1 SISTEMAS MODELO DE BEBIDAS
Los sistemas modelo de bebidas se prepararon en base a bebidas comerciales con el fin de
igualar los parámetros de color y pH principalmente. En la Tabla 6.1 se presentan los datos
experimentales de dos bebidas:
Tabla 6.1 Datos obtenidos de la caracterización de bebidas comerciales
Jugo Boing sin pulpa Gatorade rojo
pH 2.8 pH 2.7
L= 84.43 L= 58.3
a + 35 a +35
b + 17.5 b+ 21
Las bebidas se formularon a pH de 2,8 con un buffer de citrato-fosfato, adicionando
glucosa. Así mismo, se utilizó como copigmento al ácido cafeico en una concentración 1:1
de copigmento:antocianina, ya que según resultados previos, se espera que puede funcionar
para provocar el efecto de copigmentación.. Las condiciones de almacenamiento fueron en
una estufa a una 50°C, con el fin de acelerar el estudio y que el cambio que ocurra, se
observe más rápido. Además se adicionó benzoato de potasio al 1% como agente
antimicrobiano a las bebidas.
Cabe destacar que para todos los parámetros se tomaron mediciones por duplicado en todos
los días de estudio, pero que se presentan Figuras que contienen el promedio de los dos
valores.
6.3.2 CONCENTRACIÓN DE ANTOCIANINA
En la Figura 6.11 se observa la evolución de la concentración de antocianina con respecto
del tiempo (25 días) tanto para el control como para el sistema modelo 1:1 antocianina:
copigmento, así como el duplicado del mismo. Estos valores se obtuvieron aplicando la
ecuación 1 y 2 (p.42).
Como se puede observar, las tres muestras estudiadas disminuyen su concentración de
antocianina. Sin embargo, tanto el sistema modelo 1:1 de ácido cafeico:antocianina y su
duplicado no reducen tanto sus niveles de concentración como lo hace el control.
El control y la bebida con copigmento presentan un comportamiento similar durante los
primeros 9 días, sin embargo el control presenta un decremento considerable de
concentración de pigmento de los días 15 al 25. El control al final del estudio pierde un
93% en su concentración de antocianinas, mientras que el sistema 1:1 que contiene al
copigmento pierde 61% de concentración de pigmento.
Figura 6.11 Evolución de la concentración para un sistema modelo Ácido cafeico-antocianina y el control
02468
101214161820
0 2 5 9 15 25
días
con
cen
trac
ión
(mg
/L)
Control 01:01
La Figura 6.12 muestra la tasa de degradación de la antocianina con respecto al tiempo.
Además se determinó la tasa de cambio (k), por medio de una regresión lineal donde se
obtuvo la pendiente que corresponde la valor de k. También se calcularon los coeficientes
de correlación para las muestras como se muestran en la Tabla 6.2.
Para determinar el sistema más estable, se debe de observar la magnitud de k, ya que a
mayor valor de k, mayor es el cambio en la concentración de antocianina; por lo que a
menor valor de k, refleja una mayor estabilidad. Se puede observar que en los primeros días
del estudio, es decir del día cero hasta el día 5, prácticamente las muestras se comportan de
la misma forma, ya que el valor de la k no varía por mucho y muestran una estabilidad
similar. Por el contrario, como se observa del valor de la segunda k, se puede demostrar que
a partir del día 9 hasta el día 25 del estudio, el control pierde notoriamente concentración de
pigmento pues el valor de la k es grande comparándolo con el del sistema 1.1. El sistema
1:1 que contiene al copigmento ácido cafeico se muestra más estable en los últimos días del
estudio pues el valor de k no varía tanto como para el control.
El resultado final que se presenta en el sistema 1:1 copigmento:antocianina se puede deber
a un efecto de copigmentación entre la antocianina (cianidina-3-glucósido) y el ácido
cafeico que es el copigmento en una relación 1:1 formando empalmamientos de ‘stacking’
que de cierta manera protegen a la antocianina de ser degradada. Se observa cierta pérdida
en la concentración del pigmento ya que Romero et al (2000) señalan que la pérdida de
antocianinas en sistemas modelo se incrementa significativamente conforme aumenta la
temperatura de almacenamiento. Se observa la formación de precipitados color café debido
a un cambio irreversible causado por la degradación del pigmento. (Acevedo, 2003).
Figura 6.12 ln C/Co vs tiempo para un sistema modelo Ácido cafeico-antocianina y el control
Tabla 6.2 Valores de k obtenidos en la concentración del pigmento:
Sistema k 1er periodo
día 0-5
r2 k 2º periodo
día 9-25
r2
Control -0.145 0.94 -1.095 0.87
1.1 -0.1991 0.97 - -
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
00 2 5 9 15 25
días
lnC
/Co
control 01:01
6.3.3 LUMINOSIDAD (L)
Debe aclararse como primer punto que en el estudio realizado no se pudo lograr alcanzar la
luminosidad que normalmente presentan las bebidas comerciales ya que se requería de una
cantidad impresionante de pigmento, y con ello, un mayor tiempo requerido para su
purificación. En la Figura 6.13 se muestra el cambio en la luminosidad con respecto al
tiempo del control y del sistema 1:1 almacenados a una temperatura de 50°C.
Como se puede apreciar en la Figura, la luminosidad del control disminuye
considerablemente, principalmente desde el día quince hasta el día veinticinco; mientras
que el sistema que contiene al copigmento ácido cafeico mantiene su luminosidad
presentando únicamente un ligero aumento.
Los resultados se obtuvieron de esa manera debido a que como observa Patjane (2002) que
entre mayor sea la proporción de copigmento que interaccioné con la antocianina, ésta será
más estable en cuanto a su cambio en la luminosidad. (Acevedo, 2003)
Figura 6.13 Evolución de la luminosidad para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
20
30
40
50
60
70
80
0 2 5 9 15 25
días
"L"
Control 01:01
El cambio en la luminosidad (ln C/Co) con respecto al tiempo se presenta en la Figura
6.14. Además se determinó la tasa de cambio (k) para la luminosidad, por medio de una
regresión lineal donde se obtuvo la pendiente que corresponde la valor de k. También se
calcularon los coeficientes de correlación para las muestras como se muestran en la Tabla
6.3.
De los datos que se obtienen para el primer periodo comprendido del día cero hasta el día
cinco, se puede observar que prácticamente no existen cambios en la luminosidad tanto
para el control como para el sistema 1:1, ya que el valor de la k es extremadamente
pequeño, por lo que se concluye que se mantuvieron estables.
A partir del día nueve hasta el día veinticinco se observa que el sistema 1:1 junto con su
duplicado presentaron menores valores de k a comparación del control, con lo cual se ve
que la luminosidad casi no presentó cambios y se mantuvo estable, ya que la k es muy
pequeña. Por lo que se puede intuir que el copigmento está estabilizando la luminosidad del
sistema que lo contiene, ya que como se mencionó anteriormente Patjane (2002) observó
este comportamiento. El control presentó un decremento en el valor de su luminosidad, lo
que refleja que está cambiando hacia un tono oscuro. Este valor disminuyó mucho en
especial a partir del día quince hasta el día veinticinco.
Figura 6.14 ln L/Lo vs tiempo para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
Tabla 6.3 Valores de k obtenidos para la luminosidad:
Muestra k1r periodo
Día 0-5
r2 k 2º periodo
Día 9-25
r2
Control 0.019 0.93 -0.4745 0.99
1:1 0.0099 0.99 - -
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0 2 5 9 15 25
días
ln L
/Lo
control 1.1
6.3.4 “a” y “b”
La Figura 6.15 es una representación de “a” con respecto al tiempo durante veinticinco días
almacenados a 50°C. Como se puede apreciar en la Figura, tanto el control como el sistema
1:1 y su duplicado disminuyen su valor de “a”. El control presenta un decremento
especialmente a partir del día quince hasta el final de su estudio. Aunque cabe resaltar que
los cambios en este parámetro tanto en el control como en el sistema 1:1 no son tan
diferentes como lo son en otros parámetros medidos.
La figura 6.16 representa el cambio en “b” con respecto a los días tanto para el control
como para el sistema almacenados a 50°C.
Al analizar las dos gráficas presentadas de “a” y de “b”, se puede concluir que el control
presenta un cambio mayoritario en “b” que es notoriamente diferente de aquel del sistema
1:1 ácido cafeico:antocianina y su duplicado. En cambio, los valores de “a” para el control
son más parecidos a los del sistema con un decremento más notorio en el control.
Figura 6.15 Evolución de la “a” para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
a vs días
0
5
10
15
20
25
30
0 2 5 9 15 25
días
a Control01:01
Figura 6.16 Evolución de “b” para un sistema modelo Ácido cafeico-antocianina y el control
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 5 9 15 25
días
b
control 01:01
6.3.5 PUREZA (C)
Los datos que se presentan en la Figura 6.17 son la representación del cambio en la
pureza (chroma) del control y el sistema 1:1 con respecto al tiempo almacenados a 50°C.
Todos los sistemas disminuyeron sus valores de pureza conforme al paso de los días, no
obstante, el sistema 1:1 antocianina: ácido caféico es el que conserva más su pureza en
comparación con el control.
El control va bajando en sus niveles de pureza al mismo tiempo que el sistema 1.1 durante
los primeros nueve días; sin embargo, a partir del día quince hasta el día veinticinco se
puede apreciar un decremento en pureza imponente del control.
El control se presenta opaco y contaminado en el día veinticinco, mientras que el sistema
que contiene copigmento se observa vívido, con mucho color, es decir, saturado.
Figura 6.17 Evolución de la pureza para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 5 9 15 25
días
pu
reza
(c)
control 01:01
El cambio en la pureza (ln P/Po) con respecto al tiempo se presenta en la Figura 6.18.
Además se determinó la tasa de cambio (k) para la luminosidad, por medio de una
regresión lineal donde se obtuvo la pendiente que corresponde la valor de k. También se
calcularon los coeficientes de correlación para las muestras como se muestran en la Tabla
6.4.
Durante el primer periodo del experimento, que comprende del día cero hasta el día cinco
se puede observar que va disminuyendo la pureza, tanto del control como del sistema 1:1
pero van en decremento todos a la par, por lo que se obtienen valores similares para todos
de k.
Por el contrario, para el segundo periodo comprendido desde el día 9 hasta el día
veinticinco, los valores de k indicados en la Tabla 6.4 reflejan que el sistema con un mayor
cambio en la pureza es el control, mientras que el sistema 1:1 tiene los valores más
pequeños de k, es decir, presentan una mayor estabilidad en la pureza y se obseva una
mayor saturación del color, es decir, se ven más vívidos y brillantes, mientras que el control
se ve opaco y sucio. El sistema 1.1 es el que contiene al copigmento por lo que
probablemente tenga una contribución en la estabilidad de la pureza.
Lo anterior lo podemos concluir ya que Patjane (2002) encontró que entre mayor sea la
proporción de copigmento que interaccione con la antocianina, ésta será más estable en
cuanto al cambio de su pureza .
Figura 6.18 ln P/Po vs tiempo para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
Tabla 6.4 Valores de k obtenidos para la pureza:
Muestra k1er per r2 k 2º per. r2
Control -0.113 0.99 -0.575 0.99
1:1 -0.12 0.99 - -
-1.6
-1.4
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
00 2 5 9 15 25
días
lnP
/Po
control 01:01
6.3.6 TONO (h)
En la Figura 6.19 se observa el cambio en el tono con respecto a los días para el control y el
sistema 1.1 antocianina-copigmento. El tono inicial del control y el sistema 1:1 junto con su
duplicado se ubicaba en la región de los rojos (25°). (El sólido de color L,a,b de Hunter se
presenta en el Anexo). Sin embargo, al paso de los 25 días de estudio, se observó que el
tono del sistema y duplicado se orienta más hacia la región de los tonos rojo-anaranjado
(50°-60°). El tono el control al final del estudio se ubica entre los 40°y 45°, lo cual significa
que se sigue ubicando en la región de los rojos con tendencia a pasar a los naranjas. Por lo
que, el tono del control no aumentó tanto como aquel del sistema 1:1.
El cambio en el tono (ln h/ho) con respecto al tiempo se presenta en la Figura 6.20.
Además se determinó la tasa de cambio (k) para la luminosidad, por medio de una
regresión lineal donde se obtuvo la pendiente que corresponde la valor de k. También se
calcularon los coeficientes de correlación para las muestras como se muestran en la Tabla
6.5. Para determinar que muestra fue más estable se debe observar la magnitud de k, donde
a mayor k, mayor cambio en el tono. Por lo que podemos observar que quien presenta un
cambio menor en el tono es el control, es más estable en cuanto a tono, ya que presenta una
k menor tanto para el primer periodo como para el segundo. El sistema 1:1 presentó un
cambio mayor de tono al finalizar los 25 días.
Por lo que el control presenta mejor tono que el sistema con copigmento, sin embargo,
como se mencionó anteriormente, el control se presenta más sucio y contaminado.
Figura 6.19 Evolución del tono para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
0 2 5 9 15 25
días
To
no
(h
)
control 01:01
Figura 6.20 ln h/ho vs el tiempo para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
Tabla 6.5 Valores de k obtenidos para el tono:
Sistema K 1er
periodo
R2 k 2º
periodo
R2
control 0.063 0.99 -0.13 0.98
1:1 0.078 0.99 -0.29 0.98
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 2 5 9 15 25
días
ln h
/ho
control 1.1
6.3.7 DIFERENCIA NETA DE COLOR ( ∆ E )
La figura 6.21 es una representación de la diferencia neta de color con respecto al tiempo
para el control y el sistema1.1 almacenados a 50°C. De la Figura podemos observar que
durante los primeros 9 días todas las muestran presentan valores similares de diferencia
neta de color. Sin embargo, a partir del día 9 hasta el día 25 del estudio, el control presenta
un aumento drástico en la diferencia neta de color.
En la Figura 6.22 se presenta el logaritmo natural de la diferencia neta de color con
respecto al tiempo. Así mismo, la Tabla 6.6 nos indica los valores de k para determinar qué
muestra es más estable al paso del tiempo, junto con los coeficientes de correlación tanto
para el control como para el sistema de bebida 1:1 antocianina:copigmento.
Como se ha mencionado anteriormente, los valores de k nos indican qué tanto cambió una
muestra. Por lo que se observa en la Tabla 6.6, para el primer periodo, el control y el
sistema con copigmento mantienen valores similares de k, sin embargo para el segundo
periodo quien presentó un mayor cambio en la diferencia neta de color es el control quien
tiene la k más grande, mientras que el sistema 1:1 presenta menos cambios puesto que
tienen una k menor. Por lo que se puede intuir que el copigmento sí estabiliza el color de
cierta forma, ya que se observa que se mantiene más estable a comparación del control.
Figura 6.21 Evolución de la diferencia neta de color para un sistema modelo
ácido cafeico-antocianina y el control
0
10
20
30
40
50
60
0 2 5 9 15 25
días
dif
eren
cia
de
colo
r
control 01:01
Figura 6.22 lnAE vs el tiempo para un sistema modelo ácido cafeico-antocianina y el control
Tabla 6.6 Valores de k obtenidos para la diferencia neta de color:
Sistema k 1er
periodo
r2 k 2º
periodo
r2
Control 0.925 0.93 0.82 0.91
1:1 0.57 0.95 - -
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
0 2 5 9 15 25
días
ln A
E
control 1.1
6.4 ANÁLISIS DE CROMATOGRAMAS
La cromatografía es un método poderoso de separación de compuestos. Es la ciencia y el
arte de separar entre sí los componentes de una muestra. La cromatografía líquida de alta
presión es una herramienta importante para la separación de compuestos en extractos de
plantas y frutos (como con las antocianinas) y en éste caso, sirve para monitorear el
comportamiento de los sistemas modelo al paso de los días.
Las antocianinas presentes en la ciruela (Prunus domestica) son: cianidina-3-glucósido,
cianidina-3-rutinósido y peonidina-3-glucósido; siendo la antocianina mayoritaria la
cianidina 3-glucósido (Harborne and Hall,1964).
Según investigación de Harborne y Hall, la cianidina 3- glucósido tiene su pico en un
tiempo de retención de aproximadamente 31 minutos, y la peonidina-3- glucósido a los 38
minutos aproximadamente para jugos de uva. Además encontró en cromatogramas de
HPLC para la ciruela a la cianidina-3-glucósido a los 31 minutos, a la cianidina-3-
rutinósido con trazas de peonidina a los 33 minutos aproximadamente, y a cianidina-3-
galactósido a los 30 minutos pero en pequeñisismas cantidades.
En el HPLC se realizaron mediciones a 280 y 510 nm para identificar si existía presencia
de anillos conjugados (280 nm) y si se observaba el efecto de copigmentación, y a 510 nm
para observar la presencia de las antocianinas con el paso de los días y para ver si se
formaban otros compuestos coloridos.
Fig 6. 12 Cromatogramas del control días 2, 9 y 25 a 510 nm
6.4.1 CONTROL DIA 2, 5 Y 9 A 510 NM
Al observar en los cromatogramas, se pueden distinguir los siguientes picos: con un tiempo
de retención de 31 minutos se encuentra la cianidina-3-glucósido, y con un tiempo de
retención de 33 minutos se observa la cianidina-3- rutinósido con trazas de peonidina.
(Harborne y Hall, 1964).
En este caso solo se toma al área bajo la curva como comparativo para saber si la
concentración de la antocianina se mantiene, incrementa o disminuye. En la Tabla 6.7 se
muestran las áreas bajo la curva para el control con respecto al tiempo a 510 nm. Se
advierte que las áreas de pico de las dos antocianinas disminuyen considerablemente al
paso de los días, por lo que se puede pensar que también su concentración disminuyó.
Además al ver los cromatogramas, se puede observar que tres picos surgen con tiempos de
retención de 54 min, 56 min y 58 min aproximadamente. Éstos picos probablemente se
deban ya sea a antocianidinas (agliconas de las antocianinas) que tienen mayor afinidad por
la fase estacionaria, y por eso aparecen a tiempos de retención más alargados; o pueden ser
debido a aductos nuevos formados al paso de los días, ya sea por antocianinas
copolimerizadas con ellas mismas o productos de degradación.
Tabla 6.7 Porcentaje de área para las dos antocianinas de la ciruela con el tiempo para el control Cianidina-3-glucósido
% de área
Cianidina-3-rutinósido
% de área
Control- Día dos 100 100
Control-Día nueve 61.74 66.83
Control-Día veinticinco 19.73 18.7
6.4.2 SISTEMA MODELO ÁCIDO CAFEICO-ANTOCIANINA 1:1 DIA 2, 5 Y 9
A 510 NM
Para los cromatogramas del sistema modelo 1:1 antocianina- copigmento cabe destacar que
se observan los picos para la cianidina-3-glucósido con un tiempo de retención de 31
minutos y a la cianidina-3-rutinósido con un tiempo de retención de 33 minutos
aproximadamente (Harborne y Hall, 1964).
Además a partir del día nueve se observan otros dos picos a 55 minutos y a los 57 minutos
respectivamente, los cuales como se mencionó anteriormente pueden deberse a nuevos
aductos formados como antocianinas copolimerizadas (presentes como agliconas) que
tienen tiempos de retención más largos o debido a antocianidinas presentes.
Si comparamos la Tabla 6. 6 que contiene información de los % de área en el sistema
modelo con la Tabla 6.7 que ofrece los % de área para el control, se puede apreciar que el
sistema modelo al finalizar los veinticinco días de estudio mantiene mucho más constantes
sus % de área que el control. Lo anterior quiere decir, que solo como un parámetro
cualiltativo para la concentración, se puede asumir que el sistema modelo mantiene la
concentración de antocianinas de manera mucho más significativa que el control, el cual va
disminuyendo considerablemente sus % de área con el paso del tiempo, con lo que se
puede intuir que sí está ocurriendo un fenómeno de copigmentación, pues la degradación es
menor.
Fig 6.13 Cromatogramas del sistema modelo acn-copigmento días 2, 9 y 25 a 510 nm
Tabla 6.8 Porcentaje de área para las dos antocianinas de la ciruela en sistemas modelo
Cianidina-3-glucósido
% de área
Cianidina-3-rutinósido
% de área
Sistema modelo-día dos 100 100
Sistema modelo-día nueve 99.98 84.20
Sistema modelo-día veinticinco 35.5 40
6.4.3 CONTROL DIA 2, 9 Y 25 A 280 NM
Se presenta a continuación en la Figura 6.14, en la que se puede analizar la presencia de
compuestos fenólicos presentes durante el tiempo de análisis, y antocianinas de la ciruela
(Prunus domestica), que presentan absorbancia en esta región del espectro de ultravioleta.
Se pueden apreciar en los cromatogramas dos picos con tiempos de retención de 31
minutos y 33 minutos respectivamente, los cuales corresponden a cianidina-3-glucósido y a
cianidina-3- rutinósido con trazas de peonidina. Adicionalmente, se observa que hay un
incremento de compuestos altamente polares que eluyen en los primeros diez minutos
conforme al paso de los días.
Además se observa un pico con un tiempo de retención de 39 minutos con una absorbancia
muy grande, el cual corresponde al conservador y antimicrobiano, ya que se adicionó al
1%, es decir 0.24 g de sorbato de potasio en 244 ml de extracto de cirue la. Por lo que se
puede ver es grande la cantidad que se adicionó por lo que se atribuye ese pico al
conservador. Además de que se comprobó que ese pico correspondía al conservador
inyectándolo solo y observando un pico en un tiempo de retención de 39 minutos.
Fig 6.14 Cromatogramas del control días 2, 9 y 25 respectivamente a 280 nm
6.4.4 SISTEMAS MODELO DIÁS 2, 9 Y 25 A 280 NM
Así como para el control, se observan los picos de las antocianinas de la ciruela a los 31 y
33 minutos respectivamente (Figura 6.15). De igual manera, se observan picos con tiempos
de retención antes de los diez minutos, los cuales se atribuyen a compuestos polares
formados con el tiempo.
También se puede apreciar el pico que en el control se observa con un tiempo de retención
de 39 minutos, el cual, como ya se mencionó se atribuye a la presencia del conservador y
antimicrobiano, sorbato de potasio pues es su estructura es insaturada y conjugada y según
las reglas de Woodward, éste absorbe a 256 nm aproximadamente. Además de que se
comprobó su presencia inyectándolo solo, observando un pico con un tiempo de retención
de 39 minutos.
Figura 6.15 Cromatogramas del sistema modelo acn- copigmento días 2, 9 y 25 a 280 nm
