7 cinetique et stochiometrie

Cinétique et stochiométrie

A. GarnierGCH-2103A-2010

Cinétique et stochiométrie

Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale

– Taux initiaux– Cuvée– Chemostat– Stop flow

Croissance cellulaire - variables

X S PTaux de variation(kg/(m3.s)

dX/dt dS/dt dP/dt

Taux de production /consommation

rx rs rp

Taux spécifique(kg/(kg.s)

= rx/X qs= -rs/X qp= rP/X

Rendement (kg/kg) Yx/s = rx/rs = /qp

Yp/x, Yp/s

Mode d’opération

Système fermé: cuvée (batch)

•Aucune entrée ou sortie

•Régime transitoire

•dX/dt = rX, dS/dt = rS

•À t = 0, X = X0, S = S0

Cuvée alimentée (Fed-batch)

•Alimentation seulement


•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0

•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc

•Si S est constant, le sera aussi, = c

F(t), Sin

V, X, S

Chemostat (continu, CSTR)

F, Sin

V, X, S, P

F, S, X, P

•Une entrée, une sortie

•Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P

•Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent:

V= cst, X= cst, S= cst, P= cst

Chemostat avec recirculation

F F(1+w)

V, X

Bioréacteur Décanteur

F(1+w)

wF, Xx

Fc, Xc

Fex, Xx

•Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur•Permet de repousser le lavage•Développement pour X seulement

Croissance cellulaire –type de modèles

STRUCTURÉ/SÉGRÉGÉ

NON-STRUCTURÉ

STRUCTURÉ

NON-SÉGRÉGÉ

+ simple

SÉGRÉGÉ

Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulairesSégrégé: Tient compte d’une distribution de population

Modèles de croissance

Du plus simple au plus compliqué– Exponentiel (ordre 0!!)– Linéaire (logistique)– Monod– Autres

Phénomènes connexes– Maintenance– Mortalité

Production– Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

Modèle enzymatique - Monod

SKS

S

MAX

XdtdX

XYXqsdtdS

SX

/

-Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!

(1)

(2)

(3)

-Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant:

Modèle de Monod

Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire:

dtdX

YdtdX

YX

YdtdS

sxsxsx ///

11

Xmax-X = Yx/s * S

Alors:

XXX

YK

XXY

dtdX

MAXSX

S

MAXSX

MAX

)(1

)(1

/

/

X

XXYKXX

MAXSXS

MAXMAX

)()(

/

Modèle de Monod

XXXYK

XXdtdX

MAXSXS

MAXMAX

)()(

/

t

MAX

X

XMAX

MAXSXS dtdXXXX

XXYK0

/

0 )()(

t

MAX

X

XMAX

MAX

MAX

SXS dtdXXXX

XXXXX

YK0

/

0 )()(

)(

Modèle de Monod

t

MAX

X

XMAX

SXS dtdXXXXX

YK0

/

0

1)(

axax

xax)ln(ln

)(1

Sachant que:

tXX

XXXYK MAX

X

XMAX

MAXSXS

0

)ln()ln(ln/

tXXXX

XYK

XX

XXYK

MAXMAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)()(lnln

0

/

0

/

Modèle de Monod

tXXXX

XYK

XX

XXYK

MAXMAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)()(lnln

0

/

0

/

Modèle de Monod

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8

temps (-)

X (-)

0

4

8

12

16

20

24

S (-)S = (Xmax-X)/Yx/s

Données

max= 1

Ks= 5

Yx/s= 0,5

So= 20

Xo= 0,1

Détermination théorique

Cinétique…

Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire

[C6H12O6]n C6H12O6 G3P

glycerol

purines

pyruvate Acétyl-CoA

lactate

Acides gras

éthanol

Lipides

Ac.aminéspyrimidinesCycle de

Krebs

Acides nucléiques

protéinesNAD+ATPH2O

NADHADPO2

Chaîne respiratoire

Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH

Modèle stochiométrique (cliquez ici)

Autres valeurs du coefficient de rendement

(Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)

Détermination expérimentale

Coefficient de rendement

Cinétique– Taux initiaux– Stop-flow– Cuvée– Chemostat

Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant

tXXXX

XYK

XX

XXYK

MAXMAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)()(lnln

0

/

0

/

Modèle de Monod

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8

temps (-)

X (-)

0

4

8

12

16

20

24

S (-)S = (Xmax-X)/Yx/s

Données

max= 1

Ks= 5

Yx/s= 0,5

So= 20

Xo= 0,1

Estimation des rendements en cuvée

Modèle de Monod -X vs S

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20

S (-)

X (-)

Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S:

Ici, Yx/s = 0,5

Effet de maintenance

S = S(croissance) + S(maintenance)

rS = 1/YG* rX + m * X

qs = 1/YG* + m

1/Yx/s = qs/1/YG + m/

Effet de maintenance

1/Yx/s = qs/1/YG + m/

1/Yx/s vs 1/mu

22,05

2,12,15

2,22,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/mu

1/(Y

x/s)

Effet de mortalité

Le taux de mortalité cellulaire:

rd = - kd*X où kd=cste

Donc en cuvée:

dX/dt = *X – kd*X = (– kd)*X

En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement

glutamine

-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)

GLUCOSE PYRUVATE

TCA cycle,resp. chainlactate

glucose pyruvate

GLUTAMINE

GLUTAMATE

OU

NH3

NH3

glutamate

Détermination de la cinétique – Taux initiaux

Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Méthode de flux arrêté (Stopped-flow):

Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.

Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».


Moteur

Mélangeur

LumièreDétection

MoteurMoteur

Temps mort :

Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)

De l’ordre de 1 milliseconde.

Réactif 1 Réactif 2

Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :


Photodiodes Dichroïsme circulaire Tube photomultiplicateur Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)


Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :

Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.

Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.


Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :

Types d’étanchage :

Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)

Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

Moteur

Mélangeur

Moteur

Mélangeur

Récupération des fractions


Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes

Chambre réactionnelle linéaire

Réactif 1 Réactif 2

Agent étanchant

Spectroscopie de masse « en ligne » Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse Électrophorèse sur gel, Comptage à scintillation, etc…


Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques :

Estimation des paramètres de Monod en cuvée

Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement:

tXXXX

XYK

XX

XXYK

MAXMAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)()(lnln

0

/

0

/

÷t÷t

tXX

XXXX

XYK

tXX

MAX

MAX

MAX

SXSMAX

00/0

ln)()(lnln

Y = b + m X

Monod – estimation des paramètres

tXX

0

ln

tXX

XXXX

MAX

MAX

00

ln)()(ln

Modèle de Monod - Estimation des paramètres

y = 0,2475x + 1

0,50,550,6

0,650,7

0,750,8

0,850,9

-1,9 -1,7 -1,5 -1,3 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5

max = 1

m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax

Ks= 0,2475*10,1/0,5

Ks= 5

Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques

Relation cinétique, par exemple Monod:

DSKS

S

MAX

1D

KD

KDSMAX

S

MAX

S

Modèle de Monod -=D vs S

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20 25

S (-)

=

D(-)

Modèle de Monod - S vs D

0

5

10

15

20

25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

D (-)

S

Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch)

•Alimentation seulement


•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0

•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc

•Si S est constant, le sera aussi, = c

F(t), Sin

V, X, S


3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système:

F

dtdV

dtFVVt

00

tV

VdtFdV

00

VXdt

XVd

VX

dtXdV

dtVdX

F

…. )()()()()()( tVtXdt

tXdtVtFtX


VXdt

VXd

dt

VXVXd

c

t

c

XV

VXdtVXd

VX 000

1

tVXVX

c

00

ln tceVXVX 00


VXY

SFdt

VSd

sx

cin

/

VXY

SFdtVdS

dtSdV

sx

cin

/

F0

VXY

SSFsx

ccin

/

cinsx

c

SSYVXF

/

t

cinsx

c ceSSY

VXF

/

00


tceVXVX 00

t

cinsx

c ceSSY

VXF

/

00

dtFVVt

00 dte

SSYVXVV

t t

cinsx

c c

0

/

000

11

/

00

t

cinsx

ceSSY

XVV

11/

0

0

t

cinsx

t

c

c

eSSY

XeXX

7 cinetique et stochiometrie

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