8. manual de prácticas quimica clinica ii
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Manual de practicas de Química Clinica II BUAPTRANSCRIPT
BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLAVICERRECTORÍA DE DOCENCIA
DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIORFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
AREA: ANÁLISIS CLÍNICOS
ASIGNATURA: LABORATORIO QUÍMICA CLÍNICA II
PROFESORA DEL CURSO:MC. MARTHA ALICIA SALGADO JUÁREZ
CÓDIGO:
CRÉDITOS: 2
FECHA: agosto de 2014
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NIVEL EDUCATIVO: LicenciaturaNOMBRE DEL PROGRAMA EDUCATIVO:
Licenciatura en Químico Farmacobiólogo
MODALIDAD ACADÉMICA: PresencialNOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO QUÍMICA CLÍNICA IIUBICACIÓN: Nivel FormativoCORRELACIÓN:
– ASIGNATURAS PRECEDENTES:
QUIMICA CLINICA I
– ASIGNATURAS CONSECUENTES:
QUIMICA CLINICA III INTERPRETACION DIAGNOSTICA POR EL LABORATORIO
– CONOCIMIENTOS
FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS CONCEPTO ACIDO BASE VIAS METABOLICAS DE LIPIDOS
– HABILIDADES Y ACTITUDES
PIPETEO,MANEJO DE ESPECTROFOTOMETRO,TRABAJO EN EQUIPO Y COLABORATIVO
– VALORES PREVIOS:RESPETO, RESPONSABILIDAD,TOLERANCIA HONRRADES PUNTUALIDAD.
CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE
CONCEPTO
HORAS POR PERIODO
(PERIODO = 16 SEMANAS)
NÚMERO DE
CRÉDITOS
HORAS TEORIA Y PRÁCTICA.32
(2 HP/Semana = 32)
2
HORAS DE PRÁCTICA PROFESIONAL
CRÍTICA
0 0
HORAS DE TRABAJO INDEPENDIENTE 0 0
TOTAL 32 2
2
AUTORES:M.C. HILDA ALICIA CARRASCO PERAL M.C. GONZALO GARZON GARCIA M.C.JOSE MANUEL RODRIGUEZ LUNA
FECHA DE DISEÑO: OCTUBRE 2009
FECHA DE LA ÚLTIMA ACTUALIZACIÓN:REVISORES:SINOPSIS DE LA REVISIÓN Y/O ACTUALIZACIÓN
PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:
DISCIPLINA PROFESIONAL: Q.F.B. QBP Y QC
NIVEL ACADÉMICO: MAESTRIA Y/O DOCTORADO
EXPERIENCIA DOCENTE: CINCO AÑOS
EXPERIENCIA
PROFESIONAL:CINCO AÑOS
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PRESENTACIÓN GENERAL DEL PROGRAMA DE LABORATORIO:
a) El programa de laboratorio de Química Clínica II se encarga del
desarrollo y ejecución de los análisis químico biológicos, para el diagnóstico,
pronóstico y profilaxis de las enfermedades.
b) Se requiere de los conocimientos previos de las materias de biología,
histología, anatomía, bioquímica, química analítica, análisis instrumental,
fisiología, inmunología, estadística.
c) Durante este curso se abordarán las pruebas para valorar el metabolismo
de proteínas y lípidos, así como la enfermedad metabólica y padecimientos
cardiacos.
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OBJETIVO GENERAL:
El objetivo del curso es que el alumno desarrolle las habilidades analíticas y
de interpretación de las diferentes pruebas del laboratorio para valorar el
metabolismo de proteínas, lípidos, enfermedad metabolica y funcionamiento
cardiaco.
EVALUACIÓN.-
La asistencia al laboratorio será del 100%
Participación en seminarios y prácticas 20 %
Reportes individuales 20 %
Reportes por equipo 20 %
Reporte de casos clínicos 20 %
Evaluación final práctica 20 %
Total 100 %
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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Elaborada en forma conjunta por la Secretaria de Salud y de Medio Ambiente y
Recursos Naturales, la norma oficial mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-
2002, Protección Ambiental - Salud Ambiental - Residuos Peligrosos Biológico -
Infecciosos – Clasificación y Especificaciones de Manejo, fue publicada en el
Diario Oficial de la Federación el 17 de Febrero del 2003 y sustituye a la NOM-
087-ECOL-1995.
Los RPBI se consideran como residuos peligrosos y como tal se debe establecer
un plan integral para su manejo, almacenamiento, transporte, tratamiento y
disposición final.
PRINCIPALES MODIFICACIONES EFECTUADAS EN LA NOM-087-SEMARNAT-
SSA1-2002.
I. Criterios para considerar un residuo como RPBI
II. Nueva clasificación de los RPBI
III. Cantidad de sangre o fluido corporal en los RPBI
IV. Niveles de los establecimientos generadores
V. Periodo de almacenamiento temporal de los RPBI en los
establecimientos generadores.
VI. Atribución a la Secretaria de Salud, para la vigilancia de la
norma.
I. Los lugares que ofrecen atención médica y los centros de
investigación, son considerados establecimientos
generadores de materiales contaminados por agentes
biológico-infecciosos. Estos desechos se denominan
Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI´s), su
manejo y disposición inadecuados, representa un riesgo para
la salud del personal que labora en estos sitios, así como para
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la salud de la población aledaña, ocasionando además, el
deterioro del medio ambiente. Los microorganismos
patógenos, virus, parásitos y priones (estructuras proteicas)
son ejemplos de agentes biológicos-infecciosos. Para que un
microorganismo sea capaz de producir enfermedad, es decir,
que sea un Agente Biológico-Infeccioso, debe ocurrir lo
siguiente: tener una concentración suficiente (inóculo), estar
en un ambiente propicio (supervivencia), en presencia de una
vía de entrada en un hospedero susceptible.
II. En la Nueva clasificación, los RPBI´s son:
1. La sangre y sus componentes únicamente en estado
líquido.
2. Los cultivos de agentes biológico-infecciosos generados
en:
a. Los procedimientos de diagnóstico e investigación.
b. La producción y el control de agentes biológico-
infecciosos.
3. Los utensilios desechables usados para contener,
transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico-
infecciosos.
4. Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven
durante las autopsias, las cirugías o algún otro tipo de
intervención quirúrgica que no estén conservados en
solución de formol.
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5. Las muestras biológicas empleadas en los análisis clínicos
(excepto las muestras de orina y de excremento), y
aquellas usadas en los análisis patológicos.
6. En los centros de investigación, los cadáveres y las partes
de los animales que fueron inoculados con agentes entero
patógenos.
7. Los residuos no anatómicos:
a. Los recipientes desechables que contengan sangre
líquida.
b. Los materiales desechables que contengan fluidos y
secreciones corporales, provenientes de los
pacientes de quienes se sospechen o exista un
diagnóstico de una enfermedad infecto-contagiosa
como la tuberculosis.
c. Los materiales de curación empapados de sangre
líquida o de cualquier otra secreción o líquido
corporal.
d. Los materiales absorbentes utilizados en las jaulas
de los animales que hayan sido expuestos a agentes
entero patógenos.
8. Los materiales punzo cortantes desechables como las
hojas de bisturí, las agujas de sutura y los estériles de
catéter. El material de vidrio de laboratorio, que se haya
roto al momento de ser manipulado, se deberá desinfectar
o esterilizar y ya no se considerará como RPBI´s, por lo
que se podrá disponer posteriormente como residuo
municipal.
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La disposición general para el desecho de RPBI´s en el laboratorio
queda de la siguiente manera:
TIPO DE RESIDUO
ESTADO FISICO
ENVASADO COLOR
Sangre LíquidosRecipientes herméticos
Rojo
Cultivos y cepas de agentes infecciosos
SólidosBolsas de polietileno
Rojo
Patológicos SólidosBolsas de polietileno
Amarillo
Residuos no anatómicos
SólidosBolsas de polietileno
Rojo
Objetos punzocortantes
SólidosRecipientes rígidos polipropileno
Rojo
III. Para que un material de curación se considere como RPBI´s,
debe ser desechable y estar goteando, chorreando o
escurriendo sangre o cualquier líquido corporal contemplado
en la norma.
IV. Niveles de los Establecimientos Generadores
NIVEL I NIVEL II NIVEL IIIEstablecimientos de atención médica hasta con 5 camas e instituciones de investigación con excepción de los señalados en el Nivel III.
Unidades hospitalarias de 6 hasta 60 camas.
Unidades hospitalarias de más de 60 camas.
Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 1 a 50 muestras al día.
Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 51 a 200 muestras al día.
Centros de producción e investigación experimental en enfermedades infecciosas.
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Unidades hospitalarias psiquiátricas.
Bioterios que se dediquen a la investigación con agentes biológico-infecciosos.
Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis a más de 200 muestras al día.
Centros de toma de muestras para análisis clínicos.
Establecimientos que generen de 25 a 100 kilogramos al mes de RPBI´s.
Establecimientos que generen más de 100 kilogramos al mes de RPBI´s
V. Período de almacenamiento temporal de los RPBI´s en los establecimientos generadores.
NIVEL I NIVEL II NIVEL III30 días máximos
de almacenamiento temporal.
15 días máximos de almacenamiento
temporal.
7 días máximos de almacenamiento
temporal.No requiere de área específica
para el almacenamiento
temporal.
Si requiere de área específica para el almacenamiento
temporal.
Si requiere de área específica para el almacenamiento
temporal.
Se podrán ubicar los contenedores
específicos para los RPBI´s* en el lugar
más apropiado dentro de sus
instalaciones, de manera tal que no obstruyan las vías
de acceso.
Deberá cumplir con las
especificaciones establecidas en la
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, para el área
de almacenamiento temporal.
Deberá cumplir con las especificaciones establecidas en la
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, para el área
de almacenamiento temporal.
*Los contenedores pueden ser plásticos o metálicos, con señalamiento del
símbolo universal de RPBI´s y no mezclarlos con la basura municipal.
VI. Atribución a la Secretaria de Salud. Corresponde a la Secretaria de
salud regular y vigilar el equipamiento, instalación y funcionamiento de
los servicios médicos que son los principales generadores de los RPBI
´s, por ello participa complementariamente con la SEMARNAT en la
regulación y vigilancia de la norma, para lo cual se estableció en el
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cuerpo de la misma, la disposición de crear las Bases de
Colaboración que firmarán ambas dependencias y que serán
publicadas en el Diario Oficial de la Federación, en las que se
especificarán los puntos de la norma que vigilarán cada una
de ellas.
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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL CURSO DE LABORATORIO
SEMANANo.
PRÁCTICA
NOMBRE DE LA PRÁCTICA PÁGINA
1 1 Presentación y NOM 087-SEMARNAT
2 2 Seminario de introducción al laboratorio de química clínica
3 3 Determinación de proteínas totales séricas 13
4 4 Determinación de albumina sérica 13
5 5 Seminario y resolución de casos clínicos de proteinograma
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6 6 Determinación de a colesterol sérico 20
7 7 Determinación de triglicéridos séricos 20
8 8 Determinación de lípidos totales séricos 20
9 9 Determinación de colesterol HDL, LDL y VLDL 27
10 10 Determinación de glucosa, IMC, PC y TA 35
11 11 Determinación de LDL-col y fibrinógeno 44
12 12 Determinación de CK total sérica 51
13 13 Determinación de CK total sérica y CK-MB sérica 54
14 14 Seminario de troponinas y homocisteína
15 15 Resolución de casos clínicos
16 16 Evaluación final
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PRACTICA 3 y 4
DETERMINACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y
ALBUMINA
INTRODUCCION:
La mayoría de proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado,
exceptuando a las inmunoglobulinas que se forman en las células plasmáticas del
bazo, los nódulos linfáticos y la médula ósea.
Las dos causas generales de alteraciones de la proteína total sérica son cambios
de volumen de agua plasmática y cambios en la concentración de una o varias
proteínas séricas.
La hiperproteinemia puede ser debida a deshidratación (aporte insuficiente de
agua, vómitos o diarreas severas, enfermedad de Addison, cetoacidosis diabética)
o a un aumento en la concentración de proteínas específicas (inmunoglobulinas en
infecciones, mieloma múltiple).
La hipoproteinemia se puede producir a causa de una hemodilución (síndromes de
retención salina y la infusión intravenosa masiva), por un defecto en la síntesis
proteica (malnutrición severa, enfermedad hepática crónica, malabsorción
intestinal) o por pérdidas excesivas debidas a enfermedad renal crónica o
quemaduras severas.
OBJETIVO GENERAL:
El alumno realizara la determinación de proteínas totales por el método de
Biuret, como prueba diagnóstica en la alteración de su síntesis y degradación, así
como la perdida por vía renal.
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MATERIAL Y METODOS:
FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA PROTEINAS
La proteína presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio alcalino, originando
un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.
MUESTRAS
Suero y plasma heparinizado recogido mediante procedimientos estándar.
PROCEDIMIENTO
1. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Agua destilada 20 μL --------- ----------
Patrón Proteína -------- 20 μL ---------
Muestra -------- -------- 20 μL
Reactivo 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
2. Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra frente al Blanco a 545 nm. El color es estable
durante al menos 2 horas.
CÁLCULOS
La concentración de proteína en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
A Muestra
___________ x C Patrón = C Muestra
A Patrón
VALORES DE REFERENCIA
60-78 g/L
FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA ALBUMINA
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La albúmina presente en la muestra reacciona con el verde de bromocresol en medio ácido,
originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.
MUESTRAS
Suero o plasma (EDTA, heparina o citrato) recogido mediante procedimientos estándar.
PROCEDIMIENTO
1. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Patrón Albúmina -------- 10 μL --------
Muestra -------- -------- 10 μL
Reactivo 1,0 Ml 1,0 mL 1,0 mL
2. Agitar bien y dejar los tubos durante 1 minuto a temperatura ambiente.
3. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 630 nm frente al Blanco. El color es estable
durante al menos 30 minutos.
CÁLCULOS
La concentración de albúmina en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
A Muestra
___________ x C Patrón = C Muestra
A Patrón
VALORES DE REFERENCIA
Recién nacidos, 2 a 4 dias 28-44 g/L
4 dias a 14 años 38-54 g/L
Adultos 35-50 g/L
> 60 años 34-48 g/L
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BIBLIOGRAFÍA
1. Doumas BT, Watson WA and Biggs HG. Albumin standards and the measurement of serum
albumin with bromocresol green. Clin Chim Acta 1971: 31: 87-96.
2. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.
3. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press, 1995.
4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, 1997.
16
PRACTICA 5
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
INTRODUCCION:
Se designa como electroforesis a la migración de una micela coloidal a
través de un medio de dispersión, cuando actúa una fuerza electromotriz. Si se
usa una solución buffer con un pH superior al punto isoeléctrico de las proteínas a
separar, puede obtenerse su fraccionamiento. El primitivo método de electroforesis
libre de Tiselius mostró que la movilidad de las fracciones proteicas dependen del
tamaño molecular y de la carga eléctrica. Así la albúmina de menor tamaño
molecular se mueve con más rapidez siguiendo en orden de velocidad las
globulinas, las alfas, betas, el fibrinógeno (en plasma) y las globulinas.
La electroforesis de zona, permitió la generalización de los métodos
electroforéticos y su aplicación en el laboratorio de análisis clínicos. En este tipo
de electroforesis se utiliza un medio estabilizado como soporte para el buffer.
Puede utilizarse como soporte el papel, el acetato de celulosa seco o gelatinizado,
el gel de agar, agarosa, almidón, gel de acrilamida, etc.
En la electroforesis de zona por lo común se observan 5 fracciones, la más
anódica es la albúmina, luego le siguen , siendo ésta la más catódica.
OBJETIVO:
Que el alumno aplique el método electroforético al estudio de las proteínas
plasmáticas.
MATERIAL Y MÉTODO
Reactivos.- Equipo.-
Sol’n buffer pH 8.6 Cámara de Electroforesis
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Ponceau-S Fuente de Poder
Ac. Acético 5% Aplicador
Metanol Parrilla
Ac.acético glacial
Membranas de acetato de celulosa
MATERIAL POR SECCIÓN. MATERIAL POR EQUIPO:
1 probeta de 100 ml 1 tubo Vacutainer rojo
3 cajas Petri soporte, aguja y torniquete
20 tiras de papel filtro 4x10 cm 1 tubo 7X100
1 pip. Pasteur c/chuzo
TÉCNICA:
1) Se principia a remojar la membrana de acetato de celulosa en la sol’n buffer,
durante 15 – 60 min., deslizando el borde de la membrana debajo de la
superficie de la sol’n poco a poco y sin interrupción hasta que quede sumergida
completamente.
2) Verter 70 ml de sol’n buffer en cada electrodo de la cámara, y colocar una tira
de papel filtro en cada borde de los electrodos poniéndolas en contacto con la
sol’n buffer.
3) Colocar en los pozos de la base toma-muestras el suero, y alimentar el
aplicador descendiéndolo en los pozos 3 o 4 veces y eliminar esta primera
muestra. Volver a alimentar el aplicador y dejarlo preparado.
4) Quitar el exceso de buffer a la membrana de acetato de celulosa, con ayuda de
papel filtro, e inmediatamente aplicar la muestra manteniendo el aplicador
firmemente contra la membrana durante 10 seg.
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5) Colocar la membrana en la cámara, fijándola con un portaobjetos a cada lado
del electrodo. Tapar la cámara y conectar a la fuente de poder 180 Voltios
durante 15 min.
6) Retirar la membrana de la cámara y proceder a colorearla con Ponceau-S
durante 10 min.
7) Llevar a la membrana a una serie de baños. Primeramente con ac. acético al
5% durante 5 min., para quitar el exceso de colorante.
8) Colocar en baño con metanol durante 5 min, para deshidratar la membrana.
9) Colocar en baño de sol’n aclaradora (metanol-ac. acético) durante 5 min.
10)Secar la membrana a temperatura ambiente o a 70º C por 2 min.
BIBLIOGRAFÍA:
1. Richterich R., Colombo J:P:, Química Clínica. Teoría, Práctica e interpretación,
Ed. Salvat. Barcelona.
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PRACTICA 6, 7 y 8
DETERMINACION DE LIPIDOS TOTALES, COLESTEROL Y
TRIGLICERIDOS
INTRODUCCIÓN:
Los lípidos constituyen un grupo heterogéneo de sustancias insolubles o
poco solubles en agua, sí en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benzal,
éter de petróleo, etc. En general los lípidos del organismo se distribuyen en: las
células en el citoplasma y material de reserva. En la sangre circulante están
unidos a las proteínas plasmáticas por lo que constituyen las lipoproteínas. Estas
lipoproteínas tienen como función principal posibilitar el desplazamiento de los
lípidos exógenos y endógenos entre el hígado, el tejido graso y otros órganos de
la economía.
Las lipoproteínas se estudiaron separándolas por métodos salinos,
precipitación con antisueros específicos, electroforesis, ultracentrifugación o
cromatografía. La clasificación más frecuente se basa en el procedimiento
electroforético, y reciben diferentes nombres: Quilomicrones (QM) constituídos a
partir de TG exógenos en su mayor proporción, y que transportan las grasas del
intestino hacia el corazón por medio de los vasos linfáticos. Las preLP (VLDL) se
constituyen predominantemente a partir de TG endógenos. Las LP (LDL)
transportan la mayor parte del colesterol, y abastecen a todas las membranas
celulares de los tejidos periféricos. Las LP (HDL) en cuya composición predominan
las proteínas y los fosfolípidos, y transportan el colesterol al hígado en donde es
metabolizado y excretado, de donde se considera un factor de protección contra el
acúmulo de colesterol.
Debido a lo anterior la cuantificación de lípidos totales, colesterol total, C-
HDL, CLDL, triglicéridos y una electroforesis son de gran ayuda para la
identificación de las diferentes dislipoproteinemias.
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OBJETIVO:
Que el alumno efectúe diversas determinaciones de lípidos que le ayuden a
identificar la presencia de dislipoproteinemia.
MATERIAL Y MÉTODOS
REACTIVOS: EQUIPO:
Equipo para lípidos totales Centrífuga
Equipo para triglicéridos enzimáticos Espectrofotómetro
Equipo para colesterol enzimático Celdas de
espectrofotómetro Algodón y alcohol
Material por Sección: Material por Equipo:
3 pip. 10 ml 1 gradilla
2 pip. 5 ml 2 tubos de rosca grandes
1 pip. 2 ml 5 tubos 10X100 pyrex
7 pip. 1 ml 7 tubos de 10X100
7 pip. O.1 ml 1/100 2 tubos 16X150 pyrex
1 tubo Vacutainer rojo
soporte, aguja y torniquete
1 pip. Pasteur c/chuzo
FUNDAMENTO DEL METODO PARA LIPIDOS TOTALES:
Los lípidos insaturados reaccionan con el acido sulfúrico formando un ion
carbonio que reacciona con el carbonilo de la fosfovainillina produciendo un
complejo de color rosa, que es estabilizado por resonancia. La intensidad del color
del complejo es proporcional a la concentración de los lípidos en el suero.
MUESTRAS:
Suero, plasma (EDTA).
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METODO:
1.- Marcar tres tubos de ensayo con las letras MMA (mezcla, muestra, acida),
MPA (mezcla, patrón acida) y B (blanco) y proceder como sigue:
B MMA MPA
Muestra ----------- 0.1 ml -----------
Patron ----------- --------- 0.1 ml
Acido sulfúrico conc. ----------- 2.0 ml 2.0 ml
2.- Mezclar bien y poner en baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
3.- Colocar 5 minutos en baño de agua fría. Proceder como sigue:
B Muestra Patron
MMA ----------- 0.1 ml -----------
MPA ----------- ----------- 0.1 ml
Acido sulfúrico conc. 0.1 ml ----------- -----------
Reactivo de color 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
4.- Mezclar bien con Vortex e incubar a 37º C durante 15 minutos. Determinar las
absorbancias de la muestra y del patrón a 540 nm igualando a cero con el blanco.
El color es estable por 15 minutos.
CALCULOS:
A Muestra
___________ x C Patrón = C Muestra
A Patrón
LIMITES DE REFERENCIA:
En ayuno 400-1000 mg/dl
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FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA TRIGLICERIDOS
Los triglicéridos presentes en la muestra originan, según las reacciones acopladas
descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría.
Triglicéridos + H2O Glicerol + Ácidos grasos
Glicerol + ATP Glicerol – 3 – P + ADP
Glicerol – 3 – P + O2 Dihidroxiacetona – P + H2O2
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + 4 - Clorofenol Quinonaimina + 4 H2O
MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar.
PROCEDIMIENTO
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Patrón Triglicéridos ----------- 10 μL -----------
Muestra ----------- ----------- 10 μL
Reactivo 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 2 horas.
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CÁLCULOS
La concentración de triglicéridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente
fórmula:
A Muestra
___________ x C Patrón = C Muestra
A Patrón
VALORES DE REFERENCIA
Hasta 150 mg/dL Bajo
150-199 mg/dL Dudoso
200-499 mg/dL Alto
> 500 mg/dL Muy alto
FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL TOTAL
Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan,
según las reacciones acopladas descritas a continuación, un complejo coloreado
que se cuantifica por espectrofotometría.
Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso
Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar.
El colesterol en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. Pueden utilizarse como
anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
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PROCEDIMIENTO
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Patrón Colesterol ----------- 10 Μl -----------
Muestra ----------- --------- 10 μL
Reactivo 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 2 horas.
CÁLCULOS
La concentración de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente
fórmula:
A Muestra
___________ x C Patrón = C Muestra
A Patrón
VALORES DE REFERENCIA
Los siguientes valores discriminantes universales han sido establecidos por el US
National Cholesterol Education Program y también aceptados en otros paises para
la evaluación del riesgo de enfermedad de las arterias coronarias.
Hasta 200 mg/dL = 5,2 mmol/L Optimo
200-239 mg/dL = 5,2-6,21 mmol/L Moderado
> 240 mg/dL = > 6,24 mmol/L Elevado
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BIBLIOGRAFÍA
1. Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W and Fu PC. Enzymatic
determination of total serum cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-475.
2. Meiattini F, Prencipe L, Bardelli F, Giannini G and Tarli P. The 4-
hydroxybenzoate/4- aminophenazone chromogenic system used in the enzymic
determination of serum cholesterol. Clin Chem 1978; 24: 2161-2165.
3. National Cholesterol Educarion Program Expert Panel. Third report of the
National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection,
Evaluation, andTreatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH
Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute; 2001.
4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press,
1995.
5. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.
26
PRÁCTICA 9
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL, LDL y VLDL
INTRODUCCION:
Las HDL participan en la captación del colesterol de los tejidos y en su
transporte hacia el hígado donde se elimina en forma de ácidos biliares.
Existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de HDL-colesterol en
plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y
accidentes cerebrovasculares.
Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con
niveles reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas,
hiperalimentación intravenosa, malnutrición severa, diabetes, anemia crónica,
alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier, analfalipoproteinemia,
estrés agudo, algunos medicamentos y el tabaco.
Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol hepático hacia
los tejidos.
Existe una correlación positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol
en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y
accidentes cerebrovasculares.
Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con
niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad, algunos medicamentos y el
tabaco.
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OBJETIVO:
El alumno ejecutará la técnica para la determinación de colesterol HDL,
LDL y VLDL séricos y evaluará si se encuentras dentro o fuera de los límites
biológicos de referencia para un probable diagnóstico de dislipidemia.
MATERIAL Y REACTIVOS
FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL HDL
Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de baja densidad (LDL)
presentes en la muestra, precipitan en presencia de fosfotungstato y iones
magnesio. El sobrenadante contiene las lipoproteínas de elevada densidad (HDL),
cuyo colesterol se cuantifica espectrofotométricamente mediante las reacciones
acopladas descritas a continuación:
col. esterasa
Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso
col. oxidasa
Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2
peroxidasa
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL LDL
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) presentes en la muestra, precipitan en
presencia de polivinil sulfato. La concentración de colesterol LDL se calcula por
diferencia entre los valores de colesterol en el suero y en el sobrenadante
28
obtenido tras la precipitación. El colesterol se cuantifica espectrofotométricamente
mediante las reacciones acopladas descritas a continuación.
col. esterasa
Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso
col. oxidasa
Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2
peroxidasa
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Tanto el Reactivo como el Patrón están listos para su uso.
EQUIPO ADICIONAL
− Centrífuga de sobremesa
− Baño de agua a 37ºC (opcional)
− Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm
MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar.
PROCEDIMIENTO
Precipitación
1. Pipetear en un tubo de centrífuga:
Muestra 0,2 mL
Reactivo (A) (kit de Colesterol HDL) 0,5 Ml
2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 10 minutos a un mínimo de 4.000 r.p.m.
29
4. Recoger con cuidado el sobrenadante.
Colorimetría
5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente.
6. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Agua destilada 100 μL ---------- ---------
Patrón Colesterol HDL (S) ----------- 100 μL -----------
Sobrenadante muestra ----------- ------------ 100 μL
Reactivo (A) (kit de Colesterol) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC.
8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 30 minutos.
CÁLCULOS
La concentración de colesterol HDL en la muestra se calcula a partir de la
siguiente fórmula general:
A Muestra
---------------- x C Patrón = C Muestra
A Patrón
Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol HDL suministrado:
x 52,5 = mg/dL colesterol HDL
x 1,36 = mmol/L colesterol HDL
30
VALORES DE REFERENCIA
Las concentraciones de colesterol de HDL varían considerablemente con la edad y
el sexo. El siguiente valor discriminante ha sido recomendado para identificar
indivíduos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.
Hasta 35 mg/dL = 0,91 mmol/L Elevado
> 60 mg/dL = > 1,56 mmol/L Bajo
REACTIVOS ADICIONALES PARA COLESTEROL LDL
Este reactivo precipitante debe ser utilizado junto con el Reactivo de Colesterol
contenido en cualquiera de los kits de Colesterol
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
El Reactivo está listo para su uso.
EQUIPO ADICIONAL
− Centrífuga de sobremesa
− Baño de agua a 37ºC
− Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm
MUESTRAS
Suero recogido mediante procedimientos estándar.
El Colesterol LDL en suero es estable 24 horas días a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
Precipitación
1. Pipetear en un tubo de centrífuga:
Muestra 0,4 mL
31
Reactivo (A) (kit de Colesterol LDL) 0,2 Ml
2. Agitar bien y dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 15 minutos a un mínimo de 4.000 r.p.m.
4. Recoger con cuidado el sobrenadante.
Colorimetría
5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente.
6. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Agua destilada 20 μL ---------- ---------
Patrón Colesterol HDL (S) ----------- 20 μL -----------
Sobrenadante muestra ----------- ------------ 20 μL
Reactivo (A) (kit de Colesterol) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC.
8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 30 minutos.
32
CÁLCULOS
La concentración de colesterol en el sobrenadante se calcula a partir de la
siguiente fórmula
general:
A Muestra
---------------- x C Patrón = C Muestra
A Patrón
Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol, incluido en el Kit de Colesterol:
x 200 x 1,5 = mg/dL colesterol en sobrenadante
x 5,18 x 1,5 = mmol/L colesterol en sobrenadante
La concentración de colesterol LDL en la muestra se calcula:
colesterol LDL = colesterol total – colesterol en sobrenadante
VALORES DE REFERENCIA
Hasta 100 mg/dL = 2,59 mmol/L Optimo
100-129 mg/dL = 2,59-3,34 mmol/L Casi óptimo
130-159 mg/dL = 3,37-4,12 mmol/L Moderado
160-189 mg/dL = 4,14 -4,90-mmol/L Elevado
> 190 mg/dL = 4,92 mmol/L Muy elevado
33
BIBLIOGRAFÍA
1. Grove TH. Effect of reagent pH on determination of high-density lipoprotein
cholesterol by precipitation with sodium phosphotungstate-magnesium. Clin Chem
1979; 25: 560-564.
2. Burstein M, Scholnick HR and Morfin R. Rapid method for the isolation of
lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. Scand J Clin Lab
Invest 1980; 40: 583-595.
3. National Cholesterol Educarion Program Expert Panel. Third report of the
National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection,
Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH
Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute; 2001.
4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press,
1995.
5. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.
6. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed.
AACC Press, 1997.
34
PRACTICA 10
INDICADORES DE SINDROME METABOLICO
INTRODUCCION
Aunque la medida de la presión arterial es hoy dia una exploración rutinaria,
siguen siendo los resultados de la misma los que permiten diagnosticar la
hipertensión, independientemente de otras exámenes o tests de laboratorio. Su
correcta determinación reviste, por tanto, gran importancia ya que una
sobrestimación de la misma puede inducir un diagnóstico erróneo en un enfermo
sano con la probable aplicación de un tratamiento innecesario.
La medida de la presión arterial deberá ser, por tanto, realizada con un equipo
adecuado que garantice su exactitud y reproducibilidad tanto individual como
interindividual.
OBJETIVO
El alumno realizarà la determinación de Marcadores para determinar enfermedad
metabolica o no
Técnica
La técnica utilizada para la determinación de la presión arterial se basa en la
interrupción del flujo de sangre de la arterial braquial mediante la aplicación de una
presión uniforme con un manguito inflable. Cuando la presión aplicada es mayor
que la presión arterial, el vaso se colapsa y el flujo se detiene no auscultándose
ningún ruido.
35
Al ir diminuyendo la presión del manguito, el flujo en el vaso se restaura originando
unos ruidos característicos del flujo turbulento que progresivamente pasa a flujo
laminar y que permiten el cálculo de las presiones arteriales diastólica y sistólica.
Los ruidos que permiten dichos cálculos se conocen como fases de Korotkoff:
Fase I: Indica que la presión del vaso ha soprepasado la presión externa.
Es un sonido abrupto, alto y progresivamente intenso.
Fase II: El sonido es más claro, intenso y prolongado.
Fase III: el sonido continua alto y claro aunque empieza a percibirse un
murmullo que indica su próxima desaparición
Fase IV: hay un pérdida brusca de la intensidad del sonido que se hace
marcadamente apagado con un murmullo continuo. En ocasiones es lo
último que se escucha
Fase V: Desaparición total del sonido al restablecerse el flujo laminar.
Para la correcta medida de la presión arterial se deberán tomar las siguientes
precauciones:
el manguito inflable deberá ser de las dimensiones adecuadas para rodear
el perimetro del brazo exactamente. Existen multitud de "tallas" de
manguitos de tal forma que puede elegirse el más apropiado para cada
enfermo. Incluso existen manguitos de un solo uso para uso enfermos
infecciosos. El estetoscopio se colocará en la parte inferior
el manguito será inflado rápidamente hasta que su presión sobrepase la
PAS estimada, lo que se puede comprobar por la desaparición del pulso
radial.
Desde este nivel de presión se comienza a desinflar el manguito de forma
lenta y progresiva.
Cuando la presión arterial y la del manguito se igualan, en cada sístole la
presión es capaz de superar ligeramente la presión externa. Esto se
traduce en la aparición del pulso y de un sonido intenso que accompaña
cada onda de pulso.
36
A medida que se desinfla el manguito van apareciendo las distintas fases
de Korotkoff hasta desaparecer en la fase V.
Factores que influyen
Para que las medidas de la presión arterial sean reproducibles por otro
observador, es necesario estandarizar el procedimiento, teniendo en cuenta los
factores que influyen:
Ambiente: el local donde se realice la medida deberá ser lo más tranquilo
posible, sin ruidos y con una temperatura e iluminación agradables.
Paciente: el paciente deberá permanecer en reposo durante 5 minutos
antes de efectuar la medida de la presión, sentado confortablemente en un
sillón adecuado con el brazo a explorar relajado y apoyado, con la palma
hacia arriba. El brazo debe estar descrubierto.
Observador: los profesionales que realizan las medidas de la presión
arterial deberán tener un entrenamiento similar. Deberán estar familiarizado
con el sonido del estetoscopio y tener la capacidad de discriminar sonidos
correspondientes a las fases de Korotkoff. En particular, los ruidos de las
fases IV y V deben ser perfectamente discriminados.
Equipos
El equipo preciso para la medida de la presión arterial está constituído por el
estetoscopio, el esfingomanómetro y el manguito.
Estetoscopio:
los sonidos arteriales son bien transmitidos y serán bien percibidos si se
coloca sobre la arteria humeral, en el pliegue del codo.
Esfigomanómetro:
puede ser de mercurio, aneroide u oscilométrico:
37
o de mercurio: consiste en un cubeta que contiene mercurio
conectada a un tubo vertical de cristal con un extermo abierto por
donde sube el mercurio al inflar el manguito. El tubo está calibrado
entre 0 y 300 mm . El sistema va conectado mediante un tubo de
goma al mecanismo de inflado que consiste en una pera y una
válvula que regula el paso del aire hacia el sistema o hacia el
exterior. Deberá estar en posición vertical sobre una mesa horizontal
o mejor aún colgado de una pared.
o aneroide: se trata de un mecanismo a resorte que se moviliza a una
presión determinada y de forma proporcional a la misma,
desplazando una aguja en una esfera graduada en mm de Hg.
Aunque vienen calibrados de fábrica, son sensibles a la temperatura
y humedad y se deben recalibrar cada 6 meses
o oscilométrico: es un aparato electrónico basado en el análisis de la
onda de pulso. Algunos equipos que llevan este tipo de
esfingomanómetro pueden ser muy sofisticados, siendo
programables y permitiendo el inflado automático del manguito.
Incluso algunos se han desarrollado como periféricos para conectar
a un PC. En los más sencillos y baratos, el inflado es manual. La
fiabilidad de estos aparatos ha sido bien establecida, lo que los hace
ideales para la toma domiciliaria de la PA.
Manguito:
el maguito consta de una cámara de caucho infable situada en el interior de
una funda de tela que la engloba y que permite un abombamiento en su
parte interna. Las dimensiones del mismo son críticas, ya que un brazal
demasiado ancho dará valores anormalmente bajos de la PA, mientras que
uno demasiado estrecho dará valores más altos.
Se han comercializado numeros tipos de manguitos para adultos y niños,
multiusuarios o para pacientes individuales. Las tallas más usuales se
muestran en la tabla 2.1
38
DETERMINACION DE INDICE DE MASA DE CINTURA
El índice cintura-cadera (IC-C) es una medida antropométrica específica para
medir los niveles de grasa intraabdominal, relaciona el perímetro de la cintura
con el de la cadera (en centímetros) y dependiendo del resultado se estima si hay
cierto riesgo cardiovascular.
La OMS establece unos niveles normales de 0,8 en mujeres y 1 en hombres,
valores superiores indicarían obesidad abdominovisceral, lo cual se asocia a
un riesgo cardiovascular aumentado. Este parámetro es un buen indicativo para
ir vigilando tu salud cardiovascular de manera sencilla, si tus niveles se salen de
los valores normales ve tomándote en serio empezar con una vida saludable,
mejor prevenir que curar.
Además esta medida es complementaria al Índice de Masa Corporal (IMC), ya que
el IMC no distingue si el sobrepeso se debe a retención de líquidos, hipertrofia o
similar. De este modo el medir el IMC y el IC-C nos aproximará mejor a
conocer nuestra situación respecto al peso y riesgo cardiovascular.
39
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE
INTRODUCCION:
En el laboratorio clínico el metabolismo que el organismo lleva a cabo sobre
los carbohidratos consumidos y producidos en él, se refleja en la concentración
que la glucosa alcanza a nivel sérico. Por tal motivo ésta determinación es una de
las más importantes a nivel del laboratorio clínico ya que permite definir el estado
basal de dicho proceso.
La glucosa es la principal fuente de energía del organismo. La insulina,
producida en las células de los islotes del páncreas, facilita la entrada de glucosa
en las células de los tejidos. Una deficiencia de insulina o una disminución de su
actividad ocasiona un aumento de la glucosa en sangre.
Se encuentran concentraciones elevadas de glucosa en suero o plasma en
pacientes con diabetes mellitus (dependiente de insulina o no dependiente de
insulina) y con otras condiciones o síndromes. La hipoglucemia puede darse como
respuesta al ayuno, o bien puede ser debida a fármacos, venenos, errores
congénitos del metabolismo o gastrectomía previa.
El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un
único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio (1).
OBJETIVO:
El alumno ejecutará la técnica para la determinación de glucosa sérica y
evaluará si se encuentras dentro o fuera de los límites biológicos de referencia.
MATERIAL Y REACTIVOS
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
40
La glucosa presente en la muestra origina, según las reacciones acopladas
descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría.
Glucosa + ½ O2 + H2O Glucónico + H2O2
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Tanto el Reactivo como el Patrón están listos para su uso.
EQUIPO ADICIONAL− Baño de agua a 37ºC
− Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm
MUESTRASSuero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El suero o plasma
deben separarse de los elementos celulares lo antes posible para evitar la
glucolisis. La adición de fluoruro sódico a la muestra de sangre previene la
glucolisis.
PROCEDIMIENTO
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.2. Pipetear en tubos de ensayo: (Nota 1)
Blanco Patrón MuestraPatrón (S) 10 μL
Muestra 10 μLReactivo (A) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o
durante 5 minutos a 37ºC.
41
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 2 horas.
CÁLCULOSLa concentración de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente
fórmula general:
A Muestra
---------------- x C Patrón = C Muestra
A Patrón
Si se utiliza para calibrar el Patrón de Glucosa suministrado
x 100 = mg/dL glucosa
x 5,55 = mmol/L glucosa
VALORES DE REFERENCIA
Suero y plasma:
Neonato, prematuro 25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L
Neonato, a término 30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L
Niños, adultos 70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L
BIBLIOGRAFÍA1. Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an
alternative oxygen acceptor. Ann Clin Biochem 1969; 6: 24-27.
2. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.
3. National Diabetes Data Group: Classification and diagnosis of diabetes mellitus
and other categories of glucose intolerance. Diabetes 1979; 28:1039-1057.
4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press,
1995.
5. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed.
AACC Press, 1997.
42
PRACTICA 11
DETERMINACION DE LDL-C Y FIBRINOGENO
REACTIVOS ADICIONALES PARA COLESTEROL LDL
Este reactivo precipitante debe ser utilizado junto con el Reactivo de Colesterol
contenido en cualquiera de los kits de Colesterol
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
El Reactivo está listo para su uso.
EQUIPO ADICIONAL
− Centrífuga de sobremesa
− Baño de agua a 37ºC
− Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm
MUESTRAS
Suero recogido mediante procedimientos estándar.
El Colesterol LDL en suero es estable 24 horas días a 2-8ºC.
PROCEDIMIENTO
Precipitación
1. Pipetear en un tubo de centrífuga:
Muestra 0,4 mL
Reactivo (A) (kit de Colesterol LDL) 0,2 Ml
2. Agitar bien y dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 15 minutos a un mínimo de 4.000 r.p.m.
43
4. Recoger con cuidado el sobrenadante.
Colorimetría
5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente.
6. Pipetear en tubos de ensayo:
Blanco Patrón Muestra
Agua destilada 20 μL ---------- ---------
Patrón Colesterol HDL (S) ----------- 20 μL -----------
Sobrenadante muestra ----------- ------------ 20 μL
Reactivo (A) (kit de Colesterol) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-
25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC.
8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El
color es estable durante al menos 30 minutos.
CÁLCULOS
La concentración de colesterol en el sobrenadante se calcula a partir de la
siguiente fórmula
general:
A Muestra
---------------- x C Patrón = C Muestra
A Patrón
44
Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol, incluido en el Kit de Colesterol:
x 200 x 1,5 = mg/dL colesterol en sobrenadante
x 5,18 x 1,5 = mmol/L colesterol en sobrenadante
La concentración de colesterol LDL en la muestra se calcula:
colesterol LDL = colesterol total – colesterol en sobrenadante
VALORES DE REFERENCIA
Hasta 100 mg/dL = 2,59 mmol/L Optimo
100-129 mg/dL = 2,59-3,34 mmol/L Casi óptimo
130-159 mg/dL = 3,37-4,12 mmol/L Moderado
160-189 mg/dL = 4,14 -4,90-mmol/L Elevado
> 190 mg/dL = 4,92 mmol/L Muy elevado
BIBLIOGRAFÍA
1. Grove TH. Effect of reagent pH on determination of high-density lipoprotein
cholesterol by precipitation with sodium phosphotungstate-magnesium. Clin Chem
1979; 25: 560-564.
2. Burstein M, Scholnick HR and Morfin R. Rapid method for the isolation of
lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. Scand J Clin Lab
Invest 1980; 40: 583-595.
3. National Cholesterol Educarion Program Expert Panel. Third report of the
National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection,
45
Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH
Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute; 2001.
4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press,
1995.
5. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.
6. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed.
AACC Press, 1997.
DETERMINACION DE FIBRINOGENO
INTRODUCCION
Para la conversión del valor en segundos a mg/dl de fibrinógeno sirve
la tabla adjunta al estuche. Los valores indicados en ésta son válidos
sólo para el reactivo de fibrinógeno con el mismo número de control y
para los analizadores indicados.
La conversión (para la dilución 1 + 9) es posible en el intervalo de 5–
40 seg. El intervalo de precisión óptimo (8–25 seg) está marcado por
dos líneas negras. Si se requiere una determinación más exacta fuera
de este intervalo óptimo, se recomienda repetir el test con otra
dilución.
Si el tiempo de coagulación es inferior a 8 seg, se repite el test con
la dilución de 1 + 19 y se multiplica el resultado obtenido por 2. Si el
tiempo de coagulación es superior a 25 seg, se repite el test con una
dilución de 1 + 4 ó 1 + 1. Con una dilución de 1 + 4, dividir el valor
obtenido por 2, con una de 1 + 1 dividir por 5.
Observaciones
46
Un inhibidor de la heparina, añadido al reactivo, permite la
determinación también en pacientes bajo tratamiento con heparina.
OBJETIVO
El alumno realizarà la determinación de Marcadores para determinar enfermedad
metabolica o no
Extracción de sangre venosa
La estasis venosa debe hallarse entre la presión sistólica y diastólica
y no debe durar más de un minuto. La estasis repetida de la misma vena no es
posible antes de haber transcurrido 10 minutos.
Se recomienda emplear jeringas de un solo uso con solución estéril
de citrato sódico (0,11 mol/l). Hay que observar estrictamente las
proporciones de mezcla de citrato sódico y sangre de 1 + 9. La velocidad de la
extracción se elige de manera que no se presente una depresión demasiado alta
en la jeringa.
Obtención del plasma
Inmediatamente después de la extracción, mezclar bien la sangre y
trasladarla a un tubo de centrífuga, evitándose la formación de espuma.
Centrifugar 15 min. a aprox. 2500 g. Efectuar la centrifugación en el plazo de 2
horas después de la extracción de sangre. A continuación, pipetear el
sobrenadante.
Estabilidad de la muestra
4 horas a 15–25°C (a partir del momento de la extracción de sangre)
Dilución de plasma
Diluir una parte de plasma citratado con nueve partes de la solución
tampón, pH 7,35.
Método de determinación
Pipetear en un tubo de ensayo:
Muestra o plasma de control diluidos 0,2 ml
47
Incubar 1 min a 37°C
Reactivo de Fibrinógeno (20–25°C) 0,2 ml
Con la adición del reactivo de fibrinógeno, disparar el cronómetro y determinar el
comienzo de la coagulación.
* La determinación del fibrinógeno con el Fibrintimer requiere la adición de caolín.
Disolver el contenido del frasco 1 con 1,8 ml de agua bidest. y añadir 0,2 ml de
una
suspensión de caolín (p. ej. del Reactivo PTT, Ref. 126 551 ó 524 298).
Evaluación
Para la conversión del valor en segundos a mg/dl de fibrinógeno sirve
la tabla adjunta al estuche. Los valores indicados en ésta son válidos
sólo para el reactivo de fibrinógeno con el mismo número de control
y para los analizadores indicados.
La conversión (para la dilución 1 + 9) es posible en el intervalo de 5– 40 seg. El
intervalo de precisión óptimo (8–25 seg) está marcado por
dos líneas negras. Si se requiere una determinación más exacta fuera
de este intervalo óptimo, se recomienda repetir el test con otra dilución.
Si el tiempo de coagulación es inferior a 8 seg, se repite el test con
la dilución de 1 + 19 y se multiplica el resultado obtenido por 2. Si el
tiempo de coagulación es superior a 25 seg, se repite el test con una
dilución de 1 + 4 ó 1 + 1. Con una dilución de 1 + 4, dividir el valor obtenido por 2,
con una de 1 + 1 dividir por 5.
Observaciones
Un inhibidor de la heparina, añadido al reactivo, permite la determinación también
en pacientes bajo tratamiento con heparina.
FUNDAMENTO DE LA TECNICA
Plasmas de control
Para el control de calidad se pueden emplear:
48
– los plasmas de control contenidos en el estuche (normal, frasco 3,y patológico,
frasco 4),
– PreciClot I/II (normal, patológico)
– PreciClot I/II (normal)
– PreciClot II/I (patológico)
Preparación de los plasmas de control normal y patológico
Disolver el contenido de un frasco de plasma de control con exactamente 0,5 ml
de agua bidest. La solución no se debe agitar y debe debe agitar y debe reposar
por lo menos 30 min antes del uso. – El plasma de control se trata como plasma
citratado normal.
Estabilidad: 2 horas a 4–25°C
Estabilidad: 1 mes a –20°C.
Dilución del plasma
Plasma de control normal: diluir 1 + 9 con solución tampón.
Plasma de control patológico: diluir 1 + 9 ó 1 + 4 con solución tampón.
Método de determinación
La determinación se efectúa según el esquema de al lado. Evaluación
Para la conversión del valor en segundos a mg/dl de fibrinógeno sirve
la tabla adjunta al estuche. Con una dilución de 1 + 4, dividir por 2 el valor indicado
en la tabla.
Valores teóricos para los plasmas de control
Los valores exactos para los plasmas de control se toman de la hoja
adjunta a los estuches. Son válidos sólo para el número de control
correspondiente.
Valor normal200–400 mg/dl o resp. 2,0–4,0 g/l
Bibliografía
Clauss A. Acta haemat 1957;17:237.
Paar D. Blut 1971;23:1.
49
PRACTICA NÙMERO 12
DETERMINACIÒN DE CREATINA QUINASA
INTRODUCCIÒN:
La creatina quinasa (CK) desempeña una importante función en el músculo
proporcionando ATP, cuando el músculo se contrae, a partir de ADP y utilizando
creatina fosfato como reservorio de fosforilación.
La CK sérica procede fundamentalmente del músculo y su concentración
depende de una serie de variables fisiológicas (sexo, edad, masa muscular,
actividad física y raza).
La concentración sérica de CK se encuentra notablemente elevada en
pacientes con algunas de las enfermedades del músculo esquelético (distrofia
muscular, miositis, polimiositis, hipertermia maligna, trauma, rabdomiolisis aguda),
del sistema nervioso central (enfermedad cerebrovascular aguda, isquemia
cerebral, síndrome de Reye) y de el tiroides (hipotiroidismo). Se observan
concentraciones elevadas de CK al cabo de 3-6 horas de un infarto de miocardio
alcanzando valores máximos a las 24-36 horas. La concentración vuelve a la
normalidad en 3-4 días debido a que la enzima es eliminada rápidamente del
plasma. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado
de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
OBJETIVO:
El alumno realizarà la determinación de CK como un indicador enzimático de
confirmación de diagnostico de Infarto agudo al miocardio.
MATERIAL Y MÈTODOS:
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
50
La creatina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de
creatina, obteniéndose creatina y ATP. La concentración catalítica se determina,
empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, a partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340
nm.
Fosfato de creatina + ADP Creatina + ATP
ATP + Glucosa ADP + Glucosa - 6 - fosfato
Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH + H
MUESTRAS
Suero recogido mediante procedimientos estándar
PROCEDIMIENTO
1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a la temperatura de
reacción.
2. Pipetear en una cubeta:
Muestra 50 µL Reactivo de Trabajo 1,0 mL
3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronómetro en marcha. 4.
A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada
minuto durante3 minutos.
5. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).
CÁLCULOS
A/min x 3333 = U/L
VALORES DE REFERENCIA
25ºC 10-65 U/L
30ºC 15-105 U/L
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37ºC 38-174 U/L
BIBLIOGRAFÍA
1. IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part
7: IFCC method for creatine kinase. JIFCC 1989; 1: 130-139.
2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB
Saunders Co., 1999.
3. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press,
1997. 4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th
ed. AACC Press,1997.
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PRACTICA NUMERO 13
DETERMINACION DE CREATINA QUINASA TOTAL E ISOENZIMA
CK-MB
INTRODUCCIÒN:
La creatina kinasa esta compuesta de 2 cadenas polipeptídicas, denominadas
B (de cerebro) y M (de músculo), que dan origen a los tres isoenzimas diméricos:
MM (CK-1), MB (CK-2) y BB (CK-3).
Los porcentajes de la actividad de CK-MB sérica respecto a la actividad CK
total suele ser inferior al 6%. Sin embargo, estos valores aumentan al 10 a 30%
después de un infarto de miocardio dependiendo de la extensión de tejido
miocárdico afectado y de la localización del infarto. No obstante, pueden
encontrarse índices bajos de CK-MB sérica tras un infarto de un miocardio
previamente sano. Por consiguiente, el diagnóstico de infarto de miocardio debe
basarse en la historia clínica y otros datos, junto con la magnitud de la elevación
de CK-MB y su perfil en el tiempo.
OBJETIVO:
El alumno determinarà la CK-total y CK-MB como indicadores enzimáticos de la
confirmación y seguimiento de un Infarto al miocardio.
MATERIAL Y METODOS.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
La creatina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de
creatina, obteniéndose creatina y ATP. La concentración catalítica se determina,
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empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, a partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340
nm.
Fosfato de creatina + ADP Creatina + ATP
ATP + Glucosa ADP + Glucosa - 6 - fosfato
Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH + H
MUESTRAS
Suero recogido mediante procedimientos estándar
PROCEDIMIENTO
1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a la temperatura de
reacción.
2. Pipetear en una cubeta:
Muestra 50 µL Reactivo de Trabajo 1,0 mL
3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronómetro en marcha. 4.
A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada
minuto durante3 minutos.
5. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).
CÁLCULOS
A/min x 3333 = U/L
VALORES DE REFERENCIA
25ºC 10-65 U/L
30ºC 15-105 U/L
37ºC 38-174 U/L
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FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Un anticuerpo específico inhibe las dos subunidades M de la CK-MM
(CK-3) y la única subunidad M de la CK-MB (CK-2), lo que permite la
medición de la subunidad B de la de la CK- MB (asumiendo la ausencia
de CK-BB o CK-1)
. La concentración catalítica de CK-B, que corresponde a la mitad de la
actividad CK-MB, se determina empleando las reacciones acopladas de
la hexoquinasa (HK) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6P-DH), a
partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340 nm.
Fosfato de creatina + ADP Creatina + ATP
ATP + Glucosa ADP + Glucosa - 6 - fosfato
Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH
+ H
PROCEDIMIENTO
1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a 37ºC.
2. Pipetear en un tubo de ensayo:
Muestra 40 µL Reactivo de Trabajo 1,0 mL
3. Mezclar bien e incubar inmediatamente a 37ºC. Poner en marcha el
cronómetro.
4. Leer la absorbancia (A) a 340 nm exactamente a los 5 minutos (A 5)
y a los 10 minutos (A 10) de incubación.
CÁLCULOS
La concentración de CK-MB en la muestra se calcula a partir de la
siguiente fórmula:
A 10 – A 5 x 1651= U/L
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VALORES DE REFERENCIA
Se han descrito valores discriminantes de alrededor de 25 U/L = 417
nkat/L para el infarto agudo de miocardio. No obstante, es preferible
emplear el límite del índice de CK-MB del 6% de la concentración de CK
total valor discriminante.
BIBLIOGRAFÍA
1. IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part
7: IFCC method for creatine kinase. JIFCC 1989; 1: 130-139.
2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB
Saunders Co., 1999.
3. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press,
1997. 4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th
ed. AACC Press,1997.
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