A 8.1 ősi MHC haplotípus: kétélű kard

Doktori értekezés

Dr. Laki Judit

III. sz. Belgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem, Budapest

Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Prof. Dr. Füst György

Hivatalos bírálók: Dr. Novák Zoltán

Dr. Szántai Eszter

Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Falus András

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Madarasi Anna

Dr. Vásárhelyi Barna

Budapest

2008

2

Tartalomjegyzék

1. Rövidítések jegyzéke 4. oldal

2. Bevezetés 5. oldal

2.1. Az MHC regió jellegzetességei 5. oldal

2.1.1.1. Immunregulációs gének 5. oldal

2.1.1.2. MHC I osztály 5. oldal

2.1.1.3. MHC II osztály 5. oldal

2.1.1.4. MHC III osztály: a központi MHC régió 6. oldal

2.1.2. Az MHC régiókon belüli blokkok: a humán genom egy különleges

része

7. oldal

2.1.3. A 8.1 ősi haplotípus (AH) 9. oldal

2.1.3.1. Citokinek 10. oldal

2.1.3.2. C4A komplement fehérje hiánya 11. oldal

2.1.3.3. Antigén prezentáció és feldolgozás 12. oldal

2.1.3.4. Betegség asszociáció 12. oldal

2.2. RAGE 14. oldal

2.3. Cisztás fibrózis 15. oldal

2.4. Colorectalis tumor 16. oldal

3. Célkitűzések 17. oldal

4. Módszerek 17. oldal

4.1. DNS extrakció 17. oldal

4.2. Génpolimorfizmusok meghatározása 18. oldal

4.3. Vizsgált populációk 22. oldal

4.4. Statisztikai analízis 27. oldal

5. Eredmények 28. oldal

5.1.1. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros genetikai

kapcsoltság 1-es típusú diabeteses betegekben

28. oldal

5.1.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus és MHC II és III osztályú gének

marker alléljei nyolc 1-es típusú diabeteses családban

29. oldal

5.1.3. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros kapcsoltság

megerősítése magyar, ohioi és izlandi egészségesek csoportjában

34. oldal

5.1.4. A RAGE -429C és a diabeteses betegek klinikai tünetei közti 37. oldal

3

összefüggés

5.2.1. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei egymással kapcsoltak,

haplotípust alkotnak

39. oldal

5.2.2. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei és haplotípusaik gyakorisága

egészséges kontrollokban és CF-os betegekben

39. oldal

5.2.3. A CF-os betegcsoport felosztása 8.1AH-t hordozókra és nem

hordozókra –a 8.1AH hatása a kolonizációra

41. oldal

5.2.4. A kolonizáció mentes időszak hossza különbözik 8.1AH hordozók és

nem hordozók között

43. oldal

5.3.1. MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros

betegekben és egészséges kontrollokban

45. oldal

5.3.2. A 8.1 ősi haplotípus gyakoriságának összehasonlítása colorectalis tumoros

betegekben és egészséges kontrollokban, kor és nem szerint csoportosítva

47. oldal

5.3.3. A 8.1AH és klinikai jellemzők összefüggésének hiánya colorectalis

tumoros betegekben

49. oldal

6. Megbeszélés 50. oldal

6.1.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje 50. oldal

6.1.2. RAGE -429C összefüggése a szénhidrát anyagcserével 51. oldal

6.2. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban 52. oldal

6.3. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel 54. oldal

6.4. A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban 54. oldal

7. Következtetések 56. oldal

7.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje 56. oldal

7.2. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel 56. oldal

7.3. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban 56. oldal

7.4 A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban 57. oldal

7.5 A 8.1ősi haplotípus: kétélű kard 58. oldal

8.1. Összefoglalás 60. oldal

8.2. Summary 61. oldal

9. Irodalomjegyzék 62. oldal

10. Publikációk jegyzéke 76. oldal

11. Köszönetnyilvánítás 79. oldal

4

1. Rövidítések jegyzéke

RAGE receptor for advanced glycation end-products

AH ancestral haplotype, ősi haplotípus

bp bázispár

CEH conserved extended haplotype, konzervált kiterjesztett

haplotípus

CF cisztás fibrózis

CFTR cisztás fibrózis transzmembrán kondukciós regulátor (protein)

COPD krónikus obstruktív tüdőbetegség

C2, C4 komplement 2, komplement 4

HBV hepatitis B vírus

HCV hepatitis C vírus

HIV humán immundeficiencia vírus

HLA humán leukocita antigén

HSP70 70kDa-os hősokk fehérje

LAK limfokin-aktivált killer (ölősejt)

LTA limfotoxin alfa

MHC fő hisztokompatibilitási komplex

NK natural killer (cell), természetes ölősejt

PCR polimeráz láncreakció

RFLP restrikciós fragmens hossz polimorfizmus

SDS nátrium (sodium)-dodecil-szulfát

SNP single nucleotide polymorphism, egyes nukleotid

polimorfizmus

SSP PCR szekvencia specifikus polimeráz láncreakció

TNF-α tumor nekrózis faktor alfa

5

2. Bevezetés

2.1. Az MHC regió jellegzetességei

2.1.1.1. Immunregulációs gének

A fő hisztokompatibilitási complex (MHC), vagy ahogyan emberben még hívják, a

human leukocita antigén (HLA) regió a 6-os kromoszóma rövid karján található, és

három további régióra osztható: I, II és a középső III osztályra. Az I és II osztályú MHC

gének által kódolt sejtfelszíni molekulák segítségével a sejtek antigén peptideket

mutatnak be T-sejteknek, így az immunválasz elindításában kulcsszerepet játszanak. Az

MHC III régióban az immunválasz szabályázosában fontos citokinek és plazmafehérjék

kódoltak.

2.1.1.2. MHC I osztály

Az I osztály génjeinek terméke egy variábilis α-láncból és egy másik, konstans β2

mikroglobulin láncból áll. A polimorf I osztályú α-láncokat 6 gén kódolja: a

„klasszikusnak” nevezett HLA-A, -B, -C gének és a „nem klasszikusnak” nevezett

HLA-E, -F és –G gének. Az I osztályú molekulákat minden magvas sejt expresszálja, és

ezzel mutatja be a saját (normális, fertőzés miatt vagy tumorosan módosult) antigéneket

és intracelluláris kórokozók antigénjeit CD8+-limfocitáknak és NK-sejteknek. A

kórosan módosult saját antigénjeinek vagy az intracelluláris kórokozók antigénjeinek

felismerése a sejt lízisét okozó folyamatokat indít be.

2.1.1.3. MHC II osztály

A II osztályú molekulák szintén α- és β-láncokból állnak, de az I osztályú molekulákkal

ellentétben ezek mindegyike polimorf. Ezeket a lácokat a –DP, -DM, -DQ és –DR

gének kódolják. Az MHC II osztályú gének termékeit az úgynevezett „hivatásos”

antigén prezetáló sejtek, mint a dendritikus-sejtek, B-sejtek, makrofágok fejezik ki

sejtfelszínükön. Ezek a hivatásos antigénbemutató sejtek a II osztályú molekulák

segítségével prezentálják a paraziták, baktériumok antigénjeit és az allergéneket a

szervezet CD4+ T-sejtjei számára. Az extracelluláris kórokozók antigénjeinek

6

felismerését követően a CD4+ T-sejtek a fertőző ágens eliminációjához vezető

megfelelő immunválasz elindításában segítenek, ezért hívják őket T-helper, vagyis

segítő T-sejteknek. A CD4+, T-helper-sejtek (Th-sejteknek) Th1 alcsoportja által

termelt és ezért Th1 típusúnak nevezett citokinek az IL-2, IL-12, IFNγ, TNF-α, TNF-β

vagy más néven LT-α. A Th1-sejtek CD8+ T-sejteket, NK-sejteket és makrofágokat

aktiválnak. A Th-sejtek egy másik csoportja, a Th2-sejtek termelik a Th2 citokineket,

ezek az IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13. A Th2-sejtek az antitesttermelés fő elősegítői,

aktiválják a B-sejteket, hatásukra fokozódik az IgM és bizonyos típusú IgG-antitestek

termelése, és szintén hat az IgE termelésére.

Genetikai betegség asszociációs vizsgálatok általában a jelentős polimorfizmust mutató

–DQ és –DR génekkel foglalkoznak.

.

2.1.1.4. MHC III osztály: a központi MHC régió

Az MHC III régióban hatvannál több gén található, ezzel egyike a humán genom

„leggéndúsabb” területeinek (2). Ez a régió sok olyan, mind a természetes, mind a

szerzett immunválasz szabályozásában fontos szerepet játszó gént kódol, mint például a

hősokk fehérjék, komplement fehérjék, citokinek –tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α)

vagy limfotoxin-alfa (LT-α). Így nem meglepő, hogy számos tanulmány kereste ezen

gének egy-egy, funkcionális szempontból jelentős alléljeinek kapcsolatát gyulladásos és

fertőző kórképekkel, tumorral.

A TNF-α és TNF-β (más néven LT-α) közös molekulacsaládba tartoznak, génjeik az

MHC III régióban, egymás mellett találhatók. A TNF-α-t legnagyobb részt az aktivált

makrofágok termelik, az akut fázis válaszban, lokális gyulladásban,

endothelaktivációban, citotoxikus hatásokban van szerepe. A LT-α leginkább aktivált T-

sejtekből származik, szintén rendelkezik endothelaktivációs és citotoxikus hatással.

A klasszikus út komplement komponensei közül a C4 (ezt két gén, a C4A és a C4B

kódolja), a C2, az alternatív út komponensei közül a B-faktor kódolt a 6-os kromoszóma

MHC III régiójában. A komplementkaszkád működésének eredménye sokrétű: sejtek,

kórokozók lízise, opszonizáció, fagocitózis fokozása, kemotaktikus, gyulladáskeltő

hatás, immunkomplexek eliminálása a keringésből. A C4 gének egy speciális genetikai

modulban, az úgynevezett RCCX modulban kódoltak, mely a C4 gén(ek)en kívül még 3

7

másik gént is tartalmaz (RP, CYP21 és TNX gének). Ez a négy gén egy genetikai

egységet alkot. Az RCCX modulból az apai és anyai kromoszómákat külön-külön

tekintve 1, 2, legtöbb 3 kópia fordulhat elő, amely diploid szinten 1-6 kópiaszámok

között változhat. Ezt a változatosságot növeli, hogy a C4 fehérjét C4A vagy C4B gén

kódolja, valamint az is, hogy jelen van-e egy úgynevezett endogén retrovírus a gén 9.

intronjában, mely így annak jelenlétében illetve hiányában rövid (S, short) illetve

hosszú (L, long) lehet.

A hősokk fehérjék stressz hatására termelődnek, molekuláris chaperonként

(dajkafehérjeként) működve helyreállítják a fehérjemolekulák (stressz hatására)

megváltozott szerkezetét, szerepük van antigének feldolgozásában és bemutatásában.

Autoimmun betegségekben a hősokkfehérjék gyakran az immunválasz fő célpontjai. Az

MHC III régióban a HSP70-1, HSP70-2, HSP70-Hom gének kódoltak.

2.1.2. Az MHC régiókon belüli blokkok: a humán genom egy különleges része

A „konzervált, kiterjesztett haplotípus” (conserved extended haplotype = CEH), vagy

„ősi haplotípus” (ancestral haplotype = AH), ahogyan még hívják, kifejezés egy közös

őstől származó, a genom igen nagymértékben konzervált szakaszaiból álló, jelentősen

konzervált haplotípus blokkokat jelöl.

Az MHC régiókban található ilyen kiterjesztett és konzervált haplotípusok adják a

humán genom ezen területének különlegességét. A blokkok igen polimorf szakaszokat

foglalnak magukba, de ennek és az úgynevezett rekombinációs „hot-spotok” (olyan

helyek, ahol DNS darabok cserélődhetnek ki különböző DNS-kópiák között) ellenére a

blokkokat egymástól nagyon nagy távolságban lévő, fix, nem változó DNS-szakaszok

alkotják. Az említett blokkok a következők:

1. a HLA-Cw/B blokk az MHC I régióban,

2. a HLA-DR/DQ blokk az MHC II régióban,

3. a komplotípus blokk (komplement gének csoportja) és

4. a TNF blokk (TNF-α és LT-α) az MHC III régióban.

Egyes haplotípusok nem az összes említett blokkból, csak ezek közül néhány

kombinációjából állnak, míg az igazi kiterjesztett, ősi haplotípusok mind a négy blokkot

tartalmazzák. Ezen esetekben a blokkok, az AH tagjaiként jelenlévő allélek közötti

8

genetikai kapcsolat (kapcsoltság) keresztülnyúlik az MHC I, II és III régiókon, akár 4

Mb távolságban is, melyre emberben az MHC régiókon kívül máshol nincsen példa (3).

Az ősi haplotípusok egyrészt populáció-specifikusak, és vannak egy-egy népcsoportra

kifejezetten jellemző kiterjesztett haplotípusok, másrészt viszont különböző

populációkban előfordulhatnak, persze általában más gyakorisággal, ugyanazon

haplotípusok (4). Nem minden ember rendelkezik ilyen kiterjesztett, ősi HLA

haplotípussal, de megközelítőleg a Föld teljes lakosságának felében megtalálható

belőlük legalább egy kópia (4).

Az ősi haplotípusokat alkotó tagok, allélek nem véletlenszerűen kerültek egymás

közelébe, ugyanarra a kromoszómára, ugyanabba a haplotípusba, hanem a köztük lévő

szoros genetikai kapcsoltság, más néven „linkage disequilibrium” az, aminek hatására

ugyanazon a DNS-szálon találjuk őket. Így már érthető, hogy a haplotípusok

gyakorisága nem egyenlő az őket alkotó allélek külön-külön vett gyakoriságának

szorzatával, ahogyan egymástól független helyzetben lévő allélek esetén várhatnánk.

Sok olyan betegség asszociációs vizsgálat létezik, melyben csak egyes nukleotid

polimorfizmusokat (SNP) néznek. Amennyiben ezek az SNP-k részét képezik egy

haplotípusnak, kiterjesztett haplotípusnak, úgy a vizsgálók figyelmen kívül hagyják az

egész haplotípus hatását. Olyan esetekben, amikor az immunválasznak döntő

jelentősége lehet a kérdéses betegség kialakulásában vagy lefolyásában, az

immunválaszt esetlegesen befolyásoló genetikai változók mind nagyobb csoportját

célszerű vizsgálni. Ez első hallásra nem tűnik egyszerű feladatnak, de az MHC

régiókban található kiterjesztett haplotípusok vizsgálata lehetőséget ad erre.

9

2.1.3. A 8.1 ősi haplotípus (AH)

Az előbbiekben említett konzervált, kiterjesztett haplotípusok közé tartozik a 8.1 ősi

haplotípus, melyben mind a négy blokk, a HLA-Cw/B, -DR/DQ, komplotípus és TNF-

blokk megtalálható. A blokkokban a következő allélek a haplotípus tagjai,

„alkotórészei”: HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, TNFAB*a2b3, C2*C,

Bf*S, C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201. A

8.1AH módosult immunválaszt kódol, melyre magas autoantitest-, keringő

immunkomplex- és TNF-α-szint mellett módosult citokin profil a jellemző (5,6). A

módosult immunválasz további ismertetőjele a fokozott limfocita apoptózis, az

allergénekre adott fokozott IgE válasz és az IgM+ B-sejtek emelkedett aránya; az NK-

és LAK-sejtek csökkent aktivitása, csökkent makrofág funkció és neutrofil chemotaxis,

alacsonyabb összes limfocitaszám, mitogénre és hepatitis B vakcinációra adott csökkent

humorális és limfoproliferatív válasz (1. táblázat) (5,6).

Az immunológiai tulajdonságok genetikailag kódoltak, ezért a haplotípust alkotó allélek

felelősek, melyek közül némelynek ismert a pontos szerepe, míg másoké még teljesen

tisztázott.

1. ábra: MHC I, II és III régiókban kódolt gének (1)

10

1. táblázat: 8.1AH által kódolt immunválasz jellemzői

2.1.3.1. Citokinek

A 8.1 ősi haplotípusra jellemző, már említett módosult citokin profilt általában 2-es

típusúként említik. 8.1AH-t hordozókban a Th1-es citokinek csökkent szintje jellemző,

mint amilyen az IL-2, IL-12, IFNγ, így kerülnek relatív túlsúlyba a Th2-es citokinek. A

Th1-es citokinek a celluláris, míg a Th2-es citokinek a humorális immunválaszt

aktiválják. A, szintén jellemzően magas szérumszintű, TNF-α viszont a Th1-es

citokinek közé tartozik, így a citokin miliőt mégsem célszerű tisztán Th2-esnek nevezni,

célszerűbb inkább mind a magas TNF-α-szintet, mind a dominánsan Th2-es citokin

profilt megemlíteni.

Mind a TNF2-ként is nevezett TNF-α -308A allél, mind a szintén a 8.1AH részét

képező TNF mikroszatelliták (például TNFA*a2b3c1) fokozott TNF-α termelést okoz.

Az irodalmi adatok ezen a téren nem megegyezők, ennek okát a 8.1 ősi haplotípusban is

kereshetjük.

Az esetek körülbelül 60%-ában a TNF-α -308A (TNF2) allél nem önmagában, más

genetikai tényezőktől függetlenül, hanem a 8.1AH részeként, annak tagjaival

genetikailag kapcsolva van jelen. A haplotípusban viszont már nem csak a TNF2,

8.1AH által kódolt immunválasz jellemzői (5-12)

↑ fokozott: ↓ csökkent:

Autoantitest-szint NK és LAK aktivitás

Keringő immunkomplexek

szintje Makrofág funkció

TNF-α termelés in vitro és in

vivo Mitogénre adott T-sejt válasz

Limfocita apoptózis neutrofil kemotaxis

IgM+ B-sejtek aránya összes limfocitaszám

2 típusú citokin profil 1 típusú citokin profil

Allergénekre adott IgE válasz Hepatitis B vakcinációra adott humorális és

limfoproliferatív válasz

11

hanem emellett más allélek is megtalálhatók, melyek közül TNF-α mikroszatelliták

(TNFAB*a2b3) szintén magas TNF-α-szintet eredményeznek (3,6,13). Így, az érzékelt

fokozott TNF-α-termelés nem kizárólag a TNF2 allél jelenlétének, hanem a 8.1 ősi

haplotípus tagjaiként jelenlévő, a TNF-α-szintre ható allélek együttes, egymást erősítő,

összeadódó hatásáról.

Az esetek kisebbik felében a TNF-α -308A (TNF2) allél nem a 8.1AH részeként van

jelen, így a TNF-α-szintre ható, a haplotípusban jelenlévő egyéb allélek nincsenek

jelen, vagy legalább is ennek a szoros genetikai kapcsoltság miatt nagyon alacsony a

valószínűsége. Ez persze nem zárja ki, hogy más, nem a 8.1AH részeként szereplő,

magas TNF-α-szintet eredményező egyéb allél jelen legyen, de ennek gyakorisága az

allélek előfordulási gyakoriságának szorzatával egyenlő, mely igen alacsony érték.

Tehát a TNF-α-szintre nem azok a többszörös genetikai tényezők hatnak, mint a 8.1AH

esetében.

Ez, természetesen, a helyzet leegyszerűsítése, de mégis az SNP-k szintjén túl igyekszik

az összefüggéseket vizsgálni.

2.1.3.2. C4A komplement fehérje hiánya

A C4A és C4B fehérje közötti fő különbség az antigénekkel létesített kovalens kötések

módjai. Az amino-csoportot tartalmazó antigénekkel amid-kötést képez a C4A, így

ennek inkább az immunkomplexekhez való kötődésben, és azok eliminációjában van

szerepe. A C4B fehérje a hidroxil-csoportot tartalmazó célmolekulákkal észter-kötést

alakít ki, ezért is okoz hemolízist a C4B a vörösvértestek felszínén lévő hidroxil-

csoportokhoz való kötődése révén. A 8.1AH részeként C4A*Q0 mellett C4B1 jelenléte

jellemző, ez gyakorlatilag azt jelenti, hogy C4A nincs jelen, C4B-ből egy kópia

található az RCCX modulban, melyben a C4 gének is elhelyezkednek, melyben így

egyetlen C4B szakasz egyedül, C4A nélkül található. Ezt nevezzük a korábbiakban már

bemutatott mono-S (short) RCCX modulnak. A C4A*Q0 allél eredménye, hogy a

komplement 4-es fehérje egyik alkotórésze, az „A” fehérje nem expresszálódik. Ezzel a

komplement rendszer egyik központi tagjánál sérül a kaszkád, leginkább az

immunkomplexek eliminációját érintve, vagyis csökkent clearance miatt az

autoantitestek és a keringő immunkomplexek tovább maradnak a keringésben. Ez

magyarázza ezek emelkedett szintjét 8.1AH-t hordozókban, mely nem fokozott

12

termelésből ered. Minél tovább maradnak a keringésben autoantitestek és

immunkomplexek, annál nagyobb az esély kóros folyamatok, autoimmun betegségek

kialakulására.

2.1.3.3. Antigén prezentáció és feldolgozás

Mivel MHC I és II osztályú génváltozatok is részét képezik a 8.1 ősi haplotípusnak

(HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501, HLA-

DQB1*0201), feltételezhető, hogy az antigén prezentációjának és feldolgozásának a

haplotípusra jellemző módja is hozzájárulhat a speciális immunválaszhoz. Nem

feltétlenül minden, a haplotípust alkotó HLA allélnek van ebben szerepe, lehet, hogy

némelyik csak véletlenszerűen került a haplotípusba az evolúció során.

2.1.3.4. Betegség asszociáció

Immunológiai jellegzetességei magyarázzák, hogy a 8.1AH hosszú távon

„mellékhatásként” autoimmun betegségek kialakulásának a kockázatát növeli. A

haplotípusnak vagy fragmentjeinek bizonyított az összefüggése számos olyan

autoimmun betegséggel, kóros állapottal, melyek kialakulásában az immunválasznak

döntő szerepe van:

Addison-kór (14)

Alkoholos májcirrhosis (15)

Anti-Ro antitestekkel összefüggő örökletes szívblokk (16)

Autoimmun hepatitis (17)

Basedow-Graves betegség (18,19)

Dermatitis herpetiformis (Duhring) (20-22)

Dermatomyositis (23)

Dohányzás (nőkben erősebb összefüggés) (24)

EBV infekcióra adott csökkent válasz (25)

Galambtenyésztők tüdőbetegsége (26)

Glutén szenzitív enteropathia/coeliacia (27)

Gyakori variábilis immundeficiencia (28)

Hashimoto thyroiditis (18)

13

HCV infekcióhoz kapcsolódó cryoglobulinaemia (29)

Hepatitis B vakcinációra adott csökkent válasz (7,30)

HIV fertőzöttek csökkent túlélési esélye (31-33)

HIV fertőzöttekben a CD4+ T-sejtek gyorsult vesztése (31)

IgA deficiencia (28)

Magas életkor elérése férfiakban (5,34)

Myasthenia gravis (35)

Polymyositis (22,23,36)

Primer sclerotizáló cholangitis (37,38)

Sarcoidosis (39)

Scleroderma (40)

Sjögren-syndroma (21,41)

Szisztémás lupus erythematosus (SLE) (42,43)

Zárványtestes myositis (22,36)

1 típusú diabetes mellitus (3,44,45)

A 8.1AH tekintetében ellentmondásosnak tűnik, hogy, ha ez a genetikai kombináció

autoimmun betegségek kialakulására hajlamosít, akkor mi magyarázhatja, hogy mégis

10 millió európai a hordozója (3). Pontosan a haplotípusra jellemző módosult

immunválasz lehet ennek a feltételezett oka. A 8.1AH hordozóiban a magas TNF-α- és

keringő immunkomplex-szinttel járó immunológiai sajátosságok fertőzések

leküzdésében előnyösek, előnyösebbek lehetnek. Ez a lényeges tulajdonság pozitív

szelekciót élvezhetett az evolúció során, és magyarázhatja akkumulációját a kaukázusi

populációban (5). Hogy miért pont ebben a népcsoportban, arra nehéz választ találni. A

8.1AH földrajzi eloszlása Európában egy északnyugat-délkelet grádienst követ;

Északnyugat-Európában a legmagasabb a gyakorisága, ez a kelta eredetű populációkban

eléri a 20-25%-ot (saját eredmények, Laki és munkatársai, a kézirat szerkesztés alatt).

Tekintve, hogy ez Európában az ír és brit populációt, valamint az ezekből származó

észak-amerikai és ausztráliai populációt, így jelentős nagyságú népcsoportot érint.

14

2.2. RAGE

Az angolul „advanced glycation end-products”-nak, AGE-nek nevezett, glikációval,

tehát nem enzimatikus glikozilációval keletkező végtermékek diabetes,

veseelégtelenség, gyulladás és az öregedés természetes lefolyása során halmozódnak fel

az emberi szervezetben (46). Az AGE-receptor, röviden AGER vagy RAGE az

immunglobulin szupercsalád egy multiligand receptora. A ligandok jelenléte a receptor,

a RAGE tartós expresszióját okozza; ha receptor ligandot köt, az pedig a gyulladásos

citokinek, mint például a TNF-α vagy az IL-6, termelődéséhez vezető jelátviteli utak

aktiválását okozza, így állandósítva a gyulladást (47-49).

AGE mellett a RAGE további ligandja az Alzheimer-kórban és amyloidosisban

felszaporodó amyloid-β-peptid, a gyulladásos marker S100/calgranulin, és a neuronális

fejlődésben és tumorokban metasztázis képződésében szerepet játszó amphoterin (50).

A RAGE gén a 6-os kromoszóma rövid karján, az MHC III régióban helyezkedik el.

Mint ezt már említettem, az MHC régiókban található sok, az immunválasz

szempontjából fontos gén, (51,52), mint amilyenek a HLA, a TNF-α (53) vagy egyes

komplement fehérjék génjei (54). Hudson és munkatársai a következő polimorf helyeket

azonosították a RAGE génen: −429T >C, 63 bázispárnyi deléció −407 és −345 pozíció

között és a −374T>A. A gén promóter, szabályozó régiójában található −429C, −374A

allélek és a 63 bázispárnyi deléció up-regulációs hatással jelentősen fokozzák a

transzkripciós aktivitást (55).

A 8.1AH számos más autoimmun betegség, a többi között 1-es típusú diabetes mellitus

kialakulására hajlamosít (3,45). A RAGE promóter polimorfizmusok diabetesszel való

kapcsolatáról viszont kevés és ellentmondó adat ismert. A, már említett munkacsoport

vizsgálatai a RAGE −429C allél retinopathiával való kapcsolatát mutatta 2-es típusú

diabeteses betegekben (55), bár ezt az összefüggést másik vizsgálat nem tudta

megerősíteni (56). Közel ezer, 1-es típusú diabeteses beteg körében végzett finn

tanulmány összefüggést talált a RAGE −374 T>A polimorfizmus és proteinuria valamint

cardiovascularis betegség kialakulása között a nem megfelelően beállított, kontrollált

szénhidrát-anyagcseréjű betegekben (57). Szintén 1-es típusú diabeteses betegekben a

RAGE -1152 C>A polimorfizmust nephropathia kialakulásával szemben mérsékelten

védő szerepűnek találták (58). Egy, a RAGE −429C allélt is tartalmazó haplotípus

15

szintén proteinuriával való összefüggését írták le 2-es típusú diabeteses betegekben

(59).

2.3. Cisztás fibrózis

A kaukázusi populációban leggyakoribb letális autoszómális recesszív genetikai

betegséget, a cisztás fibrózist (CF) a 7-es kromoszómán található 230 kb-nyi ún. „cystic

fibrosis transmembrane conductance regulator” (CFTR) génen bekövetkező mutációk

okozzák. Ez a gén egy 1480 aminosavból álló, epitheliális membránok anion

csatornájaként működő polipeptidet kódol (60). A leggyakoribb az 508 helyen

fenilalanin delécióját okozó mutáció, innen a neve: ΔF508. A CF-os betegek túlnyomó

többségének tüdejében krónikus bakteriális fertőzés/gyulladás zajlik, melyet nagyrészt

Staphylococcus aureus és/vagy Pseudomonas aeruginosa okoz. Az ilyen krónikus

fertőzést nevezik kolonizációnak, és ez felelős a CF-os betegek csökkent életkilátásaiért

(61). A ΔF508 homozigóta betegek fenotípusban, klinikai jellemzőkben nagy

különbségeket mutatnak, ez pedig arra enged következtetni, hogy mind a CFTR-en

kívül más gének, mind környezeti faktorok befolyásolhatják a betegség kialakulását,

lefolyását, súlyosságát (62-67). A tüdőbetegség kezdetét, súlyosságát nem könnyű

megbecsülni (68,69), ezért a CF lefolyását módosító tényezők meghatározása igen nagy

jelentőséggel bír (60). A betegséget befolyásoló kandidáns ún. módosító gének jelentős

része a természetes és adaptív immunitásban játszik fontos szerepet; így például a

transzformáló növekedési faktor β (70), a mannóz kötő fehérje (MBL) (71,72),

nitrogén-oxid szintáz (73), a fő hisztokompatibilitási komplex régióban található gének

(74,75) –mint a TNF-α is (62-67). Számos esetben vitás a CF módosító gének

lehetséges szerepe, mivel sokszor a CF-os betegek állapotával való korreláció még

kétséges. A TNF-α -308A (TNF2) allél egy jó példa a pulmonális fenotípussal, a

betegség súlyosságával való ellentmondásos kapcsolatra. Vannak szerzők, akik a TNF2

allél csökkent FEV1-gyel való kapcsolatát írták le (65), míg más tanulmányok ilyen

összefüggést nem tudtak igazolni (66,67). Mindegyik esetben SNP-ket vizsgáltak külön,

nem haplotípus részeként, így veszítve el lehetséges fontos összefüggéseket. Különböző

allélek és haplotípusok különböző populációkban eltérő eloszlást mutatnak. Ráadásul a

16

módosító gének interakciója a környezeti tényezőkkel, mint amilyen a dohányfüst, a

betegség klinikai képének sokszínűségét okozhatja (76).

2.4. Colorectalis tumor

A colorectalis tumor az egyik leggyakoribb tumor a nyugati országokban, és

előfordulása folyamatosan növekszik. Jelenleg mind incidenciában, mind mortalitásban

a második helyen áll Európában. A vastagbélrák lassan növekvő és későn metasztatizáló

daganat, ezért aránylag sok idő áll rendelkezésre az időben történő diagnózis

megállapításáig és a kezelés megkezdéséig. A magyar mortalitási adatok a colorectalis

tumor halálozási gyakoriságának az elmúlt negyven évben majdnem háromszorosára

való növekedését mutatják, ez a növekedés az utóbbi években megállt (77).

Az életmód, étkezési szokások és más exogén rizikófaktor mellett örökletes tényezők

szerepe is lényeges a tumorképződésre való hajlamban (78). Ilyen örökletes tényezők az

MHC régiókban található polimorfizmusok, melyek kapcsolatát emlő tumorral (79-82),

ovarium tumorral (83), méhnyakrákkal (84-86), gyomor tumorral (87), melanomával

(88), HIV fertőzéshez kapcsolódó Kaposi sarcomával (89), fej és nyak carcinomával

(90) és krónikus myeloid leukemiával (91) írták le. Gyakorlatilag mind a három MHC

régió górcső alá került már az asszociációs vizsgálatokban, melyek sok esetben vezettek

ellentmondó eredményre, nagyrészt valószínűleg alacsony esetszám miatt. Ezek mellet

azonban találhatunk egymást megerősítő eredményeket allélek, haplotípusok szerepéről

különböző tumorok, leginkább emlő- és colorectalis tumor esetén. Lehetséges, hogy

vannak közös örökletes tényezők e két tumorfajta kialakulásában (92). Érdekes módon,

nagyrészt olyan allélek kapcsolatát írták le emlő tumorral, melyek az MHC III régióban

találhatók. Ide tartozik, például a TNF2 és a HSP70-2G (-1267G) allél, melyek

homozigóta hordozói között magasabb az emlő tumor rizikója, Mestiri és munkatársai

megfigyelései alapján (79). Ezzel összhangban van annak a vizsgálatnak az eredménye,

mely szerint egy, az MHC III régión keresztülnyúló haplotípus mérsékelt kockázati

tényezőt jelent emlő tumor kialakulására (80). Ugyanezen munkacsoport alacsony

penetranciájú TNF allélek és colorectalis tumor kapcsolatát találta (93), de az említett

MHC III haplotípus esetén ezt nem sikerült igazolni nagy betegszám mellett sem (94).

17

3. Célkitűzések

3.1. A RAGE gén az MHC II régió közvetlen szomszédságában található, előzetes

vizsgálataink pedig arra utaltak, hogy a RAGE −429C and TNF2 allélek között szoros a

genetikai kapcsoltság. Így elsődleges célunk annak tisztázása volt, hogy a RAGE -429

T>C polimorfizmus és a 8.1 AH részét is képező TNF -308 G>A, HLA-DQB1 és HLA-

DRB1 polimorfizmus valamint az RCCX modul-változat között van-e genetikai

kapcsoltság, linkage disequilibrium.

További célunk annak vizsgálata volt, hogy a RAGE -429 polimorfizmus illetve a

8.1AH mutat-e valamilyen összefüggést 1-es típusú diabetesszel vagy ennek

szövődményeivel.

3.2. A 8.1 ősi haplotípusra jellemző módosult immunválasz, a magas TNF-α- és keringő

immunkomplex-szint kedvező lehet a fertőzések leküzdésében. Cisztás fibrózisos

betegek a betegséget okozó genetikai eltérés miatt folyamatosan bakteriális infekciónak

vannak kitéve. Vizsgáltuk, hogy a 8.1 ősi haplotípusnak van-e valamilyen szerepe a

cisztás fibrózisban kialakuló krónikus infekcióban (kolonizációban).

3.3. A látszólag ellentmondásos eredmények és a tény, hogy egy-egy olyan allél esetén,

mely valamely haplotípus tagja, célszerű SNP-ken túlmutató módon haplotípusokat

vizsgálni, sarkalltak arra, hogy a centrális, MHC III régióban található, a 8.1AH részét

képező allélek és az általuk alkotott haplotípus szerepét vizsgáljuk colorectalis tumor

kialakulásában.

4. Módszerek

4.1. DNS extrakció

DNS extrakció perifériás vérből, Miller által közölt kisózási módszernek megfelelően

történt (95):

Magyar betegcsoportok és egészséges kontrollok esetében a teljes genomiális DNS-t

perifériás vérből származó mononukleáris sejtekből nyertük ki. 500 μl EDTA-val

18

(Merck & Co, Whitehouse Station, NJ, USA) vagy heparinnal alvadásgátolt vérhez 1 ml

vörösvértest lízis puffert (0.32 M Sucrose, 1%-os Triton X-100, 5 mM MgCl2, 12 mM

Tris-HCl) adtunk, majd fél perces erőteljes rázást követően, miután a vörösvértestek

szétestek, maximális fordulatszámmal lecentrifugáltuk a mintákat. A fehérvérsejtek a

cső alján pellet formájában, a vörösvértestek fragmentumai a felülúszóban találhatók. A

felülúszó leöntését követően a fehérvérsejtek a még oldatban maradt vörösvértest

fragmentumoktól 2 alkalommal 1-1 ml desztillált vízzel történő mosással tisztíthatók

meg. Ezt követően a fehérvérsejteket 0.75 mg/ml proteináz-K (Fermentas International

Inc, Ontario, Canada) enzimet és 1% SDSt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

tartalmazó proteináz-K pufferrel (0.075 M NaCl, 0.024 M EDTA) lizáltuk, majd 55 °C-

on 30 percig rázó vízfürdőben emésztettük. A sejtek lizálást és a fehérjeemésztést

követően a mintákat szobahőmérsékletre hűtöttük, majd 200μl telített NaCl oldat

hozzáadásával és intenzív rázással precipitáltuk a fehérjéket. A kicsapódott fehérjék a

cső alján centrifugálást követően üledékként összegyűlnek, a DNS molekulák a

felülúszóban találhatók. A felülúszókat Eppendorf csövekbe pipettázva, 500 μl

izopropanol hozzáadásával, 2 percet követően a DNS precipitálódik. Az így kicsapódott

DNS 70 %-os, majd 100 %-os alkohollal további centrifugálással tisztítottuk, majd 50-

100 μl desztillált vízben oldottuk.

4.2. Génpolimorfizmusok meghatározása

A polimeráz láncreakciókat az AB GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems,

Foster City, California, USA) PCR készülékben végeztük el.

A hasítási termékeket hagyományos gélelektroforézis segítségével 1x TBE pufferben

(0.09M Tris, 0.09M bórsav, 0.002M EDTA, pH=8.0) választottuk szét, amelyhez 1

μg/ml ethidium-bromidot tartalmazó, megfelelő tömegszázalékú agaróz gélt

használtunk. A DNS-EtBr fragmentumokat UV-fénnyel megvilágítva, Syngene

Chemigenious2 (Cambridge, UK) géldokumentációs rendszerben detektáltuk.

4.2.1. A TNF-α −308 G>A polimorfizmus vizsgálata

PCR-RFLP módszer TNF-α -308 G>A polimorfizmus vizsgálatára (96):

19

Forward primer: 5’-AAT AGG TTT TGA GGG CCA TG-3’, reverse primer: 5’-ATC

TGG AGG AAG CGG TAG TG-3’. PCR reakció 10 μl reakció pufferben történt, mely

tartalmaz dNTP-t 200-200 μM koncentrációban, a primereket 1,5-1,5 μM

koncentrációban, 20 ng/μl templát DNS-t, 2 mM koncentrációban MgCl2-t, 10 mM

koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mM koncentrációban KCl-t és 0.025 U/μl HotStart Taq

DNS polimerázt (Qiagen). A PCR reakció technikai paraméterei: I. denaturáció 94ºC-on

15 perc; II: 35 ciklus: 1. denaturáció 95ºC-on 10 másodperc, 2. primer bekötődés 57 ºC-

on 30 másodperc, 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 30 másodperc, majd III: végső

lánchosszabbítás 1 ciklus 72 ºC-on 5 perc. 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó

elegyet 8 egységnyi NcoI restrikciós endonukleázzal 37 °C-on teljes éjszakán át

inkubáltuk, majd a G allél jelenléte esetén 18+202 bp, és az A allél jelenléte esetén 220

bp hosszú restrikciós fragmentek detektálása gél elektroforézissel 3%-os agaróz gélen

történt.

TNF-α -308 G>A polimorfizmus vizsgálata SSP-PCR módszerrel (97):

10 µl PCR reakció elegyben: -308 G forward primer: 5’ ATA – GGT – TTT – GAG –

GGG – CAT – GG 3’ 7 μg/ml koncentrációban, reverse primer: 5’ GGC – TGG –

GTG – TGC – CAA – CAA – C 3’ 7 μg/ml koncentrációban, -308 A forward primer:

5’ ATA – GGT – TTT – GAG – GGG – CAT – GA 3’ 9 μg/ml koncentrációban,

reverse primer: 5’ GGC – TGG – GTG – TGC – CAA – CAA – C 3’ 9 μg/ml

koncentrációban, kontroll DNS-szakasz forward primer: 5’ TGC–CAA–GTG–GAG–

CAC–CCA–A 3’ 6,5 μg/ml koncentrációban, reverse primer: 5’ GCA-TCT-TGC-TCT-

GTG-CAG-AT 3’ 6,5 μg/ml koncentrációban, 2-10 ng/μl templát DNS, 200 μM

koncentrációban dNTP-k, 1,9 mM koncentrációban MgCl2, 20 mM koncentrációban

Tris–HCl, 50 mM koncentrációban KCl és 0.03 U/µl DuplaTaq polimeráz (ZenonBio,

Szeged, Magyarország). PCR program: I: 1 ciklus: 96°C-on 60 másodpercig, majd II: 5

ciklus: 96°C-on 20 másodpercig, 70°C-on 45 másodpercig, 72°C-on 25 másodpercig;

III: 21 ciklus: 96°C-on 25 másodpercig, 65°C-on 50 másodpercig, 72°C-on 30

másodpercig; IV: 4 ciklus: 96°C-on 30 másodpercig, 55°C-on 60 másodpercig, 72°C-on

90 másodpercig; 1 ciklus 20°C 300 másodpercig amplifikációt követően az egyes

allélekre specifikus PCR termékek detektálása gél elektroforézissel 2%-os agaróz gélen

20

történt. Kontroll DNS szakasz PCR-terméke: 796bp hosszúságú, TNF-α -308 G allél és

TNF-α -308 A allél jelenléte esetén a PCR-termék 330 bp hosszúságú.

4.2.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus vizsgálata

RAGE -429 T>C polimorfizmus vizsgálata PCR-RFLP módszerrel az irodalomban

közölteknek megfelelően történt (55):

Forward primer: 5’-GGG GGC AGT TCT CTC CTC-3’ , reverse primer: 5’-TCA GAG

CCC CCG ATC CTA TTT-3’. A PCR reakció 50 μl reakció pufferben történt, mely a

primerekből 50-50 pmol-nyi mennyiséget, 2-10 ng/μl templát DNS-t, 200-200 μmol/l

koncentrációban dNTP-ket, 2 mmol/l koncentrációban MgCl2-t, 20 mmol/l

koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mmol/l koncentrációban KCl-t és 0.02 U/μl Taq DNS

polimerázt (Promega Corp.,Madison, WI, USA) tartalmazott. A PCR reakció technikai

paraméterei: I: 35 ciklus: 1. denaturáció 94ºC-on 1 percig, 2. primer bekötődés 56 ºC-on

1 percig, 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 2 percig, II: végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 10

percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 2 egység AluI restrikciós

endonukleázzal (Fermentas) 6 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd a T allél jelenléte

esetén 345 bp, és a C allél jelenléte esetén 183+162 bp hosszú restrikciós fragmentek

detektálása gél elektroforézissel 3%-os agaróz gélen történt.

4.2.3. HSP70-2 +1267A>G polimorfizmus vizsgálata

HSP70-2 +1267A>G polimorfizmus vizsgálata az irodalomból ismert PCR-RFLP

módszerrel történt (98,99):

A 10 μl PCR reakció elegy tartalmazott forward primert: 5’-CAT CGA CTT CTA CA

C GTC CA-3’ 1.5 μM mennyiségben, reverse primert: 5’-CAA AGT CCT TGA GTC

CCA AC-3’ 1.5 μM mennyiségben, 20 ng/μl templát DNS-t, 200 μM koncentrációban

dNTP-ket, 2 mM koncentrációban MgCl2-t, 10 mM koncentrációban Tris–HCl-t, 50

mM koncentrációban KCl-t és 0.02 U/μl Taq DNS polimerázt (Fermentas). A PCR

reakció technikai paraméterei: I: denaturáció 95ºC-on 3 percig, II: 35 ciklus: 1.

denaturáció 95ºC-on 20 másodpercig, 2. primer bekötődés 60 ºC-on 20 másodpercig, 3.

lánchosszabbítás 72 ºC-on 20 másodpercig, III: végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 6

percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 10 egység PstI restrikciós

enzimmel 37°C-on, 6 órán keresztüli inkubálását követően az A allél jelenléte esetén

21

1117 bp, a G allél jelenléte esetén 936+181 bp hosszúságú fragmentek detektálása gél

elektroforézissel, 2%-os agaróz gélen történt.

4.2.4. LTA 252 A>G polimorfizmus meghatározása

LTA 252 A>G polimorfizmus vizsgálatát irodalmi adatok alapján (101) PCR RFLP

módszerrel Bíró Adrienn végezte:

Forward primer: 5’-CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC-3’, reverse primer: 5’-

GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT-3’. A PCR reakció 10 μl reakció pufferben

történt, mely primereket 0,5-0,5 mM végkoncentrációban, 20 ng/μl templát DNS-t,

dNTP-ket 0,2mM végkoncentrációban, 2 mMl koncentrációban MgCl2-t, 20 mmol/l

koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mM koncentrációban KCl-t és 0,025u/μl HotStarTaq

polimerázt (Qiagen) tartalmazott. A PCR reakció technikai paraméterei: 1 ciklus: 95°C-

on 15 percig, 30 ciklus: 30 másodpercig 94 °C-on, 30 másodpercig 56 °C-on és 45

másodpercig 72°C-on, majd 1 ciklus 72 °C-on 7 percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket

tartalmazó elegyet 10 egység NcoI restrikciós endonukleázzal 3 órán át 37 °C-on

inkubáltuk, majd az A allél jelenléte esetén 368 bp, és a G allél jelenléte esetén 235+133

bp hosszú restrikciós fragmentek detektálása gél elektroforézissel 2%-os agaróz gélen

történt.

4.2.5. HLA-DQB1 és HLA-DRB1 allélek vizsgálata

HLA-DQB1 allélek vizsgálata SSP-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető

kittel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Sweden) Pozsonyi Éva és

Rajczy Katalin segítségével és felügyelete alatt történt.

HLA-DRB1 allélek vizsgálata SSP-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető

kittel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Sweden) és szekvencia

specifikus oligonukleotid próba-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető

kittel (INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus kit, Innogenetics, Ghent, Belgium) Pozsonyi Éva

és Rajczy Katalin segítségével és felügyelete alatt történt.

4.2.6. Az RCCX modul meghatározása

22

Az RCCX modulban a C4A és C4B polimorfizmusok genotípizálását az irodalomban

közölt Southern blot módszer alapján (100) Szalai Csaba felügyeletével Kiszel Petra

végezte:

TaqI restrikciós endonukleázzal való emésztéssel határoztuk meg az C4 génszámot, a

hosszú és rövid C4 gének arányát.

5 μg genomiális DNS TaqI restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Ipswich, MA,

USA), egész éjszakán át, 65 ºC-on történt emésztését követően a DNS fragmentumokat

újabb egy éjszaka alatt 0.8%-os agaróz gélen elektroforézissel választottuk szét. Az így

kapott DNS fragmentumok széttöredezése érdekében a gélt 2 percig UV-illuminátoron

hagytuk. Ezt követően a DNS szálakat 1.5 M NaCl és 0.5 M NaOH oldattal

denaturáltuk, majd 7.4 pH-n 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl oldattal neutralizáltuk. Az

agaróz gélből vett mintákat vákuum blot készülék (BioRad Laboratories, Hercules, CA,

USA) segítségével helyeztük Hybond N+ nylon hibridizációs membránra (Amersham

Biosciences, Buckinghamshire, UK), amelyhez 3M NaCl és 0.3M Na-citrát (SSC) 20x-

os oldatát használtuk. A DNS molekuláknak a hibridizációs membránhoz való

keresztkötéséhez UV-fényt használtunk a blottolás végén, majd ezt a membránt 30

percig mostuk 42 ºC-os előmelegített 0.1 %-os SDS oldattal (150 mM NaCl, 50 mM

Tris [pH=7.5], 5mM EDTA, 0.1% SDS). A membrán előhibridizálása lazac spermium

DNS-sel történt: az előzőleg felforralt lazac spermium DNS-t 200μg/ml

végkoncentrációban, prehibridizációs folyadékban (10% dextrán-szulfát, 50%

formamid, 0.5M NaCl, 1% SDS) a membránhoz adtuk, melyet 16 órán keresztül, 42 ºC-

on, forgó hibridizációs kamrában inkubáltunk. A következő napon C4 génre specifikus

DNS próbákat [α-32P]dCTP-vel jelöltük, majd a hibridizációt ezzel folytattuk további

16 órán keresztül. Ezt követően a membránt 0.1%-os SDS-2x SSC, majd 65 ºC-on

0.5%-os SDS-0.1x SSC oldattal mostuk. A β-emissziós radioaktív jeleket

autoradiográfiás módszerrel detektáltuk.

4.3. Vizsgált populációk

4.3.1.1. 1-es típusú diabeteses betegek

23

A Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján gondozott 82, 1-es típusú

diabeteses beteg DNS-mintáiban a HLA-DQB1 és HLA-DRB1 polimorfizmusokat SSP

PCR módszerrel (Olerup SSP TM DQ, DR kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden,

Sweden), és a RAGE -429 és TNF-α -308 polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel.

Az RCCX modul genotípizálását 51 betegben Kiszel Petra az irodalomban közölt

adatoknak megfelelően végezte. A vizsgált betegek közül 66 felnőtt (34 férfi, 32 nő,

koruk: 41 + 12 év) és 16 gyermek (10 fiú, 6 leány, koruk: 11,5 + 5,0 év).

4.3.1.2. 1-es típusú diabeteses betegek és családjaik

A Heim Pál Gyermekkórházban és a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekgyógyászati

Klinikáján gondozott 1-es típusú diabeteses gyerekek családjait is bevontuk a

vizsgálatba. 10 ilyen családból összesen 74 egyén DNS-mintáit határoztuk meg a HLA-

DQB1 és HLA-DRB1 polimorfizmusokat SSP PCR módszerrel (Olerup SSP TM DQ,

DR kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden, Sweden), és a RAGE -429 és TNF-α -308

polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel. Az RCCX modul genotípizálását Kiszel

Petra az irodalomban közölt adatoknak megfelelően végezte.

Egészséges kontrollként 3 különböző kaukázusi populációból 123 magyar (34 férfi, 89

nő), 99 ohioi nő és 91 izlandi egyén (46 férfi, 45 nő) DNS-mintáiban a RAGE -429 és

TNF-α -308 polimorfizmusok genotípizálását a fent említettek szerint végeztük. Az

RCCX modul vizsgálatát Kiszel Petra 115 egészséges magyar, 75 egészséges ohioi és

49 egészséges izlandi kontrollban végezte.

4.3.2. Cisztás fibrózisos betegek

72 cisztás fibrózisos beteget vizsgáltunk, közülük 39 ΔF508 homozigóta -koruk 1-28 év

(korok mediánja: 11 év, 25%-75%: 4-18 év) és 33 ΔF508 heterozigóta -koruk 3-35 év

(korok mediánja: 12 év, 25%-75%: 6,5-17,5 év). A betegeket hét magyar CF gondozó

központban kezelik. A diagnózis az összes beteg esetén mind a tipikus klinikai

megjelenés, mind a kóros verejték-teszt és CFTR mutáció igazolása alapján született.

A centrumokban évenként legalább egy vagy két alkalommal ellenőrzik a betegeket, a

P. aeruginosa és S. aureus kolonizációt az ilyen ellenőrzések alkalmával levett

köpetminták mikrobiológiai tenyésztési eredménye alapján határozták meg. A

kolonozációt az első regisztrált pozitív köpettenyésztés idejétől számítottuk abban az

24

esetben, amennyiben következetesen pozitív is maradt. Az összes kolonizált beteg P.

aeruginosával és/vagy S. aureusszal kolonizálódott. A vizsgált CF-os betegek között

Burkholderia, Stenotrophomonas, Achromobacter vagy Nontuberculous mycobacteria

kórokozókkal való kolonizációt nem észleltünk. Az összes beteg klinikai adatait követni

tudtuk legalább a kolonizáció kezdetének évétől. Négy beteg kapott P. aeruginosa elleni

védőoltást, egyikük sem kolonizálódott. A cisztás fibrózisos betegek kezelése és

gondozása a nemzeti szakmai irányelveknek megfelelően történik az ország minden CF

központjában. Minden betegtől, kiskorú beteg esetén a szülőktől kértünk és kaptunk a

genetikai vizsgálatba írásban beleegyező nyilatkozatot. A vizsgálat a Magyar Etikai

Bizottság és az 1983-ban módosított, 1975-ös Helsinki Nyilatkozat elveinek

megfelelően zajlott. Elhunyt betegek DNS-mintáit nem vizsgáltuk. A vizsgálat a

Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának jóváhagyásával zajlott.

Kontrollként 139 egészséges felnőtt (56 férfi, 83 nő, koruk 29,4±3,9 év) DNS-mintáit

használtuk.

Az MHC III régióban TNF-α -308 polimorfizmust SSP-PCR módszerrel, a RAGE -429

és HSP70-2 +1267 polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel vizsgáltuk CF-os betegek

és egészségesek DNS-mintáiban. Az MHC II HLA-DQB1 polimorfizmust SSP PCR

módszerrel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden, Sweden), a HLA-

DRB1 polimorfizmust szekvencia specifikus oligonukleotid próba PCR módszerrel

(INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus kit, Innogenetics, Ghent, Belgium) csak a CF-os

betegekben vizsgáltuk.

A HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és HSP70-2

1267G allélek együttes előfordulását tekintettük a 8.1AH jelenlétének, melyet a 2. ábra

szemléltet.

25

2. ábra: HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és HSP70-2

1267G allélek hordozóit tekintettük 8.1AH-t hordozóknak.

4.3.3. Colorectalis tumoros betegek

A Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján Dr. Kocsis Judit és Dr. Tóth

Éva Katalin által gondozott, 183 colorectalis tumoros beteget vizsgáltunk; 100 férfit és

83 nőt, életkoruk 65,7 + 10,5 év. Demográfiai és klinikai adatok a 2. táblázatban

láthatók. Kontrollként 141 egészséges egyént (61 férfi, 80 nő) 60-79 éves populációt

reprezentáló (koruk 68,4 + 6,6 év) vizsgáltunk. Betegektől és kontrolloktól is a

vizsgálatba beleegyező írásos nyilatkozatot kaptunk. A vizsgálat a Semmelweis

Egyetem Etikai Bizottságának jóváhagyásával zajlott.

26

2. táblázat: Colorectalis tumoros betegek demográfiai és klinikai adatai

Változó

Vizsgált betegek száma 183

Kor években, átlag + SD 65,7 + 10,5

Férfiak/nők 100/83

Tumor elhelyezkedése colon 112

sigma 10

rectum 50

rectum+sigma 2

rectum+colon 3

colon vagy rectum más

szervek érintettségével 6

Dukes A/B/C/D 3/69/75/25

TNM-T 0/1/2/3/4/ nem meghatározott 1/5/36/104/20/17

TNM-N 0/1/2/ nem meghatározott 74/67/18/24

TNM-M 0/1/ nem meghatározott 84/30/69

Grade 1/2/3/nem meghatározott 19/107/47/10

A HSP70-2 1267A<G, RAGE -429 T>C és LTA 252 A>G polimorfizmusok

meghatározását PCR RFLP módszerrel végeztük. A TNF-α -308 G<A polimorfizmust

SSP-PCR módszerrel vizsgáltuk. A TNF-α -308A, RAGE -429C, HSP70-2 1267G és

LTA +252G allélek egyidejű előfordulását a 8.1AH jelenlétének tekintettük, ezt az

alábbi, 3. ábra szemlélteti.

27

3. ábra: 8.1AH hordozónak a TNF-α -308A, RAGE -429C, HSP70-2 1267G és LTA

+252G allélek egyidejű hordozóját tekintettük

4.4. Statisztikai analízis

A statisztikai analízis GraphPad Prism V 4.00, Windows software package (GraphPad

Software, San Diego Calif., USA, www.graphad.com) készült. Genotípusok, allélek és

haplotípusok gyakoriságának összehasonlítsát χ2-teszt, χ2 for trend –teszt vagy Fisher

exact-teszt segítségével végeztük. 0,05-nél kisebb p-értéket értékeltük szignifikánsnak.

Linkage disequilibrium (LD) együttható számítására az Arlequin Software-t (Schneider,

S., Roessli, D., and Excoffier, L. (2000) Arlequin: A software for population genetics

data analysis. Ver 2.000. Genetics and Biometry Lab, Dept. of Anthropology,

University of Geneva, http://lgb.unige.ch/arlequin) használtuk. Két allél kapcsolt, ha a

LD együttható nagyobb, mint 0,4.

„Power” analízist GraphPad StatMate software-rel (GraphPad Software) végeztünk.

Bármely, egyszeres változós analízisben szignifikáns különbséget többszörös

logisztikus regressziós modellben is vizsgáltunk.

CF-os betegekben a kolonizáció-mentes időszakok hosszúságát Mantel–Haenszel

logrank-teszttel hasonlítottuk össze.

28

A vizsgált betegek és egészséges kontrollok korának összehasonlítására Mann–

Whitney-tesztet használtunk.

5. Eredmények

5.1.1. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros genetikai kapcsoltság 1-

es típusú diabeteses betegekben

RAGE -429C allél kapcsoltságát vizsgáltuk HLA-DQB1, HLA-DRB1 és TNFα -308

G>A polimorfizmusokkal 82 1-es típusú diabeteses betegben (66 felnőtt, 16 gyerek). 54

betegben az RCCX modul genotípusát is meghatároztuk. A RAGE -429C allél

statisztikailag szignifikáns, rendkívül szoros genetikai kapcsoltságot, úgynevezett

linkage disequilibriumot (LD) mutatott a 8.1AH vizsgált tagjaival: HLA-

DQB*0201(DQ2), HLA- DRB*0301(DR3), TNF2 allélekkel és mono-S-RCCX

modullal, p=6,7x10-7 -től 5,1x10-9 -ig, D’= 0,6131-0,9068 terjedt (3. táblázat). A 82

betegben vizsgált, a 8.1AH részét képező allélek egymással is a RAGE -429C allélhez

hasonló szoros linkage disequilibriumot mutattak (3. táblázat).

1-es típusú diabetesre nem csak a HLA-DQ2 és HLA-DR3, hanem a HLA-DQ8 és

HLA-DR4 allélek is hajlamosítanak, mely utóbbiak viszont nem részei a 8.1 ősi

haplotípusnak. Megvizsgáltuk ugyanezen 82, 1-es típusú diabeteses beteg csoportjában,

hogy a RAGE -429C kapcsolt-e ezekkel, a HLA-DQ8 és HLA-DR4 allélekkel.

Ellentétben a 8.1AH tagjaival észlelt szoros kapcsoltságával, a RAGE -429C LD

együtthatója mind a HLA-DQ8, mind a HLA-DR4 esetén gyenge volt (p=0,031 és

D’=0,0476, illetve p=0,023 ás D’=0,336).

29

3. táblázat: RAGE -429C allél és a 8.1 ősi haplotípus ismert alkotórészei: HLA-DQ2,

HLA-DR3, TNF2 allél és a monomoduláris rövid RCCX modul (mono-S) közötti

kapcsoltság (linkage disequilibrium, p-érték és D’-együttható) 82 magyar 1-es típusú

diabeteses betegben

5.1.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus és MHC II és III osztályú gének marker alléljei

nyolc 1-es típusú diabeteses családban

Olyan családokban, ahol előfordul 1-es típusú diabetes mellitus, vizsgáltuk a RAGE -

429 T>C polimorfizmus öröklődését. Emellett MHC II osztályú HLA-DQB1 és HLA-

DRB1 haplotípust, MHC III osztályú TNFα -308 G>A polimorfizmust és az RCCX

modult határoztunk meg. A családfák és a családtagok haplotípusai –a 8 család

összesen 32 apai és anyai 6-os kromoszómáján 15 különböző MHC haplotípus- a 4.

ábrán, a haplotípus szegregáció a RAGE -429T illetve RAGE -429C allélekkel a 4.

táblázatban látható.

DQ2 DR3 TNF2 Mono-S

RAGE -429 C p=6,23×10-8

D’=0,8212

p=5,13×10-9

D’=0,6131

p=7,81×10-9

D’=0,7663

p=6,66x10-7

D’=0,9068

(n=54)

DQ2 p=0,0006

D’=0,9311

p=4,50x10-4

D’=0,7576

p=0,0001

D’=0,8921

(n=54)

DR3 p=2,74x10-5

D’=0,6982

p=0,0371

D’=0,6274

(n=54)

TNF2 p=8,18x10-6

D’=0,8921

(n=54)

30

4. ábra: Nyolc magyar család 1-es típusú diabeteses gyermekkel. HLA-DQ, HLA-DR, -

RAGE -429, RCCX modul és TNFα -308 polimorfizmusok apai és anyai MHC

haplotípusai szerepelnek az ábrán. Használt szimbólumok: a számok a családot

jelölik, a és b az apai MHC haplotpust, c és d az anyai MHC haplotípust jelöli.

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-L-C-2

b: DQ5-DR10-L-T-1

c: DQ8-DR4-L-T-1

d: DQ2-DR7-L-C-1

1. család

2. család

3. család

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-S-C-2

b: DQ6-DR15-L-T-1

c: DQ5-DR16-L-T-1

d: DQ6-DR13-L-T-2

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-L-C-2

b: DQ9-DR7-S-T-1

c: DQ2-DR7-L-C-1

d: DQ7-DR13-L-C-1

31

4. család

6. család

5. család

7. család

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-S-C-2

b: DQ5-DR1-L-T-1

c: DQ5-DR1-L-T-1

d: DQ2-DR3-L-T-1

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-S-C-2

b: DQ5-DR1-L-T-1

c: DQ8-DR4-L-T-1

d: DQ5-DR1-L-T-1

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-S-C-2

b: DQ7-DR11-L-T-1

c: DQ5-DR1-L-T-1

d: DQ2-DR3-L-T-1

Haplotípusok:

a: DQ8-DR4-L-C-1

b: DQ7-DR11-L-T-1

c: DQ2-DR3-S-C-2

d: DQ7-DR11-L-T-1

32

A nyolc 1-es típusú diabeteses családban a leggyakoribb haplotípus a HLA-DQ2 /HLA-

DR3/S/RAGE -429C /TNF2, melyben az „S” a monomoduláris RCCX modult (rövid

C4B génnel) jelöli. Ez a haplotípus szoros összefüggést mutat a 8.1 ősi haplotípussal

(45), és hét alkalommal fordul élő a szülők között (4. táblázat). Ezen kívül a 8.1AH

három variánsa 4 szülőben fordult elő, akikben a HLA-DQ2/HLA- DR3 haplotípussal

RAGE -429T vagy -429C, hosszú vagy rövid RCCX modul és TNF-α -308A (TNF2)

helyett -308G (TNF1) fordult elő (4. táblázat B része). Említésre méltó, hogy a

haplotípusok közül az összes 8.1AH és kettő a három 8.1AH variánsból átörökítődött a

diabeteses gyerekekbe.

A 8.1AH és ennek variánsai mellett három további, RAGE -429C allélt tartalmazó

MHC haplotípust hordozott 3 szülő (4. táblázat C része). Ezen haplotípusok mindegyike

TNF-α -308G alléllel kapcsolt.

A RAGE -429T allél nyolc különböző MHC II és III osztályú haplotípussal kapcsolt.

Ezek közül kettő kivételével az összes haplotípusra igaz, hogy nem kapcsolt a mono-S

RCCX modullal, és vagy TNF-α -308G vagy -308A allél van jelen. A RAGE -429T

allél a leggyakrabban (7 szülőben) a HLA-DQ5, -DR1, TNF1 allélekkel és a mono-S

RCCX modul hiányával kapcsolt. HLA-DQ5/DR1/TNF1 haplotípus RAGE -429C-vel

kapcsoltan egyik szülőben sem fordult elő (4. táblázat D rész).

Az összes haplotípus, melyben a 8.1AH ismert, általunk vizsgált négy alkotó allélje

(HLA-DQ2, -DR3, mono-S, TNF2) közül legalább három jelen volt, minden esetben

kapcsolt volt a RAGE -429C alléllel (5. táblázat). A 8.1AH tagjai közül 1 vagy 2 allélt

tartalmazó hat haplotípus közül egy volt kapcsolt a RAGE -429C alléllel, míg a 8.1AH

8. család

Haplotípusok:

a: DQ2-DR3-S-C-2

b: DQ6-DR15-L-T-1

c: DQ2-DR3-S-C-2

d: DQ5-DR1-L-T-1

33

tagjait egyáltalán nem tartalmazó 17 haplotípus közül 15 volt kapcsolt a RAGE -429T

alléllel.

4. táblázat: RAGE 429 T>C polimorfizmus alkotta MHC II és III osztályú haplotípusok

A. 8.1 kaukázusi ősi MHC haplotípus

1. DQ2 - DR17 - S – 429C - TNF2 haplotípus

1T diabeteses családokban: 2a, 3a, 4a, 5c, 6a, 7a, 7b

B. 8.1 ősi haplotípus variánsai

2. DQ2 - DR17 – L – -429C - TNF2 haplotípus

1T diabeteses családokban: 1a

3. DQ2 - DR17 - L– -429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 3d, 6d

4. DQ2 - DR17- S – -429C - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 8a

C. RAGE -429C allélt tartalmazó más MHC haplotípusok

5. DQ2 - DR7 - L - -429C – TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 1c

6 DQ7 - DR13 - L - -429C – TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 1d

7. DQ8 - DR4 - L --429C - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 5a

D. RAGE -429T allélt tartalmazó más MHC haplotípusok

8. DQ5 - DR1 - L –429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 3b, 3c, 4b, 4d, 6c, 6d, 8d

9. DQ5 - DR1 - S - -429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 7d

10. DQ5 - DR16 - L --429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 2c, 8c

11. DQ6 - DR13 - L --429T - TNF2 haplotípus

1T diabeteses családokban: 2d

12. DQ6 - DR15 - L --429T - TNF1 haplotípus

34

1T diabeteses családokban: 2b, 7b

13. DQ9 – DR7 - S – -429T – TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 1b

14. DQ7 - DR11 - L - -429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 5b, 5d, 6b

15. DQ8- DR4 - L –429T - TNF1 haplotípus

1T diabeteses családokban: 4c, 8b

Rövidítések: S: monomoduláris RCCX modul rövid C4 génnel; L: RCCX modul(ok)

hosszú C4 génnel az első modulban; -429C: RAGE -429C allél; -429T: RAGE -429T

allél; TNF2: TNF-α -308A allél; TNF1: TNF-α -308G allél.

5. táblázat: A 8.1 ősi haplotípus ismert tagjai kapcsoltak a RAGE -429C alléllel

RAGE -429 SNP allél DQ2/DR3/mono-S/ TNF2 haplotípus

C T összes

mind a négy 7 0 7

három 2 0 2

kettő 0 2 1

egy 1 3 3

egy sem 2 15 26

összesen 12 20 32

5.1.3. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros kapcsoltság megerősítése

magyar, ohioi és izlandi egészségesek csoportjában

A RAGE gén az MHC II osztályú gének és a C4 géneket is magában foglaló RCCX

modul között található. Magyar, ohioi és izlandi egészséges egyénekben a TNF-α -308A

(TNF2) gyakorisága 0,183, 0,192 illetve 0,093 (6. táblázat). A RAGE -429C allél

gyakorisága megközelítőleg hasonló a TNF2 alléléhoz, az említett populációkban 0,175,

0,182 illetve 0,121. Mind a RAGE -429C és a TNF2 kétszer olyan gyakori, mint a

mono-S RCCX modul a megfelelő populációkban.

35

A 123 magyar, 99 ohioi és 91 izlandi egészséges egyén vizsgálata a RAGE -429C és a

TNF2 allél szoros kapcsoltságára derített fényt, p<0,0001 mindegyik LD együttható

esetén (5. ábra). 115 magyar, 75 ohioi és 49 izlandi egészséges egyénben elvégzett

RCCX modul meghatározásával a RAGE -429C allél és a mono-S RCCX modul szoros

kapcsoltsága igazolódott, p<0,0001 mindegyik LD együttható esetén (6. ábra).

6. táblázat: RAGE -429, TNF -308 és RCCX modul genotípusok megoszlása három

kaukázusi (magyar, ohioi és izlandi) populációban

Egészséges

magyar

egyének

n=123 (%)

Egészséges ohioi

nők

n=99 (%)

Egészséges izlandi

egyének

n=91 (%)

RAGE -429

TT

TC

CC

83 (67,5)

37 (30,1)

3 (2,4)

66 (66,7)

29 (29,3)

4 (4,0)

69 (75,8)

22 (24,2)

0 (0,0)

RAGE -429C allél

gyakorisága 0,175 0,182 0,121

TNFα -308

GG

GA

AA

82 (66,7)

37 (30,1)

4 (3,1)

65 (65,7)

30 (30,3)

4 (4,0)

74 (81,3)

17 (18,7)

0 (0,0)

TNF2 allél

gyakorisága 0,183 0,192 0,093

Mono-S-C4B-

RCCX

Nem hordozó

Heterozigóta

Homozigóta

95 (82,6)

19 (16,5)

1 (0,9)

58 (77,3)

17 (22,7)

0 (0,0)

42 (85,7)

7 (14,3)

0 (0,0)

Mono-S genotípus

gyakorisága 0,091 0,113 0,051

36

5. ábra: TNFα -308 G>A és RAGE -429 T>C polimorfizmusok közötti linkage

disequilibrium (LD) egészséges magyar populációban (A), egészséges ohioi nőkben (B)

és egészséges izlandi populációban (C). LD-együttható és p-érték Arlequin software-rel

számítva.

A

TNFA GG TNFA GA TNFA AA0

10

20

30

40

50

60

RAGE -429 TTRAGE -429 TC

RAGE -429 CC

D' = 0.5161p=<0.0001

össz

es e

set %

-a (n

=127

)

B

TNFA GG TNFA GA TNFA AA0

10

20

30

40

50

60

D' = 0.4981p=<0.0001

össz

es e

set %

-a (

n=10

1)

C

TNFA GG TNFA GA TNFA AA0

10

20

30

40

50

60

70

D' = 0.5985p=<0.0001

össz

es e

set %

-a (n

=91

)

37

6. ábra: Mono-S-RCCX modul és RAGE -429 T>C polimorfizmusok közötti linkage

disequilibrium (LD) egészséges magyar populációban (A), egészséges ohioi nőkben (B)

és egészséges izlandi populációban (C). LD-együttható és p-érték Arlequin software-rel

számítva.

A

nincs mono-S egy mono-S két mono-S0

10

20

30

40

50

60

70RAGE -429 TT

RAGE -429 TC

RAGE -429 CCD' = 1.000p<0.0001

össz

es e

set %

-a (

n=11

7)

B

nincs mono-S egy mono-S két mono-S0

10

20

30

40

50

60

70

D' = 0.7951p<0.0001

össz

es e

set %

-a (

n=80

)

C

nincs mono-S egy mono-S két mono-S0

25

50

75

D' = 1.000p<0.0001

össz

es e

set %

-a (n

=49)

5.1.4. A RAGE -429C és a diabeteses betegek klinikai tünetei közti összefüggés

A RAGE -429 TT, TC és CC genotípusú betegek között nem észleltünk különbséget

proteinuria (p=0,97) vagy retinopathia (p=0,85) előfordulása tekintetében. A szénhidrát-

anyagcsere szabályozásában azonban találtunk különbséget. A regisztrált HbA1C-érték

61 diabeteses beteg esetén volt elérhető, ezeket összehasonlítottuk a RAGE -429C

hordozókban és nem hordozók között (7. ábra). A HbA1C csúcsértékek szignifikánsan

magasabbak voltak a RAGE -429C hordozókban, mint a nem hordozókban (7.a ábra).

Ezen kívül, a rossz szénhidrát-anyagcserére jellemző magas HbA1C-érték (>10%)

nagyobb arányban fordult elő a RAGE -429C hordozókban (17/28, 61%), mint a nem

38

hordozókban (11/33, 33%), (p=0,042) (7.b ábra). A RAGE -429C allélt hordozók esélye

(OR), hogy legalább egy magas HbA1C-értékük legyen 3,09 (95% konfidencia

intervallum: 1.08-8.82) az allélt nem hordozókkal szemben.

Hasonló, bár gyengébb kapcsolatot észleltünk a HLA-DQ2 allélel, OR: 3.24 (95%

konfidencia intervallum: 1.05-10.11, p=0,058). A HLA-DQ2/RAGE -429C haplotípust

hordozó illetve nem hordozó betegeket összehasonlítva, magas HbA1C-érték nagyobb

eséllyel fordult elő a haplotípust hordozókban, OR: 3.40 (95% konfidencia intervallum:

1,17-9,81, p=0,037). Ezzel szemben a magas HbA1C-értékek előfordulása nem mutatott

összefüggést sem a DR3 (OR: 1,15, 95% konfidencia intervallum: 0,43-3,19, p=0,802),

sem a TNF2 (OR: 1,22, 95% konfidencia intervallum: 0,42-3,187, p=0,787) alléllel,

sem a mono-S RCCX modullal (OR: 4,038, 95% konfidencia intervallum: 0,68-23,95,

p=0,654).

7. ábra: Mért legmagasabb HbA1C-értékek a RAGE -429C allélt hordozó és nem

hordozó 1-es típusú diabteses betegben (p=0,013) (A rész), és magas HbA1C-

értékek (>10%) előfordulása a RAGE -429C allélt hordozó és nem hordozó 1-es

típusú diabteses betegben (p=0,039)(B rész)

39

5.2.1. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei egymással kapcsoltak, haplotípust

alkotnak

Mivel a vizsgált HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és

HSP70-2 1267G allélek egymással való kapcsolatát nézve minden p-érték szignifikáns

és minden D’-érték nagyobb 0,4-nél, ezért kimondhatjuk, hogy az allélek egymással –

szoros- linkage disequilibriumban állnak, vagyis genetiakilag kapcsoltak, haplotípust

alkotnak. Az összefüggést a 7. táblázatban láthatók.

7. táblázat: A 8.1AH MHC II és III marker alléljeinek kapcsolata 72 magyar cisztás

fibrózisos betegben

DR3 TNF2 RAGE -429C HSP70-2G

D’=0.99

p < 0.0001

D’=0.54

p < 0.0001

D’=0.60

p < 0.0001

D’=0.67

p = 0.0007 DQ2

D’=0.96

p < 0.0001

D’=0.75

p = 0.0001

D’=0.85

p = 0.0063 DR3

D’=0.44

p = 0.0007

D’=0.50

p = 0.0099 TNF2

D’=0.60

p = 0.0004 RAGE -429C

5.2.2. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei és haplotípusaik gyakorisága egészséges

kontrollokban és CF-os betegekben

HLA-DQB1, HLA-DRB1, TNF-α -308 G>A, RAGE -429 T>C és HSP70-2 -1267 A>G

polimorfizmusokat határoztunk meg 7 magyar CF központban gondozott, összesen 72

CF-os beteg (39 ΔF508 homozigóta és 33 ΔF508 heterozigóta) DNS-mintáiban. A

kontroll csoportban HLA-típizálást nem végeztünk, így a 139 egészséges kontroll

esetében csak a három MHC III allél tekintetében van lehetőség a betegek és kontrollok

összehasonlítására (8. táblázat).

A 8.1AH marker alléljeinek és ezek haplotípusainak gyakoriságában nem találtunk

különbséget a kontrollok és CF-os betegek között. A betegeket két csoportra,

kolonizáltak (n = 44) és nem kolonizáltak (n = 28) csoportjára osztottuk. Drámai

40

különbséget észleltünk a nem kolonizált betegek esetén: egy kivételével (HSP70-2 -

1267G) minden allél és egy kivételével minden vizsgált haplotípus szignifikánsan

gyakoribb volt a betegek ezen csoportjában, mint az egészséges kontrollokban. A

legnagyobb különbséget a TNF2/HSP70-2-1267G/RAGE -429C haplotípus mutatta,

ennek frekvenciája több mint háromszor magasabb a nem kolonizált betegekben, mint

az egészséges kontrollokban. Ezzel ellentétben, a kolonizált betegek és az egészségesek

között egyik allél vagy haplotípus tekintetében sem volt szignifikáns különbség (8.

táblázat). A nem kolonizált CF-os betegek kora (9,8 ± 6,2 év) lényegesen eltért a

kontrollokétól (29,4 ± 3,9 év). Az ezért végrehajtott, korra és nemre illesztett többszörös

regressziós analízis eredményeként is megmaradt a szignifikáns különbség (p = 0,031) a

TNF2/HSP70-2-1267G/RAGE -429C haplotípus előfordulási gyakoriságában a két

csoport között.

8. táblázat: MHC III marker allélek és haplotípusok gyakorisága cisztás fibrózisos

betegekben és egészséges kontrollokban

Allél (haplotípus) Cisztás fibrózisos betegek

Összes beteg

(n=72)

Nem kolonizált

betegek (n=28)

Kolonizált

betegek

(n=44)

Egészséges

kontrollok

(n= 139)

Allél (haplotípus) gyakoriság

TNF2 (-308A) 0,155 0,304*** 0,105 0,118

HSP70-2 -1267G

(HSP70-2G)

0,420 0,519 0,389 0,427

RAGE -429C (AGER-

C)

0,181 0,286 0,198 0,188

TNF2-HSP70-2G 0,140 0,259*** 0,097 0,072

TNF2-RAGE-C 0,104* 0,214** 0,047 0,061

HSP70-2G-RAGR-C 0,160 0,259* 0,153 0,137

TNF2-HSP70-2G-

RAG-C

0,104* 0,222*** 0,056 0,062

Egészséges kontrollokhoz viszonyított különbség (Fisher exact teszt) *p<0,05,

**0,01***<0,001

41

5.2.3. A CF-os betegcsoport felosztása 8.1AH-t hordozókra és nem hordozókra –a

8.1AH hatása a kolonizációra

A CF-os betegek klinikai adatait a 2. táblázat mutatja. A 8.1AH-t hordozók és nem

hordozók között nincs jelentős különbség az átlag életkorban, a nemek vagy a ΔF508

homozigóták és heterozigóták arányában a 72 CF-os beteg között. A ΔF508

heterozigóta betegek között a 8.1AH-t hordozók életkora kis mértékben, nem

szignifikánsan (p = 0.086) magasabb volt, mint az ezen haplotípust nem hordozóké (9.

táblázat). Ezzel ellentétben, a 8.1AH-t hordozók és nem hordozók között statisztikailag

jelentős különbséget észleltünk a kolonizáltak és nem kolonizáltak arányában és az

életkorban a kolonizáció kialakulásakor. A P. aeruginosával és/vagy S. aureusszal

kolonizált betegek életkora a kolonizáció kialakulásakor szignifikánsan magasabb volt

8.1AH hordozók esetén, mint a haplotípust nem hordozóknál (p=0,012) (9. táblázat). A

8.1AH hordozók egy negyede kolonizálódott szemben a 8.1AH nem hordozók két

harmadával. A „power” analízis szerint a mintaszám elég nagy volt ahhoz, hogy

szignifikáns különbséget 80% erőséggel bizonyíthassuk. Csak a már kolonizált

betegeket vizsgálva a kolonizáció mentes időszak átlagos hossza több mint ötször

hosszabb volt 8.1AH hordozókban, nem hordozókhoz viszonyítva (p = 0.036) (9.

táblázat).

Ezeket az egy változós analízissel kapott eredményeket a többszörös logisztikus

regressziós analízis is megerősítette: korra, nemre és ΔF508 genotípusra adjusztálva a

8.1AH hordozók esélyhányadosa (OR, 95% CI) 0.112 (0.024–0.520; p = 0.005) a

kolonizációra, a nem hordozókkal szemben (10. táblázat). Érdekességként említem meg,

hogy az egyetlen 8.1AH-ra és ΔF508-ra nézve is homozigóta beteg 17 éves korában

kolonizálódott, mely igen későinek számít.

Azon a négy beteg közül, akik P. aeruginosa elleni védőoltásban részesültek, egyikük

sem kolonizálódott, és egyikük sem hordozta a 8.1AH-t.

42

9. táblázat: Cisztás fibrózisos betegek adatai (n=72) a 8.1 ősi haplotípus (AH)

hordozásának megfelelően csoportosítva

8.1AH+

(n=14)

8.1AH-

(n=58) p-értékb

nő/férfi 5/9 34/24 0,123

korc (év) 16.5

(8.3-20.5)

10

(4-17) 0,086

ΔF508 homozigóta/ heterozigóta 5/9 34/24 0,123

P. aeruginosával kolonizált 2 14 0,721

S. aureusszal kolonizált 1 15 0,169

P. aeruginosával+ S. aureusszal

kolonizált 1 11 0,437

Összes kolonizált 4 40

Nem kolonizált 10 18 0,012

Kor a kolonizáció kezdeténc (év)d

ΔF508 homozigóta

ΔF508 heterozigóta

Összes beteg

3,0 (1,0-8,0)

4,0 (3,0-10,0)

15,5 (5,4-17,8)

14,0; 17,0

3,0; 18,0

3,0 (0,8-8,0)

0,036 a Betegek száma és koruk mediánja került feltüntetésre b Mann-Whitney teszt vagy χ2 teszt cBetegek átlagéletkora (mediánja, 25%-75% percentilis) d Csak a már kolonizált betegek kerültek feltüntetésre

43

10. táblázat: A 8.1 ősi haplotípus (8.1AH) kolonizációval való összefüggésének erőssége

72 cisztás fibrózisos beteg esetében, többváltozós logisztikus regressziós analízissel

számítva

Esélyhányados (OR) (95% konfidencia

intervallum, CI) * p-érték

Nem illesztett 0,180 (0,050-0,651) 0,009

Korra és nemre illesztett 0,100 (0,022-0,455) 0,003

Korra, nemre és ΔF508

genotípusra illesztett 0,112 (0,024-0,520) 0,005

*8.1AH hordozók vs. nem hordozók

5.2.4. A kolonizáció mentes időszak hossza különbözik 8.1AH hordozók és nem

hordozók között

Túlélési görbével, Mantel–Haenszel log rank teszttel hasonlítottuk össze a kolonizáció-

mentes időszakokat a betegcsoportban. Az összes CF-os beteget együtt vizsgálva, a

8.1AH-t hordozók körében a kolonozáció-mentes időszak hossza igen szignifikáns

különbséget mutatott (p < 0,0001) (8.a ábra). ΔF508 homozigóta betegekben a S. aureus

és/vagy P. aeruginosa kolonizációtól mentes periódus szintén szignifikánsan hosszabb

volt 8.1AH hordozókban, mint a haplotípust nem hordozókban (p=0,029) (8.b ábra).

Ugyanilyen összefüggést figyelhettünk meg ΔF508 heterozigóta betegekben, a 8.1AH

hordozókban jelentősen hosszabb volt a kolonizáció-mentes időszak hossza (p=0,004)

(8.c ábra).

A 8.b ábrán a függőlegesen végződő görbék azt mutatják, hogy ΔF508 homozigóta

betegek esetében a görbe által jelzett legmagasabb életkorú mind 8.1AH hordozók és

nem hordozók kolonizálódnak. Ezzel szemben az 8.a és 8.c ábrán a görbék vízszintesen

végződnek, mutatva, hogy az összes CF-os beteg és a ΔF508 heterozigóta betegek

esetén a görbe által jelzett legidősebb betegek nem kolonizáltak.

A CF-os betegekről közölt legtöbb adat P. aeruginosa kolonizációt említ, ezért

elvégeztük a fenti analízist a P. aeruginosával kolonizáltak körében is (n=31). A

kolonizáció egy folyamat, és nem kizárólag P. aeruginosa az első kolonizáló törzs, de a

betegek ezen csoportjában mindenkiben megtalálható a P. aeruginosa. Az eddigi

44

megfigyelésekhez hasonló eredményt kaptunk; a 8.1AH hordozókban jelentősen

hosszabb kolonizáció-mentes időszakot észleltünk, mint a haplotípust nem hordozókban

(p= 0.025, az adatokat a táblázatban nem tüntettük fel).

8. ábra: Kolonizáció-mentes periódus (a): ΔF508 homozigóta és ΔF508 heterozigóta

cisztás fibrózisos betegekben (n=72), (b): ΔF508 homozigóta cisztás fibrózisos

betegekben (n=39), és (c): és ΔF508 heterozigóta cisztás fibrózisos betegekben (n=33).

A 8.1 AH-t hordozók (folytonos vonal) és nem hordozók (szaggatott vonal) között

szignifikáns a különbség az egyes csoportokban; (a): p<0,0001, (b): p=0,029, (c):

p=0,004, (Mantel-Haenszel logrank teszt).

0 10 20 300

102030405060708090

100 8.1 AH+8.1 AH-

kolonizáció mentes időszak (év)

CF-

es b

eteg

ek s

záza

léka

(%)

8 .a ábra

0 5 10 15 20 250

102030405060708090

100 8.1 AH+8.1 AH-

kolonizáció mentes időszak (év)

CF-

es b

eteg

ek s

záza

léka

(%)

8 .b ábra

45

0 10 20 300

102030405060708090

100 8.1 AH+8.1 AH-

kolonizáció mentes időszak (év)

CF-

es b

eteg

ek s

záza

léka

(%)

8 .c ábra

5.3.1. MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros betegekben és

egészséges kontrollokban

LTA 252 A>G, TNF-α -308 G>A, HSP70-2 -1267 A>G és RAGE -429 T>C egyes

nukleotid polimorfizmus genotípusok hordozóinak megoszlását hasonlítottuk össze 183

colorectalis tumoros betegben és 141 korra és nemre illesztett egészséges kontrollban

(11. táblázat). Ezen polimorfizmusok ritka alléljei a 8.1AH részét képezik.

Egyik SNP esetén sem észleltünk különbséget a betegek és a kontroll csoport között.

Ezzel szemben teljesen más volt a helyzet a 8.1AH-t alkotó allélek alkotta haplotípus

gyakorisága tekintetében (11. táblázat). A LTA 252G-TNFα -308A haplotípus esetében

marginális volt a szignifikancia, míg a 3-lókuszos és 4-lókuszos haplotípus jelentősen

magasabb arányban fordult elő a tumoros betegekben, mint egészségesekben (p=0,008

illetve p=0,006).

Bár a betegek és kontrollok kora hasonló volt (p=0.110), enyhe különbséget (p=0.031)

figyelhettünk meg a két csoport között nemek szerinti megoszlásban (a betegek között

viszonylag több férfi volt). Ezért többszörös logisztikus regressziót alkalmazva

vizsgáltuk a LTA 252G+TNFα -308A +HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípus (a

továbbiakban: 8.1AH) korra és nemre illesztett gyakoriságát. A betegek és egészséges

kontrollok közti különbség az illesztésnek megfelelő korrekciót követően is szignifikáns

46

maradt, a 8.1AH hordozóknak a nem horodzókkal szemben 2,5-szeres az esélye

colorectalis tumor kialakulására.

11. táblázat: MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros

betegekben és egészséges kontrollokban

allélek/haplotípusok hordozói Kontrollok

(n=141)

Colorectalis tumoros

betegek (n=183)

p-érték (χ2 for

trend-teszt)

Esetszám (%)

Kor (év) medián (IQ range) 68,0 (61,9-

73,0)

66,0 (59,5-74,0) 0,418*

Férfiak/nők 60/81 100/83 0.034**

LTA 252 AA

AG

GG

69 (48,4)

64 (45,4)

8 (5,7)

84 (45,9)

80 (43,7)

19 (10,4)

0,278

TNFα -308 GG

GA

AA

111 (78,7)

30 (21,3)

0 (0,0)

132 (72,1)

48 (26,2)

3 (1,6)

0,110

HSP70 -1267 AA

AG

GG

65 (46,7)

57 (40,4)

19 (13,5)

69 (37,7)

87 (47,5)

27 (14,8)

0,214

RAGE -429 TT

TC

CC

101 (71,6)

35 (24,8)

5 (3,5)

135 (73,8)

44 (24,0)

4 (2,2)

0,545

LTA 252G + TNFα -308A

Nem hordozó

Heterozigóta hordozó

homozigóta hordozó

112 (79,4)

29 (20,6)

0 (0,0)

132 (72,1)

48 (26,2)

3 (1,6)

0,081

LTA 252G + TNFα -308A +

HSP70 1267G

Nem hordozó

Heterozigóta hordozó

122 (86,5)

19 (13,5)

137 (74,9)

45 (24,6)

0,008

47

homozigóta hordozó 0 (0,0) 1 (0,5)

LTA 252G + TNFα -308A +

HSP70 1267G + RAGE -

429C

Nem hordozó

Heterozigóta hordozó

130 (92,2)

11 (7,8)

148 (80,9)

35 (19,1)

0,003

*Mann-Whitney-teszt, **Fisher exact-teszt

5.3.2. A 8.1 ősi haplotípus gyakoriságának összehasonlítása colorectalis tumoros

betegekben és egészséges kontrollokban, kor és nem szerint csoportosítva

Mivel logisztikus regressziós vizsgálattal jelentős összefüggést észleltünk a kor

(p=0,026), a nem (p=0,047), colorectalis tumor kialakulásának veszélye és a 8.1AH

között (12. táblázat), a következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy van-e különbség a

8.1AH és a colorectalis tumor esélyhányadosa között különböző korú illetve nemű

betegek esetében.

A betegeket koruk mediánja (67 év) szerint osztottuk csoportokra. A 67 évnél fiatalabb

betegek az 1., a 67 évnél idősebb betegek a 2. korcsoportba kerültek. A 8.1AH

hordozók lényegesen magasabb arányban (p=0,008) fordultak elő az 1. korcsoportba

tartozó betegekben, mint a kontrollokban, de ez a különbség nem volt szignifikáns az

idősebb betegcsoport és a kontrollok között (9. ábra). Az 1. korcsoportban a nemre

illesztett esélyhányados a 8.1AH-t hordozók körében majdnem hatszorosa a haplotípust

nem hordozókhoz képest (13. táblázat).

Nemek trekintetében is jelentős különbségeket észleltünk. A 8.1AH hordozók

gyakorisága magasabb volt beteg nőkben, mint egészséges nőkben (9. ábra). Korra való

illesztést követően a 8.1AH hordozó nőkben az esélyhányados több mint négyszeres

volt a haplotípust nem hordozókkal szemben, míg férfiakban nem észleltünk

különbséget 8.1AH hordozók és nem hordozók között (14. táblázat).

48

12. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust

hordozók korra és nemre illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a

haplotípust nem hordozókkal szemben

Változó Esélyhányados (95% konfidencia

intervallum)

p-érték

Hordozók:nem hordozók 2,514 (1,208-5,232) 0,014

Férfiak:nők 1,547 (0,983-2,434) 0,059

Kor 0,971 (0,946-0,998) 0,034

9. ábra: LTA 252A+ TNFα -308A +HSP70 1267G +RAGE -429C haplotípus

előfordulási gyakorisága colorectalis tumoros betegekben és egészséges

kontrollokban 67 év alatt (A rész), 67 év felett (B rész), nőkben (C rész) és

férfiakban (D rész).

49

13. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust

hordozók nemre illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a haplotípust nem

hordozókkal szemben (diagnóziskor különböző korok)

Csoport Esélyhányados (95% konfidencia

intervallum)

p-érték

Kor < 67 év 4,073 (1,317-12,596) 0,015

Kor > 67 év 2,036 (0,721-5,752) 0,180

Összes beteg 2,788 (1,355-5,735) 0,005

14. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust

hordozó nők és férfiak korra illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a

haplotípust nem hordozókkal szemben

Csoport Esélyhányados (95% konfidencia

intervallum)

p-érték

Nők 3,771 (1,302-10,927) 0,014

Férfiak 1,684 (0,612-4,633) 0,312

Összes beteg 2,490 (1,202-5,161) 0,014

5.3.3. A 8.1AH és klinikai jellemzők összefüggésének hiánya colorectalis tumoros

betegekben

Sem a Dukes stádiumok, sem a TNM-index, sem a grade, sem pedig a tumor

elhelyezkedése tekintetében nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a

8.1AH hordozók és nem hordozók között. Érdekes módon, a 33 8.1AH-t hordozó beteg

között egyben sem észleltük a sigmában elhelyezkedő tumort, míg a haplotípust nem

hordozók 7.1%-ban (11/156) a tumor a sigmában helyezkedett el, bár a különbség

statisztikailag nem szignifikáns (p=0,1281).

50

6. Megbeszélés

6.1.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje

Az 1-es típusú diabetes mellitusos családok körében elvégzett, MHC II és III osztályú

allélek öröklődési, szegregációs vizsgálata az MHC régiók genetikája terén számos

fontos jellegzetességre mutatott rá.

Megerősíti, hogy az MHC régiókban akár pár ezer kilobázist is felölelő, nagy fokban

konzervált haplotípusok találhatók. Megfigyeléseink alapján a 8.1AH eddig ismert és

általunk vizsgált négy alkotó-allélje közül legalább három allélt tartalmazó haplotípus

minden esetben kapcsoltságot mutat RAGE -429C allélel. A HLA-DQ2, HLA-DR3,

RAGE -429C allélek, a monomoduláris rövid RCCX genotípus C4A gén nélkül rövid

C4B génnel (mono-S) és a TNF2 allél együttes, többszöri, ismételt előfordulása 1-es

típusú diabeteses családokban, az ősi MHC haplotípusoknak meggyőző és kellő erejű

bizonyítéka. 82, egymással rokoni kapcsolatban nem lévő 1-es típusú diabetes

mellitusos beteg és három különböző, egészséges kaukázusi csoportban elvégzett

populációs vizsgálat is megerősítette a RAGE -429C allél és a 8.1AH kapcsoltságát.

Mindamellett, az 1-es típusú diabetes mellitusos családokban többszörös, rekombináns

MHC haplotípusok jelenlétét mutatták eredményeink. A nyolc vizsgált családban,

például, HLA-DQ2 és HLA-DR3 allélt tartalmazó MHC haplotípusból 10 különbözőt

találtunk. A 10 haplotípusból hét esetben (70%) volt jelen a RAGE -429C allél és a

8.1AH ismert tagjaiként mono-S RCCX és TNF2. A fennmaradó három haplotípus

(vagyis 30%) a hosszú C4B gén, TNF1 és RAGE -429T allél variációja. Ezen genetikai

változók dichotómikus természete arra utal, hogy legnagyobb valószínűséggel genetikai

rekombináció eredményeként keletkeztek. A családokban a 8.1AH-n kívül más ősi

MHC haplotípusok rekombináns variánsai is előfordultak.

Mindenképp érdemes kihangsúlyozni, hogy a RAGE -429C allél gyakorisága a TNF-α -

308A alléléhoz hasonló, mely a 8.1AH kaukázusi populációkbéli gyakoriságának

körülbelül a fele. Autoimmun, infektív vagy gyulladásos betegségekkel kapcsolatos

MHC asszociációs vizsgálatokban célszerű lenne a klasszikus I és II osztályú allélek

mellett a centrális MHC III régióban lévő RAGE és TNF-α promóter

polimorfizmusokat, az RCCX modult és a C4 poligénes változatait is vizsgálni.

51

Az elvégzett, szisztematikus viszgálatunk az első, mely a RAGE -429C allél és 8.1AH

kapcsoltságát populációs szinten bizonyítja. Eredményeink összhangban vannak Price

és munkatársai megfigyelésével, akik a 8.1AH-ra nézve homozigóta 6 egyénből izolált

sejtvonalon mutatták ki a RAGE -429C allél és a 8.1AH kapcsoltságát (3).

Kutatócsoportunk egy másik SNP, szintén az MHC III régióban elhelyezkedő HSP70-2

gén -1267A>G polimorfizmusának vizsgálata kapcsán a HSP70-2 -1267G allél 8.1 ősi

haplotípusssal való szoros kapcsoltságát írta le (102), valamint nem közölt eredmény,

hogy a LTA 252G allél szintén a 8.1 ősi haplotípust alkotó allélek közé tartozik.

6.1.2. RAGE -429C összefüggése a szénhidrát anyagcserével 1-es típusú diabetes

mellitusban

Irodalmi adatok azt jelzik, hogy a RAGE gén polimorfizmusok leginkább a diabeteses

szövődményekkel mutatnak összefüggést, de az eredmények nem minden esetben

megegyezőek. Hudson és munkatársai megfigyelései szerint a RAGE -429C allél

gyakorisága magasabb 2-es típusú diabeteses betegekben retinopathia esetén (55). Sem

JiXiong és munkatársai nem tudták alátámasztani ezt az összefüggést kínai, 2-es típusú

diabeteses betegek körében elvégzett vizsgálataik alapján (103), sem egy szintén 2-es

típusú diabeteses betegeket vizsgáló szlovén tanulmány (56) nem erősítette meg a

korábbi megfigyelést. 1-es típusú diabetes és RAGE promóter polimorfizmusok

kapcsolatát idáig csak két tanulmány vizsgálta. Egy finn vizsgálat azt mutatta, hogy egy

másik RAGE SNP ritka alléljének homozigóta változata, a RAGE -374 AA genotípus

védő hatású olyan szövődmények kialakulásával szemben, mint a cardiovascularis

megbetegedés és albuminuria, 1-es típusú diabeteses betegekben (57). A másik

vizsgálatban a RAGE -1152 C>A polimorfizmus nephropathiával szembeni mérsékelt

védő szerepét találták (58). Korábbi vizsgálataink a RAGE -429C és a RAGE -374A

allél erős negatív asszociációját mutatták (nem közölt eredmények). Az általunk észlelt,

RAGE -429C allél és magas HBA1C-értékek (rossz szénhidrát-anyagcsere) összefüggése

alapján elmondható, hogy eredményeink összhangban vannak a finn munkacsoport által

észleltekkel. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy az 1-es típusú diabetes lefolyása,

legalább is részben függhet a transzkripciós aktivitást fokozó RAGE promóter

allélektől. Bár, érdekes módon, a magas HBA1C-értékekkel a RAGE -429C allél mellett

csak a HLA-DQ2 allél mutatott összefüggést, és a 8.1AH más alkotóeleme közül (mint

52

a TNF2 allél, HLA-DR3 allél, mono-S RCCX modul) egyik sem. Ez a megfigyelés azt

jelzi, hogy az összefüggés nem magyarázható a RAGE -429C allél 8.1AH-sal való

szoros kapcsoltságával.

6.2. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban

A cisztás fibrózisos betegek körében elvégzett vizsgálat új, korábban mások által nem

közölt eredményeket hozott. Ezek alapján megállapíthatjuk, hogy cisztás fibrózisos

betegekben a 8.1 ősi haplotípus jelenléte összefüggést mutat a mind S. aureus, mind P.

aeruginosa által okozott kolonizáció ritkább előfordulásával és jelentősen későbbi

kezdetével. Érdekességként említem meg, hogy az egyetlen olyan beteg, aki a 8.1AH-ra

nézve homozigóta volt, 17 éves koráig nem kolonizálódott annak ellenére, hogy CFTR

genotípusa ΔF508 homozigóta. Ez azért különösen érdekes, mert a ΔF508 homozigóta

betegekre igen korai, az első pár életévben kialakuló kolonizáció az általánosan

jellemző. Egyetlen más, a kolonizáció kialakulásának idejével ilyen erős összefüggést

mutató genetikai tényező sem ismert. De Rose és munkatársai megfigyelése szerint

(104) az Fc-gamma-receptor IIA gén R/R homozigóta formája bakteriális infekció

veszélye nagyobb P. aeruginosával kolonizált CF-os betegekben, mint a nem

kolonizáltakban vagy egészséges kontrollokban. Az észlelt különbség azonban kevéssé

szignifikáns (p = 0,042), mint a saját vizsgálatunkban a 8.1AH esetében.

Eredményeink azt sugallják, hogy a 8.1AH befolyásolhatja cisztás fibrózisban a

betegség lefolyását, ezért ezen haplotípus meghatározása CF-os betegekben gyakorlati,

klinikai jelentőséggel bír, amennyiben segít a prognózis megbecsülésében. P.

aeruginosa elleni oltás igazoltan magasabb kötődési affinitással rendelkező antitestek

képződéséhez vezet, így előzve meg, vagy legalább is késleltetve a bakteriális infekció

létrejöttét, mely következményesen a légzésfunkció megőrzéséhez vezet (105). A

betegség patofiziológiája –a légutakban lévő sűrű nyák- miatt a CF-os betegek

immunrendszere folyamatos kihívásoknak van kitéve anélkül, hogy a szó klasszikus

értelmében immunkomprimáltak lennének. Ezért lehetséges, hogy az immunválasz

genetikailag kódolt jellemzőinek eltérése az infekciók tekintetében detektálható

különbségeket okoz.

53

Az infekciók elleni védekezésben a gazdaszervezet-patogén kölcsönhatás döntő

jelentőségű. Bár nem tudunk biztos magyarázatot adni arra, hogy miért kolonizálódnak

később a 8.1AH-t hordozó CF-os betegek, megfigyelésünk mégis összhangban van

számos, a haplotípusról eddig közölt jellemzőkkel. A 8.1AH ismert jellemzői, mint a

fokozott TNF-α termelés, a keringő immunkomplexek elégtelen kezelése, az antigén

prezentáció és feldolgozás, valamint az antitesttermelés sajátosságai (3,5,106), mind

befolyásolhatják a mikroorganizmusok elleni védekező mechanizmusokat.

Megfigyelésünket megerősíti és részben kiegészíti 100 ír cisztás fibrózisos beteg

körében elvégzett hasonló vizsgálat még nem közölt eredménye (Laki és munkatársai,

kézirat szerkesztés alatt): a 8.1AH-t hordozó betegekben fertőzést követően jelentősen

kisebb arányban alakul ki krónikus fertőzés, azaz kolonizáció (p=0,027). További

érdekes és értékes megfigyelés, hogy a 8.1AH ír CF-os betegekben alacsony

mortalitással mutatott szoros összefüggést (p=0.016).

A 8.1AH hordozók módosult immunválasza genetikailag kódolt. A haplotípus az

autoimmun betegségekre való fokozott hajlam mellett infekciókkal szemben

rezisztenciát fejthet ki (5,106). MHC I és II allélek, melyek közül néhány a 8.1AH-ban

is megtalálható, az antigénprezentációban és feldolgozásban betöltött különleges

szerepük miatt számos esetben voltak CF módosító géneket vizsgáló tanulmányok

fontos célpontjai. Ilyen feltételezett módosító gén a TNF-α is, melynek sokat vizsgált

TNF2 allélje az esetek körülbelül 60%-ában a 8.1AH részeként van jelen. Így

megfigyeléseink segítségével érthetővé válhat az önmagában vizsgált TNF2 allél és a

cisztás fibrózis súlyosságának kapcsolatáról közölt egymásnak ellentmondó

eredmények lehetséges oka is (62-67). Ezek az adatok tovább erősítik annak a

fontosságát, hogy az egyszeres polimorfizmusok, SNP-k helyett haplotípusokat

vizsgáljunk, ha a kérdéses SNP valamely haplotípus részeként is jelen van. Ezt

korábban más szerzők is javaslatként vetették fel betegség asszociációs vizsgálatok

kapcsán (105,107,108). A bemutatott vizsgálat, melyben a cisztás fibrózis a bakteriális

infekciókra való fokozott hajlam modelljéül szolgált, alkalmazható lehet más

betegségek infekciós komplikációi, például szepszis vagy COPD esetén is.

54

6.3. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel

Az 1-es típusú diabeteses betegek, 1-es típusú diabeteses családok, a magyar, ohioi és

izlandi egészséges populációk, valamint cisztás fibrózisos betegek vizsgálatakor a már

ismert, a 8.1AH részeként jelenlévő MHC II és III allél (HLA-DRB1*0301, HLA-

DQB1*0201, TNF-α -308A), az MHC III régióban a mono-S-RCCX modul valamint

három, a 8.1AH összefüggésében még nem vizsgált allél (RAGE -429C, HSP70-2

+1267G és LTA +252G) között rendkívül szoros kapcsoltságot észleltünk. A HLA-

DRB1, HLA-DQB1 és az RCCX modul vizsgálatánál egyszerűbb és kevésbé költséges

az SNP-k vizsgálata. Tekintve, hogy a TNF-α -308A, RAGE -429C, HSP70-2 1+267G

és LTA +252G allélek egy haplotípust alkotnak, mely része a 8.1AH-nak, ezek

segítségével relatíve egyszerűbben vizsgálható ez a kiterjesztett MHC haplotípus. Ezt a

módszert, a 8.1 ősi haplotípus MHC III SNP-k segítségével történő meghatározását

először alkalmaztam, melyet kutatócsoprtunk további munkája során sikerrel folytatott.

6.4. A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban

Eredményeink azt mutatják, hogy szignifikánsan magasabb a colorectalis tumor

kialakulásának kockázata a nem hordozókkal szemben a 8.1AH hordozókban. Ez az ősi

haplotípus a konzervált kiterjesztett haplotípusok közül a leggyakoribb a kaukázusi

populációban. Továbbá az, aki a 8.1AH-t alkotó allélek közül hármat hordoz, nagy

valószínűséggel hordozza az egész kiterjesztett haplotípust.

A jelen vizsgálat eredménye, mely szerint a 8.1AH tagjaként ismert allélek

kombinációjaként összeálló három vagy négy alléles haplotípust hordozók gyakorisága

jelentősen magasabb volt colorectalis tumoros betegekben, azt jelzi, hogy a 8.1AH-t

hordozóknak tényleg nagyobb a kockázata colorectalis tumor kialakulására. Ez a

megfigyelés összhangban van Kubler és munkatársai ovarium tumoros betegekben

észlelt tapasztalataival (83). A szerzők ovarium tumoros betegekben az MHC II

osztályú, a 8.1AH részét képező DRB1*0301/DQA1*0501/DQB1*0201 haplotípus,

frekvenciáját szignifikánsan magasabbnak (20,2%) találták, mint egészséges

kontrollokban (8,6%), az esélyhányados 2,12. Ez nagyon hasonló ahhoz, melyet mi

észleltünk (esélyhányados: 2,514) a 8.1AH-t hordozó colorectalis tumoros betegekben.

Familiáris esetekben az ovarium tumor előfordulása öröklődő nonpolyposus colorecatlis

55

tumorral kapcsolt, Lynch syndroma II típusaként ismert (109). Egy másik tanulmány

szerint colorectalis tumoros betegek első fokú rokonainak nagyobb az esélye ovarium

tumor kialakulására (110). Mindezt saját megfigyelésünkkel kiegészítve lehetséges,

hogy a két tumornak közös genetikai hajlamosító tényezői vannak.

A 8.1AH-t hordozóknak magasabb a kockázata, hogy fiatalabb korban alakuljon ki

colorectalis tumoruk. Ebben a fiatalabb csoportban a haplotípust hordozók esélye a

tumor kialakulására majdnem hatszoros a 8.1AH-t nem hordozókkal szemben. Ez a

megfigyelés összhangban áll azzal, hogy a fiatalabb életkorban diagnosztizált

colorectalis tumor előfordulása esetén a rokonokban nagyobb ezen tumor

kialakulásának a veszélye (78,111). Azoknak, akiknek első fokú rokonában 50 évesnél

korábban diagnosztizáltak colorectalis tumort, ennek kialakulásának az esélye 2:3, míg

abban az esetben, ha a tumort 50 évesnél idősebb korban diagnosztizálták, ez 4:6 (111).

Igazolódni látszik, hogy a colorectalis tumor familáris formájának előfordulása

legnagyobb részt genetikai okoknak az eredménye (112). 30 polimorfizmus

vizsgálatából kiderült, hogy közülük néhány, alacsony penetranciájú allél, mely az

anyagcserét, detoxikáló enzimeket, mitogén kiváltotta jelátviteli utat vagy a gyulladásos

választ (TNF2) befolyásolja, fokozott kockázatot jelent colorectalis tumor kialakulására

(93). Vizsgálatunk alapján hasonló genetikai tényezőnek tűnik az MHC régióban kódolt

kiterjesztett haplotípus. Bár az említett munkacsoport számos MHC III osztályú allél és

haplotípus tekintetében nem talált összefüggést colorectalis tumorral, magát a 8.1 ősi

haplotípus előfordulását nem vizsgálták (94).

Eredményeink szerint a 8.1AH nemtől függően mutatott kockázatot colorectalis tumor

kialakulására. Az összefüggés nőkben erős, szignifikáns volt, de férfiakban ilyen

összefüggést nem észleltünk. Érdemes megjegyezni, hogy az eddigi irodalmi adatok

alapján egy összefoglaló közlemény a 8.1AH és a hosszú élet közötti pozitív kapcsolatot

valószínűsíti, mely összefüggés –szintén- nemtől függő(5). Míg igen idős, nyolcvan-

kilencven éves férfiak között magasabb arányban vannak jelen a 8.1AH-t hordozók,

ilyen korcsoportú nőkben hasonló összefüggést nem észleltek. Nehéz megítélni, hogy az

általunk megfigyelt, a 8.1AH nőkben colorectalis tumorral való összefüggése

valamilyen mértékben hozzájárulhat-e ahhoz, hogy ezen ősi haplotípus férfiakban igen,

de nőkben nem mutat összefüggést a hosszú életkorral.

56

7. Következtetések

7.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje

Vizsgálatainkkal igazoltuk, hogy az RAGE -429C allél a 8.1 ősi haplotípus egyik

marker allélje. Új eredményeink segítségével hozzájárulhatunk az ősi haplotípusokról,

különösen a kaukázusi populációban leggyakoribb kiterjesztett haplotípusról, a 8.1AH-

ról alkotott ismereteink bővítéséhez. Saját megfigyelésünk, hogy a RAGE -429T>C,

HSP70-2 -1267A>G és a TNF-α -308G>A polimorfizmusok és az RCCX modul

meghatározásával, a 8.1 ősi haplotípussal kapcsolt allélek jelenléte esetén nagy

valószínűséggel megjósolhatók a 8.1AH részét képező MHC II osztályú allélek, sőt,

maga a 8.1AH is. Így az említett MHC III polimorfizmusok (RAGE -429, HSP70-2 -

1267 és a TNF-α -308) a 8.1 ősi haplotípust jelölő SNP-nek számítanak (113,114).

7.2. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel

A RAGE -429T>C polimorfizmus RFLP módszerrel, valamint a TNF-α -308G>A

polimorfizmus SSP-PCR módszerrel való vizsgálatának bevezetését követően a 8.1AH

részeként azonosítottunk újabb alléleket az MHC III régióban. Ezek, vagyis a RAGE -

429C, HSP70-2 1+267G és LTA +252G allélek és a már ismert 8.1AH tag, a TNF-α -

308A segítségével sikerült viszonylag egyszerű és kevésbé költséges módszerrel

vizsgálni a 8.1 ősi haplotípust. Ezen módszer alkalmazása meghonosodott

kutatócsoportunk további munkájában.

7.3. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban

Bár a 8.1 ősi haplotípus immunológiai jellegzetességei közül sokat ismerünk, ilyen a

többi között a magas TNF-α-szint in vitro (9,10) és in vivo (6), immunkomplexek és

autoantitestek magas szintje (106) vagy a jellemzően 2-es típusú citokin profil (11,12),

attól még távol vagyunk, hogy teljes részleteiben megértsük, a 8.1AH milyen

mechanizmus révén hajlamosít autoimmun betegségek kialakulására.

Eredményeink, a 8.1AH cisztás fibrózisban betöltött szerepével kapcsolatosan felvetett

hipotézis megerősítése nagy létszámú betegcsoportban –akár több ország részvételével-

született alátámasztó eredményekkel lehetséges. Amennyiben az itt bemutatott

megfigyelések reprodukálhatók, a 8.1AH meghatározásával a CF-os betegek

57

kolonizáció szempontjából nézve alacsony és magas rizikójú csoportokra oszthatók,

melynek antibiotikus, immunprofilaktikus (vakcinációs) és terápiás következményei

lehetnek. Ennek segítségével pedig CF-os betegcsoportok megfelelően, az eddigieknél

esetleg pontosabban stratifikálhatók immunológia, mikrobiológiai, gyógyszertani

vizsgálatokban. A CF-os betegek esetén rutinszerűen alkalmazott preventív antibiotikus

kúrák nem kívánt vagy toxikus mellékhatásai –rezisztens törzsek kialakulása, oto-,

nephrotoxicitás- szempontjából sem közömbös a 8.1AH feltételezett védő szerepe

kolonizáció kialakulásában; ha a genetikailag kódolt módosult immunválasszal

rendelkező betegekben az antibiotikus prevenció nem hoz jelentős többlet előnyt, az

lehetséges változásokat eredményezhet a prevenciós protokollban is. Az időben

felismert és ennek megfelelően kezelt CF-os betegek bizonyíthatóan nagy előnyre

tesznek szert a később, csak már kiteljesedett klinikai tünetek alapján diagnosztizált

társaikhoz képest. Ez nem csak szakmailag, infekciós és egyéb szövődmények, hanem

gazdaságilag, a különböző költségek terén is mérhető és igazolható (115). Emiatt

számos nyugat-európai országban elkezdődött az újszülöttek CF-szűrése. Prof. Stuart

Elborn, Dr. Anil Mehta és Dr. Keith Brownlee vezetésével 2009 januárjától az e módon

már kiszűrt betegek mellett a brit CF központokban már gondozott britt betegek 8.1AH

hordozására való szűrését tervezik, melyhez ausztrál, svéd, dán és cseh CF gondozó

központok is csatlakoztak. Az igen nagyszámú beteg részvételével létrejövő retrospektív

és prospektív vizsgálattal a felvetett kérdések remélhetőleg jó eséllyel, megfelelően

tisztázhatók.

A ΔF508 allél és a 8.1AH Európában hasonló földrajzi eloszlást mutat (45,116),

mindkettő tipikusan kaukázusinak mondható. Az említett szükséges kiterjesztett

vizsgálatok arra a kérdésre is választ adhatnak, hogy az evolúció során a ΔF508 allél

hordozóiban szelekciós előnyt kifejtve a 8.1AH hozzájárulhatott-e a cisztás fibrózis

fennmaradásához.

7.4 A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban

Colorectalis tumoros betegekben az egészséges kontrollokhoz vizsonyítva magasabb

arányban volt jelen a 8.1AH, mely a kórkép kialakulásában kockázati tényzőként

szerepel. A 8.1 ősi haplotípusra jellemző módosult immunválasz jellegzetességei közül,

jelenlegi tudásunk szerint, kiemelhetjük a csökkent komplement-szintet, valamint a

58

TNF-α, keringő immunkomplexek és autoantitestek magas szintjét (45,106). Ezek

mindegyike befolyásolhatja az immunválaszt a tumorsejtek felismerésében. Ismert,

hogy a krónikus gyulladással járó állapotok tumor kialakulására hajlamosítanak. Az

ilyen, krónikus gyulladás esetén magas a TNF-α-szint, ez a citokin pedig valószínűleg

elősegíti a tumorképződést (117). Ezek az adatok is alátámasztják –és vice versa-

colorectalis tumoros betegek körében kapott megfigyeléseinket.

Természetesen még számos vizsgálat szükséges ahhoz, hogy megértsük, a 8.1AH mily

módon hajlamosít colorectalis vagy ovariumtumor (83) kialakulására. Még nem ismert,

hogy a 8.1 ősi haplotípus által kódolt immunválasz pontosan melyik komponense lehet

felelős azért, hogy az ilyen haplotípust hordozók között magasabb a colorectalis tumor

kialakulásának esélye. Ha rájövünk, hogy melyik a „gyenge láncszem” a 8.1AH

immunológiai jellegzetességei közül, közelebb kerülve a hatékony tumor ellenes

védekező mechanizmusok pontos megértéséhez lehetséges, hogy hozzájárulhatunk

ahhoz, hogy ezeket tovább erősíteni, fokozni is tudjuk. Ennek mélyebb megismerése a

tumor ellenes terápiában, szűrésben vagy megelőzésben is hasznosítható információt

adhat. Eredményeinket összefoglalva, a 8.1AH hordozóknak magasabb a kockázata

colorectalis tumor kialakulására. Ezt az összefüggést erősebbnek észleltük fiatalabb

korban diagnosztizált betegekben és nőkben. Gyakorlati szempontból is jelentősége

lehet, ha a colorectalis tumorra pozitív családi anamnesissel rendelkező betegekben

vizsgálhatnánk a 8.1AH jelenlétét. Ebben az esetben, ugyanis a betegeknek, akiknek

fokozott a kockázata a tumor kialakulására, szűrővizsgálatként gyakoribb colonoscopia

megfontolandó lehet.

7.5 A 8.1ősi haplotípus: kétélű kard

A 8.1AH által kódolt, genetikailag meghatározott módosult immunválasz, mely

hatékonyabb lehet bakteriális fertőzésekkel szemben, így előnyös cisztás fibrózisban

kolonizáció kialakulásával szemben, magasabb kockázatot jelent, így hátrányos

colorectalis tumor kialakulása szempontjából. Két különböző kórképben a 8.1AH a

betegség lefolyása szempontjából különböző, pozitív illetve negatív összefüggést mutat.

A, már említett feltételezés szerint a 8.1 ősi haplotípust hordozók pozitív szelekciós

előnyt élvezhettek az evolúció során a haplotípus által kódolt, fertőzésekkel szemben

hatékonyabb immunválasz miatt. Ez a szelekciós előny magyarázhatja a 8.1AH-t

59

hordozók magas arányát. Az antibiotikus érában viszont a fertőzések leküzdése már

nem csupán a gazdaszervezet hatékony vagy kevésbé hatékony immunválaszán múlik –

bár bizonyos esetekben ennek még mindig jelentős hatása van-, így a korábban előnyös,

módosult immunválasz bizonyos tekintetben fölöslegessé válhat, mely már nem a

kórokozóban, hanem magában a gazdaszervezetben tesz, tehet kárt, kedvezőtlen

folyamatoknak engedve teret.

60

8.1 Összefoglalás

A „konzervált, kiterjesztett haplotípus” (CEH), vagy „ősi haplotípus” (AH), ahogyan

még hívják, kifejezés egy közös őstől származó, a genom igen nagymértékben

konzervált szakaszaiból álló, jelentősen konzervált haplotípus blokkokat jelöl. A fő

hisztokompatibilitási komplex (MHC) régiókban számos, a természetes vagy

veleszületett immunválaszban fontos szerepet játszó gén található. Ezen gének

variánsai, alléljei alkotnak az MHC I, II és III osztályú régiókat is érintő, néhány

megabázis távolságon keresztülnyúló konzervált, kiterjesztett haplotípusokat. A 8.1AH-

t, a többi között, HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, TNFAB*a2b3, C2*C,

Bf*S, C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201

allélek alkotják. A 8.1AH hordozókra jellemző módosult ctikoin profil, magas TNF-α-,

autoantitest és keringő immunkomplex-szint. Ezek a jellegzetességek magyarázhatják,

hogy a 8.1AH hosszú távon „mellékhatásként” autoimmunbetegségek kialakulásához

vezet. A 8.1AH ezen immunológiai sajátosságai fertőzések leküzdésében előnyösek

lehetnek, emiatt a haplotípus pozitív szelekciót élvezhetett az evolúció során, mely

magyarázhatja akkumulációját a kaukázusi populációban.

1. Igazoltuk, hogy a RAGE -429C allél a 8.1AH része, munkacsoportunk egy másik

vizsgálatában ugyanezt találta LTA +252G és HSP70-2 +1267G allélek tekintetében is.

2. A TNF-α -308A, RAGE -429C, LTA +252G és HSP70-2 +1267G allélek

segítségével egyszerűbben határozhatjuk meg a 8.1AH-t.

3. Megfigyelésünk szerint a 8.1AH késlelteti a kolonizáció kialakulását cisztás

fibrózisban, valószínűleg a bakteriális infekciók elleni hatékonyabb immunválasznak

köszönhetően.

4. További eredményünk a 8.1AH-t hordozók colorectalis tumorra való jelentősen

magasabb kockázatát mutatta.

A genetikailag kódolt módosult immunválasz fertőzésekkel szemben hatékonyabb, de

tumorok kialakulásával szemben kevésbé előnyös lehet.

Azok a betegség asszociációs tanulmányok, melyek SNP-kel foglalkoznak, ha az SNP

valamely haplotípus részét képezi, úgy lehetséges, hogy –részben- a haplotípus hatását

érzékelik, és tévesen értékelhetik az eredményeket. Ezért hangsúlyozandó SNP-k

helyett a haplotípusok betegség módosító hatásának vizsgálata.

61

8.2 Summary

The term ”conserved extended haplotype” or as also known ”ancestral haplotype” (AH)

defines highly conserved haplotype—blocks of highly conserved genomic sequences—

derived from a common remote ancestor. The main histocompatibility complex (MHC)

or human leukocyte antigen (HLA) regions harbour genes -such as HLA-A, B, C, DQ,

DR, heat shock proteins, complement components and cytokines like TNF-α and LT-α

-that play important roles in the innate or acquired immune response. Variations, alleles

of these genes make up conserved extended haplotypes in the MHC regions, extending

through class I, class II and class III regions in few megabase. The so-called 8.1 AH

consists of, among others, HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, C2*C, Bf*S,

C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201 alleles.

Individuals carrying the 8.1 AH have altered cytokine profile, increased TNF-α

production, high titers of autoantibodies and circulating immune complexes. These

features are thought to be beneficial in response to infections and are thought to have

had positive selection during evolution, thereby resulting in accumulation in the

Caucasian population. However, the 8.1AH may lead to the development of

autoimmune diseases as a long-term side effect.

1.We have shown RAGE -429C and in another study LTA +252G and HSP70-2

+1267G alleles to be member alleles of the 8.1AH.

2.The detection of TNF-α -308A, RAGE -429C, LTA +252G and HSP70-2 +1267G

alleles may simplify the detection of the 8.1AH.

3.According to our studies carrier state of this haplotype may modify the clinical course

of cystic fibrosis by delaying the onset of colonization, possibly by exerting a more

efficient immune response against bacterial infections.

4.In another study we found carriers of the 8.1 AH to have a significantly higher risk for

colorectal cancer than non-carriers.

So the genetically encoded alteration of the immune response of 8.1AH carriers which

is more efficient against infections may not be advantageous in terms of tumours.

Disease association studies focusing on single alleles lose the context and detection of

the effect of the complex haplotype they belong to, therefore the importance of

haplotype analysis rather than determination of single alleles as modifier factors in

disease association studies is to be emphasized.

62

9. Irodalomjegyzék

1 Walsh, E. C., Mather, K. A., Schaffner, S. F., Farwell, L., Daly, M. J., Patterson,

N., Cullen, M., Carrington, M., Bugawan, T. L., Erlich, H., Campbell, J.,

Barrett, J., Miller, K., Thomson, G., Lander, E. S., and Rioux, J. D. 2003. An

integrated haplotype map of the human major histocompatibility complex. Am J

Hum Genet 73:580-90.

2 Gruen, J. R. and Weissman, S. M. 1997. Evolving views of the major

histocompatibility complex. Blood 90:4252-65.

3 Price, P., Witt, C., Allcock, R., Sayer, D., Garlepp, M., Kok, C. C., French, M.,

Mallal, S., and Christiansen, F. 1999. The genetic basis for the association of the

8.1 ancestral haplotype (A1, B8, DR3) with multiple immunopathological

diseases. Immunol Rev 167:257-74.

4 Yunis, E. J., Larsen, C. E., Fernandez-Vina, M., Awdeh, Z. L., Romero, T.,

Hansen, J. A., and Alper, C. A. 2003. Inheritable variable sizes of DNA

stretches in the human MHC: conserved extended haplotypes and their

fragments or blocks. Tissue Antigens 62:1-20.

5 Caruso, C., Candore, G., Colonna Romano, G., Lio, D., Bonafe, M., Valensin,

S., and Franceschi, C. 2000. HLA, aging, and longevity: a critical reappraisal.

Hum Immunol 61:942-9.

6 Lio, D., Candore, G., Colombo, A., Colonna Romano, G., Gervasi, F., Marino,

V., Scola, L., and Caruso, C. 2001. A genetically determined high setting of

TNF-alpha influences immunologic parameters of HLA-B8,DR3 positive

subjects: implications for autoimmunity. Hum Immunol 62:705-13.

7 Salazar, M., Deulofeut, H., Granja, C., Deulofeut, R., Yunis, D. E., Marcus-

Bagley, D., Awdeh, Z., Alper, C. A., and Yunis, E. J. 1995. Normal HBsAg

presentation and T-cell defect in the immune response of nonresponders.

Immunogenetics 41:366-74.

8 Marsh, D. G., Meyers, D. A., and Bias, W. B. 1981. The epidemiology and

genetics of atopic allergy. N Engl J Med 305:1551-9.

63

9 Garcia-Merino, A., Alper, C. A., Usuku, K., Marcus-Bagley, D., Lincoln, R.,

Awdeh, Z., Yunis, E. J., Eisenbarth, G. S., Brink, S. J., and Hauser, S. L. 1996.

Tumor necrosis factor (TNF) microsatellite haplotypes in relation to extended

haplotypes, susceptibility to diseases associated with the major

histocompatibility complex and TNF secretion. Hum Immunol 50:11-21.

10 Abraham, L. J., French, M. A., and Dawkins, R. L. 1993. Polymorphic MHC

ancestral haplotypes affect the activity of tumour necrosis factor-alpha. Clin Exp

Immunol 92:14-8.

11 Candore, G., Colucci, A. T., Modica, M. A., and Caruso, C. 1991. HLA-B8,DR3

T cell impairment is completely restored by in vitro treatment with interleukin-2.

Immunopharmacol Immunotoxicol 13:551-61.

12 Caruso, C., Candore, G., Colucci, A. T., Cigna, D., Modica, M. A., Tantillo, G.,

and Salerno, A. 1993. Natural killer and lymphokine-activated killer activity in

HLA-B8,DR3-positive subjects. Hum Immunol 38:226-30.

13 Dawkins, R., Leelayuwat, C., Gaudieri, S., Tay, G., Hui, J., Cattley, S.,

Martinez, P., and Kulski, J. 1999. Genomics of the major histocompatibility

complex: haplotypes, duplication, retroviruses and disease. Immunol Rev

167:275-304.

14 Betterle, C., Scalici, C., Presotto, F., Pedini, B., Moro, L., Rigon, F., and

Mantero, F. 1988. The natural history of adrenal function in autoimmune

patients with adrenal autoantibodies. J Endocrinol 117:467-75.

15 Saunders, J. B., Wodak, A. D., Haines, A., Powell-Jackson, P. R., Portmann, B.,

Davis, M., and Williams, R. 1982. Accelerated development of alcoholic

cirrhosis in patients with HLA-B8. Lancet 1:1381-4.

16 Julkunen, H., Siren, M. K., Kaaja, R., Kurki, P., Friman, C., and Koskimies, S.

1995. Maternal HLA antigens and antibodies to SS-A/Ro and SS-B/La.

Comparison with systemic lupus erythematosus and primary Sjogren's

syndrome. Br J Rheumatol 34:901-7.

17 Lohr, H. F. 2002. [Autoimmune hepatitis and overlap syndrome: therapy].

Schweiz Rundsch Med Prax 91:1347-51.

18 Skanes, V. M., Barnard, J., Farid, N., Marshall, W. H., Murphy, L., Rideout, D.,

Taylor, R., Xidos, G., and Larsen, B. 1986. Class III alleles and high-risk MHC

64

haplotypes in type I diabetes mellitus, Graves' disease and Hashimoto's

thyroiditis. Mol Biol Med 3:143-57.

19 Baldini, M., Pappalettera, M., Lecchi, L., Orsatti, A., Meroni, L., Tozzi, R.,

Scalamogna, M., and Cantalamessa, L. 1995. Human lymphocyte antigens in

Graves' disease: correlation with persistent course of disease. Am J Med Sci

309:43-8.

20 Wilson, A. G., Clay, F. E., Crane, A. M., Cork, M. J., and Duff, G. W. 1995.

Comparative genetic association of human leukocyte antigen class II and tumor

necrosis factor-alpha with dermatitis herpetiformis. J Invest Dermatol 104:856-

8.

21 Otley, C. and Hall, R. P., 3rd. 1990. Dermatitis herpetiformis. Dermatol Clin

8:759-69.

22 O'Hanlon, T. P., Carrick, D. M., Arnett, F. C., Reveille, J. D., Carrington, M.,

Gao, X., Oddis, C. V., Morel, P. A., Malley, J. D., Malley, K., Dreyfuss, J.,

Shamim, E. A., Rider, L. G., Chanock, S. J., Foster, C. B., Bunch, T., Plotz, P.

H., Love, L. A., and Miller, F. W. 2005. Immunogenetic risk and protective

factors for the idiopathic inflammatory myopathies: distinct HLA-A, -B, -Cw, -

DRB1 and -DQA1 allelic profiles and motifs define clinicopathologic groups in

caucasians. Medicine (Baltimore) 84:338-49.

23 Chinoy, H., Salway, F., John, S., Fertig, N., Tait, B. D., Oddis, C. V., Ollier, W.

E., and Cooper, R. G. 2007. Tumour necrosis factor-alpha single nucleotide

polymorphisms are not independent of HLA class I in UK Caucasians with adult

onset idiopathic inflammatory myopathies. Rheumatology (Oxford) 46:1411-6.

24 Fust, G., Arason, G. J., Kramer, J., Szalai, C., Duba, J., Yang, Y., Chung, E. K.,

Zhou, B., Blanchong, C. A., Lokki, M. L., Bodvarsson, S., Prohaszka, Z.,

Karadi, I., Vatay, A., Kovacs, M., Romics, L., Thorgeirsson, G., and Yu, C. Y.

2004. Genetic basis of tobacco smoking: strong association of a specific major

histocompatibility complex haplotype on chromosome 6 with smoking behavior.

Int Immunol 16:1507-14.

25 Caruso, C., Candore, G., Colucci, A. T., Cigna, D., Sammartano, F., and

Ammatuna, P. 1993. HLA-B8,DR3 phenotype and the antibody response against

Epstein-Barr virus. Immunol Invest 22:41-51.

65

26 Rittner, C., Sennekamp, J., Mollenhauer, E., Rosinger, N., Niese, D.,

Luttkenhorst, M., Baur, M. P., and Stroehmann, I. 1983. Pigeon breeder's lung:

association with HLA-DR 3. Tissue Antigens 21:374-9.

27 Hall, M. A., Lanchbury, J. S., and Ciclitira, P. J. 1996. HLA class II region

genes and susceptibility to dermatitis herpetiformis: DPB1 and TAP2

associations are secondary to those of the DQ subregion. Eur J Immunogenet

23:285-96.

28 Volanakis, J. E., Zhu, Z. B., Schaffer, F. M., Macon, K. J., Palermos, J., Barger,

B. O., Go, R., Campbell, R. D., Schroeder, H. W., Jr., and Cooper, M. D. 1992.

Major histocompatibility complex class III genes and susceptibility to

immunoglobulin A deficiency and common variable immunodeficiency. J Clin

Invest 89:1914-22.

29 Lenzi, M., Frisoni, M., Mantovani, V., Ricci, P., Muratori, L., Francesconi, R.,

Cuccia, M., Ferri, S., and Bianchi, F. B. 1998. Haplotype HLA-B8-DR3 confers

susceptibility to hepatitis C virus-related mixed cryoglobulinemia. Blood

91:2062-6.

30 Alper, C. A., Kruskall, M. S., Marcus-Bagley, D., Craven, D. E., Katz, A. J.,

Brink, S. J., Dienstag, J. L., Awdeh, Z., and Yunis, E. J. 1989. Genetic

prediction of nonresponse to hepatitis B vaccine. N Engl J Med 321:708-12.

31 Cameron, P. U., Mallal, S. A., French, M. A., and Dawkins, R. L. 1990. Major

histocompatibility complex genes influence the outcome of HIV infection.

Ancestral haplotypes with C4 null alleles explain diverse HLA associations.

Hum Immunol 29:282-95.

32 Cameron, P. U., Mallal, S. A., French, M. A. H., and Dawkins, R. L. 1992.

Central MHC genes between HLA-B and complement C4 confer risk for HIV-1

disease progression. Oxford University Press, New York.

33 Keet, I. P., Klein, M. R., Just, J. J., and Kaslow, R. A. 1996. The role of host

genetics in the natural history of HIV-1 infection: the needles in the haystack.

Aids 10 Suppl A:S59-67.

34 Proust, J., Moulias, R., Fumeron, F., Bekkhoucha, F., Busson, M., Schmid, M.,

and Hors, J. 1982. HLA and longevity. Tissue Antigens 19:168-73.

66

35 Degli-Esposti, M. A., Andreas, A., Christiansen, F. T., Schalke, B., Albert, E.,

and Dawkins, R. L. 1992. An approach to the localization of the susceptibility

genes for generalized myasthenia gravis by mapping recombinant ancestral

haplotypes. Immunogenetics 35:355-64.

36 Garlepp, M. J. 1993. Immunogenetics of inflammatory myopathies. Baillieres

Clin Neurol 2:579-97.

37 Donaldson, P. T. 2004. Genetics of liver disease: immunogenetics and disease

pathogenesis. Gut 53:599-608.

38 Worthington, J., Cullen, S., and Chapman, R. 2005. Immunopathogenesis of

primary sclerosing cholangitis. Clin Rev Allergy Immunol 28:93-103.

39 Olenchock, S. A., Heise, E. R., Marx, J. J., Jr., Mentnech, M. S., Mull, J. C.,

Spurgeon, D. E., Hancock, J. S., Elliott, J. A., Pearson, D. J., Price, C. D., and

Major, P. C. 1981. HLA-B8 in sarcoidosis. Ann Allergy 47:151-3.

40 Kallenberg, C. G., Van der Voort-Beelen, J. M., D'Amaro, J., and The, T. H.

1981. Increased frequency of B8/DR3 in scleroderma and association of the

haplotype with impaired cellular immune response. Clin Exp Immunol 43:478-

85.

41 Anaya, J. M., Delgado-Vega, A. M., and Castiblanco, J. 2006. Genetic basis of

Sjogren's syndrome. How strong is the evidence? Clin Dev Immunol 13:209-22.

42 Christiansen, F. T., Zhang, W. J., Griffiths, M., Mallal, S. A., and Dawkins, R.

L. 1991. Major histocompatibility complex (MHC) complement deficiency,

ancestral haplotypes and systemic lupus erythematosus (SLE): C4 deficiency

explains some but not all of the influence of the MHC. J Rheumatol 18:1350-8.

43 Smerdel-Ramoya, A., Finholt, C., Lilleby, V., Gilboe, I. M., Harbo, H. F.,

Maslinski, S., Forre, O., Thorsby, E., and Lie, B. A. 2005. Systemic lupus

erythematosus and the extended major histocompatibility complex--evidence for

several predisposing loci. Rheumatology (Oxford) 44:1368-73.

44 Hanifi Moghaddam, P., de Knijf, P., Roep, B. O., Van der Auwera, B., Naipal,

A., Gorus, F., Schuit, F., and Giphart, M. J. 1998. Genetic structure of IDDM1:

two separate regions in the major histocompatibility complex contribute to

susceptibility or protection. Belgian Diabetes Registry. Diabetes 47:263-9.

67

45 Candore, G., Lio, D., Colonna Romano, G., and Caruso, C. 2002. Pathogenesis

of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype: effect of

multiple gene interactions. Autoimmun Rev 1:29-35.

46 Bucciarelli, L. G., Wendt, T., Qu, W., Lu, Y., Lalla, E., Rong, L. L., Goova, M.

T., Moser, B., Kislinger, T., Lee, D. C., Kashyap, Y., Stern, D. M., and Schmidt,

A. M. 2002. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic

apolipoprotein E-null mice. Circulation 106:2827-35.

47 Bierhaus, A., Schiekofer, S., Schwaninger, M., Andrassy, M., Humpert, P. M.,

Chen, J., Hong, M., Luther, T., Henle, T., Kloting, I., Morcos, M., Hofmann, M.,

Tritschler, H., Weigle, B., Kasper, M., Smith, M., Perry, G., Schmidt, A. M.,

Stern, D. M., Haring, H. U., Schleicher, E., and Nawroth, P. P. 2001. Diabetes-

associated sustained activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB.

Diabetes 50:2792-808.

48 Lander, H. M., Tauras, J. M., Ogiste, J. S., Hori, O., Moss, R. A., and Schmidt,

A. M. 1997. Activation of the receptor for advanced glycation end products

triggers a p21(ras)-dependent mitogen-activated protein kinase pathway

regulated by oxidant stress. J Biol Chem 272:17810-4.

49 Yeh, C. H., Sturgis, L., Haidacher, J., Zhang, X. N., Sherwood, S. J., Bjercke, R.

J., Juhasz, O., Crow, M. T., Tilton, R. G., and Denner, L. 2001. Requirement for

p38 and p44/p42 mitogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear

factor-kappaB transcriptional activation and cytokine secretion. Diabetes

50:1495-504.

50 Bucciarelli, L. G., Wendt, T., Rong, L., Lalla, E., Hofmann, M. A., Goova, M.

T., Taguchi, A., Yan, S. F., Yan, S. D., Stern, D. M., and Schmidt, A. M. 2002.

RAGE is a multiligand receptor of the immunoglobulin superfamily:

implications for homeostasis and chronic disease. Cell Mol Life Sci 59:1117-28.

51 Gleeson, M. H., Walker, J. S., Wentzel, J., Chapman, J. A., and Harris, R. 1972.

Human leucocyte antigens in Crohn's disease and ulcerative colitis. Gut 13:438-

40.

52 van den Berg-Loonen, E. M., Dekker-Saeys, B. J., Meuwissen, S. G., Nijenhuis,

L. E., and Engelfriet, C. P. 1977. Histocompatibility antigens and other genetic

68

markers in ankylosing spondylitis and inflammatory bowel diseases. J

Immunogenet 4:167-75.

53 Franciotta, D., Cuccia, M., Dondi, E., Piccolo, G., and Cosi, V. 2001.

Polymorphic markers in MHC class II/III region: a study on Italian patients with

myasthenia gravis. J Neurol Sci 190:11-6.

54 Carroll, M. C. 1998. The role of complement and complement receptors in

induction and regulation of immunity. Annu Rev Immunol 16:545-68.

55 Hudson, B. I., Stickland, M. H., Futers, T. S., and Grant, P. J. 2001. Effects of

novel polymorphisms in the RAGE gene on transcriptional regulation and their

association with diabetic retinopathy. Diabetes 50:1505-11.

56 Globocnik Petrovic, M., Steblovnik, K., Peterlin, B., and Petrovic, D. 2003. The

- 429 T/C and - 374 T/A gene polymorphisms of the receptor of advanced

glycation end products gene are not risk factors for diabetic retinopathy in

Caucasians with type 2 diabetes. Klin Monatsbl Augenheilkd 220:873-6.

57 Pettersson-Fernholm, K., Forsblom, C., Hudson, B. I., Perola, M., Grant, P. J.,

and Groop, P. H. 2003. The functional -374 T/A RAGE gene polymorphism is

associated with proteinuria and cardiovascular disease in type 1 diabetic

patients. Diabetes 52:891-4.

58 Poirier, O., Nicaud, V., Vionnet, N., Raoux, S., Tarnow, L., Vlassara, H.,

Parving, H. H., and Cambien, F. 2001. Polymorphism screening of four genes

encoding advanced glycation end-product putative receptors. Association study

with nephropathy in type 1 diabetic patients. Diabetes 50:1214-8.

59 Kankova, K., Stejskalova, A., Hertlova, M., and Znojil, V. 2005. Haplotype

analysis of the RAGE gene: identification of a haplotype marker for diabetic

nephropathy in type 2 diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant 20:1093-102.

60 Ratjen, F. and Doring, G. 2003. Cystic fibrosis. Lancet 361:681-9.

61 Koch, C. and Hoiby, N. 1993. Pathogenesis of cystic fibrosis. Lancet 341:1065-

9.

62 Davies, J. C., Griesenbach, U., and Alton, E. 2005. Modifier genes in cystic

fibrosis. Pediatr Pulmonol 39:383-91.

63 Acton, J. D. and Wilmott, R. W. 2001. Phenotype of CF and the effects of

possible modifier genes. Paediatr Respir Rev 2:332-9.

69

64 Lester, L. A., Kraut, J., Lloyd-Still, J., Karrison, T., Mott, C., Billstrand, C.,

Lemke, A., and Ober, C. 1994. Delta F508 genotype does not predict disease

severity in an ethnically diverse cystic fibrosis population. Pediatrics 93:114-8.

65 Hull, J. and Thomson, A. H. 1998. Contribution of genetic factors other than

CFTR to disease severity in cystic fibrosis. Thorax 53:1018-21.

66 Yarden, J., Radojkovic, D., De Boeck, K., Macek, M., Jr., Zemkova, D.,

Vavrova, V., Vlietinck, R., Cassiman, J. J., and Cuppens, H. 2005. Association

of tumour necrosis factor alpha variants with the CF pulmonary phenotype.

Thorax 60:320-5.

67 Arkwright, P. D., Pravica, V., Geraghty, P. J., Super, M., Webb, A. K., Schwarz,

M., and Hutchinson, I. V. 2003. End-organ dysfunction in cystic fibrosis:

association with angiotensin I converting enzyme and cytokine gene

polymorphisms. Am J Respir Crit Care Med 167:384-9.

68 1993. Correlation between genotype and phenotype in patients with cystic

fibrosis. The Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype Consortium. N Engl J Med

329:1308-13.

69 Burke, W., Aitken, M. L., Chen, S. H., and Scott, C. R. 1992. Variable severity

of pulmonary disease in adults with identical cystic fibrosis mutations. Chest

102:506-9.

70 Arkwright, P. D., Laurie, S., Super, M., Pravica, V., Schwarz, M. J., Webb, A.

K., and Hutchinson, I. V. 2000. TGF-beta(1) genotype and accelerated decline in

lung function of patients with cystic fibrosis. Thorax 55:459-62.

71 Garred, P., Pressler, T., Madsen, H. O., Frederiksen, B., Svejgaard, A., Hoiby,

N., Schwartz, M., and Koch, C. 1999. Association of mannose-binding lectin

gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J

Clin Invest 104:431-7.

72 Gabolde, M., Guilloud-Bataille, M., Feingold, J., and Besmond, C. 1999.

Association of variant alleles of mannose binding lectin with severity of

pulmonary disease in cystic fibrosis: cohort study. BMJ 319:1166-7.

73 Texereau, J., Marullo, S., Hubert, D., Coste, J., Dusser, D. J., Dall'Ava-Santucci,

J., and Dinh-Xuan, A. T. 2004. Nitric oxide synthase 1 as a potential modifier

70

gene of decline in lung function in patients with cystic fibrosis. Thorax 59:156-

8.

74 Aron, Y., Polla, B. S., Bienvenu, T., Dall'ava, J., Dusser, D., and Hubert, D.

1999. HLA class II polymorphism in cystic fibrosis. A possible modifier of

pulmonary phenotype. Am J Respir Crit Care Med 159:1464-8.

75 Duthie, A., Doherty, D. G., Donaldson, P. T., Scott-Jupp, R., Tanner, M. S.,

Eddleston, A. L., and Mowat, A. P. 1995. The major histocompatibility complex

influences the development of chronic liver disease in male children and young

adults with cystic fibrosis. J Hepatol 23:532-7.

76 Rubin, B. K. 1990. Exposure of children with cystic fibrosis to environmental

tobacco smoke. N Engl J Med 323:782-8.

77 László Lakatos, P. L. L. 2005. A colorectalis daganatok korszerű kezelése. Lege

Artis Medicinae 15:177-86.

78 Turnbull, C. and Hodgson, S. 2005. Genetic predisposition to cancer. Clin Med

5:491-8.

79 Mestiri, S., Bouaouina, N., Ahmed, S. B., Khedhaier, A., Jrad, B. B., Remadi,

S., and Chouchane, L. 2001. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha

promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic

implications in breast carcinoma. Cancer 91:672-8.

80 de Jong, M. M., Nolte, I. M., de Vries, E. G., Schaapveld, M., Kleibeuker, J. H.,

Oosterom, E., Oosterwijk, J. C., van der Hout, A. H., van der Steege, G.,

Bruinenberg, M., Boezen, H. M., Te Meerman, G. J., and van der Graaf, W. T.

2003. The HLA class III subregion is responsible for an increased breast cancer

risk. Hum Mol Genet 12:2311-9.

81 Gopalkrishnan, L., Patil, S., Chhaya, S., Badwe, R., and Joshi, N. 2006. HLA

alleles in pre-menopausal breast cancer patients from western India. Indian J

Med Res 124:305-12.

82 Lavado, R., Benavides, M., Villar, E., Ales, I., Alonso, A., and Caballero, A.

2005. The HLA-B7 allele confers susceptibility to breast cancer in Spanish

women. Immunol Lett 101:223-5.

71

83 Kubler, K., Arndt, P. F., Wardelmann, E., Krebs, D., Kuhn, W., and van der

Ven, K. 2006. HLA-class II haplotype associations with ovarian cancer. Int J

Cancer 119:2980-5.

84 Dao, D. D., Sierra-Torres, C. H., Robazetti, S. C., de Gomez, M. N., Konig, R.,

Lema, C., Lester, L. J., Au, W. W., and Tyring, S. K. 2005. HLA-DQB1 and

cervical cancer in Venezuelan women. Gynecol Oncol 96:349-54.

85 Yang, Y. C., Chang, T. Y., Lee, Y. J., Su, T. H., Dang, C. W., Wu, C. C., Liu, H.

F., Chu, C. C., and Lin, M. 2006. HLA-DRB1 alleles and cervical squamous cell

carcinoma: experimental study and meta-analysis. Hum Immunol 67:331-40.

86 Lema, C., Fuessel-Haws, A. L., Lewis, L. R., Rady, P. L., Lee, P., Turbat-

Herrera, E. A., He, Q., Nguyen, L. T., Tyring, S. K., and Dao, D. D. 2006.

Association between HLA-DQB1 and cervical dysplasia in Vietnamese women.

Int J Gynecol Cancer 16:1269-77.

87 Watanabe, Y., Aoyama, N., Sakai, T., Shirasaka, D., Maekawa, S., Kuroda, K.,

Wambura, C., Tamura, T., Nose, Y., and Kasuga, M. 2006. HLA-DQB1 locus

and gastric cancer in Helicobacter pylori infection. J Gastroenterol Hepatol

21:420-4.

88 Fensterle, J., Trefzer, U., Berger, T., Andersen, M. H., Ugurel, S., and Becker, J.

C. 2006. HLA-B8 association with late-stage melanoma--an immunological

lesson? BMC Med 4:5.

89 Dorak, M. T., Yee, L. J., Tang, J., Shao, W., Lobashevsky, E. S., Jacobson, L.

P., and Kaslow, R. A. 2005. HLA-B, -DRB1/3/4/5, and -DQB1 gene

polymorphisms in human immunodeficiency virus-related Kaposi's sarcoma. J

Med Virol 76:302-10.

90 Koskinen, W. J., Partanen, J., Vaheri, A., and Aaltonen, L. M. 2006. HLA-

DRB1, -DQB1 alleles in head and neck carcinoma patients. Tissue Antigens

67:237-40.

91 Chhaya, S. U. 2006. Human leukocyte antigens in Indian patients with chronic

myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 47:291-5.

92 Meijers-Heijboer, H., Wijnen, J., Vasen, H., Wasielewski, M., Wagner, A.,

Hollestelle, A., Elstrodt, F., van den Bos, R., de Snoo, A., Fat, G. T.,

Brekelmans, C., Jagmohan, S., Franken, P., Verkuijlen, P., van den Ouweland,

72

A., Chapman, P., Tops, C., Moslein, G., Burn, J., Lynch, H., Klijn, J., Fodde, R.,

and Schutte, M. 2003. The CHEK2 1100delC mutation identifies families with a

hereditary breast and colorectal cancer phenotype. Am J Hum Genet 72:1308-14.

93 de Jong, M. M., Nolte, I. M., te Meerman, G. J., van der Graaf, W. T., de Vries,

E. G., Sijmons, R. H., Hofstra, R. M., and Kleibeuker, J. H. 2002. Low-

penetrance genes and their involvement in colorectal cancer susceptibility.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11:1332-52.

94 de Jong, M. M., Niens, M., Nolte, I. M., te Meerman, G. J., van der Graaf, W.

T., Mulder, M. J., van der Steege, G., Bruinenberg, M., Schaapveld, M.,

Sijmons, R. H., Hofstra, R. M., de Vries, E. G., and Kleibeuker, J. H. 2005. The

human leukocyte antigen region and colorectal cancer risk. Dis Colon Rectum

48:303-6.

95 Miller, S. A., Dykes, D. D., and Polesky, H. F. 1988. A simple salting out

procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res

16:1215.

96 Day, C. P., Grove, J., Daly, A. K., Stewart, M. W., Avery, P. J., and Walker, M.

1998. Tumour necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism and decreased

insulin resistance. Diabetologia 41:430-4.

97 Ahmad, T., Armuzzi, A., Neville, M., Bunce, M., Ling, K. L., Welsh, K. I.,

Marshall, S. E., and Jewell, D. P. 2003. The contribution of human leucocyte

antigen complex genes to disease phenotype in ulcerative colitis. Tissue

Antigens 62:527-35.

98 Vargas-Alarcon, G., Londono, J. D., Hernandez-Pacheco, G., Gamboa, R.,

Castillo, E., Pacheco-Tena, C., Cardiel, M. H., Granados, J., and Burgos-Vargas,

R. 2002. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with

spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 61:48-51.

99 Schroeder, S., Reck, M., Hoeft, A., and Stuber, F. 1999. Analysis of two human

leukocyte antigen-linked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients

with severe sepsis. Crit Care Med 27:1265-70.

100 Blanchong, C. A., Zhou, B., Rupert, K. L., Chung, E. K., Jones, K. N., Sotos, J.

F., Zipf, W. B., Rennebohm, R. M., and Yung Yu, C. 2000. Deficiencies of

human complement component C4A and C4B and heterozygosity in length

73

variants of RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in caucasians. The load of

RCCX genetic diversity on major histocompatibility complex-associated

disease. J Exp Med 191:2183-96.

101 Seidemann, K., Zimmermann, M., Book, M., Meyer, U., Burkhardt, B., Welte,

K., Reiter, A., and Stanulla, M. 2005. Tumor necrosis factor and lymphotoxin

alfa genetic polymorphisms and outcome in pediatric patients with non-

Hodgkin's lymphoma: results from Berlin-Frankfurt-Munster Trial NHL-BFM

95. J Clin Oncol 23:8414-21.

102 Kiszel, P., Kovacs, M., Szalai, C., Yang, Y., Pozsonyi, E., Blasko, B., Laki, J.,

Prohaszka, Z., Fazakas, A., Panczel, P., Hosszufalusi, N., Rajczy, K., Wu, Y. L.,

Chung, E. K., Zhou, B., Blanchong, C. A., Vatay, A., Yu, C. Y., and Fust, G.

2007. Frequency of carriers of 8.1 ancestral haplotype and its fragments in two

Caucasian populations. Immunol Invest 36:307-19.

103 JiXiong, X., BiLin, X., MingGong, Y., and ShuQin, L. 2003. -429T/C and -

374T/A polymorphisms of RAGE gene promoter are not associated with

diabetic retinopathy in Chinese patients with type 2 diabetes. Diabetes Care

26:2696-7.

104 De Rose, V., Arduino, C., Cappello, N., Piana, R., Salmin, P., Bardessono, M.,

Goia, M., Padoan, R., Bignamini, E., Costantini, D., Pizzamiglio, G., Bennato,

V., Colombo, C., Giunta, A., and Piazza, A. 2005. Fcgamma receptor IIA

genotype and susceptibility to P. aeruginosa infection in patients with cystic

fibrosis. Eur J Hum Genet 13:96-101.

105 Lang, A. B., Horn, M. P., Imboden, M. A., and Zuercher, A. W. 2004.

Prophylaxis and therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis

and immunocompromised patients. Vaccine 22 Suppl 1:S44-8.

106 Candore, G., Modica, M. A., Lio, D., Colonna-Romano, G., Listi, F., Grimaldi,

M. P., Russo, M., Triolo, G., Accardo-Palumbo, A., Cuccia, M. C., and Caruso,

C. 2003. Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral

haplotype: a genetically determined defect of C4 influences immunological

parameters of healthy carriers of the haplotype. Biomed Pharmacother 57:274-7.

74

107 Degli-Esposti, M. A., Leaver, A. L., Christiansen, F. T., Witt, C. S., Abraham,

L. J., and Dawkins, R. L. 1992. Ancestral haplotypes: conserved population

MHC haplotypes. Hum Immunol 34:242-52.

108 Slieker, M. G., Sanders, E. A., Rijkers, G. T., Ruven, H. J., and van der Ent, C.

K. 2005. Disease modifying genes in cystic fibrosis. J Cyst Fibros 4 Suppl 2:7-

13.

109 Lynch, H. T., Albano, W. A., Lynch, J. F., Lynch, P. M., and Campbell, A.

1982. Surveillance and management of patients at high genetic risk for ovarian

carcinoma. Obstet Gynecol 59:589-96.

110 Tung, K. H., Goodman, M. T., Wu, A. H., McDuffie, K., Wilkens, L. R.,

Nomura, A. M., and Kolonel, L. N. 2004. Aggregation of ovarian cancer with

breast, ovarian, colorectal, and prostate cancer in first-degree relatives. Am J

Epidemiol 159:750-8.

111 de Jong, A. E. and Vasen, H. F. 2006. The frequency of a positive family history

for colorectal cancer: a population-based study in the Netherlands. Neth J Med

64:367-70.

112 Hemminki, K. and Chen, B. 2004. Familial risk for colorectal cancers are mainly

due to heritable causes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 13:1253-6.

113 Miretti, M. M., Walsh, E. C., Ke, X., Delgado, M., Griffiths, M., Hunt, S.,

Morrison, J., Whittaker, P., Lander, E. S., Cardon, L. R., Bentley, D. R., Rioux,

J. D., Beck, S., and Deloukas, P. 2005. A high-resolution linkage-disequilibrium

map of the human major histocompatibility complex and first generation of tag

single-nucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet 76:634-46.

114 Daly, M. J., Rioux, J. D., Schaffner, S. F., Hudson, T. J., and Lander, E. S. 2001.

High-resolution haplotype structure in the human genome. Nat Genet 29:229-32.

115 Sims, E. J., McCormick, J., Mehta, G., and Mehta, A. 2005. Neonatal screening

for cystic fibrosis is beneficial even in the context of modern treatment. J

Pediatr 147:S42-6.

116 Bobadilla, J. L., Macek, M., Jr., Fine, J. P., and Farrell, P. M. 2002. Cystic

fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations--correlation with incidence

data and application to screening. Hum Mutat 19:575-606.

75

117 Yan, B., Wang, H., Rabbani, Z. N., Zhao, Y., Li, W., Yuan, Y., Li, F., Dewhirst,

M. W., and Li, C. Y. 2006. Tumor necrosis factor-alpha is a potent endogenous

mutagen that promotes cellular transformation. Cancer Res 66:11565-70.

76

10.1. Saját publikációk jegyzéke –az értekezéshez csatolt közlemények

1. Laki J, Kiszel P, Vatay Á, Kovács M, Körner A, Madácsy L, Blatniczky L,

Almássy Z, Szalai Cs, Rajczy K, Pozsonyi É, Karádi I, Fazakas Á, Hosszúfalusi

N, Pánczél P, Arason G J, Wu YL, Zhou B, Yang Y, Yu CY, Füst G. The HLA

8.1 ancestral haplotype is strongly linked to the C allele of -429T>C promoter

polymorphism of receptor of the advanced glycation endproduct gene. Mol

Immunol. 2007 Jan;44(4):648-55.

2. Laki J, Laki I, Németh K, Újhelyi R, Bede O, Endreffy E, Bolbás K, Gyurkovits

K, Csiszér E, Sólyom E, Dobra G, Halász A, Pozsonyi É, Rajczy K, Prohászka

Z, Fekete G, Füst G. The 8.1 ancestral MHC haplotype is associated with

delayed onset of colonization in cystic fibrosis. Int Immunol. 2006

Nov;18(11):1585-90.

77

10.2. Saját publikációk jegyzéke –az értekezéshez nem csatolt közlemények

3. Varga L, Széplaki G, Laki J, Kocsis A, Kristóf K, Gál P, Bajtay Z, Wieslander J,

Daha MR, Garred P, Madsen HO, Füst G, Farkas H. Depressed activation of the

lectin pathway of complement in hereditary angioedema. Clin Exp Immunol.

2008 Jul;153(1):68-74. Epub 2008 May 5.

4. Jakab L* and Laki J*, Sallai K, Temesszentandrási G, Pozsonyi T Kalabay L,

Varga L, Gombos T, Blaskó B, Bíró A., Madsen HO, Radics, J, Gergely P, Füst

G, Czirják L, Garred P, Fekete B. Association between early onset and organ

manifestations of systemic lupus erythematosus (SLE) and a down regulating

promoter polymorphism in the MBL2 gene. Clinical Immunology 2007 Oct 15.

5. Széplaki G, Varga L, Laki J, Dósa E, Rugonfalvi-Kiss S, Madsen HO,

Prohászka Z, Kocsis A, Gál P, Szabó A, Acsády G, Karádi I, Selmeci L, Garred

P, Füst G, Entz L. Low C1-Inhibitor Levels Predict Early Restenosis After

Eversion Carotid Endarterectomy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Oct 4.

6. Szabó A, Laki J, Madsen HO, Dósa E, Prohászka Z, Rugonfalvi-Kiss S, Kókai

M, Acsádi G, Karádi I, Entz L, Selmeci L, Romics L, Füst G, Garred P,

Cervenak L. Early rise in serum VEGF and PDGF levels predisposes patients

with a normal MBL2 genotype to restenosis after eversion endarterectomy.

Stroke. 2007 Aug;38(8):2247-53.

7. Kiszel P, Kovács M, Szalai C, Yang Y, Pozsonyi E, Blaskó B, Laki J, Prohászka

Z, Fazakas A, Pánczél P, Hosszúfalusi N, Rajczy K, Wu YL, Chung EK, Zhou

B, Blanchong CA, Vatay A, Yu CY, Füst G. Frequency of carriers of 8.1

ancestral haplotype and its fragments in two Caucasian populations. Immunol

Invest. 2007;36(3):307-19.

78

8. Tóth ÉK, Kocsis J, Madaras B, Bíró A, Pocsai Z, Fust G, Blaskó B, Karádi I,

Ádány R, Laki J. The 8.1 ancestral MHC haplotype is strongly associated with

colorectal cancer risk. Int J Cancer. 2007 Jun 26;121(8):1744-1748.

9. Széplaki G, Varga L, Laki J, Dósa E, Madsen HO, Prohászka Z, Szabó A,

Acsády G, Selmeci L, Garred P, Füst G, Entz L. Elevated complement C3 is

associated with early restenosis after eversion carotid endarterectomy. Thromb

Haemost. 2006 Oct;96(4):529-34.

10. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Széplaki Z, Szolnoki Z, Kovács M, Melegh B,

Széplaki G, Füst G, Blaskó B. Decreased frequency of the TNF2 allele of TNF-

α -308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction. Cytokine.

2006 Feb 9.

11. Rugonfalvi-Kiss S, Dosa E, Madsen HO, Endresz V, Prohászka Z, Laki J,

Karádi I, Gonczol E, Selmeci L, Romics L, Fust G, Entz L, Garred P. High rate

of early restenosis after carotid eversion endarterectomy in homozygous carriers

of the normal mannose-binding lectin genotype. Stroke. 2005 May; 36(5):944-8.

79

12. Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Füst György Professzor Úrnak a sok

segítségért, a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinika Kutató

Laboratóriumában dolgozó többi témavezetőnek: Dr. Prohászka Zoltánnak, Dr.

Cervenak Lászlónak, Dr. Varga Liliannak, Dr. Farkas Henriettnek; számos közös

munkában nyújtott segítségért kollégáimnak: Dr. Vatay Ágnesnek, Dr. Bíró Adriennek,

Dr. Széplaki Gábornak, Dr. Blaskó Bernadettnek, Kovács Margitnak, Dr. Kiszel

Petrának, Dr. Szalay Csabának, Dr. Rajczy Katalinnak és Pozsonyi Évának, Dr.

Oroszlán Melindának, Herczenik Eszternek, Dr. Udvarnoki Katalinnak.

A vizsgált betegek gondozóinak klinikánkon, Prof. Karádi István és Prof. Romics

László Professzor Uraknak, Dr. Pánczél Pálnak, Dr. Hosszúfalusi Nórának, Dr. Kocsis

Juditnak, Dr. Tóth Éva Katalinnak, Dr. Fazakas Ádámnak. Köszönöm a Magyar Cisztás

Fibrózis Munkacsoport összes tagjának lelkes és lelkiismeretes segítségét.

Végül, de nem utolsó sorban hálás köszönettel tartozom a kitartó és pótolhatatlan

szakmai és emberi támogatásért családomnak: szüleimnek, Dr. Gál Ilonának és Dr. Laki

Istvánnak és testvéremnek, Dr. Laki Évának.