ปท 44 ฉบบท 197 พฤศจกายน - ธนวาคม 2558

ลกเตาพสดารผลกดนนวตกรรมนำของเดกไทยสเวทนำโลกเมอเกดความสมพนธทดระหวางครและนกเรยน

การสอนเรองพนธศาสตรระดบโมเลกลและพนธวศวกรรมศาสตรการโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย

3

ปท 44 ฉบบท 197 พฤศจกายน - ธนวาคม 2558

สอการสอนเรองพนธศาสตรระดบโมเลกลและพนธวศวกรรมศาสตร การโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย

ปจจบนเทคโนโลยทางดานพนธศาสตรระดบโมเลกลและพนธวศวกรรมศาสตร มความส�าคญต อ การด�าเนนชวตของมนษยเนองจากถกน�ามาใชประโยชนทางดานตาง ๆ เชน การแพทย อตสาหกรรม และเกษตรกรรม นอกจากนการศกษาวจยในระดบหองปฏบตการกมอยางตอเนองและมการพฒนาเทคนคใหม ๆ อยเสมอ ในหนงสอเรยนระดบมธยมศกษาตอนปลายม เนอหาเก ยวกบ พนธวศวกรรมเบองตนเพอสรางสงมชวตดดแปรพนธกรรม (GMOs) เชน การโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย

บทเรยนเรองพนธศาสตรระดบโมเลกลและ พนธวศวกรรมศาสตรเปนเรองทยากตอการจดการเรยน การสอนของครและยากตอการเขาใจของนกเรยนเนองจากเปนเรองทคอนขางซบซอน การขาดวสดอปกรณรวมทงคร ผ สอนไมมประสบการณในการท�าปฏบตการดานนท�าให ในหองเรยนสวนมากจะจดการเรยนการสอนโดยใชวธการบรรยายเพราะไมสามารถท�าปฏบตการดานพนธวศวกรรมในชนเรยนได

ก า รจ ด ท� า ส อ กา ร เร ย นก า รสอน เร อ ง พนธศาสตรระดบโมเลกลและพนธวศวกรรมศาสตรจงเปน สงจ�าเปน ซงบทความนไดน�าเสนอสอส�าหรบท�ากจกรรมโดยจดท�าเปนแบบจ�าลองการโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรยในระดบหองปฏบตการเพอใหนกเรยนทได ท�ากจกรรมมความเขาใจมากขน

ดร.สนดดา โยมญาต ผช�านาญ สาขาวชาวทยาศาสตรมธยมศกษาตอนปลาย สสวท. / e-mail: syomy@ipst.ac.th

สาย DNA

เชอมชน DNA และพลาสมด ไดเปน DNA รคอมบแนนท

การโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย เรมจาก การตดยนหรอ DNA ทตองการศกษาดวยเอนไซมตดจ�าเพาะแลวน�ามาเชอมตอกบ DNA พาหะหรอเวกเตอร (vector) เชน พลาสมด ไดเปน DNA รคอมบแนนท (recombinant DNA) แลวถายโอน DNA รคอมบแนนท ทไดเขาสเซลลเจาบาน (host cell) เชน แบคทเรย เมอเซลลเจาบานมการเพมจ�านวน ยนหรอ DNA นจะเพมจ�านวนตามเซลลเจาบานดวย เซลลเจาบานทม DNA รคอมบแนนท เหมอน ๆ กนเรยกวา โคลน (clone) ดงภาพท 1

ความร พนฐานเรองการโคลนยนโดยอาศยพลาสมด ของแบคทเรย

พลาสมด

ยนทตองการ

เซลล แบคท เรยมการเพม จ�านวน ยนนจะเพมจ�านวนดวย

ถายโอน DNA รคอมบแนนท ทไดเขาสเซลลแบคทเรย

ภาพท 1 การโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย

นตยสาร สสวท.

4 ในปจจบนมการสรางพลาสมดทมส วนของยน ทตานยาปฏชวนะ เชน แอมพซลลน (ampR) เพอ ใชเปนเครองหมายในการคดเลอก (selectable marker) เซลลแบคทเรยทไดรบพลาสมด ซงจะเจรญไดในอาหารเลยง เชอทใสยาปฏชวนะแอมพซลลน อยางไรกตามเซลลแบคทเรยทไดรบพลาสมดทกเซลลจะเจรญไดแมวาพลาสมดทอย ในเซลลนนจะไมมชน DNA ทตองการแทรกอย กตาม จงไมสามารถบอกไดวาโคลนใดมชน DNA หรอยนทตองการ ดงนนในการสรางพลาสมดจงใสยน lacZ ทควบคมการสรางเอนไซม beta-galactosidase เพอใชเปนยนรายงานผล (reporter gene) วาพลาสมดในเซลลแบคทเรยนนมชน DNA ทต องการแทรกอย หรอไม ซงเซลลเจาบานทไดรบ DNA รคอมบแนนทจะมลกษณะทตางไปจากเดม นอกจากนในยน lacZ มต�าแหนงตดจ�าเพาะของเอนไซมตดจ�าเพาะชนดตาง ๆ ทสามารถใสชน DNA ทตองการแทรกเขาไปเพอใหสะดวกในการโคลนยน ดงภาพท 2 และภาพท 3

ภาพท 2 พลาสมดทมเครองหมายในการคดเลอกและ ยนรายงานผล

ภาพท 3 ขนตอนการสราง DNA รคอมบแนนท

ต�าแหนงตดจ�าเพาะ

พลาสมด

ยน lacZ ควบคมการสราง เอนไซม beta-galactosi-dase

ต�าแหนงตดจ�าเฉพาะ

ตดสาย DNA ดวยเอนไซมตดจ�าเพาะชนดเดยว กบทใชตดพลาสมด

ผสมพลาสมดและสาย DNA ทตดดวยเอนไซมตดจ�าเฉพาะแลว

สาย DNA เชอมตอกบพลาสมดดวยเอนไซม DNA ligase

ได DNA รคอมบแนนท

สาย DNA ทมยนทตองการ

สาย DNA ยนทตองการ

ยนตานทานยาปฏชวนะแอมพซลลน

EcoRI KpnI BamHI

XmaISmaI

XbaI

lacZgene

ampR

gene

Origin of replication

BspMI SphI

HindIII

SacI

HincIIAccII PstI

SaI I

lacZ

ampR

5

ปท 44 ฉบบท 197 พฤศจกายน - ธนวาคม 2558

เมอ DNA ทตดดวยเอนไซมตดจ�าเพาะแทรกเขา ไปในพลาสมดไดตรงต�าแหนงทเอนไซมตดจะท�าใหยน lacZ ไมท�างาน ไมสามารถสรางเอนไซม beta-galactosidase ได เมอน�าพลาสมดใสเขาไปในเซลลเจาบานแลวเลยงในอาหารเลยงเชอทใสยาปฏชวนะแอมพซลลน และ IPTG ซงเปนสารเหนยวน�าการสราง beta-galactosidase พรอมกบใสสาร X–gal ซงเปนสารตงตนของเอนไซมน เซลลทไดรบพลาสมดเทานนทเจรญไดและเพมจ�านวนขนจนมองเหนเปนโคโลน และสของโคโลนแบคทเรยจะบอกไดวาแบคทเรยโคลนนนสราง beta-galactosidase ไดหรอไม และเปนตวรายงานผลวาแบคทเรยโคลนนนไดรบ DNA รคอมบแนนทหรอม DNA ทตองการแทรกอยในพลาสมดหรอไม ดงภาพท 4

กอนการท�ากจกรรมครอาจจะเปดสอวดทศนเรอง การโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรย จาก http://www.scimath.org/ebook/sci/sci-sec4/14/eBook/ ซงเปนสอการสอนทอยในหนงสอเรยนอเลกทรอนกส รายวชาเพมเตมชววทยา เลม 4 ระดบมธยมศกษาตอนปลาย เพอให นกเรยนได เรยนร เรองการโคลนยนโดยอาศย พลาสมดของแบคทเรยในหองปฏบตการ

การจดกจกรรมเรองการโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรยวสดอปกรณ ส�าหรบ 1 กลม จ�านวนสมาชก 5 คน1. กระดาษสฟาขนาดกวาง 2.5 cm ยาว 29 cm จ�านวน 10 แผน2. กระดาษสเขยว กวาง 2.5 cm ยาว 20 cm จ�านวน 10 แผน3. กระดาษสขาว สฟา และสแดง ขนาดกวาง 8 cm ยาว 8 cm สละ 5 แผน4. ถงผาหรอถงกระดาษทบ 5 ถง5. ปากกา 5 อน6. เทปใส 2 อน7. กรรไกร 5 อน8. ถาดกระดาษ 6 ถาด

ภาพท 4 ฟโนไทปของแบคทเรยทไดรบและไมไดรบ DNA รคอมบแนนท

ยน lacZ ไมท�างาน และแบคทเรยไมสามารถสรางเอนไซม beta-ga-lactosidase ได

พลาสมดทม DNA แทรกบรเวณยน lacZ ถกใสเขาไปในเซลลแบคทเรย

พลาสมดทไมม DNA แทรกบรเวณยน lacZ ถกใสเขาไปในเซลลแบคทเรย

ยน lacZ ท�างาน และแบคทเรยสามารถสรางเอนไซม beta-galac-tosidase ได

ไมมเอนไซม beta-galactosidase ยอย X-gal ไดท�าใหมองเหน โคโลนของแบคทเรยเปนสขาว

เอนไซม beta-galactosidase ยอย X-gal ไดสารสฟา ท�าใหมองเหนโคโลนของแบคทเรยเปนสฟา

วธการท�ากจกรรม 1. นกเรยนแตละคนเขยนล�าดบเบสและยนทตานทาน ยาปฏชวนะแอมพซลลนลงแถบบนกระดาษสฟาดงภาพ ส�าหรบใชเปนพลาสมด หรอ download ไดจาก http://biology.ipst.ac.th/?p=2828

นตยสาร สสวท.

6 2. เขยนล�าดบเบสและยนลงบนแถบกระดาษสเขยวดงภาพ ส�าหรบใชเปนสาย DNA หรอ download ไดจาก http://biology.ipst.ac.th/?p=2828

3. น�ากระดาษสฟาทเปนพลาสมดแตละชน มวนตดกนเปนวงกลมดวยเทปใส

4. ใชปากกาวาดกรอบลอมรอบล�าดบเบสทเปนต�าแหนงตดจ�าเพาะของเอนไซม BamHI

G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-G

5. จากนนใชกรรไกรตดกระดาษสฟาทจดตดจ�าเพาะ

6. ใชกรรไกรตดกระดาษสเขยวตรงต�าแหนงทตรงกบการตดของเอนไซมตดจ�าเพาะ BamHI เชนเดยวกน

7. จากนนตอแถบกระดาษใหเปนวงดงน - ตอพลาสมดและ DNA ดวยกน

- ตอปลายชนพลาสมดบรเวณทถกตดเขาดวยกน

- ตอปลายชน DNA บรเวณทถกตดเขาดวยกน

หลงจากตอแถบกระดาษแลวจะไดเปน 3 วง และน�ากระดาษทง 3 วง ใสลงในถงทบ

7

ปท 44 ฉบบท 197 พฤศจกายน - ธนวาคม 2558

8. จากนนใหจดกจกรรมเปนกลม โดยมกลมละ 5 คน เตรยมถาดกระดาษซงใชแทนแบคทเรยทเปนเซลล เจาบานกลมละ 6 ถาด วางไวตรงกลางโตะ ใหนกเรยนแตละคนสมหยบชนกระดาษจากถงทบของตนเองขนมา 1 วง แลว ใสลงในถาดกระดาษ 1 ถาด ใหสมาชกในกลมรวมกนพจารณาเลอกถาดกระดาษทไดรบวงกระดาษทมลกษณะแตกตางกน ซงจะม 3 ถาดและ 1 ถาดทไมไดรบวงกระดาษใด ๆ

- ไดรบพลาสมดทตอกบ DNA จะใสกระดาษสขาวลงไปในถาด ซงแสดงวา แบคทเรยนเจรญไดบนอาหารเลยงเชอ และไมสามารถสรางเอนไซม beta-galactosidase เนองจากม DNA แทรกเขาไปในพลาสมดไดบรเวณต�าแหนงยน lacZ บนพลาสมดท�าใหยนนไมท�างาน

9. ใหสมาชกภายในกลมรวมกนพจารณาวาวงกระดาษ ทเปนพลาสมดหรอ DNA ทอยในถาดกระดาษนน ท�าใหลกษณะฟโนไทปของแบคทเรยเปนแบบใด แลวใสกระดาษสเหลยมสขาว ฟา หรอแดงแผนใดแผนหนงซงแทนลกษณะแตละฟโนไทปลงในแตละถาดกระดาษ ดงน- กรณทโคโลนของแบคทเรยบนอาหารเลยงเชอเปนสขาวใหใสกระดาษสขาว - กรณทโคโลนของแบคทเรยบนอาหารเลยงเชอเปนสฟาใหใสกระดาษสฟา- กรณทโคโลนของแบคทเรยไมเจรญบนอาหารเลยงเชอใหใสสแดง 10. สรปและอภปรายผลการท�ากจกรรมเกยวกบลกษณะฟโนไทปของแบคทเรยแตละเซลลวาเจรญเตบโตบนอาหารเลยงเชอทใสยาปฏชวนะแอมพซลลน X-gal และ IPTG ไดหรอไม และถาเจรญไดจะเกดเปนโคโลนสอะไร เพราะเหตใด

จากการท�ากจกรรมทใหผเรยนไดลงมอปฏบตเองและท�าอยางเปนขนตอน จะท�าใหเขาใจเรองการโคลนยนโดยอาศยพลาสมดของแบคทเรยซงมความซบซอนไดงายขน และนอกจากกจกรรมนแลว ผสอนอาจจะใหนกเรยนไปสบคนขอมลเกยวกบการสราง GMOs อน ๆ หรอผลตภณฑจาก GMOs อน ๆ ทนกเรยนสนใจหรอเกยวของกบชวตประจ�าวน เชน อาหารและยา เพอน�ามาเสนอหนาชนเรยนหรอจดท�าปายนเทศเพอเผยแพรความรตอไป

- ไดรบพลาสมดทตอปลายเขาดวยกน จะใสกระดาษสฟาลงไปในถาด ซงแสดงวา แบคทเรยนเจรญไดบนอาหารเลยงเชอ และสามารถสรางเอนไซม beta-galactosidase เนองจากไมม DNA แทรกเขาไปในพลาสมดบรเวณต�าแหนงยน lacZ ท�าใหยนนสามารถท�างานได สรางเอนไซมยอย X-gal ใหไดเปนสฟา - ไดรบชน DNA ทตอปลายเขาดวยกน จะใสกระดาษสแดงลงไปในถาด ซงแสดงวา แบคทเรยนไมสามารถเจรญไดบนอาหารเลยงเชอ เนองจากไมไดรบพลาสมดทมยนตานยาปฏชวนะแอมพซลลน - ไมไดรบพลาสมดหรอ DNA จะใสกระดาษสแดงลงไปในถาด ซงแสดงวา แบคทเรยนไมสามารถเจรญได บนอาหารเลยงเชอ เนองจากไมไดรบพลาสมดทมยนตาน ยาปฏชวนะแอมพซลลน

บรรณานกรมสถาบนสงเสรมการสอนวทยาศาสตรและเทคโนโลย.กระทรวงศกษาธการ. (2554). หนงสอเรยนรายวชาเพมเตมชววทยา เลม 4. กรงเทพมหานคร: โรงพมพองคการคา สกสค. สมาคมพนธศาสตรแหงประเทศไทย. (2548). สาระนารอณพนธศาสตร. กรงเทพมหานคร: เทกซ แอนด เจอรนล พบลเคชน จ�ากด.สรนทร ปยะโชคณากล. (2548). พนธวศวกรรมเบองตน. พมพครงท 3. กรงเทพมหานคร: ส�านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

จากการท�ากจกรรม นกเรยนควรสรปไดวา ถาดกระดาษทเปนตวแทนของแบคทเรยจะมลกษณะตาง ๆ ดงน