repository.usu.ac.id › bitstream › handle › 123456789 › 5800 › 09e... isolasi dan uji...

Jusuf Ginting : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, 2009.

8

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR

TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG

KABUPATEN KARO, SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh

JUSUF GINTING

067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009


8

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE KASAR

TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG


TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

dalam Program Studi Magister Biologi pada Sekolah Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara

Oleh

JUSUF GINTING

067030012/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009


8

Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM

AMILASE KASAR TERMOFILIK DARI SUMBER

AIR PANAS SEMANGAT GUNUNG


Nama Mahasiswa : Jusuf Ginting

Nomor Pokok : 067030012

Program Studi : Biologi

Menyetujui,

Komisi Pembimbing :

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.) Ketua Anggota

Ketua Program Studi Direktur

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M. Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B., M.Sc)


8

Tanggal lulus : 27 September 2008 Telah diuji pada

Tanggal 27 September 2008 PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.

Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.

2. Dr. Herla Rusmarilin, M.S.

3. Dr. Delvian, MP.


8

ABSTRAK

Isolasi bakteri dan uji aktivitas enzim amilase kasar termofilik dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara, dari bulan Pebruari sampai dengan Agustus 2008. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan karakterisasi bakteri termofil yang berpotensi amilolitik serta mengetahui aktivitas enzim amilase. Kemampuan isolat bakteri dalam menghidrolisis pati ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan iodin 0,1%. Tiga isolat yang dipilih menghasilkan zona bening terbesar yaitu SG.3 dengan diameter zona bening 52,56 mm, diikuti SG.2 sebesar 48,75 mm dan SG.1 sebesar 26,15 mm. Konsentrasi glukosa terbesar hasil hidrolisis pati pada penelitian ini adalah 1074,07 μg/ml setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC dan pH 7,0. Suhu dan pH optimum aktivitas enzim amilase pada penelitian ini adalah 60oC dan 5,0-7,0. Kata kunci: Amilase, termofilik, amilolitik, hidrolisis pati.


8

ABSTRACT

A study on bacterial isolation and activity assay of crude amylase of thermophilic bacteria from Desa Semangat Gunung hot spring has been carried out in Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to August 2008. This study was aimed to obtain and to characterize the thermophilic bacteria that had an amylolytic potentional and to know the activity of crude amylase enzyme. The ability of isolates to hydrolize starch was indicated by clearing zone around bacterial colonies after addition of 1% iodine solution. Three isolates with wider clearing zone were chosen for further work. The result showed that SG.3 produced clearing zone with diameter of 52.26 mm, followed by SG.2 (48.75 mm) and SG.1 (26.15 mm). The highest concentration of glucose released was 1074.07 μg/ml after incubated for 48 hours at temperature of 65oC and pH of 7.0. The optimum temperature and pH for the enzyme activity in this study was 60oC and 5.0-7.0 respectively. Key words: Amylase, thermophilic, amylolytic, starch hydrolysis.


8

KATA PENGANTAR

Dengan rendah hati, penulis mengucapkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang

Maha Esa atas anugerah dan berkat-Nya yang telah diberikan, sehingga penulis dapat

menyelesaikan penulisan tesis dengan judul, “Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Enzim

Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten

Karo, Sumatera Utara”. Tesis ini merupakan salah satu persyaratan penyelesaian studi

pada Program Studi Magister Biologi, Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera

Utara. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada:

Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp. A(K) selaku Rektor Universitas

Sumatera Utara.

Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc. selaku Direktur Sekolah Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk

mengikut i Program Studi Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas

Sumatera Utara Medan.

Kepala Bappeda Pemerintah Propinsi Sumatera Utara yang telah memberikan

beasiswa kepada penulis dan Kepala Dinas Pendidikan Kota Medan yang telah

memberikan izin untuk mengikut i Program Studi Magister Biologi di Sekolah

Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Medan.

Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing I dan Prof. Dr. Erman

Munir, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing II yang telah membimbing penulis sehingga

dapat menyelesaikan penelitian dan menyempurnakan tesis ini.


8

Seluruh Staf Pengajar pada Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara, yang telah memberikan ilmunya selama masa

perkuliahan.

Rekan-rekan Mahasiswa Program Studi Magister Biologi Sekolah Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan bantuan moril dan materil serta

dorongan kepada penulis dalam penulisan tesis ini.

Keluarga Besar Ginting di Tanjung Morawa dan Keluarga Besar Pasaribu di

Medan yang tetap mendorong dan mendoakan penulis dalam penyelesaian studi.

Terakhir penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada Istri tercinta

Dra. Roslina Pasaribu yang tidak kenal lelah memberi semangat dan tetap

mendukung dalam doa selama masa studi.

Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak/Ibu/Saudara/i dan

rekan sekalian yang telah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak

langsung. Semoga Tuhan Yang Maha Esa memberkati kita semua.

Medan, 3 Juni 2009

Penulis,

Jusuf Ginting


8

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ...................................................................................................... i ABSTRACT ...................................................................................................... ii KATA PENGANTAR ...................................................................................... iii DAFTAR ISI ................................................................................................... v DAFTAR TABEL ............................................................................................ vii DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix BAB 1 PENDAHULUAN................................................................................ 1 1.1. Latar Belakang............................................................................ 1 1.2. Perumusan Masalah .................................................................... 3 1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4 1.4. Hipotesis ..................................................................................... 5 1.5. Manfaat Penelitian ...................................................................... 5 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 6 2.1. Enzim ......................................................................................... 6 2.2. Enzim Amilase ........................................................................... 7 2.3. Bakteri Termofilik ...................................................................... 9 2.4. Enzim Termostabil...................................................................... 10 2.5. Potensi Enzim α-amilase dalam Industri...................................... 13 BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................................... 15 3.1. Waktu dan Tempat ...................................................................... 15 3.2. Bahan dan Alat ........................................................................... 15 3.3. Sumber Isolat .............................................................................. 15 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas................................................... 16 3.5. Isolasi Bakteri ............................................................................. 16 3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml Untuk Pengujian ........................................................................ 17 3.7. Pengujian Produksi Enzim α-amilase .......................................... 18 3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri .............................................. 18 3.9. Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase ................................ 20 3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............................... 20 3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa ................................................. 21 3.12. Analisis Data .............................................................................. 22 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 23 4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase ............. 23 4.2. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung ...... 25


8

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ................... 27 4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase ....................... 31 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 35 5.1. Kesimpulan................................................................................. 35 5.2. Saran .......................................................................................... 35 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 36


8

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Enzim Termostabil yang Menghidrolisis Pati dan Mikroorganisme Sebagai Sumbernya ............................................................................... 11 2. Reaksi Biokonversi dan Penggunaan Enzim Termostabil ....................... 12 3. Penggunaan α-amilase Dalam Beberapa Sektor Industri ........................ 14 4. Sidik Ragam .......................................................................................... 22 5. Karakter Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase Dari Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo .......... 24 6. Diameter Zona Bening Pada Berbagai Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase Setelah Inkubasi Selama 72 Jam .................... 26 7. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung ........................ 28 8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur

Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung .......................... 32


8

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Pembentukan Zona Bening oleh Isolat Bakteri Termofilik Penghasil Amilase Isolat Semangat Gunung .......................................... 26 2. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung .......................... 30 3. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Amilase Yang Diukur Sebagai Konsentrasi Glukosa Isolat Semangat Gunung .......................... 33


8

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ................................................... 40 2. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase ........................... 41 3. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml .................................... 42 4. Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri ......................... 43 5. Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase ................................ 44 6. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar ......................................... 45 7. Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............... 46 8. Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar .................. 47 9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase .............. 48 10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa ....................................................... 49 11. Sidik Ragam Pengaruh Suhu Terhadap Konsentrasi Glukosa Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung ....................................... 50 12. Sidik Ragam Pengaruh pH Terhadap Konsentrasi Glukosa Hasil Hidrolisis Pati Isolat Semangat Gunung ....................................... 51 13. Gambar Pewarnaan Gram ...................................................................... 52 14. Gambar Uji Biokimia ............................................................................ 52 15. Gambar Sumber Air Panas Desa Semangat Gunung .............................. 53


8

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Penggunaan enzim secara tidak langsung dalam berbagai proses telah dilakukan

sejak awal peradaban manusia. Sekarang ini, hampir 4000 macam enzim telah

diketahui, dan 200 diantaranya digunakan secara komersial. Mayoritas enzim yang

digunakan dalam industri adalah bersumber dari mikroorganisme. Hingga tahun

1960-an, total penjualan enzim hanya beberapa juta dollar per tahun, tetapi mulai saat

itu pasar enzim bertumbuh secara spektakuler (Godfrey and West, 1996).

Enzim adalah protein yang mengkatalis reaksi kimia. Pada reaksi enzimatis,

molekul pada awal proses disebut substrat, dan enzim merubahnya menjadi molekul

yang berbeda. Hampir semua proses dalam sel hidup membutuhkan enzim untuk

mempercepat reaksi. Enzim sangat spesifik terhadap substrat dan dapat menghasilkan

produk utama hampir tanpa produk sampingan. Keunggulan-keunggulan ini

menyebabkan enzim menjadi katalis hayati yang jauh lebih unggul daripada katalis

kimiawi. Prospeknya sebagai biokatalis yang ramah lingkungan karena proses yang

efisien, spesifik, dan tidak menghasilkan limbah yang merepotkan sehingga sangat

dinantikan oleh kalangan industri manufaktur dan masyarakat yang mencintai

lingkungan.


8

Industri pati adalah salah satu pengguna enzim terbesar untuk hidrolisis dan

modifikasi bahan mentahnya. Polimer pati, seperti polimer-polimer lainnya

memerlukan kombinasi enzim-enzim untuk melengkapi hidrolisisnya. Kombinasi ini

meliputi α-amilase, glukoamilase atau β-amilase dan isoamilase atau pullulanase

(Poonam and Dalel, 1995). Dari seluruh konsumsi enzim di dunia, enzim

penghidrolisis pati digunakan sebanyak 30% (Van der Maarel et al., 2002).

Pati didegradasi oleh enzim amilolitik dari sejumlah mikroorganisme (Lin et

al., 1997). Amilase dari tumbuhan, hewan dan mikroorganisme telah dipelajari sejak

pertama sekali enzim ditemukan (Boyer et al., 1972). α-amilase adalah salah satu

enzim yang paling penting dan banyak digunakan dalam bioteknologi sekarang ini.

Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara umum banyak diminati oleh

industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas digunakan di berbagai

bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri makanan dan industri

penyulingan (Pandey et al., 2000).

Amilase merupakan enzim yang menghidrolisis molekul pati untuk

memberikan produk yang bervariasi termasuk dekstrin dan polimer-polimer kecil

yang tersusun dari unit-unit glukosa (Windish and Mhatre, 1965). Enzim-enzim ini

memiliki jumlah yang besar digunakan dalam bioteknologi dalam pembuatan roti,

makanan, tekstil dan industri kertas. α-milase memiliki kira-kira 25% dari seluruh

pasar enzim, hampir menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri pengolahan pati

(Pandey et al., 2000).

1


8

Penggunaan enzim termostabil secara luas telah diterapkan dalam bidang

industri, yaitu: α-amilase dalam industri pati (Poonam and Dalel, 1995), sejumlah

pemakaian yang lain yaitu pada tahapan perkembangan yang bervariasi. Dalam

industri makanan, enzim ini telah digunakan dalam sintesis asam amino (Satosi et al.,

2001). Dalam bidang perminyakan, kimia dan industri pulp dan kertas, enzim

termostabil telah digunakan untuk melenyapkan sulfur yang mengandung polutan

pada biodegradasi senyawa kimia seperti dibenzitiofen (Bahrami et al., 2001), pada

produksi 1,3-propandiol dari gliserol dan pada penggantian reagen kimia pencemar

yang menyebabkan terbentuknya produk yang beracun (Peter et al., 2001).

Enzim termostabil adalah enzim yang stabil dan aktif pada suhu yang lebih

tinggi dari pada suhu optimum untuk pertumbuhan mikroorganisme (Saboto et al.,

1999). Enzim termostabil adalah enzim yang paling diinginkan oleh kebanyakan

industri. Enzim α-amilase termostabil telah digunakan secara luas dalam proses

pembuatan bir, produksi gula, industri tekstil dan dalam industri pembuatan deterjen

(Hewitt and Solomons, 1996). Setiap penggunaan enzim α-amilase memerlukan

kekhususan spesifitas, stabilitas, suhu dan pH. Seleksi mikroorganisme dengan

aktifitas α-amilase yang tinggi dapat memfasilitasi penemuan amilase yang baru yang

sesuai untuk digunakan dalam industri (Gupta et al., 2003). Fermentasi termofilik

juga dianggap sangat baik digunakan dalam bidang teknik dan pemeliharaan

lingkungan (Kristjanson, 1989).

3


8

1.2. Perumusan Masalah

Banyak industri yang dalam proses produksinya memerlukan bantuan enzim.

Pada umumnya enzim yang diperlukan adalah enzim yang tahan terhadap suhu tinggi

karena proses kimia dalam industri banyak yang berlangsung pada suhu tinggi yaitu

di atas 40oC. Oleh karena itu, kebutuhan akan enzim yang bersifat termostabil sangat

tinggi. Salah satu enzim yang berperan sangat penting dalam industri dan

bioteknologi adalah enzim amilase. Dilaporkan bahwa kebutuhan akan enzim amilase

termostabil bagi industri adalah yang terbesar dibandingkan dengan enzim-enzim

lainnya.

Indonesia merupakan salah satu wilayah yang memiliki aktifitas vulkanologi

yang relatif tinggi dan banyak memiliki sumber geotermal sehingga memiliki peluang

yang cukup besar sebagai sumber mikroorganisme penghasil enzim amilase

termostabil. Salah satu sumbernya adalah kolam sumber air panas yang cukup banyak

tersebar di Indonesia termasuk di Sumatera Utara, diantaranya adalah sumber air

panas yang terletak di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo, Sumatera Utara.

Melalui penelitian ini akan diselidiki apakah terdapat bakteri termofilik penghasil

amilase dalam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo,

Sumatera Utara.

1.3. Tujuan Penelitian

4


8

a. Untuk mendapatkan isolat bakteri yang memiliki potensi amilolitik dari

kolam sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka, Karo,

Sumatera Utara.

b. Untuk mengetahui karakter bakteri termofil yang bersifat amilolitik dari

kolam sumber air panas.

c. Untuk mengetahui aktivitas enzim amilase kasar dari isolat bakteri

termofil.

1.4. Hipotesis

a. Terdapat beberapa isolat bakteri termofilik yang mampu menghasilkan

enzim amilase dari sumber air panas di Desa Semangat Gunung, Merdeka,

Karo, Sumatera Utara.

b. Terdapat perbedaan karakter diantara isolat bakteri termofilik penghasil

enzim amilase.

c. Terdapat perbedaan aktivitas enzim amilase kasar dari isolat-isolat bakteri

termofilik tersebut.

1.5. Manfaat Penelitian

a. Sebagai informasi bahwa terdapat bakteri termofilik penghasil enzim

amilase di kolam sumber air panas Desa Semangat Gunung, Merdeka,

Karo, Sumatera Utara.

5


8

b. Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha

eksplorasi enzim amilase yang bersifat termostabil.


8

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Enzim

Enzim adalah suatu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi

sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi)

dalam suatu reaksi kimia. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan

molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi.

Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya

dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan

perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim α-

amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan pati menjadi glukosa (Maton

et al., 1993).

Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu,

keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH optimum

yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan

bentuk jika suhu dan pH berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak

dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini

akan menyebabkan enzim akan kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga

dipengaruhi oleh kofaktor dan inhibitor (Maton et al., 1993).


8

2.2. Enzim Amilase

Amilase adalah nama yang diberikan kepada enzim glikosida hidrolase yang

memecah pati menjadi molekul maltosa. Enzim ini ditemukan terutama pada air liur.

α-amilase bekerja dalam ikatan α-1,4-glikosida. α-amilase adalah enzim yang

pertama ditemukan dan diisolasi. α-amilase dari tumbuhan, hewan dan

mikroorganisme telah dipelajari sejak enzim ditemukan untuk pertama kalinya (Boyer

and Ingle, 1972). α-amilase merupakan salah satu enzim yang sangat penting dalam

bidang bioteknologi sekarang ini. Enzim yang bersumber dari mikroorganisme secara

umum banyak diminati oleh industri. Spektrum pemakaian enzim amilase secara luas

digunakan di berbagai bidang seperti medis, kimia analisis, industri tekstil, industri

makanan dan industri penyulingan (Pandey et al., 2000). Enzim amilase dapat

diklasifikasikan ke dalam 3 (tiga) kelompok, yaitu:

1. Alfa amilase (α-amilase)

α-amilase (EC 3.2.1.1) memiliki nama lain yaitu 1,4-α-D-glukan glukano

hidrolase; glikogenase. Enzim ini menghidrolisis pati, glikogen, dan polisakarida

lainnya melalui pemutusan ikatan α-1,4-glikosida secara acak. Karena

kemampuannya bekerja di bagian manapun dari substrat, α-amilase bekerja lebih

cepat daripada β-amilase. Enzim α-amilase terdapat pada bermacam-macam bakteri,

jamur, tumbuhan, dan hewan dan memiliki peranan yang besar dalam penggunaan

polisakarida. α-amilase merupakan enzim penting dalam industri.

6

7


8

Pada umumnya α-amilase adalah metaloenzim, yang membutuhkan ion kalsium

(Ca2+) untuk aktifitas, integritas struktural dan untuk stabilitasnya (Bordbar and

Omidiyan, 2005). α-amilase dapat dibagi ke dalam 4 kelompok, yaitu endoamilase,

eksoamilase, enzim pemutus cabang dan transferase (Van der Mareel et al, 2002).

Endoamilase memutus ikatan α-1,4, eksoamilase memutus ikatan α-1,4 atau α-1,6

dari residu glukosa eksternal, enzim pemutus cabang menghidrolisis ikatan α-1,6

rantai panjang polisakarida, dan transferase memutus ikatan α-1,4 glikosida molekul

donor dan mentransfer bagian dari donor kepada akseptor glikosida membentuk

ikatan glikosida baru.

2. Beta amilase (β-amilase)

β-amilase (EC 3.2.1.2) memiliki nama lain 1,4-α-D-glukan maltohidrolase;

glikogenase; sakarogen amilase. β-amilase juga disintesis oleh bakteri, jamur, dan

tumbuhan. β-amilase mengkatalis hidrolisis ikatan kedua dari α-1,4 glikosida,

memutuskan dua unit glukosa pada saat yang sama. Selama proses pematangan buah,

β-amilase memecah pati menjadi gula, menghasilkan rasa manis pada buah yang

matang. β-amilase juga ada pada perkecambahan, dimana α-amilase dan protease

memperlihatkan bahwa perkecambahan telah dimulai. Sejumlah mikroorganisme juga

menghasilkan amilase untuk mendegradasi pati ekstraseluler. Jaringan hewan tidak

memiliki β-amilase, kecuali bila mikroorganisme terdapat dalam saluran

pencernaannya. pH optimum β-amilase adalah 12.

3. Gamma amilase ( γ-amilase )


8

γ-amilase (EC 3.2.1.3) memiliki nama lain glukan 1,4-α-glukosidase; 1,4-α-D-

glukan glukohidrolase; exo-1,4-α-glukosidase; glukoamilase; lisosomal α-glukosidase

Pemutusan ikatan akhir α(1-4) glikosida pada ujung non reduksi dari amilose dan

amilopektin, menghasilkan glukosa, γ-amilase juga memutuskan ikatan α(1-6)

glikosida. γ-amilase sangat efisien pada lingkungan yang bersifat asam dan bekerja

pada pH optimum 3.

2.3. Bakteri Termofilik

Organisme termofilik diartikan sebagai organisme yang mampu hidup pada

suhu tinggi. Organisme ini tidak hanya mampu bertahan hidup tetapi bahkan tumbuh

subur dalam air mendidih (Brock, 1985). Bakteri dibagi menjadi beberapa kelas

berdasarkan suhu dimana mereka dapat tumbuh dengan baik. Bakteri dengan suhu

yang rendah adalah psikrofil, yang dapat tumbuh baik hingga suhu -10oC dan suhu

optimum 15oC atau lebih rendah. Mesofil dapat tumbuh pada suhu 20–45oC. Termofil

tumbuh dengan subur pada suhu di atas 45oC, dan beberapa hidup pada suhu atau

bahkan diatas titik didih air. Strain bakteri termofilik telah diidentifikasi dengan

rentang suhu optimum dari 55oC hingga 105oC

Kemampuan bakteri termofilik tumbuh pada suhu tinggi dan menghasilkan

enzim ekstraseluler yang stabil merupakan pertanda adanya kemungkinan

peningkatan produksi dan aktifitas enzim mereka melalui rekayasa genetika. Oleh

9


8

karena itu, mikroorganisme ini merupakan kandidat pertama untuk menghasilkan

enzim yang digunakan dalam industri (Hisotsuyanagi, 1979).

Mikroorganisme, sebagaimana halnya makhluk hidup lainnya, menyesuaikan

diri dengan lingkungan tempat mereka hidup. Organisme termofilik mengandung

protein yang bersifat termostabil dan tahan terhadap denaturasi dan proteolisis

(Kumar et al., 2001). Membran sel termofilik dibentuk oleh asam lemak jenuh. Asam

lemak melengkapi suatu lingkungan hidrofobik untuk sel dan menjaga kekakuan sel

untuk hidup pada suhu yang meningkat (Herbert et al., 1992).

2.4. Enzim Termostabil

Mikroorganisme termofilik dipercaya berpotensi menjadi pilihan yang baik

sebagai sumber enzim termostabil. Bakteri termofilik dapat diisolasi dari lingkungan

alam yang bersuhu tinggi yang tersebar di seluruh dunia dan ditemukan di daerah

yang memiliki gunung berapi aktif (Brock, 1985).

Enzim termostabil memungkinkan terjadinya proses pada suhu tinggi, yang

jelas menguntungkan sebab memiliki reaktifitas yang tinggi, stabilitas yang lebih

tinggi, hasil yang lebih tinggi, viskositas yang rendah dan masalah kontaminasi yang

lebih rendah (Moszhaev, 1993). Enzim termostabil dapat diperoleh dari organisme

mesofilik dan termofilik, bahkan psikrofil memiliki beberapa enzim termostabil

(Adams et al., 1995). Enzim termostabil yang diisolasi dari organisme termofilik

memiliki sejumlah pemakaian secara komersil oleh karena stabilitasnya (Demirijan et

10


8

al., 2001). Keuntungan dari bioproses yang berlangsung pada suhu tinggi adalah

kecepatan difusi yang lebih tinggi, menurunkan viskositas substrat, kecepatan reaksi

lebih tinggi (Milo et al., 1999), meningkatkan kelarutan reaktan, dan mengurangi

risiko terjadinya kontaminasi dengan mikroba patogen (Műtzel et al., 1997).

Polimer pati memerlukan suatu kombinasi enzim untuk melengkapi

hidrolisisnya. Kombinasi enzim ini meliputi γ-amilase, glukoamilase atau β-amilase

dan isoamilase atau pullunase (Poonam and Dalel, 1995). Tabel 1 berikut ini

menunjukkan enzim termostabil yang menghidrolisis pati yang diperoleh dari

mikroorganisme.

Tabel 1. Enzim termostabil yang menghidrolisis pati dan mikroorganisme sebagai sumbernya (Underkofler, 1976)

Enzim Mikroorganisme Suhu optimal ( oC )

pH optimal

α-amilase

β-amilase

Bacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus stearothermophilus Bacillus subtilis Lactobacillus manihotivorans Myceliophtora thermophila Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Staphylothermus marinus Thermococcus aggreganes Thermococcus celer Thermococcus fumicolans Thermococcus hydrothermalis Thermococcus profoundus Bacillus circulans Bacillus cereus var. mycoides Bacillus sp. Clostridium thermosulphurogenes

70 100

70 – 80 70 55

100 100 100 65

100 90 95 85 80 60 50 50 75

7,0 6,0 – 6,5 5,0 – 6,0

7,0 5,5 5,6 5,5

6,5 – 7,5 5,0 5,5 5,5

4,0 – 6,3 4,8 – 7,8 4,0 – 5,0

- -

7,5 5,5

11


8

Pullulanase

Bacillus sp. Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei Thermococus aggregans Thermus caldophilus GK 24 Thermococus celer Thermococcus hydrothermalis Thermococcus litoralis Thermotoga maritima MSB8

60 98

100 100 75 90 95 98 90

- 5,5

5,5 – 6,0 6,5 5,5 5,5 5,5 5,5 6,0

Beberapa konversi biokatalitik enzim termostabil dan penggunaannya dalam

industri dapat dilihat dalam Tabel 2.

Tabel 2. Reaksi biokonversi dan penggunaan enzim termostabil (Haki and Rakshit, 2003)

Enzim Rentang suhu (oC ) Biokonversi Aplikasi

α-amilase ( bakteri ) α-amilase ( jamur ) Pullulanase Xylanase Kitinase Selulase Protease Lipase

90 – 100

50 – 60

50 – 60 45 – 65, 105 65 – 75

45 – 55, 95

65 – 85

30 – 70

Pati → dekstrosa Pati → dekstrosa Pati → dekstrosa Bubur kayu → xylan + lignin Kitin → kitobiose Kitin → N-asetil glukosamin N-asetil glukosamin → glukosamin Kitin → kitosan Selulosa → glukosa Protein → asam amino dan peptida Pelepasan lemak,

Hidrolisis pati, pembuatan bir, pembuatan roti dan deterjen Produks i maltosa Produksi sirup glukosa Industri kertas Industri makanan, kosmetik, farmasi, agro kimia Hidrolisis selulosa, degradasi polimer dalam deterjen Pembuatan roti, pembuatan bir, deterjen, industri kulit Industri susu, deterjen,

12


8

DNA polimerase

90 - 95

hidrolisis, inesterifikasi, alkoholisis, aminolisis DNA amplifikasi

bubur kertas, farmasi, kosmetik dan industri kulit Teknik genetika / PCR

2.5. Potensi Enzim α-amilase Dalam Industri

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaannya paling

besar. Pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total

enzim yang lainnya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti

tumbuhan, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme

banyak digunakan dalam industri. Hal ini dikarenakan mikroorganisme periode

pertumbuhannya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang

berasal dari fungi pada tahun 1894 (Burhan et al, 2003).

Enzim α-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai

macam makanan, minuman dan industri tekstil. α-amilase ekstra seluler dihasilkan

dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus

dan B. licheniformis (Pandey et al, 2000). α-amilase termostabil memiliki nilai

komersial yang luas dalam penggunaannya dalam memproses pati, pembuatan bir dan

produksi gula (Leveque et al, 2000), industri tekstil dan dalam proses pembuatan

deterjen (Hewitt and Solomons, 1996). Sifat termostabil yang dimiliki oleh enzim

13


8

merupakan karakter yang diinginkan oleh banyak industri yang menggunakan enzim

(Morgan and Priest, 1981). Penggunaan enzim α-amilase dalam beberapa sektor

industri ditunjukkan pada Tabel 3 di bawah ini.

Tabel 3. Penggunaan α-amilase dalam beberapa sektor industri (Van der Mareel et al, 2002) Sektor Penggunaan

Industri makanan Produksi sirup glukosa, kristalin glukosa Produksi sirup fruktosa jagung Produksi sirup maltosa Pengurangan viskositas sirup gula Pengurangan pembentukan uap pada jus Pelarutan dan pembentukan gula pati untuk fermentasi alkohol dalam industri bir Penghambat pembusukan pada industri roti Industri deterjen Digunakan sebagai bahan tambahan untuk menghilangkan kotoran dari pati Industri kertas Pengurangan viskositas pati pada kertas Industri tekstil Pencegahan pembesaran pada serat tekstil Industri farmasi Digunakan sebagai bantuan pencernaan

14


8

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan pada bulan Pebruari sampai Agustus 2008 bertempat di

Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah yeast ekstrak, bacto pepton,

MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, KCl, pati, hidrogen peroksida 3%, iodium, kristal

violet, aquadest, gram iodin, alkohol, safranin, reagen dinitrosalicilyc acid (DNS),

sitrat buffer fosfat.

Alat yang digunakan adalah botol sampel steril, termometer, indikator pH

universal, shaker, forteks, water bath, bunsen, pipet ukur, propipet, jarum ose, petri

dish, tabung reaksi, autoklaf, inkubator, gelas objek, erlenmeyer, hot plate, magnetic

stirer, oven, test tube, mikroskop, kamera foto, spectrofotometer, sentrifuge, jangka

sorong.

3.3. Sumber Isolat


8

Sumber isolat dalam penelitian ini adalah air dari sumber air panas Desa

Semangat Gunung, Kabupaten Karo, Sumatera Utara.

3.4. Pengambilan Sampel Air Panas

Sampel air panas diambil dari sumber air panas Desa Semangat Gunung,

Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara, dari 3 tempat yang berbeda. Sebelum

sampel air diambil, terlebih dahulu dilakukan pengukuran parameter fisik dan kimia

di lapangan. Parameter pertama yang diukur adalah suhu air di tiap titik pengambilan

sampel dengan menggunakan termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam

tiap sumber pengambilan sampel. Parameter ke dua adalah pH air pada setiap titik

pengambilan sampel yang diukur dengan indikator pH universal dengan cara

dicelupkan ke permukaan air, lalu warna yang diperoleh dicocokkan dengan tabel pH

yang tertera pada kotak pH universal. Sampel air diambil dari kolam sumber air panas

dengan kedalaman 40 cm dari permukaan air sebanyak 200 ml dari setiap titik

pengambilan, kemudian dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label dan

selanjutnya dimasukkan ke dalam termos agar suhu air dapat dipertahankan. Sampel

air kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA,

Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.

3.5. Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan media padat yang mengandung

pati 10 g, yeast ekstrak 2 g, bacto pepton 5 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, NaCl 0,5 g,

15

16


8

CaCl2.2H2O 0,15 g, agar 20 g yang dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH diatur

sampai pH 7). Larutan dipanaskan dan disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit

pada suhu 121oC, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak 15 ml.

Sampel diambil sebanyak 0,1 ml dan disebarkan di atas lempeng agar dengan

menggunakan hockey stick untuk menumbuhkan bakteri. Hal ini dilakukan sebanyak

dua kali ulangan untuk setiap sampel yang berbeda. Isolat diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 60oC. Setiap koloni yang berbeda dimurnikan kembali pada medium segar

dengan metode cawan gores. Isolat murni bakteri yang diperoleh kemudian

dikarakterisasi melalui pengamatan morfologi koloni yang meliputi bentuk koloni,

tepi koloni, elevasi koloni, warna koloni, uji bakteri gram positif dan negatif, dan

sejumlah uji biokimia yang meliputi uji katalase, uji hidrolisis pati, uji hidrolisis

gelatin, uji sitrat, uji TSIA dan uji motilitas. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 1

dan 2.

3.6. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 CFU/ml Untuk Pengujian

Bakteri yang digunakan dalam pengujian dibuat dalam bentuk suspensi. Dengan

menggunakan jarum ose diambil 1-2 ose biakan bakteri lalu dimasukkan ke dalam

tabung reaksi steril yang telah berisi larutan NaCl fisiologis 0,85%. Campuran

kemudian dihomogenkan dengan vortex, kekeruhan campuran dibandingkan dengan

kekeruhan McFarland 0,5 standard yang setara dengan 108 CFU/ml. Alur kerja dapat

dilihat pada Lampiran 3.

17


8

Bahan untuk pembuatan larutan McFarland adalah BaCl2 (1,175% 10/v BaCl2)

dan H2SO4 (1% v/v). 0,05 ml dari 0,048 M BaCl2 ditambahkan pada 99,5 ml 0,35 N

H2SO4.

3.7. Pengujian Produksi Enzim Amilase

Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri yang berisi

media produksi amilase, lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 65oC. Tiap koloni

yang tumbuh pada media pati tersebut ditetesi dengan reagen iodium untuk

menyeleksi bakteri penghasil enzim amilase. Isolat yang menghasilkan enzim amilase

ditunjukkan oleh adanya zona bening di sekitar koloni bakteri. Diameter zona bening

diukur dengan menggunakan jangka sorong. Tiap isolat yang positif menghasilkan

enzim amilase melalui uji iodin ini digunakan untuk pengujian selanjutnya. Alur kerja

dapat dilihat pada Lampiran 4.

3.8. Uji Biokimia Metabolisme Bakteri

3.8.1. Uji Katalase

Sebanyak 2 tetes hidrogen peroksida diteteskan pada kaca objek, kemudian satu

ose isolat bakteri termofil amilase diletakkan di atasnya. Uji katalase positif ditandai

dengan dihasilkannya gelembung udara. Adanya gelembung udara menunjukkan

banyaknya gas oksigen yang dihasilkan (Lay, 1994).

3.8.2. Uji hidrolisis pati

18


8

Satu ose isolat bakteri dari suspensi biakan diambil lalu digoreskan pada media

pati dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC. Permukaan koloni ditetesi dengan

iodin. Uji positif ditunjukkan dengan adanya zona bening disekeliling koloni (Lay,

1994).

3.8.3. Uji hidrolisis gelatin

Satu ose inokulum ditusukkan ke bagian tengah media gelatin semi padat lalu

diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65oC dan didinginkan dalam lemari pendingin

selama 15 menit. Uji positif bila terdapat cairan pada permukaan media (Lay, 1994).

3.8.4. Uji Sitrat

Satu ose isolat bakteri digoreskan ke dalam tabung yang berisi media miring

Simone Citrat Agar (SCA) dan dengan ose lurus isolat bakteri ditusukkan di bagian

tengah media sampai ke dasar tabung reaksi, lalu diinkubasikan selama 48 jam pada

suhu 65oC. Uji positif ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi

biru (Lay, 1994).

3.8.5. Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Satu ose isolat bakteri digoreskan pada media miring TSIA, kemudian bagian

tengah media ditusuk dengan lurus. Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC. Uji

positif ditandai dengan keretakan atau naiknya media dan adanya endapan hitam

(Lay, 1994).

3.8.6. Uji Motilitas

19


8

Satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada media Sulfit Indol Motility (SIM)

dengan cara menusukkannya hingga setengah media pada tabung reaksi lalu

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC. Uji positif ditunjukkan dengan adanya

jejak pergerakan bakteri (Lay, 1994).

3.9. Pembuatan Media Produksi Enzim Amilase

Bahan untuk membuat media produksi enzim amilase terdiri dari (per liter

larutan) 2% pepton, 0,03% K2HPO4, 0,1% MgSO4.7H2O dan 0,5% pati. Semua

bahan dicampur lalu sebanyak 40 ml dipindahkan ke dalam tabung erlenmeyer 100

ml dan disterilisasi di dalam autoklaf. Satu ose isolat bakteri yang dipilih

dicampurkan dengan media produksi amilase yang telah steril kemudian digoyang

dalam shaker water bath selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 65oC.

Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 5.

3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar

Kultur bakteri penghasil enzim amilase yang berumur 72 jam disentrifugasi

dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil.

Satu ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1

ml larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat, kemudian diinkubasi dalam water bath

selama 20 menit untuk setiap perlakuan suhu (40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC, 80oC).

Variasi suhu yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan pendapat Brock

20


8

(1985) yang mengemukakan bahwa kecepatan tumbuh maksimal dari beberapa

bakteri termofilik berkisar pada suhu 55oC-70oC. Satu unit aktivitas enzim amilase

didefenisikan sebagai banyaknya pati yang terhidrolisis menjadi glukosa selama masa

inkubasi 20 menit. Setelah dikeluarkan dari water bath, ditambahkan 2 ml

dinitrosalicilyc acid (DNS) untuk menghentikan reaksi. Campuran didinginkan pada

air mengalir selama 15 menit. Selanjutnya absorbansi diuji dengan menggunakan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan

dengan kurva standard glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat dengan

konsentrasi mulai 0,01–0,20 ppm (Kombong, 2004). Alur kerja dapat dilihat pada

lampiran 6. Pekerjaan yang sama dilakukan pada perlakuan pH dengan cara

mengukur aktivitas enzim dengan menggunakan pH yang bervariasi yaitu 4,0, 5,0,

6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada suhu 65oC. Buffer yang digunakan untuk penentuan pH

optimum adalah buffer sitrat fosfat 0,05 M. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 7.

Aktivitas enzim amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif

sebagai mg glukosa yang dihasilkan per ml filtrat enzim dengan menggunakan rumus:

Dimana :

AE = Aktivitas Enzim (unit/ml filtrat enzim)

MG = Miligram Glukosa

BMg = Berat Molekul glukosa

MIxBMg1000xMGAE =

21


8

MI = Masa Inkubasi

3.11. Pembuatan Kurva Baku Glukosa

Bahan yang digunakan adalah glukosa monohidrat (C6H12O6. H2O) 1000 μg/ml

(1000 ppm), diencerkan pada berbagai konsentrasi yaitu 80, 100, 120, 140, 160, 180,

200, 220, 240, dan 260 μg/ml (10 variasi konsentrasi). Sebanyak 1 ml dari tiap

konsentrasi glukosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1,5 ml

reagen DNS, dipanaskan selama 5 menit lalu didinginkan dengan air mengalir selama

15 menit, kemudian ditambahkan 20 ml aquadest steril dan diukur absorbansinya

pada panjang gelombang 540 nm. Alur kerja dapat dilihat pada Lampiran 10.

3.12. Analisis Data

Hasil pengamatan morfologi dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil

berupa data kuantitatif dianalisis varian, bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat

nyata dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (Sujana, 1989). Rancangan

yang dilakukan adalah rancangan acak lengkap non faktorial karena media dan

kondisi lingkungan serta perlakuan terhadap amilase kasar dikondisikan sama kecuali

perlakuan suhu dan pH untuk mengukur aktivitas enzim. Perlakuan suhu dan pH

dilakukan dengan 3 kali ulangan. Dalam penelitian ini diukur konsentrasi amilase

kasar (μg/ml) pada berbagai kondisi suhu dan pH. Data hasil penelitian dihitung

dalam struktur Tabel sidik ragam yang disajikan sebagai berikut.

Tabel 4. Sidik Ragam

Sumber keragaman

Derajat bebas Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah Fhitung

Ftabel 0,05 0,01

22


8

Perlakuan

p-1

Σ(Σ Yij)2/n.FK

JKperl/dbperl

KTP/KTG

Tabel F

Tabel F

Galat

p(n-1) JKt-JKp JKG/dbG α(0,05) α(0,01)

Total p(n-1) JKtotal

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai Fhitung > Ftabel maka hipotesis nol

ditolak, yang berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata

terhadap konsentrasi glukosa (μg/ml). Dengan demikian dilakukan uji Duncan

Multiple Range Test (DMRT) untuk melihat jarak antar perlakuan suhu dan pH.

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi, Seleksi dan Karakter Bakteri Penghasil Amilase

Dari hasil isolasi yang telah dilakukan, diperoleh 8 isolat bakteri penghasil

enzim amilase yang berbeda berdasarkan pengamatan warna, bentuk, tepi dan elevasi

koloni, bentuk dan penataan sel, serta sejumlah uji biokimia sederhana yang meliputi

uji motilitas dengan menggunakan media SIM, uji sitrat dengan menggunakan media

SCA, uji TSIA, uji hidrolisis gelatin dengan menggunakan media gelatin dan uji

katalase dengan menggunakan H2O2 3% serta pewarnaan gram dengan menggunakan

mikroskop cahaya. Hasil dari pengujian ini digunakan untuk pencirian dan

identifikasi mikroorganisme.

Dari 8 isolat tersebut, diperoleh 3 isolat bakteri penghidrolisis pati terbaik yang

ditentukan berdasarkan besarnya zona bening di sekitar koloni bakteri tersebut. Tiga


8

isolat tersebut adalah SG.1, SG.2, dan SG.3. SG.1 diperoleh dari kolam I dengan suhu

air 55oC dan pH 7. SG.2 diperoleh dari kolam II dengan suhu air 59oC dan pH 6.

SG.3 diperoleh dari kolam III dengan suhu air 62oC dan pH 6. Hasil pengamatan

morfologi, uji biokimia sederhana dan pewarnaan gram dari masing-masing koloni

isolat bakteri penghasil enzim amilase dapat dilihat pada Tabel 5 berikut ini.

Tabel 5. Karakter isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase dari sumber air panas Desa Semangat Gunung, Kabupaten Karo

Isolat Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk Uji Biokimia Pewarnaan Koloni Koloni Koloni Koloni Sel M S T G K Gram

SG.1 SG.2 SG.3

bulat

tidak

beraturan tidak

beraturan

rata

rata

berlekuk

timbul

rata

timbul

krem

krem

krem

batang

batang

batang

+ + +

- + +

- + +

+ + +

+ + +

- -

+

Keterangan : M = Motilitas G = Gelatin S = Sitrat K = Katalase T = TSIA Dari bentuk koloni, ke-3 isolat memiliki bentuk, tepi dan elevasi koloni yang

bervariasi, sedang warna koloni umumnya krem dan bentuk sel batang. Pewarnaan

Gram menunjukkan 2 isolat yaitu SG.1 dan SG.2 bersifat Gram negatif, sedang isolat

SG.3 bersifat Gram positif. Uji motilitas terhadap ketiga isolat menunjukkan bahwa

23

24


8

ketiganya bersifat motil ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri di dalam

media. Hasil uji sitrat menunjukkan bahwa SG.1 tidak mampu menggunakan sitrat

sebagai sumber karbon, sedangkan SG.2 dan SG.3 mampu menggunakan sitrat

sebagai sumber karbon. Keadaan positif pada uji sitrat ditandai dengan berubahnya

medium dari hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan

pH dalam media (Cappuccino and Sherman, 1983). Dari uji TSIA diperoleh bahwa

SG.1 tidak mampu memfermentasikan glukosa dan laktosa atau sukrosa. Keadaan

positif pada uji TSIA ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan hitam

pada media. TSIA digunakan terutama untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif.

Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, serta

indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang

ditunjukkan dengan adanya endapan hitam (Lay, 1994). Dari uji hidrolisis gelatin

diperoleh bahwa SG.1, SG.2 dan SG.3 mampu menghidrolisis gelatin. Uji positif

gelatin ditandai dengan medium gelatin yang tetap cair setelah dimasukkan ke dalam

lemari pendingin selama 30 menit (Cappuccino and Sherman, 1983). Hasil uji

katalase menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki enzim katalase yang ditandai

dengan terbentuknya gelembung udara di sekitar koloni ketika ditambahkan dengan

larutan 3% H2O2. Katalase adalah enzim yang mengkatalis penguraian hidrogen

peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Hidrogen peroksida bersifat

toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen


8

peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang

tumbuh dalam lingkaran aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994).

4.2. Aktivitas Enzim Amilase Isolat Termofil Semangat Gunung

Isolat bakteri termofilik yang mengindikasikan penghasil enzim amilase

dilihat aktivitasnya dengan mengukur diameter zona bening di sekitar isolat bakteri

termofilik. Zona bening yang terbentuk di sekitar isolat bakteri termofilik

menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut mampu menghidrolisis pati (Dirnawan et

al., 2000). Diameter zona bening terbentuk setelah isolat bakteri diinkubasi selama 72

jam pada suhu 65oC.

Besar kecilnya diameter zona bening yang terbentuk dari masing-masing isolat

berbeda-beda. Hal ini disebabkan kemampuan menghidrolisis pati dari setiap isolat

juga berbeda-beda. Diameter zona bening bakteri termofilik penghasil enzim amilase

dari masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 6 dan pembentukan zona bening

oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase pada isolat Semangat Gunung dapat

dilihat pada Gambar 1.

Tabel 6. Diameter zona bening pada berbagai isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase setelah inkubasi selama 72 jam

Isolat Diameter Zona Bening (mm) SG.1 SG.2 SG.3

26,15 48,75 52,56

25

26


8

Gambar 1. Pembentukan zona bening oleh isolat bakteri termofilik penghasil amilase isolat Semangat Gunung


8

Pada Tabel 6 dan Gambar 1 dapat dilihat bahwa zona bening terbesar dihasilkan

oleh isolat SG.3 (52,56 mm) diikuti oleh SG.2 (48,75 mm) dan SG.1 (26,15 mm).

Hasil ini menunjukkan bahwa isolat SG.3 merupakan penghasil enzim amilase

dengan kriteria memiliki potensi tinggi, diikuti oleh isolat SG.2 dengan kriteria

memiliki potensi sedang dan isolat SG.1 dengan kriteria memiliki potensi rendah.

Pereira et al. (1999) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim

amilase dengan aktivitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi tinggi

dengan diameter zona bening > 30 mm, sedang kriteria yang memiliki potensi sedang

adalah diameter zona bening 20-30 mm dan kriteria memiliki potensi rendah adalah

diameter zona bening < 20 mm. Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri

termofilik penghasil enzim amilase dengan aktivitas hidrolitik termasuk kriteria

memiliki potensi tinggi dengan diameter zona bening > 26 mm, sedang kriteria yang

memiliki potensi sedang adalah diameter zona bening 14-26 mm dan kriteria yang

memiliki potensi rendah adalah diameter zona bening < 14 mm.

4.3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase

Aktivitas amilolitik supernatan dalam menghidrolisis pati diuji pada rentang

suhu 40–80oC pada pH konstan 7,0 ditunjukkan pada Tabel 7 berikut ini.

27


8

Tabel 7. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Isolat Suhu (oC) Konsentrasi glukosa (µg/ml)

Aktivitas enzim (U/ml) Notasi 5%

SG.1

40 50 60 65 70 80

141,08 319,68 463,74 422,58 411,38 341,40

0,04 0,09 0,13 0,12 0,11 0,09

c bc a ab abc abc

SG.2

40 50 60 65 70 80

772,00 908,97 969,11 856,15 715,28 626,79

0,21 0,25 0,27 0,24 0,20 0,17

c ab a ab cd d

SG.3

40 50 60 65 70 80

362,67 532,57 1074,07 876,73 597,74 489,81

0,10 0,15 0,30 0,24 0,17 0,14

e abcd

a ab abc

abcd Keterangan: angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak berbeda nyata pada taraf 5%

Pada Tabel 7 di atas dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase isolat SG.1

pada suhu 40oC menunjukkan hasil berbeda nyata pada taraf 5% dibanding dengan

perlakuan pada suhu 60oC dan 65oC. Perlakuan pada suhu 50oC berbeda nyata dengan

perlakuan pada suhu 60oC. Perlakuan pada suhu 50oC, 65oC, 70oC dan 80oC tidak

berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan suhu 40oC berbeda nyata dengan

suhu 60oC dan 80oC pada taraf 5%. Perlakuan suhu 50oC dan 65oC tidak berbeda

nyata pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan suhu 40oC dan 60oC berbeda nyata pada

taraf 5%, sedang suhu 50oC, 70oC dan 80oC tidak berbeda nyata pada taraf 5%.

28


8

Dari hasil pengujian diperoleh nilai konsentrasi glukosa tertinggi hasil hidrolisis

pati oleh isolat SG.1 terdapat pada suhu inkubasi 60oC yaitu sebesar 463,74 μg/ml

dan aktivitas enzim 0,13 U/ml, isolat SG.2 pada suhu 60oC sebesar 969,11 μg/ml dan

aktivitas enzim 0,27 U/ml, dan isolat SG.3 pada suhu 60oC sebesar 1074,07 μg/ml

dan aktivitas enzim 0,30 U/ml. Pada Tabel 7 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim

meningkat pada rentang suhu 50oC-70oC. Aktivitas enzim berkurang pada suhu diatas

70oC. Bacillus subtilis dilaporkan memiliki suhu optimum aktivitas enzim α-amilase

70oC (Burhan et al, 2003). Strain Bacillus stearothermophillus yang diisolasi dari

sampel industri pemrosesan kentang memiliki suhu optimum aktivitas enzim α-

amilase 70oC dengan pH optimum 5,5-6,0 (Wind et al, 1994). α-amilase dari genus

Bacillus stabil pada suhu tinggi dan memiliki potensi yang diharapkan dalam industri

yang menggunakan pati sebagai bahan baku. Untuk lebih jelasnya, berikut ini adalah

grafik pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat

Semangat Gunung (Gambar 2).

29


8

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Dari Tabel 7 dan Gambar 2 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim dalam

menghidrolisis pati meningkat mulai dari suhu 50oC sampai 60oC. Suhu optimum

aktivitas enzim amilase pada penelitian ini adalah 60oC. Hasil ini sesuai dengan yang

ditunjukkan oleh isolat SG.3 yang memiliki aktifitas enzim tertinggi yang diisolasi

dari sumber air panas dengan suhu 62oC. Sohail et al. (2005) melaporkan bahwa

Bacillus sp. memiliki suhu optimum aktivitas enzim α-amilase 60oC. Anto et al.

(2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus MTCC 1305 memiliki suhu optimum

0

200

400

600

800

1000

1200

40 50 60 65 70 80 Suhu (oC)

SG.2 SG.3 SG.1

Kon

sent

rasi

glu

kosa

(μg/

ml)

30


8

aktivitas enzim α-amilase 55oC. Enzim α-amilase dari genus Bacillus stabil pada suhu

tinggi dan sangat diminati oleh industri yang menggunakan larutan pati. Menurut

Burhan et al. (2003), pengaruh suhu terhadap aktivitas produksi amilase berhubungan

dengan pertumbuhan organisme. Rentang suhu yang besar (35-80oC) merupakan suhu

optimum untuk pertumbuhan dan produksi enzim α-amilase pada bakteri. Pengaruh

suhu terhadap aktivitas enzim secara umum ditunjukkan melalui mekanisme

kompleks yang melibatkan fenomena berlawanan dari stimulasi dan inaktifasi.

Aktivitas mula-mula meningkat dengan makin tingginya suhu, namun pada suatu titik

tertentu terjadi inaktifasi enzim yang ditandai dengan menurunnya aktivitas enzim.

Pengaruh suhu sesungguhnya agak kompleks, yaitu suhu yang terlalu tinggi akan

mempercepat pemecahan atau perusakan enzim, sebalikya semakin tinggi suhu

semakin aktif pula enzim tersebut.

4.4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase

Aktivitas amilolitik supernatan pada pH yang berbeda diuji pada rentang pH

4,0–9,0 pada suhu inkubasi 65oC. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim disebabkan

oleh terjadinya perubahan tingkat ionisasi pada enzim atau substrat sebagai akibat

dari perubahan pH. Analisis data pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil

hidrolisis pati isolat Semangat Gunung dapat dilihat pada Tabel 8. pH optimum pada

SG.1 adalah 7,0 dengan konsentrasi glukosa 345,29 μg/ml dan aktivitas enzim 0,10

U/ml. pH optimum SG.2 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa 798,75 μg/ml dan

31


8

aktivitas enzim 0,22 U/ml. pH optimum SG.3 adalah 5,0 dengan konsentrasi glukosa

822,99 μg/ml dan aktivitas enzim 0,23 U/ml.

Tabel 8. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

Isolat pH Konsentrasi glukosa (µg/ml)

Aktivitas enzim (U/ml) Notasi 5%

SG.1

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

225,92 264,57 268,68 345,29 265,71 241,01

0,06 0,07 0,07 0,10 0,07 0,07

bcd abc ab a

abc bcd

SG.2

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

318,99 798,75 644,85 610,78 496,67 364,50

0,09 0,22 0,18 0,17 0,14 0,10

d a b b c d

SG.3

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

786,63 822,99 610,09 576,25 568,02 534,17

0,22 0,23 0,17 0,16 0,16 0,15

ab a c

cd cde cde

Keterangan : angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada masing-masing isolat, tidak berbeda nyata pada taraf 5%

Dari Tabel 8 dapat dilihat bahwa pada SG.1 perlakuan pada pH 7,0 berbeda

nyata dengan pH 4,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0, 6,0, 7,0 dan 8,0

tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Pada SG.2 perlakuan pada pH 4,0 tidak berbeda

nyata dengan perlakuan pH 9,0 dan perlakuan pH 6,0 tidak berbeda nyata dengan

perlakuan pH 7,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 5,0 berbeda nyata dengan pH

4,0, 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Pada SG.3 perlakuan pH 5,0 berbeda nyata

32


8

dengan pH 6,0, 7,0, 8,0 dan 9,0 pada taraf 5%. Perlakuan pada pH 7,0, 8,0, dan 9,0

tidak berbeda nyata pada taraf 5%.

Pada umumnya enzim hanya aktif pada kisaran pH yang terbatas. Nilai pH

optimum suatu enzim ditandai dengan menurunnya aktivitas pada kedua sisi lainnya

dari grafik yang disebabkan oleh turunnya afinitas atau stabilitas enzim. Grafik

pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati pada isolat Semangat

Gunung dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.

Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase yang diukur sebagai konsentrasi glukosa isolat Semangat Gunung

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 pH

SG.3

Kon

sent

rasi

glu

kosa

(μg/

ml)

SG.1 SG.2

33


8

Dari Tabel 8 dan Gambar 3 dapat dilihat bahwa aktivitas enzim amilase pada

isolat SG.1 meningkat mulai dari pH 5,0-7,0 dengan pH optimum 7,0. Penurunan

aktivitas enzim terjadi pada pH di atas 7,0. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas

enzim amilase dan pertumbuhan bakteri isolat SG.1 paling baik terjadi pada

lingkungan dengan pH netral. Pada isolat SG.2, aktivitas optimum enzim amilase ada

pada pH 5,0. Pada isolat SG.3, aktivitas enzim amilase meningkat pada pH optimum

5,0. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas dan pertumbuhan bakteri isolat SG.2 dan

SG.3 paling baik terjadi pada lingkungan asam. Penurunan aktivitas enzim amilase

terjadi pada pH di atas 5,0. Anto et al. (2006) melaporkan bahwa Bacillus cereus

MTCC 1305 memiliki pH optimum aktivitas enzim α-amilase 5,0.

34


8

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi bakteri dan uji

aktivitas enzim amilase kasar termofilik, dapat disimpulkan sebagai berikut :

a. Sebanyak 3 isolat bakteri termofilik penghasil enzim amilase kasar yang

memiliki zona bening terbesar telah diisolasi dan diseleksi dari 8 isolat

dengan karakteristik morfologi koloni dan sifat biokimia yang berbeda.

b. Suhu optimum aktivitas enzim amilase ketiga isolat adalah 60oC yang

ditunjukkan oleh besarnya konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati.

c. Isolat SG.3 memiliki aktivitas enzim amilase tertinggi pada suhu dan pH

optimum 60oC dan 5,0.

d. Aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,30 unit/ml diperoleh dari isolat SG.3.

5.2. Saran

Enzim yang dihasilkan pada penelitian ini masih berupa enzim kasar dan belum

optimal. Disarankan untuk diadakan penelitian lebih lanjut untuk mempelajari

mekanisme dan faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim dari bakteri

termofilik isolat Semangat Gunung.


8

DAFTAR PUSTAKA Adams, M.W.W. and Kelly, R.M. 1998. Finding and using thermophilic enzymes.

Trends in Biotechnology 16: 329-332. Anto, H., Trivedi, U. and Patel, K. 2006. Alpha amylase production by Bacillus

cereus MTCC 1305 using solid-state fermentation. Food Technol. Biotechnol. 44 : 241-245.

Bahrami, A., Shojaosadati, and S., Mahbeli, G. 2001. Biodegradation of

dibenzothiophene by thermophilic bacteria. Biotechnol. Lett. 23: 899-901. Bordbar, K., and Omidiyan, R. H. 2005. Study on interaction of α-amilase from

Bacillus subtilis with cetyl trimethylammonium bromide, Colloids Surf. B. Biointerfaces 40: 67-71.

Boyer, E.W., and Ingle, M. 1972. Extracellular alkaline amylase from a Bacillus

species. J. Bacteriol 110: 992-1000. Brock, T.D. 1985. Life at high temperatures. Science 230: 132-138. Burhan, A., Nisa, U., Gokhan, C., Omer, C., Ashabil, A., and Osman, G. 2003.

Enzymatic properties of a nover thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkalophilic Bacillus sp. isolate ANT-6. Process Biochemistry 38: 1397-1403.

Cappuccino, J.G and Sherman, N. 1983. Microbiology a laboratory manual. 2nd ed.

New York: The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. Demirijian, D.C., Morris-Varas, F., and Cassidy, C.S. 2001. Enzyme from

extremophiles. Curr. Opln. Chem. Biol. 5: 144-151. Dirnawan, H., Suwanto, A., and Purwanaria, T. 2000. Eksplorasi bakteri termofil

penghasil enzim hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas Gunung Pancar. Hayati 7: 52-55.

35


8

Godfrey, T. and West, S. 1996. Industrial enzymology. London, UK: Macmillan Press.

Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V. K., and Chauhan, B. 2003.

Microbial α-amylase: a biotechnological perspective. Process Biochemistry 38: 1599-1616.

Haki, G.D. and Rakshit, S.K. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology 89: 17-34.

Herbert, R. and Sharp, R. 1992. Molecular Biology and Biotechnology of

Extremophiles. Chapman and Hall, New York. Hewitt, J.C., and Solomons, G.L. 1996. The production of α-amylase (E.C.3.2.1.1.)

by Bacillus amyloliquefaciens, in a complex and a totally defined syntetic culture medium. Journal of Industrial Microbiology 17: 96-99.

Hisotsuyanagi, K. 1979. Stepwise introduction of regulatory genes stimulating

production of α-amylase into Bacillus subtilis: Constructions of α-amylase extrahyper producing strain. Agric. Biol. Chem. 43:2343-2349.

Igarashi, K., Hatada, Y., Hagihara, K., Saeki K., Takaiwa, M., and Kobayashi, T.

1998. Enzymatic properties of a novel liquefying α-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3282-3289.

Kombong, H. 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur

Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar 5: 16-20. Kristjansson, J.K.1989. Thermophilic organisms as sources of thermostable enzymes.

Trends in Biotechnology 7: 349-353. Kumar, H.D. and Swati, S. 2001. Modern Concepts of Microbiology, second revised

ed. Vikas Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi. Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Edisi I. Cetakan I. Jakarta: Raja

Grafindo Persada. Leveque, E., Janecek, S., Haye, B., and Belarbi A. 2000. Thermophilic archaeal

amylolityc enzimes. Trends in biotechnology 7: 49-53.

36

37


8

Lin L.L., Hsu W.H. and Chu W.S. 1997. A gene encoding form an α-amylase form themophilic Bacillus sp. Strain TS-23 and its expression in Escherichia coli. J. Appl. Microbiol. 82: 325-334.

Maton, A., Jean, H., William, L., Susan, J.and Maryanna, QW., 1993. Human Biology

and Health. Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentic Hall. Milo, R.E., Duffner, F.M. and Muller, R. 1999. Catechol 2, 3-dioxygenase from the

thermophilic, phenol-degrading Bacillus thermoleovorans strain A2 has unexpected low thermal stability. Extremophile 3: 185-190.

Morgan, F.J. and Priest, F.G. 1981. Characterization of thermostable α-amylase from

Bacillus licheniformis NCTB 6346. Journal of Applied Bacteriology 50: 104-114.

Moszhaev, V. 1993. Mechanism-based strategies for protein thermostabilization.

Trends in Biotechnology 11: 88-95. Műtzel, A., Reinscheid, U.M., Antranikian, G. and Muller, R. 1996. Isolation and

characterization of thermostable Bacillus strain that degrade phenol and cresol as sole carbon source at 70oC. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 593- 596.

Pandey, A., Nigam P. and Soccol C.R. 2000. Advances in microbial amylases.

Biotechnol. Appl. Biochem 31: 135 152. Pereira, N., Andrade, A. and Carolina, M. 1999. Thermophilic microorganism and

their polymer-hydrolitic enzymes. Brazilian Arch. Bio. and Tech. 12: 112-130. Peter, W., Alexandra, T. and Klaus, D. 2001. Conversions of glycerol to 1,3-

propandiol by a newly isolated thermophilic strain. Biotechnol. Lett. 23: 463-466.

Poonam, N. and Dalel, S. 1995. Enzyme and microbial systems involved in starch

processing. Enzyme Microb. Technol. 17: 770-778. Saboto, D., Nucci R., Rossi, M., Gryczynski, I., Gryczynski, Z. and Lakowicz, J.

1999. The β-glycosidase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobusolfataricus: enzyme activity and conformational dynamics at temperature above 100oC. Biophys. Chem. 81: 23-31.

Satosi, H., Seigo, O., Kenji, T., Kazuhisa, K., Tetsuo, K., Toshiaki, K. and Hitosi, K.

2001. Chemo-enzymatic synthesis of 3-(2-naphtyl)-L-alanine by an amino

38


8

transfer form the extreme themophiles Thermococcus profundus. Biotechnol. Lett. 23: 589-591.

Sohail, M., Ahmad, A., Shahzad, S. and Khan, S.A. 2005. A survey of amylolytic

bacteria and fungi from native environmental samples. Pak. J. Bot., 37: 155-161.

Sujana. 1989. Metode Statistika. Edisi ke-5. Bandung: Tarsito. Underkofler, L. 1976. Microbial enzymes. In: Miller, B., Litsky, W. (Eds). Industrial

Microbiology. McGraw-Hill, New York. Van der Maarel, M., Van der Veen, B., Uitdehaag, H., Leemhuis, H. and Dijkhuizen,

L. 2002. Properties and application of starch converting enzymes of the α-amylase family. J. Biotechnol. 94: 137-155.

Wind, R.D., Buitelaar, R.M., Egglink, G.,Huizing, H.J., and DijKhuized, L. 1994.

Characterization of a new Bacillus stearothermophillus isolate: a highly thermostable α-amylase producing strain. Applied Microbiology and Biotechnology 41: 155-162.

Windish, W.W. and Mhatre, N.S. 1965. Microbial amylases. In W.U. Wayne (Ed.).

Advances in applied microbiol. 7: 273-304. New York: Academic Press. Zeikus, J., Lee, C., Lee, Y. and Saha, B. 1998. Thermostable saccharides: new

sources, uses and biodesigns. J. Biotechnol. 60: 155-163.

39


8

Lampiran

1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas

diambil 0,1 ml

disebar kedalam petri dish berisi media agar selektif termofil

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC

diambil satu ose dari tiap koloni yang tumbuh

digores pada media agar selektif amilase


ditetesi larutan iodin

terdapat zona bening

Sampel air panas

Kultur bakteri dalam media padat

Kultur murni bakteri termofil amilolitik


8

2. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase

Karakteristik makroskopis

Karakteristik mikroskopis

Karakteristik sifat fisiologi / biokimia

- bentuk koloni - tepi koloni - elevasi koloni - warna koloni

- uji bakteri gram + / - - bentuk sel

- uji katalase - uji hidrolisis pati - uji gelatin - uji sitrat - uji TSIA - uji motilitas

H a s i l

Bakteri termofil penghasil enzim amilase

40 Isolat tunggal bakteri

penghasil enzim amilase


8

3. Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 Cfu/ml

diambil satu ose

dimasukkan dalam larutan NaCl 0,85% dihomogenkan dengan

vortex

dibandingkan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard yang setara dengan 108 CFU/ml

Isolat bakteri

Suspensi isolat bakteri

41


8

4. Pengujian Produksi Enzim Amilase oleh Isolat Bakteri

diambil 0,5 ml

dimasukkan dalam cawan petri berisi media agar + pati


ditetesi larutan iodium

Suspensi isolat bakteri tunggal

Isolat bakteri

Menghasilkan zona bening

Isolat menghasilkan enzim amilase

Zona bening diukur dengan jangka sorong

42


8

5. Pembuatan Kultur Untuk Produksi Enzim Amilase

diambil satu ose

dilarutkan dalam 40 ml media produksi amilase yang telah disterilisasi

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC dalam

shaker water bath dengan kecepatan 150 rpm

Isolat tunggal penghasil amilase dengan zona

bening terbesar

Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase

Seleksi 3 isolat terpilih

43


8

6. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar

disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm

Supernatan diambil dengan mikropipet

Kultur bakteri produksi enzim amilase

Supernatan yang mengandung enzim amilase kasar

44


8

7. Uji Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

diambil 1 ml

dimasukkan ke dalam tabung reaksi

ditambahkan 1% larutan pati

diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC,

70oC, 80oC ditambahkan 2 ml reagen

DNS untuk menghentikan reaksi

dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih

didinginkan selama 15 menit pada air mengalir

absorbansi diuji dengan spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm

Ekstrak enzim amilase dari supernatan

45


8

dibandingkan dengan larutan standar glukosa

8. Uji Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

diambil 1 ml dimasukkan ke dalam

tabung reaksi ditambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer

fosfat pada pH 4, 5, 6, 7, 8, dan 9

diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 65oC ditambahkan 2 ml reagen


dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih didinginkan selama 15 menit pada air mengalir

absorbansi diuji dengan

spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm

data hasil pengujian


46


8

dibandingkan dengan

larutan standar glukosa

9. Pembuatan Larutan Kontrol Penguji Aktivitas Enzim Amilase

diambil 2 ml dipanaskan dalam air

mendidih selama 20 menit

ditambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer

fosfat sampai pH 6,5 diinkubasi dalam water bath selama 20 menit pada suhu 40, 50, 60, 65, 70, dan 80oC

ditambahkan 2 ml reagen


dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih didinginkan selama 15 menit



47


8

pada air mengalir dan ditambah 20 ml air suling

absorbansi diuji dengan spektro-fotometer dengan panjang gelombang 540 nm

dibandingkan dengan

larutan standar glukosa

10. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

dibuat pengenceran 80-280 μg/mol

dimasukkan 1ml ke dalam tabung reaksi

ditambah 1,5 ml reagen DNS dipanaskan selama 5 menit

didinginkan dengan air

mengalir selama 15 menit ditambahkan 20 ml aquadest divortex diukur absorbansinya dengan


Larutan standar glukosa

1 ml larutan standar glukosa dalam tabung reaksi

48


8

spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

dibuat kurva standar dan

persamanaan regresinya

11. Sidik ragam pengaruh suhu terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati isolat Semangat Gunung.

Sidik Ragam untuk isolat SG.1.

SK db JK KT F Perlakuan 5 199840,40 39968,0807 8,608** Galat Percobaan 12 55712,43 4642,7028

17 255552,84 Tanda ** = berbeda nyata pada taraf 5%

Koefisien Keragaman (KK) = 19,46%




Absorbansi

Kurva standar glukosa

49


8



SK db JK KT F Perlakuan 5 1067368,4 213473,679 258,7916** Galat Percobaan 12 9898,64 824,8864 17 1077267,03

Tanda ** = berbeda nyata pada taraf 5%


12. Sidik ragam pengaruh pH terhadap konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati isolat Semangat Gunung.


SK db JK KT F Perlakuan 5 25465,73 5093,1476 2,3605**

Galat Percobaan 12 25891,13 2157,5945 17 51356,87







50


8


SK db JK KT F Perlakuan 5 227288,45 45457,6916 22,0514**

Galat Percobaan 12 24737,30 2061,4414 17 252025,76



13. Gambar Pewarnaan Gram

SG.1 : Gram (-) SG.2 : Gram (-) SG.3 : Gram (+)

14. Gambar Uji Biokimia

51


8

Isolat SG.1 Isolat SG.2 Isolat SG.3

15. Gambar sumber air panas desa Semangat Gunung

1. Gambar sumber air panas I ( Lokasi I ) 52


8

Suhu air panas 55oC, pH air 7,0.

2. Gambar sumber air panas II ( Lokasi II )

53

54


8

Suhu air panas 59oC, pH 6,0.

3. Gambar sumber air panas III ( Lokasi III )

55


8

Suhu air panas 62oC, pH 6,0.


8

repository.usu.ac.id › bitstream › handle › 123456789 › 5800 › 09e... isolasi dan uji...

Documents