a inabilidade de células tcd4 + stat3 -/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática...
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A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a
menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos?
Rag2-/-
Controle: Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+ naïve marcadas
CFSE
5, 7, 9 e 14d• Linfonodos Mesentéricos• Baço
FACS CFSE+
86,4
39,281,7
98,11
STAT3 influencia, portanto, no potencial de proliferação de TCD4+.
Já a ausência de Stat3 atrasa mas não impede a proliferação celular.
anti-CD3, anti-CD28IL-6 ou IL-21
72h
FACSAnnexin-V/PI
Controle: Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+ naïve
STAT3 além de influenciar na proliferação de TCD4+, regula também a sobrevivência de células T.
A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a
menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos?
STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação?
Controle: Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
Baço e linfonodosTCD4+ naïve
CD4+CD44-CD62L+
anti-CD3, anti-CD28IL-6, TGF-β,
anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
72h
IL-6
1h
ChIP-Seqanti-pSTAT3anti-H3K4Me
Regulação gênica
Controle: Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
Baço e linfonodosTCD4+ naïve
CD4+CD44-CD62L+
anti-CD3, anti-CD28IL-6 e/ou TGF-β,
anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
72h
IL-6
1h
MicroarrayPCR em Tempo Real
STAT3 é importante para na regulação de genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação, mas não é o único
fator.
Expressão gênica
STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação?
Conclusões
STAT3 é essencial para é essencial para a diferenciação de células Th17, in vivo, no modelo de colite e, na sua ausência as células T tendem
a diferenciarem-se em Treg;
Na diferenciação para Th17, STAT3 é tanto fator de transcrição, quanto regulador transcricional;
STAT3 tem papel importante na proliferação de células TCD4+ durante respostas inflamatórias;
Entretanto STAT3 é não essencial para expansão homeostática de células TCD4+, devendo, portanto, atuar em comunhão com outros
fatores de transcrição.
ObjetivoObjetivo
Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.
Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.
STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
WT Stat3CD4-/-
Anti-CD3 eAnti-CD28 +
IL-4 anti-INF-γ
Citometria
TCD4 naive
Anti-Phospho-STAT3
e STAT6
Céls. T TCR transgênicas
Anti-CD3 ou OVA+APCAnti-
Phospho-STAT3 e STAT6
Citometria
STAT3 é fosforilado durante diferenciação de células Th2.STAT3 é fosforilado durante diferenciação de células Th2.
STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
DO11.10
Quais citocinas participam da ativação de STAT3 durante diferenciação de Th2?
Quais citocinas participam da ativação de STAT3 durante diferenciação de Th2?
WT
Anti-CD3 e anti-CD28 AcsBloqueio+ 5 dias ELISA
4 dias FACs
IL-2, IL-6 e IL-21 participam na ativação de STAT3 durante diferenciação de células Th2 (uma vez que o bloqueio das
mesmas prejudica a expressão de citocinas Th2)
IL-2, IL-6 e IL-21 participam na ativação de STAT3 durante diferenciação de células Th2 (uma vez que o bloqueio das
mesmas prejudica a expressão de citocinas Th2)
TCD4 naive
WT Stat3CD4-/-
Anti-CD3 e Anti-CD28 + IL-4 e anti-INF-γ
5 dias1x106
céls
reestimuladas
Anti-CD3/24h
ELISA
TCD4 naive
STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?
STAT3 é importante na diferenciação de Th2STAT3 é importante na diferenciação de Th2
WT Stat3CD4-/-
TCD4 naive
Anti-CD3 RNAqPCR
STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição?
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição?
WT Stat3CD4-/-
Diferenciação céls RNA
qPCR
Isolamento célsDiferentes dias
Expressãogênica
STAT3 é requerido para a expressão de fatores de transcrição.
STAT3 é requerido para a expressão de fatores de transcrição.
TCD4 naive
WT Stat3CD4-/-
Diferenciação ou não de céls
ImunoprecipitaçãoCromatina (ChIP)
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (está envolvido nas modificações do
DNA)?
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (está envolvido nas modificações do
DNA)?
H3K4me3H3K36me3 Ativação gênica
H3K17me3-Inibição gênica
TCD4 naive
qPCR
Este resultado sugere que Stat3 tem um papel na prevenção destas modificações
Este resultado sugere que Stat3 tem um papel na prevenção destas modificações
WTChIP
TCD4 naive
Anticorpo controle
Anticorpos STAT3
qPCR
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (interage com o
DNA)?
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (interage com o
DNA)?
WT Stat3CD4-/-
Diferenciação5 dias
Isola núcleo Digestão c nuclease
10 min*
qPCR
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (afeta acessibilidade
com a cromatina)?
STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (afeta acessibilidade
com a cromatina)?
* Nuclease cliva o DNA em pontos acessíveis que tem modificações ativas na transcrição.
TCD4 naive
Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída.
Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída.
WT Stat3CD4-/-
Diferenciação
2 diasTrandução c
CT, Batf ou Maf c expressão de retrovírus
Reestimulação
Anti-CD3 por 24h
ELISA
Maf e Batf provavelmente representam alvos de STAT3 durante desenvolvimento de Th2,
e os defeitos na produção de citocinas Th2 na ausência de STAT3 são resultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.
Maf e Batf provavelmente representam alvos de STAT3 durante desenvolvimento de Th2,
e os defeitos na produção de citocinas Th2 na ausência de STAT3 são resultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.
A transdução de alguns fatores de transcrição para o Stat3CD4-/- resulta na “recuperação”da produção de citocinas?
A transdução de alguns fatores de transcrição para o Stat3CD4-/- resulta na “recuperação”da produção de citocinas?
TCD4 naive
STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2?STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2?
TCD4 naive 48hAtivadas
TransduçãoCom C ou STAT3C
5 diasReestimuladasAnti-CD3/24h ELISA
Mutantes para STAT constitutivamente ativos
STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2?
STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2?
48h sob condições Th1
Transdução com C,
STAT6VT, STAT3C ou
ambos
5 diasReestimuladas
Anti-CD3/24h ELISATCD4 naive
Mutantes para STAT constitutivamente ativos
WT STAT6VT STAT6VTStat3Cd4-/-
TCD4 isoladas do baço de:
Anti-CD3 por 24h
ELISA
Estes resultados demonstraram que STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2
Estes resultados demonstraram que STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2
STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2 in vivo?
STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2 in vivo?
WT Stat3CD4-/-
TCD4 naive
Anti-CD3 e anti-CD283 dias
Sob condiçõesTh2
qPCR
STAT3 atua sobre os genes alvo de STAT6?STAT3 atua sobre os genes alvo de STAT6?
ChIP-anti-STAT6
WT STAT6VT STAT6VTStat3Cd4-/-
TCD4 isoladas de:
reestimuladasAnti-CD3 6 h
Estes resultados sugerem que STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligar aos genes alvo e na indução da expressão de fatores de
transcrição.
Estes resultados sugerem que STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligar aos genes alvo e na indução da expressão de fatores de
transcrição.
STAT6 foi capaz de induzir expressão de fatores de transcrição na ausência de
STAT3?
STAT6 foi capaz de induzir expressão de fatores de transcrição na ausência de
STAT3?
RNA
qPCR
WT Stat3CD4-/-
Imunização
OVA e Alum BAL
Desafios intranasaisContagem
FACs
STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação
alérgica?
STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação
alérgica?
2 semanas após2seg imunização
BAL eSobrenadante de cultura
Esplenócitos
OVA por 72h
ELISAWT Stat3CD4-/-
STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação
alérgica?
STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação
alérgica?
WT STAT6VT STAT6VTStat3Cd4-/-
Blefarite e dermatite alérgica
Eosinófilos do BAL
STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
WT STAT6VT STAT6VTStat3Cd4-/-
Pulmão
Hematoxilina-eosina
Estes resultados demonstraram que a perda de STAT3 em células T protege o camundongo do desenvolvimento de doenças
inflamatórias mediadas por Th2.
Estes resultados demonstraram que a perda de STAT3 em células T protege o camundongo do desenvolvimento de doenças
inflamatórias mediadas por Th2.
STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
Conclusão
STAT3 STAT6
IL-2
IL-4
IL-6/IL-21/IL-2
STAT5
STAT6
STAT3
Th2
Proteção contra doenças inflamatórias