a lc/ms を用いたメタボリック・プロファイリング …application note no....
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No.
*1 九州大学 先端融合医療レドックスナビ研究拠点 メタボリック・プロファイリンググループ *2 九州大学 大学院農学研究院*3 九州大学 バイオアーキテクチャーセンター*4 ㈱島津製作所 分析計測事業部 グローバルアプリケーション開発センター
1
LAAN-C-XX033
LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用— 農産物の生体調節機能の評価 —Application of LC/MS-based Metabolic Profiling Evaluation of Health-promoting Function of Agricultural Products
ライフサイエンス
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LifeScience
1. はじめにメタボリック・プロファイリング法は,生体内の代謝物を網
羅的に測定するメタボローム解析(メタボロミクス)技術の
一つで,複数のサンプル間の代謝物パターン(プロファイル)
の類似性や相違性を見出すことができるため,医薬品分野に
おいて,バイオマーカー探索や病因解析,薬効・毒性評価な
どへの応用が進められています。また,近年では食品(農林
水産物)の品質管理・鑑定・予測やそれら要因解析の新たな
手法として,食品中の低分子量成分(代謝物)を標的とした
プロファイリング解析が試みられています。
食品機能性(三次機能:生体調節機能)研究分野では,食品
のどのような成分・複合成分パターンが生体調節機能に関与
するかを高精度に捉える科学的評価法が模索されています。
メタボリック・プロファイリング法は,複数サンプルの多彩
な成分プロファイルを同時に把握できるため,機能性評価の
有用な解析ツールとなりえることが期待されますが,現在の
ところ,食品機能性研究への応用はほとんどなされていませ
ん。
そこで本稿では,比較的幅広い代謝物の測定で汎用されてい
る液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)を用いたメ
タボリック・プロファイリング解析によって,農産物の様々
な品種の成分プロファイルを取得し,機能性を有する品種の
識別化や機能性予測モデルの構築,さらには機能性関与成分
や共存成分バランスの解明を試みた研究例をご紹介します 1)。
藤村由紀 *1 三浦大典 *1 割石博之 *1-3 谷川哲雄 *4 立花宏文 *1-3
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No.
メタボロミクス(メタボリック・プロファイリング)は,化
学的性質が異なる様々な分子種(糖,アミノ酸,有機酸,脂
質など)の同時計測が可能な技術であるため,多彩な共存成
分の複雑な動きを特徴とする食品の性質を包括的に捉えるた
めには極めて有効な手段であり,理論的には,既存の食品機
能性評価法で汎用される単一成分評価法と比べて遥かに多く
の有用情報を得ることができます。すなわち,食品が有する
機能性とその多彩な成分プロファイル間の相関関係を計量化
学的アプローチにより導出することで,食品機能性研究で求
められる,1)機能性を有する食品素材の発掘,2)食品中
の機能性成分の同定(直接的な機能性因子や間接的な機能性
賦活因子など),3)機能性を享受できる食品の活用法の発見
(食べ合わせや機能性成分の組合せ)などを個別にまたは同時
に行うことを可能にします(図 1)。
2. 食品機能性研究におけるメタボロミクス技術の有用性と着眼点
代謝物の網羅的な分析には,種々のクロマトグラフィーによ
る分離(ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー)
と質量分析による検出とを組合せた分析法が有力なツールと
して用いられており,なかでも液体クロマトグラフィー質量
分析法(LC/MS)は,不揮発性化合物や低極性から高極性ま
での幅広い代謝物に適用できる特徴があります。LC/MS が分
析対象とするアミノ酸,有機酸,糖などの高極性代謝物やポ
リフェノール類などの二次代謝物は,食品(農林水産物)中
の機能性成分探索の極めて有用なターゲットとして注目され
ています。島津高速液体クロマトグラフ質量分析計 “LCMS-IT-
TOF” は,高速スキャンと高速極性切替による分析が可能で,
超高速 LC に適した MS であり,島津超高速 LC“Prominence
UFLC” とこれら MS との組合せは,大量の試料を扱うメタボ
ローム解析に適したシステムとなります。さらに,LCMS-IT-
TOF では MSn 分析を用いた精密質量測定により,高精度な組
成推定および部分構造情報の取得が可能となるため,プロファ
イリングやマーカー探索とともに,未知代謝物の化合物情報
を得るのに有効な装置です。
3. 食品を対象とした LC/MS によるメタボローム解析
図1 食品機能性研究の問題点とその解決法
機能性(生体調節機能)を有する食品素材を見つけること 食品中の機能性成分を見つけること 機能性を享受できる食品(成分)の活用法を見つけること
食品の機能性研究に必要なこと
メタボロミクス
現在の問題点:既存の機能性評価法の多くは単一成分評価系(食品は複合成分系なので単一系では対応しきれない)
複雑な挙動を捉えるためには複合成分評価技術が必要!
(糖・アミノ酸・有機酸等、物性の異なる多様な分子種を対象)食品中の複雑な成分の状態を捉え、今、何が起こっているかを 正確に捉えるためにはメタボリック・プロファイリング法が有効!
生体調節機能の発現
複合成分食品
食品成分の有効性や安全性の理解には共存成分パターン情報が必須
2
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トロンビン
トロンビン受容体
細胞膜
Ca 2+
MRLC
MRLC
MLCK
(不活性型)
MLCP
P
(活性型)
抑制活性 (%) 品種 品種機能性ランク 抑制活性 (%)
322104.8
14.3 423
青心大ぱん 75.8 9.6
625みなみかおり 67.6
7.1 524
ふうしゅん 74.4 8.4
726たまみどり 66.0
5.5 827
やまとみどり 65.5 1.0
9 30さやまみどり 62.3
-4.4928
べにほまれ 64.2 -4.1
60.8
221べにふうきはつもみじ
おくゆたかふくみどり
とよか印雑 131 こまかげ
りょうふう 14.4
機能性ランク
サンルージュ
緑茶の42品種の生体調節機能(血管内皮機能改善効果)
リン酸化抑制
細胞骨格の再編(内皮透過性上昇)MLCP : ミオシン軽鎖ホスファターゼMLCK : ミオシン軽鎖キナーゼ
pMRLC
MRLC
トロンビン - + + +
やぶきた
サンルージュ
未添加
かなやみどり 27.9
9 301301
あさぎり 60.8-13.9
2311さみどり 52.3
-24.5
6351やえほ 40.3
-34.8
3321くりたわせ 45.4
-31.3
5341べにひかり 42.0
-33.8
8371するがわせ 38.2
-42.3
4331しゅんめい 43.2
-32.6
0491大葉烏龍 32.6
-49.2
7361いずみ 39.4
-41.0
9381べにふじ 37.1
-46.8
1402青心烏龍 29.5
-85.4 2412
みねかおり 28.3 -112.6
うじひかりやぶきたほくめい
あさつゆ
さえみどり
みなみさやか
ごこう
あさひ
おおいわせ
さやまかおり
ゆたかみどり
おくみどりめいりょく (サンルージュによりMRLC*のリン酸化が抑制)
*:ミオシン調節軽鎖
ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるトロンビン誘導性MRLCリン酸化に及ぼす影響
ストレスなど血管
内皮細胞平滑筋細胞
血管の損傷・病変
血管内皮障害 トロンビン
トロンビン受容体
トロンビン刺激亢進
循環器系疾患の発症
・ 動脈硬化症・ 高血圧症
・ 心筋梗塞・ ・ ・ など
内皮機能障害
炎症細胞の浸潤
内皮透過性上昇
4. LC/MS を用いた緑茶品種のメタボリック・プロファイリング解析
世界中で広く愛飲されている茶(Camellia Sinensis L.)には
多彩な生体調節機能が報告されており,日本で流通・消費さ
れている緑茶の約 80% は “ やぶきた ” と呼ばれる単一品種が
占めています。しかしながら,“ やぶきた ” 以外にも様々な特
性を有する緑茶品種が存在しており,これらの特性(今回は,
成分プロファイル情報と生体調節機能との相関関係)を把握
するため,生体調節機能(血管内皮機能改善効果:MRLC リ
ン酸化抑制活性 , 図 2)の異なる代表的な緑茶品種(42 種類)
から分析試料を調製し,Prominence UFLC/LCMS-IT-TOF を用
いて測定しました。得られた測定データを多変量統計解析(主
成分分析 / 判別分析 / 回帰分析)に供し,品種間の成分プロ
ファイル(共存成分バランス)の違いを明らかにするとともに,
機能性予測モデルの構築やその機能性関与成分の同定に成功
しました。
4. 1 概要
図 2 生体調節機能(血管内皮機能改善効果)
超高速液体クロマトグラフ “Prominence UFLC”高速液体クロマトグラフ - イオントラップ - 飛行時間型質量分析計 “LCMS-IT-TOF”<特長>
高速高分離によるハイスループット分析
高いスキャン感度
高精度 MSn 分析による未知代謝物の化合物情報を取得
3LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 —
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装置 Prominence UFLC, LCMS-IT-TOF[LC 条件]
カラム Luna 5u C18(2) 100A (250 mm L. × 1.0 mm I.D., 5 µm)移動相 A 0.05% ギ酸水溶液移動相 B 0.05% ギ酸 / 99.95% メタノールグラジエントプログラム B 濃度 5% (0-2 min) – B 60% (7.5 min) – B100% (17-23 min)
– B 5% (24 min) – STOP (30 min)流量 0.1 mL/minカラム温度 40℃
[MS 条件]イオン化モード ESI (+)測定範囲 m/z 70 - 700CDL 温度 200℃HB 温度 200℃
表 1 LC/MS 分析条件
4. 2 実験
(独)農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所内
で栽培された 42 品種の緑茶葉微粉末(一番茶 , 荒茶)200
mg を 10 mL の 100℃熱水で 10 分間抽出後,遠心濾過した
上澄みを原液サンプルとしました。各種緑茶葉熱水抽出物
を水で 10 倍希釈後,0.22 µm PTFE フィルターにてろ過し,
Prominence UFLC/LCMS-IT-TOF に供しました(分析条件は
表 1 を参照ください)。
4. 2. 1 試料および測定
データ処理には,ピーク抽出ソフトウェア Profiling Solution
Ver.1.1 (LCMS-8040,LCMS-8030,LCMS-2020,GCMS-
QP2010 シリーズなどにも対応)を用いて,MS 分析の結果
から得られたピークを自動検出し,各ピーク面積値を用いて
ピークリストを作成しました。本ソフトウェアは,フィルタ
リング機能やノーマライズなどの各種演算機能によって多変
量解析のデータ前処理を行うことができます。また,デー
タ間で保持時間調整を行いピークのズレの補正が可能です。
さらに,興味対象のピークについて,各データファイルの
クロマトグラムやマススペクトルを一覧表示することがで
きます。取得したピークリストは,統計計算ソフトウェア
SIMCA-P+ Ver.12(Umetrics 社)に供し,多変量解析を行い
ました。
4. 2. 2 データ解析
Profiling Solution によるピークリストの作成
統計計算ソフトウェアによる多変量解析
4
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図 3 LCMS による緑茶品種の主成分分析(PCA)
4. 3 結果
図 3 に LC/MS で検出された 42 品種の代謝物のピークリスト
を用いて,主成分分析(PCA)を行った結果(スコアプロット)
を示しました。各品種の代謝物プロファイルの相対的な関係
を見ますと,品種により異なる分布(プロファイル)を示し,
特に,日本の代表的緑茶品種で血管内皮機能改善効果がない
“ やぶきた ” や中程度の効果を示す “ べにふうき ” を含む大き
な集団と最も高い効果を示す品種である “ サンルージュ ” に
わかれました。この結果は,両グループ間で明らかに代謝物
プロファイル(共存成分バランス)が異なっていることを示
唆しています。
4. 3. 1 主成分分析による緑茶品種の代謝物プロファイルの概要
主成分分析の結果から,各品種の生体調節機能と代謝物プ
ロファイルとの間に何らかの関係性があることがわかった
ため,効果の異なる代表的な 3 品種(やぶきた,べにふう
き,サンルージュ)を用いて,サンプル間の違いを見出す
こ と が で き る 判 別 分 析(OPLS-DA) を 行 い ま し た( 図 4)。
その結果,“ やぶきたとサンルージュ ” および “ べにふうきとサ
ンルージュ ” のそれぞれの比較において有意に判別可能なモデ
ルが作成でき(図 4a, c),両品種間の違い(機能性の違い)に
寄与する代謝物ピークを抽出することができました(図 4b, d)。
4. 3. 2 機能性の異なる2品種の判別分析による機能性関与成分の抽出
5000
10000
15000
%)
4
3
5
212
37
42
14
1624
22
33
- 10000
- 5000PC2 (10.4%
0
19
25
17
20
13
715
3
18
119
3234
21
6
36
27
14
30
40
38
28
10
35
33
2641
39
- 15000
PC1 (20.2%)- 25000- 20000- 15000- 10000 - 5000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
8
29
C ( 0 %)
サンルージュ
べにふうき 23
31やぶきた
1
数字:各品種の機能性ランク
5LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 —
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No.
主成分分析や判別分析の結果から,品種間の違いにポリフェ
ノールが関与する可能性が考えられたため,機能性の高い
“ サンルージュ ” をポリフェノール除去剤である PVPP(ポ
リビニルポリピロリドン)で処理したところ,その機能性が
消失しました。そこで,その除去された成分(図 5a, b),す
なわち,“ サンルージュ ” の機能性関与成分を見出すため,
PVPP 処理した “ サンルージュ ” と未処理のサンプル間で判
別分析を行った結果,機能性に関与する代謝物ピークを抽出
することができました(図 5c, d)。
4. 3. 3 機能性に寄与するポリフェノール関連成分の抽出
図 5 判別分析による機能性に寄与するポリフェノール関連成分の抽出
図 4 機能性の異なる品種の判別分析(OPLS-DA)
5000
10000
15000
1] 0.20.40.60.81.0
-15000
-10000
-5000
0
-60000 -40000 -20000 0 20000 40000 60000
to[1
t[1]
-1.0-0.8-0.6-0.4-0.2-0.0
-0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20
p(corr)[1]
w[1]
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
-50000 -30000 -10000 0 10000 30000 50000
to[1]
-1.0-0.8-0.6-0.4-0.2-0.00.20.40.60.81.0
-0.20 -0.10 -0.00 0.10 0.20 0.30
p(corr)[1]
t[1] w[1]
スコアプロットで品種間の分離に寄与する成分
スコアプロットで品種間の分離に寄与する成分
サンルージュ>やぶきた
サンルージュ>べにふうき
べにふうき>サンルージュ
やぶきた>サンルージュサンルージュ やぶきた
べにふうき サンルージュ
機能性ランク: サンルージュ > べにふうき > やぶきた
a)スコアプロット b)ローディングプロット(S-plot)
c)スコアプロット d) ローディングプロット(S-plot)
6
32
図 7 機能性予測モデル
判別分析で得られた機能性関与成分を更に絞り込むため,図
4 の結果で品種間の違いにより強く寄与する代謝物ピークの
うち,“ やぶきた ” よりも “ サンルージュ ” に多く,かつ,“ べ
にふうき ” よりも “ サンルージュ ” に多いピークを抽出した
ところ,そのピークの約 87.5% が図 5 に示した機能性に寄与
するポリフェノール関連ピークと一致していました(図 6)。
この結果は,従来のように機能性関与成分を絞り込むために,
成分の分画・精製やバイオアッセイを繰り返して行う必要は
なく,LC/MS で得られたサンプルの成分プロファイル情報を
多変量解析に供することで極めて容易にかつ効率的に機能性
関与成分を絞り込むことができる可能性を示唆しています。
4. 3. 4 異なる判別分析の組合せによる機能性関与成分の絞り込み
LC/MS によって得られた全品種の成分プロファイル情報を
用いて,緑茶品種の機能性をより客観的に表現するために,
用いる変数情報が多い場合に有用な多変量解析手法である
OPLS 回帰分析を行いました(図 7)。その結果,OPLS によっ
て機能性の予測値と実測値の関係のプロットが得られまし
た。予測残差(予測値と実測値のズレの程度)は 6.8 であり(機
能性の全変動値の 3.1% 程度),これは緑茶品種の機能性を客
観的に評価(予測)できる可能性があることを示しています。
4. 3. 5 回帰分析による機能性予測モデルの構築
図 6 機能性関与成分の絞り込み
判別分析の組合せでピックアップ
バイオアッセイからピックアップ
や ぶきたより多いピーク
べにふうきより多いピーク
サンルージュ > やぶきた X サンルージュ > べにふうき サンルージュ
PVPP未処理 > PVPP処理
14 32 5
X
4 28 37
X X の87.5%がバイオアッセイ由来ピークと重複
判別分析の組合せは関与成分の絞り込みに有効な可能性あり
予測残差 = 6.8 (予測値と実測値のズレの程度)
120100806040200-20-40-60-80-100-120
1925
1720 13
47
15
35
18
211128
9
21
6
27
1416 10
24 2226 23
1数字: 各品種の機能性ランク
-120 -100 - 80 - 60 - 40 - 20 0 20 40 60 80 100 120
25
3234
37
42
36
2730
40 38
2829
3533
41
3931
23
機能性の実測値
R 2 = 0.981(機能性の98%の変動を説明)Q2 = 0.891(機能性の全変動の89%を予測)
機能性の予測値
7LC/MS を用いたメタボリック・プロファイリング法の応用 — 農産物の生体調節機能の評価 —
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© Shimadzu Corporation, 2012
分析計測事業部 http://www.an.shimadzu.co.jp/
1) Fujimura Y, Kurihara K, Ida M, Kosaka R, Miura D, Wariishi H, Maeda-Yamamoto M, Nesumi A, Saito T, Kanda T, Yamada K,
Tachibana H. Metabolomics-driven nutraceutical evaluation of diverse green tea cultivars. PLoS One. 2011, 6(8), e23426.
本研究を行うにあたり,様々な緑茶品種を提供して頂きました(独)農業・食品産業技術総合研究機構 野菜茶業研究所の山本万里
博士に感謝申し上げます。
[引用文献]
[謝辞]
機能性予測モデルの形成に寄与する成分,および主成分分析
(図 3)や判別分析(図 6)で機能性に寄与する成分のなかで,
単独では機能性を示さないものの , “ やぶきた ” に加えること
で新たに機能性を付与できる(“ やぶきた ” に少ない)成分
がいくつも存在することがわかりました。図 8 に示すように,
化合物の添加により相対値(MRLC リン酸化比率)が低くな
るほど機能性が高くなります。このようにプロファイリング
解析は,従来法では得ることのできない思いがけないユニー
クな知識発見にも威力を発揮します。
4. 3. 6 “ やぶきた ” と同定化合物の組合せによる機能性の顕在化(組合せ効果)
本稿では,食品機能性研究を志向したメタボリック・プロファ
イリング解析の応用例として,緑茶品種の生体調節機能の評
価についてご紹介しました。LC/MS を用いたプロファイリン
グ法が数十種類の緑茶品種の機能性評価(機能性品種の識別
化や機能性予測モデルの構築/機能性関与成分や共存成分バ
ランスの解明など)に極めて有効であることが明らかとなり
ました。このような知見は,機能性を付与した新たな品種開
発や既存品種の有用性発掘に大いに役立つことが期待されま
す。また,試料中の複数成分間の相関関係を捉える本法は,
食品機能性の理解に不可欠な成分間/食品間相互作用に関す
る基礎情報の取得を可能にし,機能性成分を活用した食品開
発や食品の食べ合わせなどに役立つ新たな科学的根拠の創出
に寄与することでしょう。
5. まとめ
図 8 機能性付与成分の同定
低い
%)
高い
相対
値(
32
初版発行:2012 年 10 月
3218-08202-20A-IK