a magyar andrológiai társaság x. kongresszusa tapolca ... fileaz uro-genitalis traktus...

1 | O l d a l

Az áramlási citometria alkalmazása a

modern andrológiai kivizsgálásban

Az áramlási citometria (flow cytometry) alapú

diagnosztikai módszerek alkalmazása egyre

nagyobb teret nyer az andrológiai

kivizsgálásokban. A módszer nagy előnye, hogy

a sejtek

elkülönítése mellett

festékek alka

elkülöníteni az ondóban levő spermiumokat a

többi sejttől, illetve baktériu

további előnye

technikákhoz képest, hogy kis minta

mennyiségből, rövid idő alatt

tízezer) spermiumot

értékelni

található egyéb sejtfajt

1. ábra BD Facs Canto II áramlási citométer

A Magyar Andrológiai Társaság X. kongresszusa

O l d a l w w w . l a b m a g i s t e r . c o m

amlási citometria alkalmazása a






a sejtek lézer

elkülönítése mellett

tékek alkalmazásával


többi sejttől, illetve baktériu

további előnye a hagyományos mikroszkópos


mennyiségből, rövid idő alatt

tízezer) spermiumot

ni (1.ábra).

található egyéb sejtfajt

BD Facs Canto II áramlási citométer


w w w . l a b m a g i s t e r . c o m







fényszórás alapján való

elkülönítése mellett, specifikus fluoreszcens

mazásával, szelektíven képes


többi sejttől, illetve baktériumtól. A módszer

a hagyományos mikroszkópos


mennyiségből, rövid idő alatt, nagyszámú (több

tízezer) spermiumot képes

Ugyanez igaz az ondóban

található egyéb sejtfajtákra is.



w w w . l a b m a g i s t e r . c o m M i n d e n j o g f e n n t a r t v a / C o p y r i g h t








specifikus fluoreszcens

szelektíven képes


mtól. A módszer



nagyszámú (több

képes kvantitatívan



Workshop összefoglalóA Magyar Andrológiai Társaság X. kongresszusa

M i n d e n j o g f e n n t a r t v a / C o p y r i g h t








specifikus fluoreszcens

szelektíven képes


mtól. A módszer



nagyszámú (több

kvantitatívan




Az áramlási cito

alábbi andrológiai

1. Az

élő/apoptotikus/halott spermiumok

abszolút száma és részaránya

2. A spermiumok DNS állományának

integritása/fragmentáltsága

3. Az ondófolyadékban levő gyulladásos

sejtek alosztályainak azonosítása és

kvantifikálása (neutrofil granulocita,

limfocita alpopulációk, monocyta)

4. Gyulladásos fehérjék (citokinek és

kemokinek) kvantitatív meghatározása

5. A spermiumok reaktív oxigén gyök

(ROS) előfordulását és

spermiumonkénti mennyiségét

6. Az egyes spermiumok in vitro

akroszóma reakció készségét (spontán

és kiváltott akroszóma reakció)

A fentiekben felsorolt áramlási citometriás

módszerek mindegyike hozzáférhető a

LabMagister Kft.

általa használt vizsgálatokhoz

előírt belső referencia tartománnyal is

rendelkezik. Ennek alapján az andrológus

módjában

laboreredmény

betegpopuláció adatállományához viszonyítani

A felsorolt m

Workshop összefoglalóA Magyar Andrológiai Társaság X. kongresszusa Tapolca 2016. December 1


Az áramlási citometriát leggyakrabban az

alábbi andrológiai vizsgálatok

ondófolyadékban levő



A spermiumok DNS állományának


Az ondófolyadékban levő gyulladásos




Gyulladásos fehérjék (citokinek és


A spermiumok reaktív oxigén gyök



Az egyes spermiumok in vitro





LabMagister Kft.-nél. A LabMagister Kft. a

általa használt vizsgálatokhoz

belső referencia tartománnyal is

k. Ennek alapján az andrológus

áll egy

dményét a


A felsorolt módszerek által jellemzett

Workshop összefoglalóTapolca 2016. December 1

M i n d e n j o g f e n n t a r t v a / C o p y r i g h t f r o m 2 0 1 6

metriát leggyakrabban az

vizsgálatokhoz használják:




















nél. A LabMagister Kft. a

általa használt vizsgálatokhoz az ISO 15189 által


k. Ennek alapján az andrológus

egy adott páciens

a teljes vizsgált


dszerek által jellemzett

Workshop összefoglalóTapolca 2016. December 1-3

f r o m 2 0 1 6


hoz használják:




















nél. A LabMagister Kft. az

az ISO 15189 által


k. Ennek alapján az andrológusnak

adott páciens

teljes vizsgált

betegpopuláció adatállományához viszonyítani.


Workshop összefoglaló 3

f r o m 2 0 1 6















z

az ISO 15189 által


nak

adott páciens

teljes vizsgált

.


2 | O l d a l

ondó/spermium

összefüggésben vannak egymással

2. ábra

gyakorolt káros hatása

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PM

C3921845/



ondó/spermium


A reaktív oxigén gyökök spermiumokra



C3921845/



ondó/spermium paraméterek szoros







paraméterek szoros

összefüggésben vannak egymással (2.ábra).





paraméterek szoros





Az uro-genitalis traktus

gyulladásának

által használt áramlási citometriára alapuló

leukospermia vizsgálat

nyújt a gyulladás okának felderítésére, mint a

hagyományos peroxidáz teszt

nem a fehérvérsejteket, hanem az által

termelt peroxidáz jelenlétét mutatja ki

szemben az áramlási citometria

fehérvérsejteken található specifikus felületi

markerek detektálásával képes az ondóban

található leukocitákat

limfocitákat

sorolni (3. Ábra

3. ábra Az ondóban található fehérvérsejtek és

cytokinek kimutatása és kvantifikálása

Gyulladásos sejtek és

14

Gyöngyök + CD45 festék segítségével összleukocitaszám meghatátozása

Sejtpopulációk %-os meghatározása (granulociták/monociták/l

Megjegyzés: A vitális festés alkalmazásával az esetlegesen jelenlévő baktériumok is láthatóvá válnak, meghatározhatók a mintából.

Gyulladásos sejtek

Leukocytospermia and sperm preparation Reproductive Biology and Endocrinology 2009,

A gyulladás sejtes elemeinek detektálása

mellett az áramlási citometria

biztosít a gyulladásos mediátorok pl.

kemokinek, citokinek, növekedési faktorok

mennyiségi

természetű mediátorok mellett gyuladásra



genitalis traktus feltételezett

ásának diagnózisára a


leukospermia vizsgálat sokkal több információt


hagyományos peroxidáz teszt



z áramlási citometria



található leukocitákat és azon belül a

limfocitákat, kvantitatív módon

3. Ábra).

Az ondóban található fehérvérsejtek és


Gyulladásos sejtek és

LabMagister Ltd.

Gyöngyök + CD45 festék segítségével meghatátozása

os meghatározása ták/limphociták)

A vitális festés alkalmazásával az esetlegesen jelenlévő baktériumok is láthatóvá válnak, meghatározhatók a mintából.

Gyulladásos sejtek

Giuseppe Ricci, et al.and sperm preparation - a flow cytometric study

Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:128 doi:10.1186/1477-7827-7-128





meghatározására is. A protein




feltételezett

diagnózisára a LabMagister Kft.


sokkal több információt


hagyományos peroxidáz teszt. A peroxidáz teszt



z áramlási citometria a különböző



és azon belül a

kvantitatív módon, alpopulációkba



Gyulladásos sejtek és cytokine

LabMagister Ltd.

Cytokine tartalomCytokine meghatározás CBA technikával ondó plazmából

20-30 fg/mL-es koncentrációig képes detektálni a módszer

IL-6/IL-8 meghatározás jelenleg

Irodalmi adatok alapján meghatározott, általunk alkalmazott ondó plazma koncentrációk

IL-8 conc. in the semenplasma:

High

Elevated

NormalIL-6 conc. in the semen

plasma: High

Normal

Waltraud Eggert-Kruse, et al.Relationship of seminal plasma interleukinHuman reproduction Vol. 16; No. 3, pp. 517-








f r o m 2 0 1 6

feltételezett

LabMagister Kft.


sokkal több információt


. A peroxidáz teszt

nem a fehérvérsejteket, hanem az általuk

termelt peroxidáz jelenlétét mutatja ki. Ezzel

különböző



és azon belül a

opulációkba



cytokine tartalom

tartalommeghatározás CBA technikával ondó

koncentrációig képes detektálni a

8 meghatározás jelenleg

Irodalmi adatok alapján meghatározott, általunk alkalmazott ondó plazma koncentrációk

2000 pg/mL

Elevated 1000-2000 pg/mL

Normal <1000 pg/mL

>15 pg/mL

Normal <15 pg/mL

interleukin (IL) -8 and IL-6 with semen quality-528, 2001


mellett az áramlási citometria lehetőséget






f r o m 2 0 1 6

. A peroxidáz teszt

opulációkba


lehetőséget





3 | O l d a l

utaló jel

is. A gyulladás során a leukociták,

neutrofil gran

(ROS) ter

folyadékba mely onnan bejuthat

belsejébe.

citometriával kvantitatívan jellemezhető.

LabMagister

megadja a ROS tartalmú (ROS pozitív)

spermiumok százalékos részarányát az össz

spermiumszámhoz képest és értékeli a ROS

pozitív spermiumokban levő ROS mennyiséget.

Mivel vannak minták, ahol a ROS tartalmú

spermiumok részaránya vi

a ROS intenzitás magas és

spermiumok ROS tartalmának

jellemzésére a

intenzitás értéket is megadja

4. ábra A spermiumok reaktív oxigén gyök (ROS)

tartalmának a mérése

11



utaló jel a szabad gyökök

A gyulladás során a leukociták,

neutrofil granulociták reaktív ox

termelnek és sze


belsejébe. A spermiumok ROS tartalma áramlási


LabMagister Kft. által






spermiumok részaránya vi

a ROS intenzitás magas és

spermiumok ROS tartalmának

jellemzésére a LabMagister Kft. a

intenzitás értéket is megadja

A spermiumok reaktív oxigén gyök (ROS)


ROS tartalom a spermiumokban

Pink label



a szabad gyökök emelkedett

A gyulladás során a leukociták,

lociták reaktív ox

elnek és szekretálnak az ondó


A spermiumok ROS tartalma áramlási


Kft. által kifejlesztett ROS teszt






spermiumok részaránya viszonylag alacsony, de

a ROS intenzitás magas és vica versa

spermiumok ROS tartalmának egy számmal való

LabMagister Kft. a

intenzitás értéket is megadja (4. ábra



0

2e+5

4e+5

6e+5

8e+5

1e+6

400060008000100001200014000

Mea

n flu

ores

cenc

e in

tens

ity x

% R

OS+

spe

rm

Mean fluorescence intensity (MFI)

Association among sperm ROS positivity parameters

.


% ROS+MFI

Pink label



emelkedett jelenléte

A gyulladás során a leukociták, különösen a

lociták reaktív oxigén gyököket

kretálnak az ondó

folyadékba mely onnan bejuthat a spermiumok



kifejlesztett ROS teszt






szonylag alacsony, de

vica versa, ezért a

egy számmal való

LabMagister Kft. a %ROS x R

4. ábra).


0 20406080100120

020004000 % ROS+ sperm

Mean fluorescence intensity (MFI)

Association among sperm ROS positivity parameters


% ROS+ Magas (73.7%)Magas (7609)

The best samples

The worth samples



jelenléte

különösen a

gyököket

kretálnak az ondó

a spermiumok


citometriával kvantitatívan jellemezhető. A

kifejlesztett ROS teszt


spermiumok százalékos részarányát az összes




szonylag alacsony, de

, ezért a

egy számmal való

%ROS x ROS


Magas (73.7%)Magas (7609)

The best samples

The worth samples



Az laboreredmény több ezer spermium egyedi

mérése nyomán

által használt áramlási citometria teszt a

spermiumokban levő

addig a hagyományo

Oxisperm) csupán

szemi kvantitatív

gyökök mennyiségét.

tartalma szoros összefüggést mutat a

spermiumok DNS állományának

fragmentáltságával. A tudományos irodalom

egy mintából származó

egyedi kvantitatív jellemzéséből született

eredményt megbízhatóbbnak tekinti, mint a

szemi kvantitatív

analízisén alapuló eredményeit.

elterjedtebb

LabMagister Kft. által használt

“spermium

módszer 5. ábra

5. ábra

integritás vizsgálata

5

DFI = 12 %

Acrid

in O

rang

e em

issz

ió50

0⁄52

6 nm

-en

(dup

la s

zálú

DN

S)

Enyhe savas kezelés denaturálja a DNS

Acridin Orange (AO) festék képes kötődni a szimpla szálú illetve a dupla szálú DNS lánchoz

Eltérő emissziós maximum a kötődés függvényében

Acridin Orange emisszió 460⁄650 nm



eredmény több ezer spermium egyedi

e nyomán születik.


spermiumokban levő ROS mennyiséget méri,

hagyományos ROS gyorsteszt (pl.

) csupán az ondófolyadékban jellemzi

emi kvantitatív módon

gyökök mennyiségét.




egy mintából származó



szemi kvantitatív tesztek néhány száz spermium


elterjedtebb és egyben

LabMagister Kft. által használt

spermium chromatin s

5. ábra.

Spermiumok DNS állományának

integritás vizsgálata

Módszer

LabMagister Ltd.

DFI = 12 % DFI = 27 %

Enyhe savas kezelés denaturálja a DNS-t a törések mentén

Acridin Orange (AO) festék képes kötődni a szimpla szálú illetve a dupla szálú DNS lánchoz

Eltérő emissziós maximum a kötődés függvényében

emisszió 460⁄650 nm-en (ssDNS)




k. Míg a LabMagister Kft.


ROS mennyiséget méri,

s ROS gyorsteszt (pl.

az ondófolyadékban jellemzi

módon, a reaktív oxigén

A spermiumok ROS




egy mintából származó több ezer spermium



tesztek néhány száz spermium


egyben a legelfogadottabb

LabMagister Kft. által használt,

romatin structure assay


Módszer

LabMagister Ltd.

DFI = DNS fragmentációs index

Átlag:Medián (Kvartilis 2):

Kvartilis 1:Kvartilis 3:

Dar

absz

ám


f r o m 2 0 1 6


Míg a LabMagister Kft.




az ondófolyadékban jellemzi,

a reaktív oxigén

A spermiumok ROS



fragmentáltságával. A tudományos irodalom az

több ezer spermium




Ezért egyre

a legelfogadottabb a

úgynevezett

assay” azonos


DFI = DNS fragmentációs index

Átlag: 15,3Medián (Kvartilis 2): 13,0

Kvartilis 1: 8,6Kvartilis 3: 20,5

DFI (%)


f r o m 2 0 1 6


Míg a LabMagister Kft.




,

a reaktív oxigén

A spermiumok ROS



az

több ezer spermium




Ezért egyre

a

úgynevezett

” azonos


4 | O l d a l

A mérési módszer akár több tízezer

spermiumot is képes rö

DNS fragentáltság szempontjából szemben a

hosszadalmas, csupán néhány száz spermiumot

analizáló

módszerekkel. A DNS fragmentáltság igen

fontos paraméter, tekintve, hogy szoros az

összefüggés a spermiumok DNS

fragmentáltsága és az első trimeszterben

bekövetkező abortuszok száma között

A DNS fragmentáltság szintén kihatással van a

spermiumok akroszóm

(http://www.crh.com.br/pdf/59.pdf

körülmények között az akroszóma reakciónak

akkor kell bekövetkeznie, amikor a spermium

áthalad a zona pellucidán. Mind a korai

csökkent akroszóma reakció a termékenyülés

elmaradásához ve

azoknál a pároknál, ahol

kifolyólag nem születik gyermek és a pár nő

tagjánál nem

amely a pár meddőségére

szolgáltat, érdemes elvégeztetni az

akroszóma rea

az in vitro

guideline útmutatásit

Friss ondó mintából preparált spermiumokon

megméri a spontán és a kiváltott akroszóma

reakciót, majd megadja az akroszóma reakciót

mutatató sp

(6. ábra




permiumot is képes rö



analizáló hagyományos







spermiumok akroszóm

http://www.crh.com.br/pdf/59.pdf





elmaradásához vezet. Ebből következik, hogy

azoknál a pároknál, ahol


tagjánál nem állapítható



akroszóma reakció tesztet

in vitro akroszóma reakció tesztet a WHO V.

guideline útmutatásit




mutatató spermiumok százalékos részarányát

6. ábra) LabMagister Kft. az akroszóma reakció




permiumot is képes rövid idő alatt



hagyományos szemi kvantitatív







spermiumok akroszóma reakciójára

http://www.crh.com.br/pdf/59.pdf





zet. Ebből következik, hogy

azoknál a pároknál, ahol ismeretlen okból


állapítható meg olyan elváltozás,



kció tesztet. A LabMagister Kft.

akroszóma reakció tesztet a WHO V.

guideline útmutatásit figyelembe véve




ermiumok százalékos részarányát

LabMagister Kft. az akroszóma reakció




d idő alatt analizálni



szemi kvantitatív





bekövetkező abortuszok száma között.


a reakciójára

http://www.crh.com.br/pdf/59.pdf). Fiziológiás



áthalad a zona pellucidán. Mind a korai, mind a



ismeretlen okból


meg olyan elváltozás,

amely a pár meddőségére magyarázatot

szolgáltat, érdemes elvégeztetni az in vitro

. A LabMagister Kft.


figyelembe véve végzi.









analizálni



szemi kvantitatív






a reakciójára

. Fiziológiás



mind a



ismeretlen okból


meg olyan elváltozás,

agyarázatot

in vitro

. A LabMagister Kft.


végzi.








bekövetkeztét, a belső akroszóma membránon

található CD46 fehérjéhez kötődő fluorescens

jelzett antitest segítségével detektálja.

módszer kizárólag az élő spermium

belül vizsgálja az akroszóma reakciót

spermiumok részarányát.

áramlási citometriás elkülönítésre a

LabMagister Kft. a propidium iodid festést

alkalmazza. Igény esetén a LabMagister Kft.

detektálni és

fázisban levő spermium

6. Ábra In vitro akroszóma reakció mérés

áramlási citometriával

9

Indukció nélkül

Pusz

tulá

s

AR spermiumok

További információ:

Dr. Hajnal Ágnes/Dr. Mikus Endre

[email protected]

[email protected]

Tel.: +36

Mobil: +36








umok részarányát.




detektálni és szeparálni képes

fázisban levő spermiumo

In vitro akroszóma reakció mérés

áramlási citometriával

Halott spermiumok: propidium-jodid

pozitív

Élő spermiumok: propidium-jodid

negatív

Áramlási citometriás minta regisztrátumok

Indukció nélkül

AR spermiumok

Spermium

Élő

CD46+ AR

CD46-nincs AR

Halott

További információ:


[email protected]

[email protected]

Tel.: +36-1-5052291 iroda

Mobil: +36-30-2793338








umok részarányát. Az élő/halott




eparálni képes

okat is.


Áramlási citometriás minta regisztrátumok

.

Indukció után

Halott


[email protected]

[email protected]

5052291 iroda

2793338


f r o m 2 0 1 6



jelzett antitest segítségével detektálja. A

módszer kizárólag az élő spermium állományon

belül vizsgálja az akroszóma reakciót mutató

Az élő/halott sejtek




apoptotikus


Áramlási citometriás minta

Intakt akroszómávalrendelkező spermiumok:

CD46 negatív

Akroszóma reakció végbement:CD46 pozitív


[email protected]


f r o m 2 0 1 6



A

állományon

mutató

sejtek




apoptotikus


a magyar andrológiai társaság x. kongresszusa tapolca ... fileaz uro-genitalis traktus...

Documents