a mitocôndria como alvo de toxicidade crise...
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A mitocôndria como alvo de toxicidade
Crise bioenergética induzida por xenobióticos
MECHANISTIC TOXICOLOGY. The molecular basis of how
chemicals disrupt biological targets. Boelsterli, U.A., Taylor &
Francis, London, 2005.
Cap. 15: Disruption of cellular energy production by xenobiotics.
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A mitocôndria como alvo de toxicidade 2
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A mitocôndria como alvo de toxicidade
Locais de acção de xenobióticos 3
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A mitocôndria como alvo de toxicidade 4
A membrana interna mitocondrial é um alvo frequente da
toxicidade de xenobióticos.
3 aspectos toxicologicamente relevantes :
1. A composição lipídica peculiar da membrana
mitocondrial interna: cardiolipina.
2. potencial transmembranar gerado pela respiração
mitocondrial (negativo no interior)
3. Poro de permeabilidade transitória
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A mitocôndria como alvo de toxicidade 5
Aspectos toxicologicamente relevantes:
3. Poro de permeabilidade transitória
Mega-canal composto por
complexos proteicos, atravessando
membranas mitocondriais interna
e externa.
Normalmente, baixa condutância:
gradiente de H+ é mantido.
Alta condutância:
�colapso do potencial
transmembranar e
�libertação de moléculas
sinalizadoras para citosol (cit c)--
apoptose.
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Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 6
Exs: FCCP e
DNP
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Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 7
UCPs promovem dissociação moderada
da fosforilação oxidativa
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Actividade protonoforética e dissociadora (uncoupling) 8
UCPs
[ácidos gordos] é regulada
hormonalmente
(noradrenalina)
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Inibição do sistema de transporte de electrões 9
O fluxo de electrões pode ser
inibido em vários pontos da
cadeia de transferência de
electrões
Dois tipos de inibidores:
1) bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente da cadeia (rotenona,
cianeto);
2) estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-nos a determinado
nível, desviando-os da sua via normal (agentes promotores de ciclo redox, como
doxorubicina).
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Inibição do sistema de transporte de electrões 10Inibidores que bloqueiam transporte de electrões, ligando-se a um componente específico
da cadeia.
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Inibição do sistema de transporte de electrões 11
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Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 12
Inibidores que estimulam fluxo de electrões na parte inicial da cadeia, mas captam-
nos e desviam-nos da sua via normal. O caso da DOXORUBICINA.
DXR
Complexo I (NADH:ubiquinona oxidoredutase) alvo frequente da acção de
compostos que desviam os electrões do seu fluxo normal, actuando como
receptores de electrões.
Consequências: decréscimo da produção de energia e “stresse redutor”
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Inibição do sistema de transporte de electrões e aumento da geração de ROS 13
O caso da
DOXORUBICINA
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Geração de ROS, um mecanismo utilizado por alguns fármacos para favorecer a morte programada de células
cancerígenas 14
As células cancerígenas têm uma capacidade anti-oxidante muito inferior às células
normais; são, por isso, mais susceptíveis a agentes que elevam o stresse oxidativo.
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Apoptose 15
Após recepção do sinal que desencadeia a apoptose1º evento: activação de CASPASES
-
Caspases iniciadoras
Activadoras de outras caspases
Caspases efectoras
Actuam em constituintes celulares
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Caspases e pro-caspases 16
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Acção de endonucleases activadas por caspases 17
Clivagem internucleossomal de DNA1ª alteração morfológica:
condensação da cromatina
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Mecanismos gerais de apoptose 18
min. 3H
Como reconhecem os macrófagos a célula destinada a
sofrer apoptose? PS no lado externo da membrana celular.
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Apoptose: duas vias distintas 19dependendo do tipo de célula e do sinal iniciador
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O Papel da mitocôndria na apoptose 20
Mitocôndria sequestra arsenal de
proteínas pro-apoptóticas (AIF,
Smac/DIABLO, citocromo c)
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O papel da mitocôndria na apoptose 21
A mitocôndria papel-chave na apoptose porque liberta factores que activam os eventos subsequentes.
Isto pode acontecer após activação do receptor de morte (via extrínseca) ou após estímulos internos
(via intrínseca). O stresse oxidativo é um evento importante desencadeador de apoptose.
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O Papel do citocromo c na apoptose 22
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Apoptose induzida por xenobióticos 23
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Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 24
A deficiência em CL e a diminuição da peroxidação de CL estão associadas com o aumento da resistência a estímulos pró-apoptóticos.
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Interacção da Cardiolipina com o Citocromo c 25Caspase-8
BH3
A CL oxidada pode criar instabilidade transitória da
membrana mitocondrial, favorecendo a libertação de Cit. c
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Localização da Cardiolipina na Membrana Mitocondrial 26
CL + PE (são os fosfolípidos maioritários nos
locais de contacto entre MMI e MME)
Formação de fases não lamelares podem
favorecer acesso de CL a face citosólica da
mitocôndria para ancorar tBid
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proteínas Bcl-2 e inibidores de COX-2 27
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Família de proteínas Bcl-2 e relação com poro de permeabilidade
transitória da membrana mitocondrial 28
Bcl-2 mantém MPTP no estado encerrado e inibe libertação de cit c;
Bax conduz à abertura do poro promovendo a apoptose.
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O que é o poro de permeabilidade transitória da membrana mitocondrial
29
É um complexo proteico, composto por várias proteínas:
VDAC (canal aniónico dependente de voltagem), na membrana externa;
translocador de ADP/ATP, na membrana interna;
ciclofilina D,
outras proteínas acessórias.
Função fisiológica do poro: regular
Ca2+ intramitocondrial?!
Ionóforos de Ca 2+ adicionados a células
em cultura---aumento de Ca2+
mitocondrial---abertura do poro.
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O stresse oxidativo é um importante indutor da
abertura do poro de permeabilidade transitória
da membrana mitocondrial 30
Muitos xenobióticos causadores de stresse oxidativo
(directamente, por darem lugar a ROS ou indirectamente, por
baixarem as defesas anti-oxidantes)
induzem a abertura do poro e a apoptose ou necrose.
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Learning points 31
�A toxicidade mitocondrial induzida por xenobióticos pode ter por base vários mecanismos, todos os quais conduzem, por último, a um decréscimo da produção de ATP e a uma crise energética para a célula. Locais de interferência com a função mitocondrial
incluem disponibilidade de substratos e de oxigénio, ciclo de Krebs e produção de NADH,
transporte de electrões e ejecção de protões, síntese de ATP conduzida pela ATP sintetase.
�A dissociação da fosforilação oxidativa pode ser induzida por protonóforos que reconduzem os protões extruídos no espaço intermembranar para a matriz mitocondrial,
conduzindo um ciclo fútil.
�A inibição do transporte de electrões ao nível do Complexo I pode desviar os electrões e resultar na produção de ROS. Isto potencialmente conduz a dano oxidativo do DNAmitocondrial muito susceptível.
�Doxorubicina pode injuriar o músculo cardíaco devido a ter uma alta afinidade por cardolipina mitocondrial e poder iniciar um ciclo redox.
�O stresse oxidativo e outras formas de stresse induzido por compostos químicos pode levar à abertura do poro de permeabilidade transitória mitocondrial, com colapso do potencial membranar da mitocôndria, esgotamento do ATP e facilitando a libertação de factores pro-apoptóticos.
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Abordagens técnicas ao estudo da
função mitocondrial sob o efeito
de xenobióticos
Bioquímica, Voet & Voet, 3ª Ed.,2004
e protocolos das aulas práticas
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Avaliação do funcionamento da cadeia mitocondrial de transporte de electrões, por medida do consumo de oxigénio
em câmara fechada (eléctrodo de oxigénio) 33
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Estabelecimento da sequência de complexos transportadores de electrões por bloqueamento do fluxo de electrões com
inibidores selectivos da cadeia mitocondrial 34
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A fosforilação e a oxidação estão estreitamente associadas 35
ADP
Tempo
∆O2
Estado 4
Estado 3
Estado 4
veloc consumo O2 est.3
veloc consumo O2 est.4ICR =
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Estequiometria da oxidação associada à fosforilação 36
Razão ADP/O = ATP sintetizado por átomo de Oxigénio reduzido (par de electrões captado)
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Efeito de dissociadores da fosforilação oxidativa 37
[O2]≈0
ADPFCCP
FCCP
ADP
oligomicina
FCCP
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Efeitos tóxicos de xenobióticos no potencial transmembranar mitocondrial 38
Registos típicos do potencial
transmembranar mitocondrial suportado
por succinato, na ausência e na presença de
metopreno nas concentrações indicadas.
Efeito do metopreno no potencial
transmembranar mitocondrial. O parâmetro
“Energização inicial” refere-se ao potencial
obtido para cada experiência, imediatamente
antes de adicionar o metopreno.
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Efeitos de xenobióticos na indução da abertura do poro de
permeabilidade transitória mitocondrial induzida por Ca2+ 39
Decréscim
o da pseudo-
absorvência
intumescim
ento