a simple and reliable method for the silver impregnation of nerves in paraffin sections of soft and...

8/2/2019 A simple and reliable method for the silver impregnation of nerves in paraffin sections of soft and mineralized tissues

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J . A n a t . ( 1 9 7 8 ) , 1 2 7 , 3 , p p . 5 4 3 - 5 5 1 543W i t h 5 f i g u r e sP r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

A s i m p l e and r e l i a b l e method f o r t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n o fn e r v e s i n p a r a f f i n s e c t i o n s o f s o f t and m i n e r a l i z e d t i s s u e s

J . E . LINDERD e p a r t m e n t o f O r a l P a t h o l o g y , T h e D e n t a l S c h o o l ,L o n d o n H o s p i t a l M e d i c a l C o l l e g e , T u r n e r S t r e e t , L o n d o n E l 2AD

( A c c e p t e d 1 0 J a n u a r y 1 9 7 8 )INTRODUCTION

N u m e r o u s s i l v e r i m p r e g n a t i o n m e t h o d s f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f n e r v e s i n p a r a f f i ns e c t i o n s h a v e b e e n d e s c r i b e d ( D a v e n p o r t , 1 9 3 0 ; B o d i a n , 1 9 3 6 ; H o l m e s , 1 9 4 3 ;R o m a n e s , 1 9 5 0 ; U n g e w i t t e r , 1 9 5 1 ; S a m u e l , 1 9 5 3 a ; F e a r n h e a d & L i n d e r , 1 9 5 6 ;R o w l e s & B r a i n , 1 9 5 9 ) . H o w e v e r , m a n y a r e t e c h n i c a l l y d i f f i c u l t t o p e r f o r m a n d ,t e s t e d b y t h e c r i t e r i a t h a t a l l n e r v e s s h o u l d b e i m p r e g n a t e d , t h a t t h e y s h o u l d b ec l e a r l y d i f f e r e n t i a t e d f r o m o t h e r s t r u c t u r e s a n d t h a t t h e i r m o r p h o l o g y s h o u l d b ec l e a r l y s h o w n , m o s t m e t h o d s f a l l s h o r t . I t w a s t h e r e f o r e d e c i d e d t o i n v e s t i g a t e t h ef a c t o r s w h i c h m a y b e r e s p o n s i b l e f o r s p e c i f i c i t y a n d q u a l i t y o f t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n .G u i d e d b y p r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s o f t h e b a s i c m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h e r e a c t i o n( S a m u e l , 1 9 5 3 b ; P e t e r s , 1 9 5 5 a , b ; W o l m a n , 1 9 5 5 ; F e a r n h e a d & L i n d e r , 1 9 5 6 ;R o w l e s , 1 9 6 0 ) t h e s e f a c t o r s s e e m l i k e l y t o i n c l u d e : m e t h o d s o f f i x a t i o n a n d t i s s u ep r e p a r a t i o n ; t h e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n i s c a r r i e d o u t , i np a r t i c u l a r t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t y p e o f s i l v e r c o m p o u n d u s e d , pH a n d b u f f e r t y p e ;t h e t e m p e r a t u r e a n d i n c u b a t i o n t i m e ; t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e d e v e l o p i n g s o l u t i o nu s e d t o p r o d u c e t h e f i n a l v i s i b l e e n d r e s u l t . E a c h o f t h e s e f a c t o r s h a s b e e n e x a m i n e d ,a n d a s i m p l e m e t h o d f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f n e r v e s h a s b e e n e v o l v e d . T h ee f f e c t s o f v a r i a t i o n , a n d t h e t e c h n i q u e a r e d e s c r i b e d .

R e c o m m e n d e d t e c h n i q u eF i x a t i o n a n d p r o c e s s i r n gS p e c i m e n s a r e f i x e d w h e r e p o s s i b l e b y p e r f u s i o n , o t h e r w i s e s m a l l t h i n p i e c e s o fs o f t t i s s u e a r e i m m e r s e d i n t h e f i x a t i v e . F o r s t u d y o f t h e p u l p s o f f u l l y d e v e l o p e d

t e e t h t h e r o o t a p i c e s m u s t b e c u t o f f i m m e d i a t e l y a f t e r e x t r a c t i o n , o r e l s e t h e t o o t hm u s t b e s p l i t l o n g i t u d i n a l l y . T h e f i x a t i v e s u s e d a r e 4 % f o r m a l d e h y d e s a l i n e , B a k e r ' sf o r m a l d e h y d e c a l c i u m c h l o r i d e , L i l l i e ' s f o r m a l d e h y d e c a l c i u m a c e t a t e a n d B o u i n ' sf l u i d ( L i l l i e , 1 9 6 5 ) . C a l c i f i e d t i s s u e s a r e f i x e d f o r a b o u t 1 w e e k a n d t h e n t r a n s f e r r e dt o a 1 0 % ( w / v ) s o l u t i o n o f s o d i u m EDTA a t pH 7 0 , o r t o a b u f f e r e d s o l u t i o n o ff o r m i c a c i d ( K r i s t e n s e n , 1 9 4 8 ) . T h e e n d - p o i n t o f d e c a l c i f i c a t i o n i s d e t e r m i n e d b yr a d i o g r a p h y , a n d t h e d e c a l c i f y i n g a g e n t c a r e f u l l y r e m o v e d b y w a s h i n g t h e t i s s u e i nr u n n i n g t a p w a t e r f o r s e v e r a l h o u r s . T h e s p e c i m e n i s t h e n d e h y d r a t e d i n e t h y la l c o h o l , t r a n s f e r r e d t o b e n z e n e o r c h l o r o f o r m , a n d i n f i l t r a t e d i n p a r a f f i n wa x ( m e l t i n gp o i n t 5 6 C ) . S e c t i o n s r a n g i n g f r o m 5 t o 1 0 ,m i n t h i c k n e s s a r e c u t a n d m o u n t e d ons l i d e s u s i n g a h o t p l a t e a t 4 5 C t o f l a t t e n a n d d r y t h e m .

ANA 1 2 73 5


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J . E . LINDERS o l u t i o n r e q u i r e d

( a ) B u f f e r s t o c k s o l u t i o n . A 0 - 1 M s o l u t i o n o f 2 , 4 , 6 - c o l l i d i n e ( H o p k i n & W i l l i a m s ,m a t e r i a l f o r c h r o m a t o g r a p h y ) i s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 6 5 m l o f c o l l i d i n e i na p p r o x i m a t e l y 4 5 0 m l d i s t i l l e d w a t e r . T h e s o l u t i o n i s t h e n f i l t e r e d t o r e m o v e a l lt r a c e s o f s o l i d a n d a s u f f i c i e n t v o l u m e o f 1 0 % ( w / v ) s o l u t i o n o f n i t r i c a c i d( A n a l a r ) a d d e d t o b r i n g t h e pH t o 7 ' 2 . T h e v o l u m e i s t h e n made u p t o 5 0 0 m l w i t hd i s t i l l e d w a t e r . T h i s s o l u t i o n c a n b e s t o r e d i n d e f i n i t e l y a t + 4 ' C .( b ) D i l u t e d b u f f e r . To o b t a i n a w o r k i n g s o l u t i o n 8 m l o f s t o c k s o l u t i o n i s a d d e d t o9 2 m l d i s t i l l e d w a t e r , w h i c h i s t h e n h e a t e d t o t h e t e m p e r a t u r e a t w h i c h t h e i m p r e g -n a t i o n i s c a r r i e d o u t , n a m e l y 4 0 o r 6 0 ' C .( c ) T h e s i l v e r i m p r e g n a t i n g s o l u t i o n . E i g h t y f o u r m l d i s t i l l e d w a t e r i s h e a t e d t oa b o u t 6 0 ' C , t h e n , i n t h e f o l l o w i n g o r d e r , a r e a d d e d t o i t : 4 m l 1 % ( w / v ) s i l v e rn i t r a t e , 4 m l 0 ' 3 8 % ( w / v ) s o d i u m c y a n a t e a n d f i n a l l y 8 m l c o l l i d i n e b u f f e r . ( S t o c ks o l u t i o n . )( d ) D e v e l o p e r s t o c k s o l u t i o n . T w e n t y g s o d i u m s u l p h i t e ( N a 2 S O 3 . 7 H 2 0 , A n a l a r ) a n d4 - 7 5 g b o r a x ( A n a l a r ) a r e d i s s o l v e d i n a b o u t 4 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r b y h e a t i n gt o a b o u t 5 0 ' C . T e n g o f s h e e t g e l a t i n e ( B e l g i a n B r o n z e L a b e l ) i s t h e n a d d e d t o t h i ss o l u t i o n w h i l e s t i l l h o t a n d s t i r r e d u n t i l d i s s o l v e d . T h e v o l u m e i s t h e n m a d e u p t o5 0 0 m l w i t h d i s t i l l e d w a t e r .( e ) D e v e l o p e r w o r k i n g s o l u t i o n . To o b t a i n a w o r k i n g s o l u t i o n 5 m l o f 2 % ( w / v )q u i n o l i s a d d e d t o 9 5 m l d e v e l o p e r s t o c k s o l u t i o n a n d t h o r o u g h l y m i x e d . Toa c t i v a t e t h e d e v e l o p e r 2 m l 1 % ( w / v ) s i l v e r n i t r a t e ( A n a l a r ) i s a d d e d , w i t h c o n s t a n ts t i r r i n g . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e d e v e l o p e r s h o u l d b e a p p r o x i m a t e l y 2 5 ' C ; i f t h et e m p e r a t u r e f a l l s b e l o w 2 0 ' C t h e g e l a t i n e s o l i d i f i e s , r e s u l t i n g i n u n e v e n d e p o s i t i o no f s i l v e r ; i f o n t h e o t h e r h a n d t h e t e m p e r a t u r e i s a b o v e 3 0 ' C t h e s p e e d o f d e v e l o p -m e n t i n c r e a s e s t o s u c h a n e x t e n t t h a t i t s c o n t r o l i s d i f f i c u l t . T h e f i n a l s o l u t i o nc a n b e k e p t u n t i l t u r b i d i t y d e v e l o p s a n d n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n o f s i l v e r t a k e sp l a c e . A l l t h e s t o c k s o l u t i o n s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e 2 % q u i n o l , a r e c o m p l e t e l ys t a b l e . T h e q u i n o l c a n b e u s e d o v e r s e v e r a l w e e k s , p a r t i c u l a r l y i f s t o r e d i n a s t o p -p e r e d b o t t l e a n d r e f r i g e r a t e d ; t h e s l i g h t b r o w n d i s c o l o r a t i o n w h i c h d e v e l o p s w i t ht i m e d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h i t s a c t i v i t y .T h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n

S e c t i o n s a r e d e - w a x e d w i t h x y l e n e , t r a n s f e r r e d t o a b s o l u t e a l c o h o l , a n d t h e nc o v e r e d w i t h a t h i n f i l m o f c e l l o i d i n b y d i p p i n g t h e s l i d e i n t o a 0 - 2 % ( w / v ) s o l u t i o no f c e l l o i d i n i n a b s o l u t e a l c o h o l - e t h e r ( 5 0 : 5 0 ) . T h e s l i d e s a r e t h e n c a r e f u l l y d r a i n e da n d , a f t e r p a r t i a l d r y i n g , t h e c e l l o i d i n f i l m i s h a r d e n e d b y i m m e r s i o n i n 7 0 % a l c o h o l .S e c t i o n s a r e t h e n w a s h e d , f i r s t i n r u n n i n g t a p w a t e r f o r 3 0 m i n u t e s , a n d t h e n i nd i s t i l l e d w a t e r ( t h r e e c h a n g e s ) t o r e m o v e a l l t r a c e s o f f i x a t i v e a n d / o r a c i d . T h es e c t i o n s a r e n e x t p l a c e d i n d i l u t e d b u f f e r w h e r e t h e y a r e l e f t e i t h e r o v e r n i g h t ( a b o u t1 6 h o u r s ) a t a b o u t 4 0 ' C o r f o r 1 0 - 3 0 m i n u t e s a t 6 0 ' C . T h e l o n g e r i n c u b a t i o n a tt h e l o w e r t e m p e r a t u r e i s more s u i t a b l e f o r d e c a l c i f i e d t i s s u e , b u t s e c t i o n s o f s o f tt i s s u e g i v e g o o d r e s u l t s u n d e r b o t h c o n d i t i o n s .S e c t i o n s a r e t h e n t r a n s f e r r e d i n t o t h e s i l v e r i m p r e g n a t i n g s o l u t i o n a t t h e s a m et e m p e r a t u r e a s t h a t c h o s e n f o r t h e p r e v i o u s b u f f e r s t a g e a n d i n c u b a t e d f o r 1 7 2 h o u r sa t 4 0 ' C o r 1 0 - 3 0 m i n u t e s a t 6 0 ' C ; t h e y a r e w a s h e d i n s e v e r a l c h a n g e s o f d i s t i l l e dw a t e r f o r 3 m i n u t e s a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o d e v e l o p e r a t a p p r o x i m a t e l y 2 5 ' C . T h e

5 4 4


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I m p r o v e d s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e sd e v e l o p m e n t o f t h e p r i m a r y s i l v e r i m p r e g n a t i o n i n t h e s e c t i o n s , w h i c h u p t i l l n o wh a v e r e m a i n e d c o l o u r l e s s , s t a r t s s l o w l y , b u t a s s o o n a s t h e s e c t i o n s h a v e t a k e n o na p a l e g o l d e n t o n e , s p e e d o f d e v e l o p m e n t i n c r e a s e s . P r o g r e s s i s m o n i t o r e d e a s i l yw i t h t h e n a k e d e y e , o r , i f d e s i r e d , b y r i n s i n g i n d i s t i l l e d w a t e r a n d e x a m i n i n g w i t ht h e m i c r o s c o p e . When r e s u l t s a r e j u d g e d t o b e o p t i m a l , i . e . maximum c o n t r a s tb e t w e e n n e r v o u s t i s s u e a n d b a c k g r o u n d , t h e s e c t i o n s a r e w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r ,d e h y d r a t e d w i t h e t h a n o l , c l e a r e d i n x y l e n e a n d m o u n t e d i n C a n a d a b a l s a m .

- I , ' !.

I( -

*~de404

fkf

F i g . 1 . R a b b i t t o n g u e ( 6 # u m s e c t o r ) . N e r v e f i b r e s a r e w e l l d e f i n e d , s t r o n g l y i m p r e g n a t e d a n dc l e a r l y d i f f e r e n t i a t e d f r o m o t h e r s t r u c t u r e s . x 4 0 0 .RESULTS

A t y p i c a l r e s u l t u s i n g t h i s m e t h o d i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 . N e r v e f i b r e s , b o t hm y e l i n a t e d a n d n o n - m y e l i n a t e d , a r e s t r o n g l y i m p r e g n a t e d , w e l l - d e f i n e d , a n d c l e a r l yd i f f e r e n t i a t e d f r o m o t h e r s t r u c t u r e s . C o n n e c t i v e t i s s u e f i b r e s u s u a l l y s t a i n a d i f f u s ep a l e g o l d c o l o u r ; n u c l e i a n d , i n p a r t i c u l a r n u c l e o l i , a r e v e r y d i s c r e t e l y i m p r e g n a t e d ;s t r i a t e d m u s c l e f i b r e s a n d t h e i r c r o s s - s t r i a t i o n s a r e u s u a l l y v e r y c l e a r l y i m p r e g n a t e d ;m e l a n i n , i f p r e s e n t , h a s a s t r o n g a f f i n i t y f o r s i l v e r , a n d i s h e a v i l y i m p r e g n a t e d . A l lo t h e r s t r u c t u r e s a r e s t a i n e d i n v a r i o u s s h a d e s o f g o l d - b r o w n .

DISCUSSIONE v o l u t i o n o f t h e t e c h n i q u eT i s s u e p r o c e s s i n g

( a ) F i x a t i o n . A l l t h e f o r m a l d e h y d e - c o n t a i n i n g f i x a t i v e s g a v e g o o d r e s u l t s . T h er e s u l t s o b t a i n e d w i t h B o u i n ' s f l u i d w e r e a d e q u a t e , b u t t h e v e r y f i n e s t n e r v e f i b r e s d i d3 5 - 2

5 4 5


4/9

n o t i m p r e g n a t e s o c l e a r l y . I t i s i m p o r t a n t f o r t i s s u e s t o b e f i x e d t h o r o u g h l y a n dp r o m p t l y . I m p r e g n a t i o n o f s e c t i o n s p r e p a r e d f r o m p o o r l y f i x e d t i s s u e s h o w e ds t r i k i n g c h a n g e s : l a r g e m y e l i n a t e d n e r v e f i b r e s a p p e a r e d v a c u o l a t e d a n d s h o w e dr e d u c e d a f f i n i t y f o r s i l v e r , p o s s i b l y d u e t o l o s s o f l i p i d , a n d t h e f i n e r n e r v e f i b r e s a n dn e r v e e n d i n g s w e r e o f t e n u n s t a i n e d .( b ) D e c a l c i f i c a t i o n . B o t h K r i s t e n s e n ' s f o r m i c a c i d s o l u t i o n a n d 1 0 % EDTA p r o v e ds u i t a b l e . W h e n e v e r p o s s i b l e , h o w e v e r , e s p e c i a l l y f o r t i s s u e s w h i c h r e q u i r e o n l y s l i g h t

t i u ' i'4t *'v'?l.I . k F*A \ + 8 * ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ *

V. 40141

; A z 0. W

F i g . 2 . S i m i l a r s e c t i o n o f r a b b i t t o n g u e t o F i g . 1 , b u t i n c u b a t e d a t room t e m p e r a t u r e i nK r i s t e n s e n ' s f o r m i c a c i d m i x t u r e f o r 5 h o u r s a n d t h e n i m p r e g n a t e d w i t h s i l v e r . T h i s h a s r e s u l t e di n a w e a k e r i m p r e g n a t i o n o f n u c l e i , c o n n e c t i v e t i s s u e s a n d o t h e r s t r u c t u r e s , b u t n e r v e f i b r e s h a v er e t a i n e d t h e i r a f f i n i t y v i r t u a l l y u n d i n i i n i s h e d . x 4 0 0 .d e c a l c i f i c a t i o n , s u c h a s f e t a l t i s s u e s , t h e c h e l a t i n g a g e n t i s p r e f e r r e d . I f s p e e d i si m p o r t a n t , a c i d d e c a l c i f i c a t i o n i s a d e q u a t e , a l t h o u g h p r o l o n g e d u s e o f a c i d w i l ld e c r e a s e t h e amount o f s i l v e r t a k e n u p d u r i n g i m p r e g n a t i o n .To t e s t t h e e f f e c t o f a c i d , p a r a f f i n s e c t i o n s o f r a b b i t t o n g u e w e r e i n c u b a t e d a t roomt e m p e r a t u r e i n K r i s t e n s e n ' s f o r m i c a c i d s o l u t i o n f o r 5 h o u r s , w a s h e d i n t a p w a t e ra n d d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e n i m p r e g n a t e d w i t h s i l v e r a t 4 0 ' C . A c o n t r o l s e c t i o n n o tt r e a t e d w i t h a c i d was i n c l u d e d . I m p r e g n a t i o n o f n u c l e i , c o n n e c t i v e t i s s u e a n d o t h e rs t r u c t u r e s was much w e a k e r i n t h e a c i d - t r e a t e d s e c t i o n , a l t h o u g h n e r v e f i b r e s r e t a i n e dt h e i r a f f i n i t y f o r t h e s i l v e r ( F i g . 2 ) .S i l v e r i m p r e g n a t i o n

( a ) T h e b u f f e r . As t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n h a s t o b e c a r r i e d o u t i n a pH c o n t r o l l e de n v i r o n m e n t , b u f f e r s a r e e s s e n t i a l . T h e c h o i c e o f b u f f e r i s i m p o r t a n t a s i t m a y r e a c tn o t o n l y w i t h t h e s i l v e r c o m p o u n d c o n t a i n e d i n t h e i m p r e g n a t i n g s o l u t i o n , b u t

5 4 6 J . E . LINDER


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I m p r o v e d s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e s

~7 ' r4~~~~42L ' S

F i g . 3 . T o o t h p u l p ( 6 , u m ) . T h e s e c t i o n h a s b e e n i m p r e g n a t e d w i t h a s i l v e r c y a n a t e - P a l i t z s c hb u f f e r m i x t u r e . T h e r e s u l t i n g r e a c t i o n i s c o m p l e t e l y n o n - s p e c i f i c , w i t h i m p r e g n a t i o n o f n u c l e ia n d c o n n e c t i v e t i s s u e i n a d d i t i o n t o n e r v e s . x 4 0 0 .

- 1

F i g . 4 . T o o t h p u l p ( 6 , u m ) . T h i s s e c t i o n i s a d j a c e n t t o t h e o n e s h o w n i n F i g . 3 , b u t h a s b e e ni m p r e g n a t e d w i t h t h e s t a n d a r d s i l v e r c y a n a t e - c o l l i d i n e b u f f e r m i x t u r e . T h e r e s u l t i n g r e a c t i o n i sa l m o s t e x c l u s i v e l y c o n f i n e d t o n e r v e s . x 4 0 0 .

5 4 7


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a l s o w i t h t h e t i s s u e , a l t e r i n g a f f i n i t i e s o f t i s s u e c o m p o n e n t s f o r t h e s i l v e r . Two t y p e so f b u f f e r h a v e b e e n t e s t e d : P a l i t z s c h ' s b o r a x - b o r i c a c i d b u f f e r ( F e a r n h e a d & L i n d e r ,1 9 5 6 ) a n d t h e c o l l i d i n e - n i t r i c a c i d b u f f e r d e s c r i b e d a b o v e ( R o w l e s & B r a i n , 1 9 5 9 ) .T h e l a t t e r i s m o r e u s e f u l a s i t i s c o m p a t i b l e w i t h b o t h s i l v e r c o m p o u n d s u s e d ( s i l v e rn i t r a t e a n d s i l v e r c y a n a t e ) , w h e r e a s P a l i t z s c h ' s b u f f e r c a n o n l y b e u s e d w i t h s i l v e rn i t r a t e . When u s e d w i t h s i l v e r c y a n a t e , b o r a x r e a c t s t o f o r m a c o m p l e t e l y n o n - s p e c i f i ci m p r e g n a t i o n ( F i g s . 3 , 4 ) . C o l l i d i n e i s c l o s e l y r e l a t e d t o p y r i d i n e , w h i c h w a s u s e d b yB i e l s c h o w s k y ( B r o n t e G a t e n b y & B e a m s , 1 9 5 0 ) i n h i s m e t h o d f o r f r o z e n s e c t i o n s t o

. - _

F i g . 5 . R a b b i t t o n g u e ( 6 p s m ) . T h i s s e c t i o n h a s b e e n i n c u b a t e d i n d i l u t e d c o l l i d i n e b u f f e r a t 6 0 Cf o r 8 0 m i n u t e s a n d t h e n i m p r e g n a t e d w i t h s i l v e r . I m p r e g n a t i o n o f n u c l e i , c o n n e c t i v e t i s s u e a n do t h e r t i s s u e e l e m e n t s i s v i r t u a l l y a b s e n t , b u t n e r v e f i b r e s h a v e r e t a i n e d t h e i r a f f i n i t y f o r s i l v e r .I n t h e c e n t r e o f t h e p h o t o g r a p h , i n n e r v a t i o n o f m u s c l e i s s e e n w i t h f i n e t e r m i n a l f i b r i l s i n d i c a t i n gt h e p o s i t i o n o f a m o t o r e n d p l a t e . x 4 0 0 .r e d u c e t h e a r g y r o p h i l i a o f c o n n e c t i v e t i s s u e a n d n u c l e i , a c h i e v i n g t h u s a m o r e p r e c i s ed i f f e r e n t i a t i o n o f a x i s c y l i n d e r s . To t e s t i f c o l l i d i n e p r o d u c e d a s i m i l a r e f f e c t , s e c t i o n so f s o f t a n d o f d e c a l c i f i e d t i s s u e w e r e i n c u b a t e d i n d i l u t e d c o l l i d i n e b u f f e r a t 4 0 Ca n d a t 6 0 C f o r a c o n t r o l l e d t i m e s e q u e n c e a n d t h e n i m p r e g n a t e d w i t h s i l v e r . T h er e s u l t s s h o w t h a t , w i t h i n c r e a s i n g e x p o s u r e t o t h e c o l l i d i n e b u f f e r , t h e i n t e n s i t y o ft h e i m p r e g n a t i o n o f n u c l e i , c o n n e c t i v e t i s s u e a n d o t h e r s t r u c t u r e s d e c r e a s e s , w h i l en e r v e f i b r e s f u l l y r e t a i n t h e i r a f f i n i t y f o r s i l v e r ( F i g . 5 ) .( b ) T y p e o f s i l v e r c o m p o u n d u s e d . B o t h s i l v e r c y a n a t e ( R o w l e s , 1 9 6 0 ) a n d s i l v e rn i t r a t e a r e s u i t a b l e . S i l v e r c y a n a t e c r y s t a l l i s e s i n c o l o u r l e s s n e e d l e s a n d i s o n l ys l i g h t l y s o l u b l e i n c o l d w a t e r . I t i s n o t c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e b u t c a n b e p r e p a r e db y m i x i n g e q u i v a l e n t a m o u n t s o f s o l u t i o n s o f s i l v e r n i t r a t e a n d s o d i u m c y a n a t e .S o l u t i o n s o f s i l v e r c y a n a t e a r e o n l y w e a k l y d i s s o c i a t e d a n d w i l l i m p r e g n a t e t h e n e r v e

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I m p r o v e d s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e sf i b r e s i n s e c t i o n s o f p e r i p h e r a l t i s s u e m o r e s p e c i f i c a l l y t h a n c a n b e a c h i e v e d w i t h s i l v e rn i t r a t e , w h i c h w i l l f r e q u e n t l y s t a i n c o l l a g e n a n d r e t i c u l i n f i b r e s v e r y h e a v i l y . I n t h eCNS, h o w e v e r , w h e r e t h e r e a r e f e w c o n n e c t i v e t i s s u e f i b r e s , s i l v e r n i t r a t e i s p r e f e r a b l e ,a s t h e n e r v e f i b r e s b e c o m e m o r e i n t e n s e l y i m p r e g n a t e d . T h e i m p r e g n a t i n g s o l u t i o nc a n b e a d a p t e d q u i t e e a s i l y b y o m i t t i n g t h e s o d i u m c y a n a t e , l e a v i n g t h e r e m a i n d e ro f t h e s o l u t i o n u n a l t e r e d .

( c ) p H , t i m e a n d t e m p e r a t u r e o f i n c u b a t i o n . T h e s p e c i f i c i t y o f s i l v e r i m p r e g n a t i o nd e p e n d s l a r g e l y u p o n a n i n t e r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p H , t i m e , t e m p e r a t u r e a n d s i l v e rc o n c e n t r a t i o n o f t h e i m p r e g n a t i n g s o l u t i o n ( S a m u e l , 1 9 5 3 a , b ; P e t e r s , 1 9 5 5 a , b ;F e a r n h e a d & L i n d e r , 1 9 5 6 ) . F e a m h e a d & L i n d e r u s e d a s i l v e r i m p r e g n a t i n g s o l u t i o nb u f f e r e d t o pH 7 0 w h i c h g a v e c o n s i s t e n t l y w e l l d i f f e r e n t i a t e d s t a i n i n g o f n e r v e s i nt e e t h ; pH 7 0 w a s t h e r e f o r e s e l e c t e d f o r t h e p r e s e n t m e t h o d . To a d j u s t t h e pH o ft h e i m p r e g n a t i n g s o l u t i o n t o t h i s l e v e l , t h e b u f f e r s t o c k s h o u l d b e a t pH 7 - 2 a t roomt e m p e r a t u r e s o t h a t w h e n t h e b u f f e r i s s u i t a b l y d i l u t e d a n d i n c o r p o r a t e d i n t h e warmi m p r e g n a t i n g s o l u t i o n t h e f i n a l pH w i l l b e a b o u t 7 0 .To e v a l u a t e t h e e f f e c t o f t i m e a n d t e m p e r a t u r e , s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d a t 4 0 - 4 5 Ca n d a t 6 0 C f o r 1 0 , 2 0 , 4 0 , 8 0 a n d 1 2 0 m i n u t e s . D i f f e r e n t i a t i o n b e t w e e n n e r v o u s a n dn o n - n e r v o u s t i s s u e w a s o p t i m a l a f t e r a b o u t 9 0 m i n u t e s a t t h e l o w e r t e m p e r a t u r e ,b u t a c o r r e s p o n d i n g d e g r e e o f s p e c i f i c i t y w a s o b t a i n e d a f t e r 1 0 - 1 5 m i n u t e s a t t h eh i g h e r t e m p e r a t u r e . S p e c i f i c i t y a n d c o m p l e t e n e s s o f i m p r e g n a t i o n i s b e s t i nd e c a l c i f i e d s e c t i o n s a f t e r i m p r e g n a t i o n a t 4 0 C w h i l e s o f t t i s s u e w i l l g i v e e q u a l l yg o o d r e s u l t s a t 4 0 C o r 6 0 ' C . I f s e c t i o n s a r e i m p r e g n a t e d f o r a much l o n g e rt i m e , n o t o n l y w i l l t h e o v e r a l l i n t e n s i t y o f s i l v e r i m p r e g n a t i o n i n c r e a s e , b u t o t h e rf i b r i l l a r s t r u c t u r e s , s u c h a s c o l l a g e n a n d r e t i c u l i n , m a y s t a i n h e a v i l y .( d ) D e v e l o p m e n t . A p h y s i c a l m e t h o d o f d e v e l o p m e n t i s u s e d t o p r o d u c e t h e f i n a lr e s u l t b y d e p o s i t i n g s i l v e r c o n t a i n e d i n t h e d e v e l o p e r o n t o s i l v e r n u c l e i f o r m e d i nt h e t i s s u e d u r i n g i m p r e g n a t i o n . As s p e c i f i c i t y o f d e v e l o p m e n t d e p e n d s o n t h e b a l a n c eb e t w e e n q u i n o l , s o d i u m s u l p h i t e , t h e a mount o f a v a i l a b l e s i l v e r n i t r a t e , a n d t h e t y p eo f g e l a t i n e u s e d , o n l y c h e m i c a l s o f h i g h p u r i t y s h o u l d b e e m p l o y e d . T h e t y p e s o fg e l a t i n e f o u n d s u i t a b l e w e r e B e l g i a n B r o n z e a n d G o l d L a b e l s h e e t g e l a t i n e . T h ed e v e l o p e r c a n b e u s e d u n t i l i t h a s b e c o m e t u r b i d , a f t e r w h i c h i t ma y d e p o s i t s i l v e rn o n - s p e c i f i c a l l y . P r o g r e s s o f d e v e l o p m e n t c a n b e f o l l o w e d b y a c h a n g e o f c o l o u rt a k i n g p l a c e i n t h e s e c t i o n . I t w i l l a s s u m e a p a l e g o l d e n c o l o u r a f t e r 1 - 2 m i n u t e s ,w h i c h w i l l g r a d u a l l y d a r k e n a n d b e c o m e b r o w n a f t e r a b o u t 5 - 6 m i n u t e s . I f t h ep r o g r e s s o f d e v e l o p m e n t i s m o n i t o r e d w i t h t h e m i c r o s c o p e t h e f i r s t s t r u c t u r e s t os t a i n c a n b e s e e n t o b e l a r g e m y e l i n a t e d n e r v e b u n d l e s , v o l u n t a r y m u s c l e f i b r e s a n dc e l l n u c l e i . U s u a l l y , a f t e r a b o u t 5 - 6 m i n u t e s ' d e v e l o p m e n t when t h e s e c t i o n h a sb e c o m e d a r k g o l d t o l i g h t b r o w n , t h e r e w i l l b e o p t i m a l c o n t r a s t b e t w e e n n e r v o u sa n d n o n - n e r v o u s t i s s u e . I f d e v e l o p m e n t i s c a r r i e d on b e y o n d t h i s s t a g e t h e c o n t r a s tb e t w e e n n e r v e s a n d o t h e r t i s s u e s w i l l d i m i n i s h a s t h e i n t e n s i t y o f t h e b a c k g r o u n di n c r e a s e s . C o l l a g e n a n d r e t i c u l i n f i b r e s a l s o b e g i n t o t a k e u p s i l v e r , s i m u l a t i n g t h ea p p e a r a n c e o f n e r v e f i b r e s , a n d s p e c i f i c i t y t h u s s u f f e r s . D e v e l o p m e n t c a n b e s t o p p e da t a n y t i m e b y r e m o v i n g t h e s e c t i o n f r o m t h e d e v e l o p e r a n d w a s h i n g w i t h d i s t i l l e dw a t e r . T h e f i n a l i m p r e g n a t i o n , a l t h o u g h g e n e r a l l y s t a b l e a n d p e r m a n e n t , m a yo c c a s i o n a l l y f a d e a f t e r t h e s e c t i o n h a s b e e n m o u n t e d f o r some m o n t h s i n b a l s a m .T h i s m a y b e d u e t o t h e s o l v e n t a c t i o n o f c l e a r i n g a g e n t s , s u c h a s e x c e s s i v e a m o u n t so f t e r p i n e o l l e f t on t h e s e c t i o n s p r i o r t o m o u n t i n g . F a d e d p r e p a r a t i o n s c a n b e s a l -v a g e d b y r e d e v e l o p m e n t . G o l d t o n i n g o f t h e s e c t i o n , b y means o f w h i c h t h e r e d u c e ds i l v e r i s r e p l a c e d b y g o l d , w i l l a l s o a v o i d t h i s f a d i n g ( B i e l s c h o w s k y , 1 9 2 7 ) .

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J . E . LINDERAPPLICATION

E a r l i e r s i l v e r i m p r e g n a t i o n t e c h n i q u e s o f t e n a p p e a r e d t o b e m o r e s u c c e s s f u l w i t hs o m e s p e c i e s ; f o r e x a m p l e , a m e t h o d w o r k i n g e x t r e m e l y w e l l w i t h m a m m a l i a n t i s s u ei s s o m e t i m e s u n s u c c e s s f u l w i t h f i s h , a m p h i b i a n s a n d r e p t i l e s . F e a r n h e a d & L i n d e rf o u n d t h a t t h e i r t e c h n i q u e w o r k e d v e r y w e l l o n d e c a l c i f i e d m a t e r i a l , b u t w a s l e s sp r e d i c t a b l e o n s o f t t i s s u e s w h i c h h a d n o t b e e n s u b j e c t e d t o d e c a l c i f i c a t i o n .W i t h t h e p r e s e n t t e c h n i q u e , e q u a l l y g o o d r e s u l t s h a v e b e e n a c h i e v e d r e p e a t e d l yw i t h m a m m a l i a n a n d f i s h m a t e r i a l , e i t h e r d e c a l c i f i e d o r n o n - d e c a l c i f i e d , i n p e r i p h e r a lo r c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m , a n d i n e i t h e r a d u l t o r e m b r y o .As t h e i m p r e g n a t i o n c a n q u i t e e a s i l y b e r e s t r i c t e d t o n e r v o u s t i s s u e , t h e m e t h o dh a s w i d e a p p l i c a t i o n s , f o r e x a m p l e , t o i n v e s t i g a t i o n s i n v o l v i n g g r a p h i c r e c o n s t r u c t i o no f t h e n e r v e s u p p l y o f v a r i o u s t i s s u e s a n d o r g a n s .

SUMMARYTo i m p r o v e e x i s t i n g m e t h o d s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f n e r v e s i n r o u t i n e s e c t i o n st h e f a c t o r s m o s t l i k e l y t o b e r e s p o n s i b l e f o r s p e c i f i c i t y , r e l i a b i l i t y a n d r e p r o d u c i b i l i t yo f t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d . T h e s e i n c l u d e d m e t h o d s o f f i x a t i o na n d t i s s u e p r e p a r a t i o n , c o n c e n t r a t i o n a n d t y p e o f s i l v e r c o m p o u n d u s e d , pH a n db u f f e r t y p e , t e m p e r a t u r e a n d i n c u b a t i o n t i m e , a n d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e d e v e l o p -i n g s o l u t i o n . G u i d e d b y t h e r e s u l t s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n a s i m p l e , e a s i l y r e p e a t a b l e

t e c h n i q u e f o r t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e s i n h i s t o l o g i c a l s e c t i o n s h a s b e e ne v o l v e d .T i s s u e i s f i x e d b y i m m e r s i o n , o r p r e f e r a b l y b y p e r f u s i o n , w i t h f o r m a l d e h y d e -c o n t a i n i n g f i x a t i v e s . H a r d t i s s u e i s d e c a l c i f i e d e i t h e r i n 1 0 % ( w / v ) Na-EDTA a t

pH 7 0 o r i n K r i s t e n s e n ' s f o r m i c a c i d m i x t u r e , t h e n e m b e d d e d i n p a r a f f i n a n d c u t a t6 - 1 0 , u m . M o u n t e d s e c t i o n s a r e d e - w a x e d , w a s h e d i n t a p w a t e r f o l l o w e d b y d i s t i l l e dw a t e r , a n d t r a n s f e r r e d t o a n 8 mM ( p H 7 - 2 ) c o l l i d i n e - n i t r i c a c i d m i x t u r e , w h e r e t h e ya r e l e f t e i t h e r o v e r n i g h t a t 4 0 C o r f o r 1 0 - 3 0 m i n u t e s a t 6 0 ' C .T h e s e c t i o n s a r e t h e n t r a n s f e r r e d i n t o a 2 - 3 mM s i l v e r c y a n a t e s o l u t i o n b u f f e r e da t pH 7 - 2 a t t h e s a m e t e m p e r a t u r e a s t h e p r e v i o u s b u f f e r s t a g e , a n d i n c u b a t e d f o r1-2 h o u r s a t 4 0 ' C o r 1 0 - 3 0 m i n u t e s a t 6 0 ' C . T h e y a r e t h e n w a s h e d i n d i s t i l l e dw a t e r , t r a n s f e r r e d t o a p h y s i c a l d e v e l o p e r c o n t a i n i n g 1 5 8 6 mM s o d i u m s u l p h i t e( N a 2 S O 3 . 7 H 2 0 ) , 2 4 - 9 mM b o r a x , 2 % ( w / v ) s h e e t g e l a t i n e , 1 - 1 2 mM s i l v e r n i t r a t e a n d9 mM q u i n o l . D e v e l o p m e n t o f t h e l a t e n t i m a g e o f t h e s i l v e r i m p r e g n a t e d t i s s u ee l e m e n t s i s m o n i t o r e d b y w a s h i n g i n d i s t i l l e d w a t e r a n d c h e c k i n g w i t h t h e m i c r o s c o p e .S e c t i o n s a r e t h e n d e h y d r a t e d , c l e a r e d a n d m o u n t e d i n b a l s a m . M y e l i n a t e d a s w e l l a sn o n - m y e l i n a t e d n e r v e s , i n t r a d e n t i n a l f i b r e s , a n d v a r i o u s t y p e s o f n e r v e e n d o r g a n ss u c h a s m o t o r e n d p l a t e s , a s w e l l a s i n t r a e p i t h e l i a l n e r v e s , a r e i m p r e g n a t e d w i t ha h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y a n d c o n t r a s t .

I w o u l d l i k e t o e x p r e s s m y g r a t i t u d e f o r t h e g r e a t h e l p a n d a d v i c e g i v e n t o m e b yP r o f e s s o r N . W. J o h n s o n , P r o f e s s o r R . W. F e a r n h e a d a n d Dr D . M. W i l l i a m s .

5 5 0


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I m p r o v e d s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e s 5 5 1REFERENCES

B I E L S C H O W S K Y , M. ( 1 9 2 7 ) . I n E n z y k l o p d d i e d e r m i k r o s k o p i s c h e n T e c h n i k , 3 r d e d i t i o n , v o l . 3 ( e d . R .K r a u s e ) , p . 1 6 8 5 . B e r l i n , W i e n : U r b a n & S c h w a r z e n b e r g .B O D I A N , D . ( 1 9 3 6 ) . A n e w m e t h o d f o r s t a i n i n g n e r v e f i b r e s a n d n e r v e e n d i n g s i n m o u n t e d p a r a f f i n s e c t i o n s .A n a t o m i c a l R e c o r d 6 5 , 8 9 - 9 7 .B R O N T E G A T E N B Y , J . & B E A M S , H . W. ( 1 9 5 0 ) . I n T h e M i c r o m o t i s t ' s V a d e - M e c u m ( B o l l e s L e e ) , 1 1 t he d i t i o n , p p . 5 2 6 - 5 2 7 . L o n d o n : J . & A . C h u r c h i l l , L t d .D A VE N P O R T , H . A . ( 1 9 3 0 ) . S t a i n i n g n e r v e f i b r e s i n m o u n t e d s e c t i o n s w i t h a l c o h o l i c s i l v e r n i t r a t e .A r c h i v e s o f N e u r o l o g y a n d P s y c h i a t r y 2 4 , 6 9 0 - 6 9 5 .F E A R N H E A D , R . W. & L I N D E R , J . E . ( 1 9 5 6 ) . O b s e r v a t i o n s o n t h e s i l v e r i m p r e g n a t i o n o f n e r v e f i b r e s i nt e e t h . J o u r n a l o f A n a t o m y 9 0 , 2 2 8 - 2 3 5 .H O L M E S , W. ( 1 9 4 3 ) . S i l v e r s t a i n i n g o f n e r v e a x o n s i n p a r a f f i n s e c t i o n s . A n a t o m i c a l R e c o r d 8 6 , 1 5 7 - 1 8 5 .K R I S T E N S E N , H . ( 1 9 4 8 ) . An i m p r o v e d m e t h o d o f d e c a l c i f i c a t i o n . S t a i n T e c h n o l o g y 2 3 , 1 5 1 - 1 5 4 .L I L L I E , R . D . ( 1 9 6 5 ) . I n H i s t o p a t h o l o g i c T e c h n i c a n d P r a c t i c a l H i s t o c h e m i s t r y , 3 r d e d i t i o n , p p . 3 7 , 3 8 , 5 8 .N e w Y o r k : M c G r a w - H i l l Book C o m p a n y .P E T E R S , A . ( 1 9 5 5 a ) . E x p e r i m e n t s o n t h e m e c h a n i s m o f s i l v e r s t a i n i n g . P a r t I . I m p r e g n a t i o n . Q u a r t e r l yJ o u r n a l o f M i c r o s c o p i c a l S c i e n c e 9 6 , 8 4 - 1 0 2 .P E T E R S , A . ( 1 9 5 5 b ) . E x p e r i n e n t s on t h e m e c h a n i s m o f s i l v e r s t a i n i n g . P a r t I I . D e v e l o p m e n t . Q u a r t e r l yJ o u r n a l o f M i c r o s c o p i c a l S c i e n c e 9 6 , 1 0 3 - 1 1 5 .R O M A N E S , G . J . ( 1 9 5 0 ) . T h e s t a i n i n g o f n e r v e f i b r e s i n p a r a f f i n s e c t i o n s w i t h s i l v e r . J o u r n a l o f A n a t o m y8 4 , 1 0 4 - 1 1 5 .R O W L E S , S . L . ( 1 9 6 0 ) . Some o b s e r v a t i o n s o n U n g e w i t t e r ' s m e t h o d f o r s t a i n i n g n e r v e f i b r e s a n d n e r v ee n d i n g s i n t i s s u e s e c t i o n s . A r c h i v e s o f O r a l B i o l o g y 2 , 8 9 - 9 5 .R O W L E S , S . L . & B R A I N , E . B . ( 1 9 5 9 ) . An i m p r o v e d s i l v e r m e t h o d f o r s t a i n i n g n e r v e f i b r e s i n d e c a l c i f i e ds e c t i o n s o f t e e t h . A r c h i v e s o f O r a l B i o l o g y 2 , 6 4 - 6 8 .S A M U E L , E . P . ( 1 9 5 3 a ) . I m p r e g n a t i o n a n d d e v e l o p m e n t i n s i l v e r s t a i n i n g . J o u r n a l o f A n a t o m y 8 7 , 2 6 8 - 2 7 7 .S A M U E L , E . P . ( 1 9 5 3 b ) . T h e m e c h a n i s m o f s i l v e r s t a i n i n g . J o u r n a l o f A n a t o m y 8 7 , 2 7 8 - 2 8 7 .U N G E W I T T E R , L . H . ( 1 9 5 1 ) . A u r e a s i l v e r n i t r a t e m e t h o d f o r n e r v e f i b r e s a n d n e r v e e n d i n g s . S t a i nT e c h n o l o g y 2 6 , 7 3 - 7 8 .WOLMAN, M. ( 1 9 5 5 ) . S t u d i e s o f t h e i m p r e g n a t i o n o f n e r v o u s t i s s u e e l e m e n t s . I . I m p r e g n a t i o n o f a x o n sa n d m y e l i n . Q u a r t e r l y J o u r n a l o f M i c r o s c o p i c a l S c i e n c e 9 6 , 3 2 9 - 3 3 6 .

a simple and reliable method for the silver impregnation of nerves in paraffin sections of soft and...

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