J. Muchová, Z. Ďuračková

Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, LF UK Bratislava

Klinická biochémia - nové trendy

(Oxidačný stres v patológii niektorých ochorení -

ako ho rozpoznať a ako sa proti nemu brániť)

Vývoj špecifických, spoľahlivých a

neinvazívnych metód vhodných na

meranie oxidačného stresu u ľudí

má zásadný význam pre vysvetlenie

úlohy voľných radikálov v patológii

ľudských ochorení.

Kritéria pre ideálny biomarker oxidačného poškodenia

A. Základné kritérium

Biomarker by mal vyjadrovať prognózu neskoršieho

vývoja ochorenia

B. Technické kritériá

• Mal by detegovať hlavnú časť celkového oxidačného

poškodenia in vivo

• Koeficient inter-variácie medzi meraniami tej istej vzorky by

mal byť menší ako intra-variabilné rozdiely medzi subjektmi

• Jeho hladina by nemala mať široký rozptyl v tých istých

subjektoch v rôznych časoch za rovnakých podmienok

• Jeho stanovenie by malo využívať priame chemické analytické

metódy

• Nemal by byť ovplyvnený diétou

• Mal by byť stabilný počas uskladnenia a netvoriť artefakty

Existuje nejaký všeobecný biomarker oxidačného poškodenia a oxidačného stresu?

NIE

V bunkách vystavených silnému oxidačnému stresu

biomarkery oxidačného poškodenia rôznych biomolekúl

rastú paralelne

V zdravých tkanivách takáto korelácia nie je

1. Detekciou voľných radikálov

2. Meraním produktov oxidačného stresu

3. Meraním antioxidantov

4. Meraním opravnej kapacity, resp. aktivity opravných (reparačných) enzýmov

A. Priame merania

Magnetická Rezonancia

Elektrónová spinová rezonancia (Berliner et al.2001, Han et al.2001

Jadrová magnetická rezonancia Utsumi & Yamada, 2003)

Stanovenie látok s nespárenými elektrónmi - metóda dokazuje ich prítomnosť a identitu

Pulzná rádiolýza

Chemiluminiscencia buniek a tkanív

Fluorescenčné sledovanie radikálov

Stanovenie: - superoxidu (UV oblasť)

- H2O2 (240 nm)

- NO (porfyrínová elektróda)

- peroxynitritu (302 nm)

B. Nepriame merania

RS majú len veľmi krátku životnosť (okrem H2O2, NO)

„Spin trapping“ ER – ak sa radikály zachytia do stabilnejšieho aduktu (DMPO – 5,5-

dimetyl-1-pyrolín-N-oxid)

Stanovenie superoxidu – nepriame metódy využívajú jeho schopnosť redukovať

detektorovú molekulu na farebný produkt (cyc c – 550 nm,

INT – 510 nm...)

Stanovenie H2O2 – merania O2 elektródou po pridaní katalázy, fluorimetrická

detekcia s použitím peroxidázovej reakcie

Aromatická hydroxylácia – odráža tvorbu •OH (salicylát s •OH tvorí 2,3 –

dihydrobenzoát (2,3-DHB), 2,5-DHB a katechol)

Stanovenie nitrátov a nitritov - konečné metabolity NO

Stanovenie peroxynitritu – imunochemická detekcia 3-nitrotyrozínu

POŠKODENIE LIPIDOV

POŠKODENIE PROTEÍNOV

POŠKODENIE DNA

2. Meranie produktov oxidačného

stresu

Poškodenie lipidov

*Peroxidácia lipidov – hlavná črta oxidačného stresu

*Kvantifikácia primárnych alebo sekundárnych produktov lipoperoxidácie

*Primárne produkty: konjugované diény

lipidové hydroperoxidy

*Sekundárne produkty: TBARP, MDA, alkány, (4-HNE),

izoprostány

Lipoperoxidácia R 1

R 2

Fosfolipid LH

Alkylový radikál

Konjugovaný dién alkylového radikálu

Peroxylový radikál

O O

malondialdehyd (MDA)

R 1

R 2

O

O

H

LOOH

Peroxylový radikál Alkoxylový radikál

Hydroperoxid

Alkanaly Alkenaly (4-HNE, MDA)

štiepenie

R 2 O

H

Alkenylový (alebo alkanylový) radikál Alkenal

modifikácia biomolekúl

O 2

Komplex Fe(II) Komplex Fe(III)

R

RH

L

L

LOO

R 1

R 2

R 1

R 2

R 1

R 2

O

O RH

R

R 2

O O

R 1

R 1

R 2

O

LO

R 1

R 2

O

O LOO

R 1

RH

R

Alkény

Alkány

pľúca

Produkty oxidačného poškodenia VNKK

ALDEHYD Malondialdehyd Propanal, Butanal Etanal, Pentanal Hexanal 2,4-Heptadienal 4-Hydroxy-2-hexenal 4-Hydroxy-2-oktenal 4-Hydroxy-2-nonenal 4-Hydroxy-nona-2,6-dienal 4,5-Dihydroxydecenal

VNKK 18:3, 20:4, 20:5, 20:6 18:2, 20:4 18:2, 20:4 18:2, 20:4 18:2, 20:4 22:6 18:2, 20:4 18:2, 20:4 20:5, 22:6 20:4

Produkty oxidačného poškodenia lipidov

• veľké množstvo rôznych produktov

• veľká variabilita vytvoreného množstva jednotlivých produktov

• konjugované diény (lag-time, 234 nm) – extrémne nestále – nie sú akceptované

• MDA – jednoduchý TBARP test – neakceptuje sa

• MDA-TBA chromogen – HPLC – akceptuje sa

EDTA-plazma (0,13-0,63, priemer 0,36 mol/l ),

citrátová plazma (0,61-2,57, priemer 1,43 mol/l ) (Suttnar et al, 2001)

Výhody a nevýhody stanovenia MDA ako TBARP

MDA nie je špecifický produkt Tvorba MDA z VNKK s tromi a viac dvojitými väzbami Tvoria sa aj ďalšie aldehydové produkty (propanal, hexanal, 4HNE, akroleín) MDA - substrát pre ďalšie reakcie - Schiffove zásady Aldehydy sa absorbujú aj z potravy (MDA-aminokyseliny) Tvorba MDA z nelipidových molekúl (aminokyseliny, sacharidy, bilirubín, DNA) TBARP

TBA

CH=O

CH2

CH=O

Izoprostány – markery oxidačného poškodenia lipidov

F2-izoprostány (8-iso-PGF2) (Fam&Marrow, 2003) z arachidónovej kys.

F4-izoprostány (Roberts & Morrow, 2002) z eikozapentaénovej

a dokozahexaénovej kyseliny

Zvýšená hladina izoprostánov: AD, cievne ochorenia, diabetes mellitus, ateroskleróza, endotelová dysfunkcia, chronická obštrukčná choroba pľúc a bronchiálna astma

Analýza (plazma, moč):

MS (Lawson et al., 1999), imunochemicky (komerčné sety)

• 30-40 pg/ml plazmy

Stanovenie F2-izoprostánov

Meranie je založené na kompetícii medzi 8-Izo

vo vzorke a 8-izo viazanými s AchE o protilátky

králičieho antiséra proti 8-Izo. Vzniknuté

konjugáty sú vychytávané IgG, ktoré sú

prichytené na dno mikrotitračnej platne.

Množstvo zachyteného konjugátu sa stanovuje

pomocou Ellmanovho činidla, ktoré obsahuje

substrát pre acetylcholínesterázu. Reakcia

acetylcholínesterázy so substrátom vyvolá

farebnú zmenu reakčnej sústavy. Zmena

zafarbenia je nepriamo úmerná množstvu

voľných 8-Izo vo vzorke.

Oxidačné poškodenie proteínov

PRIMÁRNE

reakcie katalyzované iónmi prechodných prvkov

radiácia

ozón, oxidy dusíka, HOCl

SEKUNDÁRNE

Proteíny sú modifikované produktmi oxidácie iných molekúl (väzba 4HNE a MDA na -NH2 a -SH skupiny)

Oxidácia proteínov

NH

O

CO NH R NH2

CO

HOOC

NH RNH COOH

Prolín Pyroglutamát Glutamát

O

C

H

CH2 CH

2 CH

COR

NH R

O

C

OH

CH CH2 CH

2CH

2 NH

NHNH

2

NH2

Arginín Semialdehyd kyseliny glutámovej

NH

C

O

CH2

CH

NHR

COR

CHO NH

C

O

CH2

CH

NHR

COR

CHONH2

CH

NH

COOH

Tryptofán N - Formylkynurenín Kynurenín

HOS CH2

CH

NHR

COR HO2S CH

2CH

NHR

COR HO3S CH

2CH

NHR

CORSH CH

2CH

NH2

COOH

Cysteín Sulfenát Sulfinát Sulfonát

Stanovenie produktov oxidačného poškodenia proteínov

KARBONYLOVÉ PROTEÍNY Spektrofotometricky s DNPH (Abraham Z. a kol., 1994)

HPLC s DNPH (370 nm) [pmol] (Shacter E. a kol., 1996)

ELISA (Buss H. a kol., 1997)

3-NITROTYROZÍN HPLC s EC detektorom (Hensley K. a kol., 2000)

DITYROZÍN – v moči, mozgu – fluorescenčné sondy (Davies et al., 1999, Sakharov et al., 2003)

HO

COOH

H2NO2N

•Oxidačné poškodenie purínových a

pyrimidínových zásad

• Oxidačné poškodenie deoxyribózovej

jednotky (C4-D ribózy)

• Jednovláknové alebo dvojvláknové

zlomy DNA

OXIDAČNÉ POŠKODENIE DNA

STANOVENIE OXIDAČNÉHO POŠKODENIA DNA

*V izolovanej DNA stanovenie oxidačne poškodených

dusíkových zásad 8-oxo-dG/8-oxoG

* Zvýšený účinok oxidantov

* Znížený účinok reparačných systémov

* Stanovenie produktov v moči 8-oxo-dG /8-oxoG

* Jedno- a dvojvláknové zlomy DNA v lymfocytoch

Na stanovenie oxidačného poškodenia DNA sa môžu použiť viaceré metódy:

o HPLC/MS (hmotnostná spektrometria)

o ELISA (Kasai H.)

o HPLC/EC (elektrochemický detektor)

o Kométova metóda

Jednobunková gélová elektroforéza

Enzýmovo modifikovaná kométova metóda

- Fpg (oxidované puríny)

- endonukleáza III (oxidované pyrimidíny)

(Collins et al., 2004, ESCODD 2003, 2004)

a) Trieda 0 – nepoškodená DNA

b) Trieda 1 – veľmi málo poškodená DNA

c) Trieda 2 – poškodenia s viditeľným chvostom

d) Trieda 3 – väčšia časť DNA je v chvoste

e) Trieda 4 – takmer celá DNA je v chvoste

0 1 2

3 4

HPLC/EC METÓDA Meranie hladín 8-oxo-dG v sére v lymfocytoch Príprava vzorky:

Centrifugácia séra 1500 x g, 10 min

Ultracentrifiltrácia séra Filter Microcon YM-10

1500x g, 60 min

HPLC analýza

Izolácia DNA z

jadier lymfocytov

alebo z tkanív

(150-250 µg DNA)

Hydrolýza DNA

s fosfatázou

a nukleázou P

HPLC analýza

Kolóna: Nucleosil C18 5 mm, 250 x 4 mm

Mobilná fáza: 50 mM KH2PO4

(pH 5,5) s 5,5% metanolu

Prietok: 0,8 ml/min

Detekcia: ESA Coulochem II EC detector (20 mV, 500 mV)

Konvalina I. et al., 2004

8-oxo-dG

HPLC chromatograf vzorky séra a vzorky s interným štandardom

ESCODD: Collins, A.R., ….. Ďuračková, Z., et al., 2002

Hydrofilné, plazma

Kyselina askorbová

Kyselina močová

Glutatión - plazma

Bilirubín

Albumín

Transferín

Ceruloplazmín

Polyfenoly

- SH skupiny

Lipofilné, plazma

-, -tokoferol

-karotén

Lykopén

Luteín

Ubichinón

Erytrocyty, plazma

Superoxiddizmutáza Glutatiónperoxidáza

Glutatiónreduktáza

Paraoxonáza

Glutatión

3. Parametre antioxidačného stavu

Stanovenie aktivity SOD

NEPRIAME METÓDY STANOVENIA AKTIVITY SOD

Pri skúmaní antioxidantov sa musí definovať

• cieľová molekula/substrát

• zdroj OS

• použitá metóda na stanovenie antioxidantov

Preanalytika:

Vit. E, -karotén, Ko-Q: citrát/EDTA plazma, -25°C, niekoľko týždňov

Vit. C: citrát/EDTA plazma rýchlo získaná v tme, -80°C, niekoľko týždňov

SOD: krv (heparín, citrát, EDTA) Ery - lyzát GPx - krv (heparín, EDTA),

PON: NIE EDTA plazma, -80°C

TAS: závisí od metódy

Metódy používané na stanovenie TAS Test

TRAP

ORAC

TAS

TEAC

FRAP

Plasma-Lag

Oxidant

ABAP

AAPH

Feryl-Mb/H2O2

K2S2O8

Fe3+-TPTZ

Cu2+

Princíp stanovenia

Poškodenie proteínu R-PE

Inhibícia oxidácie proteínu -PE

Inhibícia oxidácie ABTS na ABTS.+

Inhibícia oxidácie ABTS na ABTS.+ Redukcia na Fe2+-TPTZ

Kinetika absorbancie pri 245 nm

Literatúra

Ghiselli 1995

Cao 1993

Miller 1993

Re 1999

Benzie 1996

Schnitzer 1995

TRAP - Total Radical Trapping Antioxidant Parameter

ABAP - 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride

ORAC – Oxygen radical absorbance capacity

AAPH - 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) hydrochloride

TEAC – Trolox equivalent antioxidant capacity

ABTS - 2,2’-azinobis-(3-etyl-benzotiazolin-6-sulfónová kys.)

FRAP – Ferric reducing antioxidant power

TPTZ - 2,4,6-tripyridyl-s-triazine, PE - phycoerythrin

Ďalšie markery oxidačného stresu

Hydroperoxidy lipidov a proteínov (El-Saadani et al., 1989)

AGE produkty (HPLC, imunochemická detekcia)

(Takahashi et al., 1993, Izuhara et al., 1999)

Lipofuscín (Tsuchida et al., 1987)

Alantoín (HPLC) (Žitňanová et al., 2004)

LMW-Cu a Fe (Ďuračková et al.: 2000)

OXIDAČNÝ STRES

MONITOROVAŤ

NIE JE ĽAHKÉ

OXIDAČNÝ STRES

MONITOROVAŤ

JE VŠAK MOŽNÉ

OXIDAČNÝ STRES

MONITOROVAŤ

JE POTREBNÉ

MONITOROVANIE OXIDAČNÉHO STRESU UMOŽNÍ

poznať príčinu poškodenia (druh oxidanta)

poznať dôsledok (poškodené molekuly)

cielene voliť farmakoterapiu

ZÁVER *Monitorovať oxidačný stres je potrebné.

*Poznanie skutočného stavu oxidačného stresu umožní

cielenú aplikáciu antioxidantov s vylúčením možnosti

sekundárneho poškodenia.

*Úspešnosť antioxidačnej terapie bude závisieť od

toho ako dobre budeme poznať exaktnú úlohu RM vo

fyziologických aj patologických procesoch a hlavne

prostredie, v ktorom pôsobia.

ĎAKUJEM ZA POZORNOSŤ