30

บทที่ 3

การออกแบบการทดลอง

แผนการทดลองในภาพรวม 3.1 การทดลองเตรียมสารสกัดหยาบฟาทะลายโจรจากผงพืชสมุนไพร 3.2 การทดลองหาสูตรและสภาวะการเตรียมเม็ดเจลไคโตซานโดยใชวิธีการ droplet extrusion เพื่อกลบรสขมของสารสกัดฟาทะลายโจรมีรสขมลดลง 3.3 การทดลองหาสูตรยาเม็ดแตกตัวเร็วในปากใหไดยาเม็ดท่ีแตกตัวในเวลาไมเกิน 60 วินาทีและยาเม็ดมีคา crushing strength อยางนอย 2 กิโลกรัม การทดลองท้ัง 3 สวนมีความสัมพันธกันดังรูปท่ี 3.1 โดยทําการสกัดผงสมุนไพรแหงดวยตัวทําละลายท่ีเหมาะสม แลวทําใหสารสกัดเหลวกลายเปนผงแหง นําสารสกัดแหงไปกลบรสขมโดยใชไคโตซานไดเปนเม็ดเจลท่ีมีความขมลดลง นําเม็ดเจลท่ีมีตัวยามาผสมกับแกรนูลของสารเจือจางและตอกเปนเม็ดยา สุดทายนํายาเม็ดมาผานกรรมวิธีเพิ่มความพรุนและเพิ่มความแข็ง

การทดลองสกัดและการทําใหแหง การทดลองหาสูตรยาเม็ด

แตกตัวเร็วในปาก

การทดลองกลบรสขม โดยวิธี droplet extrusion  

ผสม

การตอกเปนยาเม็ดและทําการเพ่ิมความพรุนและความแข็ง

รูปท่ี 3.1 ภาพรวมในการเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปากของสารสกัดฟาทะลายโจร

แกรนูลของสารเจือจางท่ีมีความพรุน เม็ดเจลของสารสกัด

ไคติน, กลูโคส, เมนทอล และซูโครส

ผงแหงสารสกัด

ผงสมุนไพร

ยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก

31

3. 1 การเตรียมผงแหงสารสกัดหยาบฟาทะลายโจร สารเคมี 1. ผงสมุนไพรฟาทะลายโจรบดแหง 2. แอลกอฮอล บริสุทธ์ิ 95 เปอรเซ็นต 3. น้ํากล่ัน 4. ผงแปงมันสําปะหลัง 5. ผงไคโตซานกุงชนิดโอลิโกเมอร 6. Kedd's reagents เคร่ืองมือและอุปกรณ 1. เคร่ืองช่ังน้าํหนัก top load ทศนิยม 2 ตําแหนง (Ohaus) 2. เคร่ืองสกัดท่ีมีใบพัด ดดัแปลงจากเคร่ืองวัดการละลายของยาชนดิหลุมเดยีว (EYELA Dissolution Tester DE-1s) 3. Rotary vacuum evaporator (EYELA N-N series) 4. Digital water bath (EYELA SB-651) 5. Cooler (EYELA cool Ace CA-11) 6. Round bottom flask 2 L 7. Vacuum pump  8. Filter paper no.42 (Whatman) 9. Büchner funnel 10. Vacuum flask

ขั้นตอนการเตรียมสารสกัด 1. เลือกวัตถุดบิผงสมุนไพรฟาทะลายโจรบดละเอียดและอบแหง 2. ตรวจสอบเอกลักษณเบ้ืองตนโดย Kedd's reagents และ คา Rf

3. วิเคราะหปริมาณความช้ืน, crude extract และ andrographolide ในผงพืชสมุนไพร 4. ช่ังผงสมุนไพรฟาทะลายโจรบดแหง น้าํหนัก 95 กรัม 5. บรรจุผงสมุนไพรลงเคร่ืองสกัด

32

6. เตรียมเอทานอล 85 เปอรเซ็นต จาก เอทานอล 95 เปอรเซ็นต

Ethanol 95 % 85 parts of ethanol 95 %

85 %

Water 0 % 10 parts of water 7. ช่ังเอทานอล 85 เปอรเซ็นต น้ําหนัก 950 กรัม บรรจุลงเคร่ืองสกัด สภาวะการสกัด

- อัตราสวนผงสมุนไพรบดแหงตอตัวทําละลายคือผงสมุนไพร 10 ตอตัวทําละลาย 1 สวน โดยน้ําหนกั

- อัตราการหมุนใบพัด 200 รอบตอนาที - อุณหภูมิการสกัดท่ี 50 องศาเซลเซียส - ระยะเวลาสกัด 6 ช่ัวโมง

8. ทําการสกัด 5 คร้ัง รวมใชผงสมุนไพร 475 กรัม และ เอทานอล 85 เปอรเซ็นต ปริมาณ 4750 กรัม

9. แยกน้ํายาสารสกัดเจือจางออกจากกากโดยกรองผานกระดาษกรองเบอร 42 ภายใตสุญญากาศ 10 ระเหยนํ้ายาสารสกดัเจือจาง ภายใตสุญญากาศดวยเคร่ือง rotary evaporator

สภาวะการระเหย - อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส - แรงดัน 60 - 70 มิลลิเมตรปรอท - ความเร็วรอบการปน 4 – 5 รอบ - round bottom flask ขนาดบรรจุ 2 ลิตร - บรรจุสารสกัดลงไปคร้ังละ 500 มิลลิลิตร - ใชเวลาในการระเหยแตละคร้ังประมาณ 20 นาที

11. เม่ืออัตราการระเหยนอยมากจึงปดเคร่ืองและเทสารสกัดเขมขนลง crystallizing dish เพื่อใหตะกอนสารสกัดเกดิการตกตะกอนรวมตัวกัน

12. นําสารสกัดเขมขนมาระเหยน้ําบน magnetic stirrer with hot plate อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส จนไดน้ํายาเขมขน

33

13. ผสมนํ้ายาสารสกัดท่ีเขมขนเขากับสารดูดซับ เชน ผงแปงมันสําปะหลัง 100 กรัมหรือ ผงไคโตซานกุงชนิดโอลิโกเมอร 50 กรัม คนผสมใหเขากนั แลวเทสารผสมลงถาดปากกวาง และกระจายสารผสมท่ัวถาด

14. ลางสารผสมท่ีติดคางบน crystallizing dish และรวมน้ําลางลงถาดสารผสม 15. อบสารผสม 50 องศาเซลเซียสประมาณ 1 - 2 ช่ัวโมง จนไดสารผสมเปยกหมาด 16. ผสมตัวดูดซับอีกในปริมาณเทากับการผสมครั้งแรก และผสมใหท่ัวถาด สารผสมจะมีความ หนืดลดลง การเกาะติดถาดลดลง 17. อบสารผสม 50 องศาเซลเซียสประมาณ 8 ช่ัวโมง จนไดสารผสมแหงเปนกอนเล็ก ๆ 18. แรงสารผสมดวยเคร่ือง oscillating granulator ผานแรงเบอร 14 ไดแกรนูลและผงละเอียด 19. นําแกรนลูมาบดในโกรงใหเปนผงท่ีผานแรงเบอร 100 20. เก็บผงสารสกัดในภาชนะปดสนิทและแหง 21. วิเคราะหกึ่งปริมาณ andrographolide โดย HPTLC

22. กลบรสขมโดยวิธี 3.2 ฉ (การเตรียมเม็ดเจล) และ 3.3 จ (การเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก)

3. 2 การทดลองกลบรสขมของสารสกัดฟาทะลายโจร แผนการทดลองในภาพรวม 3.2.1 การทดลองหา coagulation medium ท่ีใหเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง 3.2.2 การทดลองหาระยะหางท่ีเหมาะสมระหวางปลายเข็มและผิวหนา coagulation medium

3.2.3 การทดลองเตรียมเม็ดเจลแหงจากไคโตซานปู, กุงและปลาหมึก

3.2.4 การเตรียมเม็ดเจลแหงจากไคโตซานกุง

3.2.1 การทดลองหา coagulation medium ท่ีใหเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง จุดประสงคการทดลอง

เพื่อหาวา coagulation medium ท่ีประกอบดวย โซเดียม ซิเตรตเพียงอยางเดียวหรือcoagulation medium ท่ีประกอบดวย โซเดียม ซิเตรตและโซเดียมอัลจิเนต จะใหเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง แผนการทดลอง ก. การระบุผลตอบสนอง (responses) ท่ีตองการ

- การเกดิเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง ข. การกําหนดปจจยั (factors) และระดับ (levels) ดังตารางท่ี 3.1

34

ตารางท่ี 3.1 ปจจัยและระดบัในการทดลองหา coagulation medium ท่ีใหเม็ดเจลเปยกท่ี แข็งแรง

ปจจัย ตัวแปรตน ระดับ 1 2 3 4 5 อัตราสวนของผงยาตอไคโตซานโดยน้ําหนัก

X1 5 0 : 1 1 : 1 2 : 1 3 : 1 4 : 1

ความเขมขนโซเดียม อัลจิเนต ( % w/v )

X2 2 0 0.5 - - -

ความเขมขนโซเดียม ซิเตรต ( % w/v )

X3 4 1 2 5 10 -

วิธีการทดลอง 1. ช่ังสารละลายไคโตซานปู ความเขมขน 1 เปอรเซ็นต ปริมาณ 10 กรัมและผสมผงสารสกัดฟา

ทะลายโจรท่ีผสมไคโตซานโอลิโกเมอรกุง ไดเปนสารแขวนตะกอน 2. กําหนดระยะหางระหวางปลายเข็มหางจากผิวหนา coagulation medium เทากับ10 ซม. 3. เตรียม coagulation medium ดังตารางท่ี 3.2 โดยผสมสารละลายโซเดียมซิเตรต 5 มิลลิลิตร และ

สารละลายโซเดียมอัลจิเนต ปริมาณ 5 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากันดวยแทงแกวและเทลงจานแกว (Petri dish) ขนาดเล็ก

4. หยด สารแขวนตะกอนของสารสกัดและไคโตซานลงจานแกวท่ีมี coagulation medium 5. ท้ิงใหเม็ดเจลแชในจานแกวนาน 2 ช่ัวโมง 6. ตักเม็ดเจลจากจานแกวสูหลอดทดลอง 7. ดูดน้ํากล่ัน 10 มิลลิลิตรใสหลอดทดลอง ลางเม็ดเจลโดยกลับหลอดทดลองไปมา 2 รอบและเท

เม็ดเจลลงจานแกวใบใหม 8. ตักเม็ดเจลออกจากถาดแกว และวางบนกระจกนาฬิกา ตักเม็ดจากโดยรินน้ําออกใหมากท่ีสุด

9. ตักเม็ดเจลลงจานแกวขนาดใหญ ท่ีผิวหนาแหงสนิท

10. ใช spatula แยกเม็ดเจลท่ีเกาะกลุมออกจากกัน และปลอยใหแหงท่ีอุณหภูมิหอง 12 ช่ัวโมง 11. บันทึกผลการเกิดเจลเปยกท่ีแข็งแรง โดยเม็ดเจลท่ีแข็งแรงหมายถึงเม็ดเจลท่ีสามารถตักออกมา

จาก coagulation medium ได ไมแตกตัวเม่ือลางน้ําและสามารถทําการแยกเปนเม็ดเดี่ยว ๆ ไดดวย spatula และยังคงสภาพการเปนเม็ดอยู

35

ตารางท่ี 3.2 สูตรการเตรียมเม็ดเจลจากการหยดสารผสมของสารละลายไคโตซานปูเขมขน 1 เปอรเซ็นต และสารสกัดฟาทะลายโจรลงใน coagulation medium ชนิดตาง ๆ

X1 รหัส X2 X3

0:1 1:1 2:1 3:1 4:1

1c 1 2c 2 3c 5 4c

0

10 5c 1 6c 2 7c 5 8c

0.5

10

3.2.2 การทดลองหาระยะหางท่ีเหมาะสมระหวางปลายเข็มและผิวหนา coagulation medium จุดประสงคการทดลอง

เพื่อหาระยะหางท่ีเหมาะสมในการหยดสารละลายไคโตซาน ลงบน coagulation medium แผนการทดลอง ก. การระบุผลตอบสนอง (responses) ท่ีตองการ - การเกดิเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง ข. การกําหนดปจจยั (factors) และระดับ (levels) ตารางท่ี 3.3 ปจจัยและระดบัในการทดลองหาระยะหางท่ีเหมาะสมระหวางปลายเข็มและ

ผิวหนา coagulation medium

ปจจัย ตัวแปรตน ระดับ 1 2 ระยะหางระหวางปลายเข็มและผิวหนา coagulation medium

X1 2 10 ซม. 5 ซม.

วิธีการทดลอง 1. ช่ังสารละลายไคโตซานปู ความเขมขน 1 เปอรเซ็นต ปริมาณ 10 กรัม ผสมผงยาอัตราสวน 4: 1

2. กําหนดระยะหางระหวางปลายเข็มและผิวหนา coagulation medium เทากับ 5 และ 10 ซม.

36

3. ผสมสารละลายโซเดียมซิเตรต 2 เปอรเซ็นต ปริมาณ 5 มิลลิลิตร และสารละลายโซเดียมอัลจิเนต 1 เปอรเซ็นตปริมาณ 5 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากันดวยแทงแกวและเทลงจานแกวขนาดเล็ก

4. หยดสารละลายไคโตซานลงถาดแกวในขอ 3. โดยในการหยดตองหมุนถาดแกวเพื่อปองกันการหยดซํ้าตําแหนงเดิม เนื่องจากเม็ดเจลจะเกาะติดกันได

5. ท้ิงใหเม็ดเจลแชในจานแกวนาน 2 ช่ัวโมง 6. ตักเม็ดเจลจากจานแกวสูหลอดทดลอง 7. ดูดน้ํากล่ัน 10 มิลลิลิตรใสหลอดทดลอง ลางเม็ดเจลโดยกลับหลอดทดลองไปมา 2 รอบและเท

เม็ดเจลลงจานแกวใบใหม 8. ตักเม็ดเจลออกจากถาดแกว และวางบนกระจกนาฬิกา ตักเม็ดจากโดยรินน้ําออกใหมากท่ีสุด 9. ตักเม็ดเจลลงจานแกวขนาดใหญ ท่ีผิวหนาแหงสนิท 10. ใช spatula แยกเม็ดเจลท่ีเกาะกลุมออกจากกัน และปลอยใหแหงท่ีอุณหภูมิหอง 11. บันทึกผลการเกิดเจลเปยกท่ีแข็งแรง

3.2.3 การทดลองเตรียมเม็ดเจลแหงจากไคโตซานปู , กุงและปลาหมึก จุดประสงคการทดลอง

เพื่อเตรียมเม็ดเจลแหงท่ีแข็งแรงจากไคโตซานปู , กุงและปลาหมึก โดยใช coagulation medium ท่ีประกอบดวย โซเดียมซิเตรต 1 เปอรเซ็นต และโซเดียมอัลจิเนต 0.5 เปอรเซ็นต กําหนดระยะหางระหวางปลายเข็มหางจากผิวหนา coagulation medium เทากับ 10 ซม. แผนการทดลอง ก. การระบุผลตอบสนอง (responses) ท่ีตองการ ดังแสดงในตารางท่ี 3.4

ตารางท่ี 3.4 ผลตอบสนองในการทดลองหาเม็ดเจลแหงจากไคโตซานปู , กุงและปลาหมึก

ผลตอบสนอง ตัวแปรตาม การเกิดหยดเม่ือดัน suspension ผานเข็มเบอร 18 Y1 การเกิดเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง Y2 การเกิดเม็ดเจลแหงท่ีเก็บเปนเม็ดไดหลังการลางน้ํา Y3 ขนาดเม็ดเจลแหง Y4 รสขมของเม็ดเจลแหง Y5

37

วิธีการประเมินผลตอบสนอง (responses) การเกิดหยดเม่ือดัน suspension ผานเข็มเบอร 18 (ตัวแปรตาม Y1)

บันทึกผลการทดลอง ดวยเคร่ืองหมาย √ และ x

- เคร่ืองหมาย √ คือ สามารถหยดสารผสมเปนหยดและเม็ดเจลเปนทรงกลม - เคร่ืองหมาย x คือ ไมสามารถหยดไดเปนหยดท่ีสมํ่าเสมอ เชน หยดไดเปนเสนหรือเม่ือหยดแลว

เม็ดเจลท่ีไดมีหาง ไมเปนทรงกลม

การเกิดเม็ดเจลเปยกท่ีแข็งแรง (ตัวแปรตาม Y2) บันทึกผลการทดลอง ดวยเคร่ืองหมาย √ และ x

- เคร่ืองหมาย √ คือเม็ดเจลท่ีแข็งแรงหมายถึงเม็ดเจลท่ีสามารถตักออกมาจาก coagulation medium ได ไมมีการแตกตัวเม่ือลางน้ําและสามารถทําการแยกเปนเม็ดเดี่ยว ๆ ไดดวย spatula และยังคงสภาพการเปนเม็ดอยู

- เคร่ืองหมาย x คือ เม็ดเจลท่ีไมแข็งเรง

การเกิดเม็ดเจลแหงท่ีเก็บเปนเม็ดไดหลังการลางน้ํา (ตัวแปรตาม Y3) บันทึกผลการทดลอง ดวยเคร่ืองหมาย และ x

- เคร่ืองหมาย คือ เม็ดเจลแหงท่ีเก็บได ไมแบนติด plate

- เคร่ืองหมาย x คือ เม็ดเจลแหงท่ีเก็บไมได

ขนาดเม็ดเจลแหง (ตัวแปรตาม Y4) วัดขนาดเม็ดเจลโดยตอกลองจุลทรรศน ( Digital Blue QX5 computer microscope ) เขากับคอมพิวเตอรและถายภาพเม็ดเจลท่ีกําลังขยาย 60 x และวัดขนาดจากสเกลท่ีปรากฏบนหนาจอ ทําการ

วัดเม็ดเจล จํานวน 100 เม็ดและหาคาเฉล่ีย รสขมของเม็ดเจลแหง (ตัวแปรตาม Y5) 1. ใชอาสาสมัครจํานวน 10 คน อาสาสาสมัครตองไมเจบ็ปวยและรับประทานยาในขณะท่ีทดสอบ

กอนท่ีจะทําการทดลองจะตองงดกินอาหารหรือขนมท่ีมีรสหวาน

2. ใหอาสาสมัครกล้ัวปากดวยน้ํา แลววางเม็ดเจลบนล้ิน 3. อมเม็ดเจลท้ิงไวนาน 60 วนิาที โดยไมเค้ียวหรือกลืน แตสามารถขยับล้ินไปมาได 4. บวนเม็ดเจลท้ิง กล้ัวปากดวยน้ําเปลาและรายงานผลโดยมีคําตอบ 3 ขอ ก. ไมรูรสอะไรเลย ข. รูสึกวามีรสแตไมรูวาเปนรสอะไร ค. รูสึกขม 5. เปรียบเทียบรสกับเม็ดเจลท่ีมีการเค้ียว

38

ข. การกําหนดปจจยั (factors) และระดับ (levels) ตารางท่ี 3.5 ปจจัยและระดบัในการทดลองหา เม็ดเจลแหงจากไคโตซานปู , กุงและปลาหมึก

ปจจัย ตัวแปรตน

ระดับ 1 2 3 4 5

แหลงท่ีมาของไคโตซาน x1  3 ปู กุง ปลาหมึก - - ความเขมขนไคโตซาน ( เปอรเซนต )

x2 3 1 2 3 - -

อัตราสวนของผงยาตอไคโตซานโดยน้ําหนกั

X3 5 0 : 0 1 : 1 2 : 1 3 : 1 4 : 1

วิธีการทดลอง ก. การเตรียมสารละลายไคโตซาน สารเคมี 1. ไคโตซานกุง, ไคโตซานปู, ปลาหมึก 2. กรดอะซิติก (acetic acid, glacial) เคร่ืองมือ 1.กระบอกฉีดยาและเข็มฉีดยาเบอร 18 วิธีการเตรียม ตวงกรดอะซิติก 2 มิลลิลิตร ละลายในนํ้ากล่ัน 100 มิลลิลิตร ทําการผสมในตูดูดอากาศ

ไดสารละลายกรดอะซิติก 2 เปอรเซ็นต

ช่ังสารละลายกรดอะซิติก ช่ังสารละลายกรดอะซิติก ช่ังสารละลายกรดอะซิติก 99 กรัม 98 กรัม 97 กรัม ช่ังผงไคโตซาน 1 กรัม ช่ังผงไคโตซาน 2 กรัม ช่ังผงไคโตซาน 3 กรัม ละลายผงไคโตซานในสารละลายกรดอะซิติก ท้ิงไวท่ีอุณหภูมิหองจนไดสารละลายใส ไมมีฟอง สารละลายไคโตซานปู สารละลายไคโตซานกุง สารละลายไคโตซานปลาหมึก

1 % 2 % 3 % 1 % 2 % 3 % 1 % 2 % 3 %

39

ข. การเตรียม coagulation medium สารเคมี 1. ผงโซเดียมอัลจิเนต (sodium alginate) 2. ผงกรดเบนโซอิก (benzoic acid) 3. ผงโซเดียมซิเตรต (sodium citrate) เคร่ืองมือ 1. magnetic stirrer , magnetic bar วิธีการเตรียม 1. ช่ังผงโซเดียมซิเตรตน้ําหนัก 2 กรัม ละลายในน้ํากล่ัน 200 มิลลิลิตร 2. ช่ังผงกรดเบนโซอิกน้ําหนัก 0.5 กรัมและละลายในขอ 1 3. ช่ังผงโซเดียมอัลจิเนทน้ําหนัก 1 กรัม แลวกระจายในขอ 2 อยางชาๆโดยมีการปนบนเคร่ือง

magnetic stirrer เพื่อลดการเกิดกอนเจลไดสารละลาย coagulation medium ท่ีมีโซเดียมอัลจิเนต 0.5 เปอรเซ็นตและโซเดียมซิเตรต 1 เปอรเซ็นต

ค. การเตรียมเม็ดเจลเปยก 1. ช่ังผงยา X กรัม (แลวแตอัตราสวนผงยาตอไคโตซาน) เทผงยาลงโกรง 2. ช่ังสารละลายไคโตซาน 10 กรัมลงโกรงและกระจายผงยาลงไปทีละนอย 3. บดผงยาใหกระจายตัวสมํ่าเสมอในสารละลายไคโตซานอยางชา ๆ จนไดสารผสมเน้ือเนยีน

สมํ่าเสมอ 4. ท้ิงไวใหฟองอากาศจากการผสมหายไปหรือลอยตัวข้ึนสูผิวหนาสารผสม ดูดสารผสมดวยหลอด

ฉีดยา และไลฟองอากาศออก 5. ใสเข็มฉีดยาเบอร 18 ท่ีปลายหลอดเข็มฉีดยาและใชกระดาษเช็ดสารผสมสวนเกินนอกหลอดฉีด 6. หยดสารผสมชวงแรกท้ิงไปกอน ทดลองหยดจนไดหยดท่ีสมํ่าเสมอ จึงเร่ิมหยดลง coagulation

medium

40

ง. สภาวะการหยดสารละลายไคโตซานลงใน coagulation medium ตารางท่ี 3.6 สภาวะการหยดสารละลายไคโตซานลงใน coagulation medium

1. ชนิดและขนาดหวัเข็ม Nipro needdle 18Gx1 1.2 / 25 mm

2. ปริมาตร coagulation medium ตอการหยด 1 รอบ 10 มิลลิลิตร 3. ปริมาตรของสารละลายไคโตซานท่ีหยดตอ 1 รอบ ประมาณ 5 มิลลิลิตร 4. อัตราเร็วการหยด 30 หยดตอนาที 5. ระยะหางระหวางปลายเข็มและผิวหนา coagulation medium 10 เซนติเมตร 6. อุณหภูมิการหยดสารละลายไคโตซาน อุณหภูมิหอง 7. ระยะเวลาการแชเม็ดเจลเปยกใน coagulation medium 120 นาที 8. ปริมาตรน้ํากล่ันท่ีใชลางเม็ดเจลเปยก 10 มิลลิลิตร 9. จํานวนคร้ังและเวลาในการลางเม็ดเจลเปยก 1 คร้ัง 10. อุณหภูมิและเวลาการทําแหงเม็ดเจลเปยก 50 องศาเซลเซียส

2 ช่ัวโมง

จ. การเตรียมเม็ดเจลแหง 1. เท coagulation medium ท้ิง โดยเทผานผาขาวบาง 2. ลางเม็ดเจลเปยกดวยน้ํากล่ัน 10 มิลลิลิตร 3. กระจายเม็ดเจลเปยกใหแยกจากกัน บน Petri dish ไมใหเกาะเปนกลุม 4. อบเม็ดเจลเปยกท่ี 50 องศาเซลเซียส 2 ช่ัวโมง เม็ดเจลจะหดตัวลง นาํมาแยกเม็ดท่ียังเกาะกลุมกนั 5. อบตอท่ี 50 องศาเซลเซียส จนน้ําหนักคงท่ี 6. แยกขนาดดวยแรง เลือกเม็ดเจลแหงท่ีคางบนแรงเบอร16 เก็บเม็ดเจลแหงใสขวดแกวฝาปดสนทิ 3.2.4 การเตรียมเม็ดเจลแหงจากไคโตซานกุง ก. การเตรียม coagulation medium 1. ช่ังผง benzoic acid น้ําหนัก 0.2 กรัม ละลายในน้ํากล่ัน 100 มิลลิลิตร ปนสารดวย magnetic

stirrer และใหความรอนชวยในการละลาย 2. ช่ังผง sodium citrate น้ําหนัก 5 กรัม และละลายในขอ 1

41

3. ช่ังผง sodium alginate น้ําหนกั 1 กรัมใสบีกเกอร เทผงใหตกลงในสารละลายขอ 2 อยางชาๆ โดยตองมีการปนบนเคร่ือง magnetic stirrer เพื่อ ลดการเกิดกอนเจล ปนสารผสมน้ีจนได สารละลาย coagulation medium

4. ตวงสารละลาย coagulation medium ปริมาณ 100 มิลลิลิตรใสลงในถาดส่ีเหล่ียมปากกวาง ขนาด 6 X 4 X 4 เซนติเมตร ข. การสกัดสารจากสารสกัด 1. ตวงเอทานอล 95 เปอรเซ็นต น้ําหนกั 50 กรัมใสบีกเกอร 2. ช่ังสารสกัดปริมาณ 5 กรัม 3. ผสมสารสกัดในเอทานอล 95 เปอรเซ็นต แลวผสมใหเขากัน 4. คนดวยแทงแกว นาน 15 นาที 5. กรองผานกระดาษกรองเบอร 1 6. ระเหยตัวทําละลายบน hot plate โดยใหความรอน 50 - 70 องศาเซลเซียส ปลอยใหเอทานอล

ระเหยจนหมด 7. ละลายสารสกัดท่ีติดอยูในภาชนะอีกคร้ังดวยเอทานอล 95 เปอรเซ็นต ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ค. วิธีการเตรียมเม็ดเจล 1. เตรียมสารละลายไคโตซานกุง 3 เปอรเซ็นต 2. ช่ังสารละลายไคโตซาน ปริมาณ 30 กรัม ผสมสารสกัดในขอ ข.7 3. ผสมสารใหเขากันในโกรงจนไดสารผสมเน้ือเนียน ท้ิงไวใหฟองอากาศจากการผสมหายไปหรือ

ลอยตัวข้ึนสูผิวหนาสารผสม 4. ดูดสารผสมดวยหลอดฉีดยาและไลฟองอากาศออก ใสเข็มฉีดยาเบอร 18 ท่ีปลายหลอดฉีดยา

และใชกระดาษเช็ดสารผสมสวนเกนินอกหลอดฉีด 5. หยดสารผสมชวงแรกท้ิงไปกอน ทดลองลองหยดจนไดหยดท่ีสมํ่าเสมอ จึงเร่ิมหยดลง

coagulation medium โดยหยดเล่ือนตําแหนงไปในถาดไมใหแตละหยดมีการทับกัน 6. หยดสารละลายไคโตซาน 3 เปอรเซ็นตท่ีไมมีตัวยา ลงจานแกว เพือ่ใชเทียบหาเวลา ท่ีเม็ดเจลมีรูปรางคงท่ี ท้ิงเม็ดเจลเปยกในถาดนาน 20 นาที 7. เท coagulation medium ท่ีมีเม็ดเจลเปยกลงบนแรงเบอร 6 8. ลางเม็ดเจลโดยรินน้ํา 10 มิลลิลิตรใหไหลผานเม็ดเจลและซับน้ําออกจากเจลดวยกระดาษทิชชู 9. ปลอยเม็ดเจลใหแหงท่ีอุณหภูมิหองนาน 24 ช่ัวโมง และนําเม็ดเจลแหงออกจากแรงโดยการปด

ดวยผาขาวบางใหเม็ดเจลตกผานแรงลงสูภาชนะรองรับดานลาง เก็บเม็ดเจลในขวดแกวสีชา ฝาเกลียว และนําไปวิเคราะหตอไป

42

3. 3 การเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก แผนการทดลองในภาพรวม 3.3.1 กําหนดผลตอบสนอง (responses ) ท่ีตองการทั้งหมด ดังรูปท่ี 3.2 3.3.2 การเลือกสารชวยในตํารับสําหรับการเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก 3.3.3 การทดลองเตรียมยาเม็ดดวยวิธีแกรนูลเปยก 3.3.1 การระบุผลตอบสนอง (responses) ท่ีตองการและระดับน้ําหนักความสําคัญ

กําหนดใหมีผลตอบสนองของยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก 4 ชนิดคือ เวลาในการแตกตัว, รสชาติ เนื้อสัมผัสและความแข็งของยาเม็ด ดังนี ้1. บรรทัดฐานของการแตกตัวคือ ตองการใหยาเม็ดแตกตัวในปากอยางรวดเร็ว โดยเวลามาก ท่ีสุดท่ียอมรับคือ 60 วินาที

ระดับความพอใจ เปน +4 เม่ือเวลาแตกตัวมีคา 0 ถึง 60 วินาที ระดับความพอใจ เปน – 4 เม่ือเวลาแตกตัวมีคามากกวา 60 วินาที

2. บรรทัดฐานของรสชาติ คือ ตองการใหยาเม็ดมีรสชาติท่ีดี ระดับความพอใจเปน -4 เม่ือรูสึกขมมากหรือเผ็ดมาก และยอมรับไมได ระดับความพอใจเปน -1 เม่ือรูสึกขมหรือเผ็ดแตยอมรับได ระดับความพอใจเปน 0 เม่ือไมรูรสอะไรเลย หรือรูสึกวามีรสแตไมรูวาเปนรสอะไร ระดับความพอใจเปน +1 เม่ือรูสึกหวาน

3. บรรทัดฐานของรสสัมผัส คือ ตองการใหยาเม็ดมีสัมผัสท่ีดี ระดับความพอใจเปน - 4 เม่ือรูสึกไมดี สากล้ินหรือช้ินสวนยาขรุขระและยอมรับไมได ระดับความพอใจเปน -1 เม่ือรูสึกไมดี สากล้ินแตยอมรับได ระดับความพอใจเปน +1 เม่ือรูสึกดี ไมสากล้ิน

4. บรรทัดฐานของความแข็งคือ ตองการใหยาเม็ดมีความแข็งอยางนอยท่ีสุด 2 กิโลกรัม ระดับความพอใจ เปน +1 เม่ือความแข็งมีคามากกวาหรือเทากบั 2 กิโลกรัม ระดับความพอใจ เปน -1 เม่ือความแข็งมีคานอยกวา 2 กิโลกรัม

เม่ือพิจารณาระยะเวลาการแตกตัวในปากและความแข็งของเม็ดยาพรอมกันแลวจะไดพื้นท่ี การตอบสนอง 4 สวน และมีระดับความพอใจโดยรวม 4 ระดับคือ -5 , - 3 , +3 และ + 5 ดังรูปท่ี 3.2 เปาหมายการทดลองคือพื้นท่ี D ซ่ึงมีระดับความพอใจโดยรวมสูงสุด เม็ดยาแตกตัวเร็วและมีความแข็งอยางนอย 2 กิโลกรัม

43

In vivo Disintegration time (seconds) 80

70

60

50

40

30

20

10

0 1 2 3 4 5 6 Crushing strength ( kg )

รูปท่ี 3.2 พื้นท่ีการตอบสนอง 4 สวนในการผลิตยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก พื้นท่ี A คือบริเวณท่ียาเม็ดแตกตัวชาและเม็ดยาไมแข็ง ระดับความพอใจโดยรวม -5 พื้นท่ี B คือบริเวณท่ียาเม็ดแตกตัวชาและเม็ดยาแข็ง ระดับความพอใจโดยรวม -3 พื้นท่ี C คือบริเวณท่ียาเม็ดแตกตัวเร็วและเม็ดยาไมแข็ง ระดับความพอใจโดยรวม +3 พื้นท่ี D คือบริเวณท่ียาเม็ดแตกตัวเร็วและเม็ดยาแข็ง ระดับความพอใจโดยรวม +5

3.3.2 การเลือกสารชวยในตาํรับสําหรับการเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก ก. การทดลองหาจุดหลอมเหลวของนํ้าตาล glucose monohydrate , น้ําตาล glucose anhydrous

และน้ําตาล glucose anhydrous ท่ีเก็บใน desiccator ท่ีมีไอน้ํา สารเคมี

1. น้ําตาลกลูโคสปราศจากน้ํา (glucose anhydrous) หจก.โอ.วี.เคมิเคิล แอนดซัพพลาย 257/19 ถ.สุเทพ อ.เมือง จ. เชียงใหม

2. น้ําตาลกลูโคส (glucose monohydrate) หจก.โอ.วี.เคมิเคิล แอนดซัพพลาย 257/19 ถ.สุเทพ อ.เมือง จ. เชียงใหม

เคร่ืองมือ 1. เคร่ือง DSC (Perkin –Elmer 7 series thermal analysis system)

2. โถควบคุมความช้ืน (desiccator)

3. เคร่ือง electronic thermo-hygrometer (Digicon , model TH-03)

A - 5

B -3

C +3

D +5

44

วิธีการทดลอง 1. ช่ังน้ําตาล glucose monohydrate, น้ําตาล glucose anhydrous อยางละ 5 มิลลิกรัมใสในถาด

อลูมินัมเบอร 40 และปดผนกึ 2. วางถาดอลูมิเนียมในเคร่ือง DSC ซ่ึงตอกับแกซไนโตรเจน ต้ังคาอุณหภูมิจาก 50 - 200 องศา

เซลเซียส ท่ีอัตรา 10.0 องศาเซลเซียสตอนาทีแลวบันทึกเทอรโมแกรมของน้ําตาล

3. ใสผง glucose anhydrous บนจานแกวและวางใน desiccator ท่ีบรรจุน้ํากล่ันและท้ิงไวท่ี อุณหภูมิหองนาน 24 ช่ัวโมง แลวช่ังผง glucose นี้น้ําหนัก 13.648 มิลลิกรัมใสในถาดอลูมินัม

เบอร 40 และปดผนึก 4. ทําตามขอ 2 5. เปรียบเทียบเทอรโมแกรมของน้ําตาลท้ัง 3 ชนิด

ข. การศึกษาผลของอุณหภมิูในการอบยาเม็ดตอความแเข็งของยาเม็ด สูตรท่ี 1 1. ผสมไคตินปลาหมึกน้ําหนัก 30 กรัมและ glucose anhydrous น้ําหนกั 70 กรัมเขาดวยกัน 2. เตรียมเปน wet mass ดวยน้ําแลวแรงผานแรงเบอร 8 3. อบแกรนูลท่ี 50 องศาเซลเซียส นาน 24 ช่ัวโมง 4. แรงผานแรงเบอร 14, เบอร 16, เบอร 30 และเลือกแกรนูลท่ีผานแรงเบอร 30 5. ผสมแกรนูลน้ําหนัก 80 กรัม เขากับเมนทอลน้ําหนกั 17 กรัม (ท่ีผานการบดและแรงผานแรง

เบอร 30 แลว) 6. ผสมแมกนเีซียมสเตียเรทน้ําหนกั 1 กรัม และทัลคัมน้าํหนัก 2 กรัม เขากับสารขอ 5 7. ใช เคร่ืองตอกยาเม็ดชนิด Rotary tableting machine ใหเม็ดยามีความแข็งประมาณ 0.5 -1 KN 8. นําเม็ดยาใสใน desiccator ท่ีมีไอน้ําอ่ิมตัวอยู (เติมน้ําอยูใตแผนรองรับสาร) 9. อบเม็ดยาท่ี 85 องศาเซลเซียส นาน 24 ช่ัวโมง 10. วัดความแข็งของยาเม็ด สูตรท่ี 2 1. ทําการทดลองเหมือนสูตรท่ี 1 ต้ังแตขอ 1 – 8 2. อบเม็ดยาท่ี 50 องศาเซลเซียส นาน 24 ช่ัวโมง 3. วัดความแข็งของยาเม็ด

45

ค. การศึกษาผลของเวลาในการอบยาเม็ดท่ี 85 องศาเซลเซียส ตอความแข็งของยาเม็ด สูตรท่ี 3 1. ผสมไคตินปลาหมึกน้ําหนัก 30 กรัม ซูโครสน้ําหนัก 35 กรัม และ glucose anhydrous 35 กรัม 2. ทําการทดลองเหมือนสูตรท่ี 1 ต้ังแตขอ 1 – 8

3. อบเม็ดยาท่ี 85 องศาเซลเซียส นาน 2 , 5 , 10 , 20 นาที และอบท่ี 50 องศาเซลเซียส นาน 24 ช่ัวโมง

4. วัดความแข็งของยาเม็ด

ง. การศึกษาผลของไคตินตอคุณสมบัติของยาเม็ด เตรียมยาเม็ดใหมีน้ําหนัก 400 มิลลิกรัมโดยวิธีตอกโดยตรง มีสูตรการทดลองดังตารางท่ี

3.7 เคร่ืองตอกเม็ดยาคือ single punch tableting machine และใช punch และdie ขนาด ½ นิ้ว ใชแรงตอกเทากบั 0. 7 KN การวัดแตกตัวของยาเม็ดทําโดยเคร่ืองวดัการแตกตัวของยาเม็ดชนิด 6 หลุม ใชปริมาตรน้ํา 600 มิลลิลิตรและอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ไมมีการวาง disk ลงบนเม็ดยา ทําการจับเวลาการแตกตัวคร้ังละหนึ่งเม็ดและจบัเวลาเม่ืออนภุาคยาลอดผานตะแกรงจนหมด ตารางท่ี 3.7 สูตรยาเม็ดท่ีใชศึกษาผลของไคติน

สูตร ไคตินปลาหมึก (เปอรเซ็นต)

แมกนีเซียมสเตียเรท (เปอรเซ็นต)

ซูโครส (เปอรเซ็นต)

แมนนิทอล (เปอรเซ็นต)

1 0 0.5 5 94.5 2 10 0.5 5 84.5 3 20 0.5 5 74.5 4 30 0.5 5 64.5

3.3.3 การทดลองเตรียมยาเม็ดดวยวิธีแกรนูลเปยก สารเคมี

1. น้ําตาลกลูโคส (glucose anhydrous) หจก.โอ.วี.เคมิเคิล แอนดซัพพลาย 257/19 ถ.สุเทพ อ.เมือง จ. เชียงใหม 2. น้ําตาลทรายบริสุทธ์ิ ตรามิตรผล (sucrose) บริษัทน้ําตาลมิตรผล จํากัด 109 หมู 10 อ.ดานชาง จ. สุพรรณบุรี 3. เมนทอล (menthol) หจก.โอ.วี.เคมิเคิล แอนดซัพพลาย 257/19 ถ.สุเทพ อ.เมือง จ. เชียงใหม

46

4.ไคตินปู , กุง , ปลาหมึก บริษัทตาหมิงเอ็นเตอรไพรส จํากัด 44/5 ม.4 ต.โคกขาม อ.เมือง จ.สมุทรสาคร 5. แมกนีเซียม สเตียเรต (magnesium stearate BP) หจก.ซี.เอ็ม.เคมีคอลแอนดแล็บซัพพลายส 41/1 ถ.ศรีภูมิ ต.ศรีภูมิ อ.เมือง จ.เชียงใหม 6. แอลกอฮอล บริสุทธ์ิ 95 เปอรเซ็นต (ethanol 95 %) องคการสุรา กรมสรรพสามิต 67 ม.4 ต.ปากนํ้า อ.บางคลา จ.ฉะเชิงเทรา 7. สีผสมอาหาร สีเขียว (tartrazine, brillian blue FCF) บริษัท อดินพ จํากัด 24/3 ม.5 ถ.เพชรเกษม69 แขวงหลักสอง เขตบางแค กรุงเทพฯ เคร่ืองมือ 1. แรงเบอร 8 , 14 , 16 , 30 2. เคร่ืองผสม เชน โกรง , ลูกโกรง

3. ตูอบ

4. โถควบคุมความช้ืน (desiccator)

5. เคร่ือง electronic thermo-hygrometer (Dogicon , model TH-03) แผนการทดลอง ก. การกําหนดปจจัย (factors) และระดับ (levels)

ตารางท่ี 3.8 ปจจัย (factors) และระดับ (levels) ในการเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปากดวยวิธี แกรนูลเปยก

ปจจัย ตัวแปรตน ระดับ 1 2 3 1.แหลงท่ีมาไคติน x1 3 ปู กุง ปลาหมึก 2. ความเขมขนไคติน (เปอรเซ็นต) x2 1 10 - -

3. ความเขมขนกลูโคส (เปอรเซ็นต) x3 2 5 10 -

4.ความเขมขนเมนทอล (เปอรเซ็นต) x4 2 5 10 -

47

ข. หลักการออกแบบพื้นท่ีการทดลอง (experimental space) กําหนดใหเม็ดยาน้ําหนัก 1000 มิลลิกรัมประกอบดวย ไคตินปู, กลูโคส, เมนทอล ,ซูโครส

แมกนีเซียมสเตียเรต, ทัลคัม การออกแบบสูตรการทดลองไดประยุกตหลักการของ mixture

design โดยกําหนดใหปจจัย 4 ชนิดไดแก ไคติน, กลูโคส, เมนทอล และซูโครส รวมกันเปน 100 เปอรเซ็นต กําหนดใหแตละดานของสามเหล่ียมดานเทาคือ กลูโคส , เมนทอล และซูโครส กําหนดใหตัวแปรแตละชนิดมีความเขมขน 2 ระดับ เม่ือลากเสนผานดานของเมนทอลท่ีระดับ 5 , 10 เปอรเซ็นตใหตัดกับเสนผานดานของกลูโคสท่ีระดับ 5 , 10 เปอรเซ็นต จะไดสูตรการทดลองดังรูป ท่ี 3.3 และตารางท่ี 3.9 เลือกสูตรท่ีมีความพึงพอใจสูงสุดมาทดลองตอโดยเปล่ียนเปนไคตินกุงและปลาหมึก

รูปท่ี 3.3 สูตรการทดลอง 4 สูตรเม่ือประยุกตหลัก mixture design ในการออกแบบ

ตารางท่ี 3.9 สูตรการเตรียมแกรนูลของสารเจือจางท่ีมีความพรุน

สูตร ไคตินปู (เปอรเซ็นต)

กลูโคส (เปอรเซ็นต)

เมนทอล (เปอรเซ็นต)

ซูโครส (เปอรเซ็นต)

1 10 5 5 77 2 10 5 10 72 3 10 10 5 72 4 10 10 10 67

Sucrose

Glucose 10 5

10 5

Menthol

1 2

3 4

48

ค. ขั้นตอนการเตรียมแกรนลูของสารเจือจางท่ีมีความพรุน

บดดวย ball mill บดดวย ball mill

ผงไคติน ผงน้ําตาลทราย ผานแรงเบอร 100 ผานแรงเบอร 100

ผสมใหเขากันในโกรง

ทําแกรนูลเปยกโดยใชน้ําเปน binder

แรง wet mass ผานแรงเบอร 8

อบแกรนูลเปยก ท่ี 50 องศาเซลเซียส นาน 12 ช่ัวโมง เม่ือมีเมนทอล 5 เปอรเซ็นต และ

นาน 24 ช่ัวโมง เม่ือมีเมนทอล 10 เปอรเซ็นต

แรงแกรนูลแหงผานแรงเบอร 14 ดวยเคร่ือง oscillating granulator

แรงแกรนูลผานแรงเบอร 30 ดวยมือ

เลือกแกรนูลท่ีผานแรงเบอร 14 และคางแรงเบอร 30 ไปผสมกับเม็ดเจลท่ีมีตัวยาสําคัญ

ละลายดวยแอลกอฮอล95 เปอรเซ็นตใน อัตราสวน 1:1 โดยนํ้าหนัก

เกล็ดไคติน น้ําตาลทรายเกล็ด ผงกลูโคส ผลึกเมนทอล

49

ง. ขั้นตอนการเตรียมยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก

ผสมใหเขากันในถุงพลาสติก

ตอกเปนเม็ด

ใสยาเม็ดยาบนจานแกวและวางใน desiccator ท่ีมีไอน้ํา ท้ิงไวท่ี อุณหภูมิหอง 24 ช่ัวโมง อบยาเม็ดท่ี 85 องศาเซลเซียส 15 นาที

อบยาเม็ดท่ี 50 องศาเซลเซียส 24 ช่ัวโมง

ท้ิงยาเม็ดใหเย็น 24 ช่ัวโมงแลววัดการแตกตัว,ความแข็ง, รสชาติ

จ. การวัดความคงตัวของผงแกรนูล

เก็บผงแกรนูลท่ีเตรียมไดจากไคตินปู, กุง, ปลาหมึกไวท่ีอุณหภูมิหองนาน 12 เดือนและสังเกตุลักษณะทางกายภาพของแกรนูล

ฉ. วิธีการประเมินยาเม็ดแตกตัวเร็วในปาก

การวัดการแตกตัวของเม็ดยา 1. การวัดการแตกตัวของเม็ดยาในอาสาสมัคร

ใหอาสาสมัคร ทําการกล้ัวปากและวางเม็ดยา 1 เม็ดลงบนล้ิน เร่ิมจับเวลา ระหวางนีใ้หมีการขยับล้ินได จุดยุติการแตกตัวคือเวลาท่ีผูทดสอบรูสึกวาไมมีเศษช้ินสวนของยาเม็ดท่ีมีความแข็งเหลืออยู ทําการทดลองซํ้า 3 เม็ด

แกรนูลของ diluent ท่ีมีความพรุน

เม็ดเจลของสารสกัดฟาทะลายโจร ท่ีมี

andrographolide 25 มิลลิกรัม

ทัลคัม 1 %

แมกนีเซียม สเตียเรท 1

%

50

2. การวัดการแตกตัวของเม็ดยาโดยเคร่ืองมือ การทดลองท่ี 3.3.2 จะใชวิธีวางเม็ดยาในจานแกวท่ีมีน้ํากล่ัน 10 มิลลิลิตร และจับภาพการแตกตัวดวยกลองจุลทรรศน (Digital Blue QX5 computer microscope) จับเวลา ณ เวลาท่ีน้ําแพรไปถึงใจกลางเม็ดยา ทําโดยสุมเม็ดยามา 10 เม็ด สวนการทดลองที่ 3.3.3 จ. จะใชเคร่ือง disintegration tester ท่ีประกอบข้ึนเองโดยใชแรงปนของแทงแมเหล็ก ดังรูป 25 ในภาคผนวก การวัดความแข็งของเม็ดยา ใชเคร่ือง Stokes Monsanto Hardness Tester โดยสุมเม็ดยา 5 เม็ดวัดแรงท่ีทําใหยาเม็ดหัก การประเมินรสชาติและเนื้อสัมผัสของยาเม็ด ใหอาสาสมัครกล้ัวปากดวยน้าํดื่ม แลววางยาเม็ดบนล้ิน อมยาเม็ดท้ิงไวนาน 60 วนิาที โดยไมเค้ียวหรือกลืน แตสามารถขยับล้ินไปมาได แลวบวนยาในปากท้ิง กล้ัวปากดวยน้าํเปลาและรายงานผลรสชาติและเนื้อสัมผัส โดยมีคําตอบใหเลือก รสชาติ ก. มีรสหวาน ข. มีรสขมแตยอมรับได ค. มีรสขมและยอมรับไมได รสสัมผัส ก. เนื้อสัมผัสดี ไมสาก ข. เนื้อสัมผัสไมดี รูสึกสาก

3.4 การวิเคราะห andrographolide แผนการทดลองในภาพรวม 3.4.1 ชนิดสารตัวอยาง 3.4.2 การตรวจเอกลักษณสมุนไพร 3.4.3 การหารอยละ andrographolide ในผงสมุนไพร 3.4.4 การหารอยละ andrographolide ในผงสารสกัดท่ีผสมสารดูดซับ 3.4.5 การหาปริมาณ andrographolide ในเม็ดเจลแหงและปริมาณเม็ดเจลท่ีจะเตรียมเปนยาเม็ด 3.4.6 การวัดการพองตัวและการละลายของเม็ดเจล 3.4.7 การวัดการปลดปลอย andrographolide จากเม็ดเจล (dissolution test)

51

3.4.1 ชนิดสารตัวอยาง ในการตั้งตํารับยาเม็ดสารสกัดฟาทะลายโจร จะตองมีการกําหนดปริมาณสารสําคัญในเม็ด

ยาวาจะใหมีปริมาณสาร andrographolide เทาใดตอหนึ่งเม็ดยา ดังนั้นจึงตองหาปริมาณสารandrographolide ในสารตัวอยางดังตารางท่ี 3.10 เพื่อนํามาคํานวณหาจํานวนเม็ดเจลแหงท่ีมีปริมาณ

andrographolide เทียบเทากบัผงสมุนไพรท่ีใชรับประทานใน 1 วัน

ตารางท่ี 3.10 ชนิดสารตัวอยางในการวิเคราะหโดยวิธี HPTLC

ลําดับ ข้ันตอนการเตรียม

ยาเม็ด ชนิดสารตัวอยาง จุดประสงคการวัด

1 การควบคุมคุณภาพวัตถุดิบ

ผงสมุนไพร 1.เพื่อตรวจสอบเอกลักษณสมุนไพร 2.เพื่อหารอยละของandrographolide ในผงสมุนไพร

2 การควบคุมคุณภาพ

สารสกัด

ผงแหงสารสกัดท่ีผสมสารดูดซับ

เพื่อหารอยละของ andrographolide ในผงสารสกัดท่ีผสมสารดูดซับ

3 การเตรียมเม็ดเจลเปยก หยดของสารละลาย

ไคโตซานสกัดท่ีมีสารสกัดกระจายตัวอยู

เพื่อหารอยละ andrographolide ตอหยด

4 การเตรียมเม็ดเจลแหง เม็ดเจลแหง เพื่อหาปริมาณ andrographolideในเม็ดเจลแหงและคํานวณปริมาณเม็ดเจลท่ีจะผสมในยาเม็ด

5 การวัดการปลดปลอยตัวยาในกระเพาะอาหาร

เม็ดเจลแหง เพื่อศึกษาการพองตัวและการละลายของเม็ดเจลในกรด HCl pH 1.2

3.4.2 การตรวจเอกลักษณสมุนไพร หลักการ

สาร andrographolide ในผงสมุนไพรฟาทะลายโจรจะแยกออกจากสารชนิดอ่ืนไดโดยวิธี HPTLC และระบุสารไดจากตําแหนงของโครมาโตแกรมเทียบกับสารมาตรฐาน

52

สารเคมี 1. Chloroform A.R. grade (Lab Scan) 2. Benzene A.R. grade (Merck) 3. Methanol A.R. grade (Merck) 4. KOH A.R. grade (Univas) 5. 3,5 - dinitrobenzoic acid (Fluka) 6. Andrographolide (Indofine chemical company 12-1 Ilene court, Belle mead, NJ, USA) เคร่ืองมือ 1. TLC alumium sheet Silica gel 60 F 254, 20 x 20 cm (Merck) 2. Developing chamber 3. Densitometer (CS-900, Dual wavelength flying spot scanner, Shimadzu, Japan) 4. Spotting system (Camag Linomat IV) 5. Syringe (Camag Linomat syringe 695.6614) การเตรียมสารละลายอางอิง andrographolide ช่ังน้ําหนกั สารอางอิงมาตรฐาน andrographolide อยางแมนยํา 0.002 กรัม ละลายดวย methanol 10 มิลลิลิตร การเตรียม mobile phase ผสม Chloroform : Benzene : Methanol ในอัตราสวน 70:15:15 ทําการเตรียมในตูดดูอากาศและเติมใส developing chamber ท้ิงใหระบบอ่ิมตัวนานอยางนอย 2 ช่ัวโมง วิธีการวิเคราะห พนสารละลายลงบนแผน HPTLC และแยกสารในแท็งของ Developing solvent จากนั้นหาตําแหนง andrographolide ของสารตัวอยางเทียบกับสารอางอิงมาตรฐาน andrographolide ดวยเคร่ือง densitometer 3.4.3 การหารอยละของ andrographolide ในผงสมุนไพร หลักการ หาปริมาณสารตัวอยางไดจากการหาพ้ืนท่ี chromatogram ของสารตัวอยาง แลวเทียบกับ calibration curve ของสารอางอิง andrographolide

53

การเตรียมสารละลายอางอิง andrographolide ช่ังน้ําหนกั สารอางอิงมาตรฐาน andrographolide อยางแมนยํา 0.002 กรัม ละลายและปรับปริมาตรใน volumetric flask ใหครบ 10 มิลลิลิตร ดวย methanol การแยกสารตัวอยาง ดวยวิธี HPTLC 1. ช่ังผงสมุนไพรอยางแมนยํา 0.1 กรัม (ทศนิยม 4 ตําแหนง) .......................... ( A ) 2. ใสใน volumetric flask 100 มิลลิลิตร 3. สกัดผงพืชดวย solvent 50 มิลลิลิตร โดยใชวิธีและเวลาตาง ๆ 4. ปรับปริมาตรดวย solvent ใหครบ 100 มิลลิลิตร 5. กรองดวยกระดาษกรอง whatman เบอร 1 6. ระเหย solvent จนไดสารสกัดแหง 7. ละลายสารสกัดตอดวย solvent 10 มิลลิลิตร 8. พนสารตัวอยางลงบนแผน TLC alumiium sheet Silica gel 60 F 254 (ขนาด 10 x 20 เซนติเมตร) ต้ังสภาวะการพนสาร โดยเคร่ือง spotting system ดังนี้

- ความกวางแผน 200 มิลลิเมตร - ระยะหางของจุดแรกท่ีจะพนสาร หางจากขอบ 150 มิลลิเมตร - ความกวางแตละแถบ 5 มิลลิเมตร - ระยะหางแตละแถบ 7 มิลลิเมตร - ปริมาตรสารตัวอยาง 10 ไมโครลิตร ……............…..(v ) - อัตราเร็วการพนสาร 10 ไมโครลิตรตอวินาที

- ปริมาตรสารอางอิงมาตรฐาน 2, 4, 6, 8, 10, 15 ไมโครลิตร

9. แยกสารในแท็งโดยวางแผน adsorbent ลง developing chamber และให mobile phase แพรข้ึน

ไป 8 เซนติเมตร

10. นําแผนเขาเคร่ือง densitometer และบันทึกพื้นท่ีของchromatogram 11. สราง Calibration curve ของสารอางอิงมาตรฐาน 12. หาปริมาณสาร andrographolide ..................................................................(B)

54

การคํานวณรอยละของ andrographolide (AP)ในผงสมุนไพร (จากขอ 12) ปริมาณ AP เทากับ B ไมโครกรัม (จากขอ 8) ปริมาตรสาร V ไมโครลิตร มี AP เทากับ B ไมโครกรัม ดังนั้นสาร 1000 ไมโครลิตร (หรือ 1 มิลลิลิตร) มี AP เทากับ (B/ V) x 1,000 ไมโครกรัม (จากขอ 7) สาร 10 มิลลิลิตรมี AP เทากับ ((B/ V) x 1,000) x 10 ไมโครกรัม (จากขอ 1) ผงสมุนไพร 0.1 กรัม มี AP เทากับ (((B/V) x 1,000) x 10) / 1,000,000 กรัม ดังนั้น ผงสมุนไพร 100 กรัม จะมี AP เทากับ (((B/V) x 1,000 ) x 10 x 100) / 1,000,000

หรือเทากบั B / (V x A ) กรัม เม่ือ B คือ ปริมาณ AP (ไมโครกรัม) ท่ีวัดไดจากการพนสารละลายในปริมาณ V ไมโครลิตร และ A คือปริมาณผงสมุนไพรท่ีช่ังมาวิเคราะห (กรัม) ตัวอยางการคํานวณ

เม่ือ A คือ ผงสมุนไพร 0.1075 กรัม B คือ andrographolide ท่ีวัดได 3.4661 ไมโครกรัม V คือ สารละลายท่ีพนไปในปริมาณ 5 ไมโครลิตร

วิธีคํานวณ ในสารละลายสารสกัด 5 ไมโครลิตร มี AP 3.4661 ไมโครกรัม ดังนั้นในสารละลายสารสกัด 1 ไมโครลิตร จะมี AP 0.69332 ไมโครกรัม หรือ 1000 ไมโครลิตร มี AP 693.32 ไมโครกรัม หรือ 1 มิลลิลิตร มี AP 693.32 ไมโครกรัม หรือ 1 มิลลิลิตร มี AP 0.00069332 กรัม ดังนั้นสารละลายสารสกัด 10 มิลลิลิตร จะมี AP 0.0069332 กรัม หรือผงสมุนไพร 0.1075 กรัมมี AP 0.0069332 กรัม ดังนั้น ผงสมุนไพร 100 กรัม มี AP (0.0069332 * 100) / 0.1075 = 6.4485 กรัม 3.4.4 การหารอยละ andrographolide ในผงสารสกัดท่ีผสมสารดดูซับ การเตรียมสารตัวอยาง 1. ช่ังสารสกัดอยางแมนยํา 0.2 กรัม (ทศนิยม 4 ตําแหนง) ......... (A) 2. ใสใน volumetric flask ขนาด 10 มิลลิลิตรแลวละลายดวย methanol 5 มิลลิลิตร

55

3. sonicate นาน 15 นาที ปรับปริมาตรดวย methanol ครบ 10 มิลลิลิตร 4. กรองดวยกระดาษกรอง whatman เบอร 1 แลว pipett สารมา 5 มิลลิลิตร ใสใน

volumetric flask ขนาด 25 มิลลิลิตร ปรับปริมาตรใหครบดวย methanol 5. นําไปพนลงบนแผน HPTLC ปริมาตร V ไมโครลิตร ………..(V) และแยกสารดวย DVS 6. วัดปริมาณ andrographolide ดวยเคร่ือง densitometer……………(B) สูตรการคํานวณรอยละของ andrographolide (AP)ในผงสมุนไพร รอยละของ andrographolide (AP) = B / (V x A) เม่ือ B คือ ปริมาณ AP (ไมโครกรัม) ท่ีวัดไดจากการพนสารละลายในปริมาณ V ไมโครลิตร และ A คือปริมาณผงสารสกัดท่ีช่ังมาวเิคราะห (กรัม) 3.4.5 การหาปริมาณ andrographolide ในเม็ดเจลแหงและปริมาณเม็ดเจลท่ีจะเตรียมเปนยาเม็ด 1. ช่ังน้ําหนกัเม็ดเจลของสารสกัดฟาทะลายโจร 30 เม็ด 2. บดเม็ดเจลในโกรงใหเปนผงละเอียด และช่ังน้ําหนกัใน weighing boat 3. ใสผงเม็ดเจลลง volumetric flask ขนาด 10 มิลลิลิตร และละลายผงยาดวย methanol ประมาณ

5 มิลลิลิตร แลว sonicate 15 นาที 4. กรองสารละลายดวยกระดาษกรอง whatman เบอร 1 5. วัดปริมาณ andrographolide ดวยวิธี HPTLC 6. คํานวณหาปริมาณเม็ดเจลท่ีจะใชเตรียมยาเม็ด 1 เม็ด 3.4.6 การวัดการพองตัวและการละลายของเม็ดเจล วิธีท่ี 1

วางเม็ดเจลแหง 5 เม็ดในถาดแกวท่ีบรรจนุ้ํากล่ันและสารละลายกรดไฮโดรคลอริกพีเอช 1.2 ปริมาตร 10 มิลลิลิตร จับภาพการพองตัวของเม็ดเจลดวยกลองจุลทรรศน (Digital Blue QX5 computer microscope) ในเวลา 2 ช่ัวโมง วิธีท่ี 2

ใสเม็ดเจลแหง 0.5 กรัมลงในเคร่ืองวัดการละลายของยาชนิดหลุมเดยีวชนิดใบพัดท่ีบรรจุ สารละลายกรดไฮโดรคลอริก (0.1 N) พีเอช 1.2 ในปริมาตร 900 มิลลิลิตร อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปด speed เปน 75 รอบตอนาที สังเกตุการลอยตัวของเม็ดเจล

56

3.4.7 การวัดการปลดปลอย andrographolide จากเม็ดเจล (dissolution test) สารเคมี 1. Hydrochloric acid solution 0.1 N 2. sodium hydroxide solution 0.1 N

เคร่ืองมือ 1. เคร่ืองวัดการละลายของยาชนิดหลุมเดยีว (EYELA Dissolution Tester DE-1s) 2. เคร่ือง centrifuge ชนิด 12 หลุม ความจุ 15 มิลลิลิตร (Hermle Z200A) 3. centrifuge tubes วิธีการ 1. เลือกเคร่ืองวัดการละลายชนิดใบพดั 2. วางเคร่ืองในแนวระนาบ บนฐานท่ีมีความม่ันคง 3.ปรับระดับของ paddle โดยปรับระดับ paddle ใหสูงจากกน vessel ประมาณ 2.5 ซม. และทดสอบการหมุน , อัตราการหมุน และอุณหภูมิ 4.ใสน้ําลงใน water bath ใหสูงกวา medium ใน vessel 5. เปดเคร่ืองและอุนเคร่ืองท้ิงไว 30 นาที 6. ใส Hydrochloric acid solution 0.1 N ลงไปใน vessel ในปริมาณ 500 มล. 7. เปด heater switch รอให Hydrochloric acid solution มีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 8. เทเม็ดเจลบีดท่ีรูน้ําหนกัแนนอน (50 เม็ดเจล น้ําหนัก 0.0600 กรัม) 9. เปด speed เปน 75 rpm 10. เก็บตัวอยางดวยการใชกระบอกฉีดยาดดูสารละลายผานทอ ตําแหนงในการเก็บคือกึ่งกลางระหวางผิวของ medium และฐานใบพัด เกบ็ตัวอยาง 100 มิลลิลิตร ณ นาทีท่ี 180 11. เติมสารละลาย NaOH 0.1 N ปริมาณ 50 มิลลิลิตรเพ่ือตกตะกอนไคโตซาน 12. ปนแยกตะกอนออกดวยเคร่ือง centrifuge ความเร็วรอบ 6,000 rpm นาน 10 นาที และนําสวน supernatant เทใส centrifuge tube ชุดใหมและปนแยกตะกอนรอบท่ีสอง 13. นํา dissolution medium ในขอ 12 ปริมาตร 12 มิลลิลิตร ผสมกับแปงมันสําปะหลัง 5 กรัมใน petri dish แลวอบในตูอบจนแปงมีลักษณะแหง 14. ขูดผงแปงออกจาก petri dish และผสมเขากับ methanol 100 มิลลิลิตร 15. ทําการ sonicate นาน 15 นาทีแลวกรองผานกระดาษกรอง 16. ระเหย methanol บน hot plate และละลายสารท่ีแหงติดบีกเกอรดวย methanol 5 มิลลิลิตร 15. นําไปวดั HPTLC เพื่อหาความเขมขนของ andrographolide