วันที่ - lib.kps.ku.ac.th€¦ · genetic diversity of moringa oleifera lam. collected...

ปญหาพเศษปรญญาตร

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวด นครปฐม โดยใช

เครองหมายโมเลกลชนด SRAP

Genetic Diversity of Moringa oleifera Lam. Collected from Nakorn Pathom Province Using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Marker

โดย

นางสาวสดารตน ทมอรรถ

ควบคมและอนมตโดย

วนท..........เดอน......................พ.ศ.............. (ดร.บบผา คงสมย)

วนท..........เดอน......................พ.ศ.............. (ดร.อญมณ อาวชานนท)

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวด นครปฐม โดยใช

เครองหมายโมเลกล SRAP

นางสาว สดารตน ทมอรรถ

บทคดยอ

ปจจบนมะรมจดเปนพชทก าลงไดรบความสนใจมากขนเพอใชประโยชนทางดานอาหารและยา แต

การศกษาทางดานความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมนนมจ ากด งานวจยจงมวตถประสงคเพอศกษา

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวด นครปฐม จ านวน 25 ตวอยาง โดยใช SRAP

Marker จ านวน 25 คไพรเมอร พบวา ม 13 คไพรเมอร ทใหความแตกตางของแถบดเอนเอ เมอศกษาลาย

พมพดเอนเอทเกดขน พบวาใหแถบของดเอนเอทงหมด 114 แถบ (เฉลย 8 แถบ/ไพรเมอร) แตเปนแถบของด

เอนเอทมความแตกตางกน 52 แถบ (45.6%) เมอศกษาความสมพนธทางพนธกรรม พบวา มความใกลชด

ทางพนธกรรมอยระหวาง 0.74 – 0.94 โดยใชวธ Unweighted pair group method with arithmetic

averages (UPGMA) ซงทคา Dice similarity coefficients เฉลยเทากบ 0.82 สามารถจดกลมตวอยางมะรม

ได 3 กลมและ Out group 4 ตวอยาง คอ กลมท 1 ประกอบดวยกลมตวอยางมะรมทรวบรวมจากบรเวณ

อ าเภอเมอง อ าเภอบางเลน และอ าเภอก าแพงแสน กลมท 2 ประกอบดวยตวอยางมะรมทอยในแถบอ าเภอ

เมอง และอ าเภอก าแพงแสน กลมท 3 ประกอบดวยตวอยางมะรมจากอนเดย และอนโดนเซย จากการ

ทดลองนแสดงใหเหนวา ตวอยางมะรมในแถบจงหวดนครปฐมมความหลากหลายทางพนธกรรมต า

ค าส าคญ : มะรม, เครองหมายโมเลกล SRAP , ความหลากหลายทางพนธกรรม

ปญหาพเศษ : ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน

อาจารยทปรกษา : ดร. บบผา คงสมย, ดร. อญมณ อาวชานนท

ปทพมพ : 2554

จ านวนหนา : 27 หนา

Genetic diversity of Moringa oleifera Lam. collected from Nakorn Pathom province using

Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)

Miss Sudarat Timat

Abstract

Moringa oleifera is currently a crop of interest especially for medicinal and food uses.

However, the study on genetic diversity of Moringa spp. is limited. The objective of this research

was to investigate genetic diversity of 25 samples Moringa oleifera collected from Nakorn Pathom

province comparing to those collected from India and Indonesia using SRAP-PCR technique. The

result showed that 13 primers out of 25 pairs of primers produced 52 polymorphic bands (45.6%)

from a total of 114 bands (averaged 8 bands / primers). According to genetic relationship

between the studied samples and cluster analysis using UPGMA, the similarity coefficient ranged

from 0.74 to 0.94. At the average similarity coefficient of 0.82, it produced 3 separated groups

and 4 sample as outgroup. The first group consists of the Moringa oleifera collected from

Mueang, Bang Lane and Kamphaeng Saen district. The second group consists of those from

Mueang and Kamphaeng Saen district. The last group consists of the Moringa from India and

Indonesia. This study indicates that genetic diversity among Moringa oleifera collected from

Nakorn Pathom province is relatively low.

Keywords : Moringa oleifera, SRAP marker, Genetic diversity

Field : Program in Agricultural Biotechnology

Degree : B.S. (Agricultural Biotechnology), Program in Agricultural Biotechnology

: Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University

: Kamphaeng Saen Campus

Advisor : Buppa Kongsamai, Ph.D., Anyamanee Auvuchanon, Ph.D.

Year : 2011

Page : 27

ค านยม

ขอขอบพระคณ ดร. บบผา คงสมย และ ดร. อญมณ อาวชานนท อาจารยทปรกษาปญหาพเศษท

กรณาใหความร ค าปรกษา และประสบการณในดานการปฏบตงาน การคนควาวจย การเรยบเรยงขอมล ตลอดจนแกไขขอบกพรองตาง ๆ ของปญหาพเศษฉบบนจนเสรจสมบรณ รวมถงใหโอกาสและการสนบสนนดวยดตลอดมา และขอขอบพระคณคณาจารยทกทานทถายทอดความรตาง ๆ จนกระทงส าเรจงานวจยในครงน

ขอขอบคณ สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร ทสนบสนนทนในการด าเนนการปญหา

พเศษและ นางสาว เมทน พลอยเปลยนแสง ทคอยใหความชวยเหลอตลอดการปฏบตงาน รวมถงพ ๆ ทก

คนทประจ าหองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาพชสวน คณะเกษตร ก าแพงแสน

สดทายนขอกราบขอบพระคณ คณพอ คณแม ครอบครวอนเปนทรก ทคอยใหก าลงใจและสนบสนนอยางดยงตลอดมา

สดารตน ทมอรรถ มนาคม พ.ศ 2555

สารบาญ

หนา สารบาญ (1) สารบาญตาราง (2) สารบาญภาพ (3) ค าน า 1 วตถประสงค 3 ตรวจเอกสาร 4 อปกรณวธการ 12 ผลการทดลอง 19 วจารณผลการทดลอง 22 สรปผลการทดลอง 24 เอกสารอางอง 25

สารบาญตาราง ตารางท หนา 1. แสดงตวอยางมะรมทง 25 ตวอยาง ทใชในการสกดดเอนเอ 13

2. แสดงไพรเมอร SRAP และล าดบเบส ทใชในปฏกรยาพซอาร 17 3.

แสดงความเขมขนและปรมาณของสารทใชในปฏกรยาพซอาร 17 4. แสดง

ขนตอนและอณหภมทใชในปฏกรยาพซอาร 18 5. แสดง

จ านวนแถบดเอนเอทเกดขนและรอยละของจ านวนแถบดเอนเอ 20

ทแสดงความแตกตาง (percentage of polymorphism)

สารบาญภาพ ภาพท หนา 1. Dendrogram แสดงตวอยางมะรมทไดจากการวเคราะหดวย 21

โปรแกรม NTSYS-pc version 2.01e และจดกลมดวยวธ UPGMA

โดยพจารณาจากคาความคลายคลง (similarity coefficients) ท 0.82

ค าน า

มะรมเปนไมยนตนขนาดกลางทถกปลกไวในบรเวณบานไทยมาแตโบราณ จดเปนพชในวงศ Moringaceae และเปนพชทองถนของประเทศอนเดย ปากสถาน บงกลาเทศ และแอฟกานสถาน ซงในปจจบนไดมการกระจายพนธไปสประเทศฟลปปนส ทวปอเมรกา ส าหรบประเทศไทยจะสามารถพบเหนตนมะรมไดในทกภาค เนองจากเปนพชททนแลง เจรญเตบโตเรวรวมถงเปนตนไมทกนไดแทบทกสวน มะรมจดเปนพชทก าลงไดรบความสนใจอยางมาก เพราะสามารถใชเปนอาหาร ยาสมนไพรและเปนสวนผสมของเครองส าอาง เนองจากใบของมะรมประกอบดวย เบตาแคโรทน โปรตน วตามนซ แคลเซยม และโปแตสเซยม ปรมาณสง ซงจดเปนสารตานอนมลอสระจากธรรมชาตทดและในเมลดยงสามารถสกดน ามนซงกลายเปนผลตภณฑทไดรบความนยมเนองจากมคณสมบตในการลบเลอนรอยแผลเปน ตอตานรวรอยสวบนใบหนาและจดดางด าบนใบหนา น ามนมะรมบรสทธ มคณสมบตพเศษในการกระตนการไหลเวยนของโลหต ชวยขยายหลอดเลอด และมสารชวยชะลอความแก นอกจากนยงมสารพฤกษเคมทหลากหลายทสามารถชวยรกษาโรคตางๆได ปจจบนมการผลตในรปแบบของ มะรมแคปซล, ชามะรม, มะรมผง, ลกประคบมะรม, โลชนมะรม และสบน าผงมะรม จงท าใหมะรมกลายเปนพชทมความส าคญทางเศรษฐกจมากขน และจากประโยชนในดานตาง ๆ ของมะรมท าใหมผสนใจท าการศกษาและวจยมะรมมากขนโดยเฉพาะประโยชนทางดานอาหารและยา แตปจจบนการศกษาทางดานความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมในประเทศไทยนนมจ ากด ขาดการพฒนาพนธหรอทดสอบพนธมะรมเพอการปลกเชงพาณชย การน าสวนตาง ๆ ของตนมะรมมาใชประโยชนนนกน ามาจากสายพนธดงเดมทขนอยทวไป นอกจากนเรมมการน าเขาพนธมะรมจากประเทศอนเดย ผลตจ าหนายในรปเมลดพนธ และตนกลาในพนทปลกภาคกลาง และมะรมเปนพชผสมขามตามธรรมชาต จงคาดวานาจะมความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมในประเทศคอนขางสง

Muluvi et al. (1999) ไดศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมดวยเทคนค AFLP จ านวน

140 ตวอยางจาก 7 ประชากรทรวบรวมมาจากแหลงตาง ๆ พบวา 4 คไพรเมอรใหแถบดเอนเอทแตกตางกน 157 แถบ (66.5%) จากทงหมด 236 แถบ เมอน ามาวเคราะหขอมลดวยวธ AMOVA สามารถแยกกลมตามความแตกตางของประชากรมะรม อยางไรกตามน าปจจบนเครองหมายโมเลกลชนด SRAP น าไปใชในการสรางลายพมพดเอนเอและศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมในพชผสมขามและพชผสมตวเองหลายชนด เชน มนฝรง ขาว กระเทยม แอปเปล Chinese cabbage (Brassica rapa L.), rapeseed (Brassica napus L.) citrus และ celery (Li and Quiros , 2001) เนองจากเครองหมายโมเลกลชนด SRAP มขอดคอ ท าไดงาย รวดเรว ไมตองทราบขอมลล าดบเบสของพชทตองการศกษา และเปนการตรวจสอบดเอนเอครงละหลายต าแหนงพรอมกน

ดงนนการศกษาในครงนจงมเปาหมายเพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมท

เจรญเตบโตอยในพนทจงหวดนครปฐมเปรยบเทยบกบสายพนธมะรมจากตางประเทศโดยใชเครองหมาย

โมเลกลชนด SRAP เพอน าไปเปนขอมลพนฐานในการปรบปรงสายพนธของมะรมทอยในประเทศไทย

วตถประสงค

เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวดนครปฐมโดยใช

เครองหมายโมเลกลชนด SRAP

สถานทท าการทดลอง

1. แปลงทดลองภาควชาพชไรนา คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน

จงหวดนครปฐม

2. หองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ ภาควชา พชสวน คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาท าการทดลอง

เรมท าการทดลองเดอน ตลาคม พ.ศ. 2553 สนสดการทดลองเดอนสงหาคม พ.ศ. 2554

การตรวจเอกสาร

ลกษณะทวไปของมะรม

มะรม (Moringa oleifera Lam.) ชอสามญคอ horse radish tree และ drumstick tree จดอยใน

วงศ Moringaceae เปนพรรณไมททนแลงมถนก าเนดในแถบเทอกเขาหมาลย โดยเฉพาะในเขตประเทศ

อนเดย ปากสถาน บงคลาเทศ และอฟกานสถาน ตนก าเนดของมะรมนนสนนษฐานวามมาแตสมยโรมนกรก

และอยปต จนปจจบนนมการปลกมะรมอยางแพรหลายในพนทกงแหงแลง เขตรอนและกงเขตรอน

แมกระทง เขตทมอณหภมประมาณ -3.9-4.4 องศาเซลเซยสในประเทศสหรฐอเมรกา เจรญเตบโตทสดในดน

ปนทรายแหง ทนดนทไมดรวมถงพนทชายฝงทะเล เตบโตไดอยางรวดเรวแพรหลายไปยง อฟรกา อเมรกา

กลาง อเมรกาใต อาหรบ มาเลเซย อนโดนเซย เอเซยรไมเนอร และฟลปปนส ประเทศอนเดยขนชอวาม

การศกษาคนควาเรองของมะรมและหนมาปลกมะรมเปนสนคาสงออกกนมาก อนเดยเปนประเทศทปลกและ

ใหผลผลตจากมะรมและน ามนมะรมมากทสดในโลก ประมาณ 1.1-1.3 ลานตนตอป จากพนท 380 ตาราง

กโลเมตรและยงขยายไปยงประเทศศรลงกาดวย ผลตภณฑของมะรมทส าคญอยางหนงคอฝกมะรมสด

(Moringa Fresh Drumsticks) ฝกมะรมสดนนอกจากจะใชบรโภคภายในประเทศแลวกยงเปนสนคาสงออก

ทส าคญอยางหนงของอนเดยอกดวย โดยมประเทศเปาหมายสงออกส าคญ เชน ออสเตรเลย ฝรงเศส และ

เนเธอรแลนด (วไลวรรณ, 2552 )

มะรมเปนพชผสมขามทมจ านวนโครโมโซม 2n = 28 ออกดอกตลอดทงป ขณะทพชชนดอน ๆ ออก

ดอกสองฤด ขยายพนธไดดวยการเพาะเมลด การปกช า หรอรากทแตกหนอ ทางดานการศกษาการกระจาย

ตวของความแปรปรวนทางพนธกรรมของมะรมนนพบวายงมจ ากด ส าหรบความหลากหลายทางพนธกรรมท

เกดขนสวนมากนน เกดจากการสบทอดลกษณะทางพนธกรรมในรปของลกษณะทางปรมาณซงเคยม

รายงานจากประเทศอนเดยและประเทศเคนยา ซงแสดงใหเหนถงศกยภาพในการปรบปรงพนธมะรมเปน

อยางมาก (Muluvi et al., 1999) ส าหรบในประเทศไทยสามารถพบมะรมไดในทกภาคของประเทศ เนองจาก

เปนพชทปลกงาย เจรญเตบโตไดดในดนทกชนด การปลกและการดแลรกษาไมยงยาก ชาวบานจงนยมปลก

มะรมไวทรมรวบานเพอใชเปนผกสวนครว (รฐศกด, 2552) มะรมจงมชอเรยกแตกตางกนออกไปตามภาค

ตาง ๆ เชน ภาคเหนอเรยก ผกอฮม, มะคอนกอม, บาคอนกอม, ภาคกลางเรยก, มะรม และภาคอสานเรยก

ผกอฮม เปนตน (วทย, 2542)

ลกษณะทางพฤษศาสตรของมะรม

ล าตน เปนพรรณไมยนตน ขนาดกลาง ล าตนเปนพมสงโปรง (วทย, 2542) สงประมาณ 3-10 เมตรล าตนมกคดงอ เรอนยอดบาง เปลอกมเสนใยหยาบ กงกานมชองอากาศ มรอยแผลเปนชดตามยอดออนมขนนมสน (กองกานดา และ ลนา, 2545)

ใบ เปนใบประกอบแบบขนนก 2-4 ชน ใบคอนขางดกทใกล ๆ ปลายกง ใบยอยม 8-10 ค ขนาดเลก

ตดตรงขามรปไข รปไขกลบ หรอรปขอบขนานกวาง 5-12 มลลเมตร ยาว 9-20 มลลเมตร ปลายกลม หรอเปนแองเลกนอย ขอบเรยบ ดานลางสเขยวออนเสนใบเหนชด ทโคนกานใบยอยและใบยอยมตอมทมกาน กานใบหนาทโคนเมอรวมแกนกลางใบยาว 25-65 เซนตเมตร ทกกงกานเปนขอตรงรอยตอ มตอมรปขอบขนานแคบ หรอรปกระบอง มกโคง (กองกานดา และ ลนา, 2545)

ดอก ออกเปนชอแยกแขนงตามงามใบ ชอดอกยาว 10-30 เซนตเมตร ใบประดบขนาดเลก ดอก

สมบรณเพศ สมมาตรดานขาง สขาว โคนสเขยวออน กลนหอม กานดอกยอยยาว 7-11 มลลเมตร กลบเลยงเปนทอสน ยาว 3-4 มลลเมตร ปลายทอเปน 5 แฉก ซอนเหลอมกน กลบหลงยาว 7-10 มลลเมตร กลบหนายาว 10-14 มลลเมตร กลบดอกม 5 กลบ แยกจากกน ทโคนมขน กลบหนากวาง 6-8 มลลเมตร ยาว 14-17 มลลเมตร กลบหลงกวาง 5-8 มลเมตร ยาว 10-13 มลลเมตร เกสรเพศผและเกสรผปลอมมขนทโคน ชไปทางกลบดอกทใหญทสด ปลายกานเกสรเพศผโคง กานชเกสรเพศเมยยาว 2-3 มลลเมตร รงไขยาว 3-4 มลลเมตร มขนหนาแนน ม 3 พลาเซนตา กานเกสรเพศเมยชขน เกลยง ยอดเกสรเพศเมยกลวง (กองกานดา และ ลนา, 2545)

ผล มลกษณะเปนฝก กลม ยาว ฝกออนมสแดงเรอ ๆ ฝกแกจะมสเขยว เปลอกของฝกหนา มคลน

นนของเมลด (วทย, 2542) ฝกแหงหอยลงรปรางคลายกรชยาว 18-45 เซนตเมตร (กองกานดา และ ลนา, 2545) หวทายเปนจะงอย เมอแกแตกเปน 3 สวนตามยาว แตละสวนมเมลดตดอย เมลดมปก 3 ปก (จตราภรณ, 2548)

เมลด กลม เสนผานศนยกลางยาว 10 มลลเมตร ม 3 ปก กวาง 4-7 มลลเมตร ยาว 25 มลลเมตร

เมอแกปกอนหนงจะซอนทบกน (กองกานดา และ ลนา, 2545)

ประโยชนของมะรม ทางอาหาร

เนอในฝกสดและเมลดน ามาแกงสมมะรม ดอกออน ลวกใหสกหรอดองรบประทานกบน าพรก เมลดมะรมแหงน ามาควเปนของกนเลนทมรสชาตอรอย ใบและรากสดกสามารถน ามาท าเปนอาหารได ใบมะรมเปนทรวมสารอาหารไวอยางหลากหลายและในปรมาณมาก ทง วตามน เอ ทมากกวาแครอทถง 4 เทา ซงจะชวยบ ารงสายตาและผวหนง มวตามน ซ มากกวาสมถง 7 เทา ซงจะชวยปองกนโรคหวด เสรมสรางภมตานทาน มแคลเซยมมากกวานม 4 เทา ซงจะชวยเสรมสรางกระดกและฟน มโปรแตสเซยมมากกวากลวย 3 เทา ซงจะชวยบ ารงสมองและระบบประสาท รวมทงยงมโปรตนมากกวานมถง 2 เทา ซงจะชวยเสรมสรางเซลลและมธาตเหลกมากกวาผกโขมและนอกจากนยงอดมไปดวยเกลอแรตาง ๆ (รฐศกด, 2552; วรรณภา, 2552 ทางยาสมนไพร

เปลอกมะรม นยมใชกนมากในเรองของการสมานแผลเปนหลก รวมทงใชขบลมในล าไส บ ารงธาต แกฝ พยาธ แกไขสนนบาต แกจกเสยดแนนเฟอ บ าบดโรคทองมาน ปวดเมอยตามขอและบ ารงหวใจ

ใบสด มวตามน ซ และเอมาก แกโรคเลอดออกตามไรฟน โรคเยอเมอกอกเสบ ต าพอกบรเวณทเปนแผลชวยหามเลอด ขบน าตา ขบน านม ท าใหนอนหลบ อกทงยงเปนยาระบาย ขบปสสาวะ แกไขบ าบดโรคทองมาน ปวดเมอยตามขอและบ ารงหวใจ และยงชวยรกษาอาการของโรคเบาหวานและควบคมความดนโลหต รวมทงชวยเพมสารอาหารและบ ารงรางกาย (รฐศกด, 2552)

ดอก เปนยาบ ารง ขบปสสาวะ เปนยากระตนความก าหนด (วทย, 2542; กองกานดา และ ลนา,

2545)

ราก มรสเผดหวานขม ชวยบ ารงและกระตนหวใจ บ าบดโรคทองมาร แกอาการบวม บ ารงไฟธาต แก

พษฝ ปวดอกเสบ ท าใหเกดความระคายเคอง แกลมเขาขอ ฟกช า ปวดบวม ขบปสสาวะ อมกลวคอ ลางแผล

แกไอ และแกอาการปวดเมอยตามขอ (นจศร, 2547; รฐศกด, 2552)

เมลด มคณสมบตเปนยาปฏชวนะออน ใชฆาเชอ เมลดมะรมแกจะชวยปองกนโรคทองเดนและยงม

รสหวาน ชมคอ แกไอ แกไขหวด เมลดมะรมยงเปนยาภายนอกพอกแผลอกเสบโดยน าเมลดมาบดแลวพอก

แผลจะหายเรวขน ใชหยอดจมกบ าบดโรคภมแพไซนส โรคทางเดนหายใจ ใชถนวดบรรเทาอาการบรเวณท

ปวดบวมตามขอ บ าบดโรคไขขออกเสบ เกาท รมาตก เปนตน (กองกานดา และ ลนา, 2545; รฐศกด, 2552)

ทงนสวนส าคญทอยในเมลดมะรมคอน ามนมะรมซงมปรมาณถง 40% ในน ามนมะรมสวนใหญมกรดไขมน

ไมอมตวถง 70% ใชเมลดสด น ามาคนเอาน ามน จะไดน ามนทเรยกวา เบนเฮนออยล (Ben hen oil) หรอ

เบน (Ben) มสเหลองทองหรอเหลองอมแดง มคณสมบตคลายน ามนมะกอก จงเปนน ามนทมคณภาพด

ส าหรบรบประทานอาหาร มสวนชวยลดคลอเลสเตอรอลในเสนเลอด ปองกนโรคหวใจ ใชรบประทานเปน

น ามนสลดกได สวนเมลดใชรบประทานเปนอาหารเชนเดยวกบถว น ามนเบนเฮนออยล (Ben hen oil) ม

คณสมบตพเศษ คอ ไมรวมกบออกซเจน (resistant to oxidation) จงใชเปนสวนผสมในเครองส าอางซงจะ

ชวยบ ารงผวพรรณ รกษาขจดความดางบนใบหนา รอยไหมจากการแพแสงแดด ชวยลดลอยเหยวยนบน

ใบหนา รวมทงยงมคณสมบตเดนในการรกษาแผลเรอรง แผลกดทบในผปวยอมพาตไดผล โดยใชน ามน

ชโลมทแผล แผลจะหายเรวขน นอกจากประโยชนทางยาสมนไพรแลวยงพบวาในตางประเทศ เชน ประเทศ

อนเดย แอฟรกา และประเทศทก าลงพฒนาในเขตรอนชน น าเอาเมลดมะรมมาใชบ าบดน าใหสะอาดและ

สามารถดมได โดยผงจากเมลดมะรมจะมโปรตนทเปนประจบวกซงจะชวยในการจบกบสงสกปรกแลวเกด

การตกตะกอนท าใหน าใสขน ใชในการบ าบดน าขนใหสามารถใชประโยชนได นอกจากนในเมลดของมะรมยง

มสารตานจลชพทมความสามารถในการลดความเขมขนของเชอแบคทเรยในน าเสยไดมากกวา 90% ท าให

สามารถน าน าไปบรโภคได (รฐศกด, 2552; Muluvi et al., 1999) และยงพบวาในมะรมมสาระส าคญอก

หลายชนดตามสวนประกอบตาง ๆ มดงน

เปลอกตน ม alkaloids 2 ชนด คอ moringine และ moringinine

ยาง ม arabinose, galactone, glucuronic acid และ traces of rhamnose

เมลด ben oil ม palmitic, steatic, arachidic, behedic, lignoceri, hexadecenoic, linoleic และ

oleic acid (กองกานดา และ ลนา, 2545)

เนองจากในสวนตาง ๆ ของมะรมนนมประโยชนมากมาย มะรมจงถกน ามาท าเปนผลตภณฑในรปแบบตาง ๆ เชน สบน าผงมะรม โลชนมะรม น ามนมะรม เจลลางหนามะรม โทนเนอรมะรม แชมพมะรม ลบบาลมมะรม และผงขดผวมะรม เปนผลตภณฑเครองส าอาง แคปซลมะรม ชามะรม แคปซลเมดมะรม และสารสกดจากใบมะรม เปนผลตภณฑเสรมอาหาร และผลตภณฑอน ๆ ไดแก การน ามะรมไปผลตเปนไหมสงเคราะหและเยอกระดาษ (Muluvi et al., 1999)

เครองหมายทางพนธกรรม (Genetic Marker)

เครองหมายทางพนธกรรม คอ ลกษณะหรอตวบงชทมความเฉพาะเจาะจง สามารถน ามาใชแยกความแตกตางทางพนธกรรม และสามารถถายทอดลกษณะนนๆไปยงรนลกได เครองหมายทางพนธกรรมทมการใชกนมากในงานปรบปรงพนธและการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม ไดแก morphological markers, biological marker และ molecular marker และในปจจบนมการพฒนา molecular marker หรอ DNA Markers ซงเปนเครองหมายโมเลกลทใชบงบอกความแตกตางของสงมชวตในระดบดเอนเอ (สรพร, 2546) และเปนเครองมอส าหรบการประเมนเชอพนธกรรมเพอการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของสงมชวตและสรางแผนททางพนธกรรมไดอยางมประสทธภาพ (Wang et al., 2008)

เครองหมายโมเลกลทนยมใชในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมเพอใชในงานปรบปรง

พนธพชไดแก เครองหมาย Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP), เครองหมาย Random

Amplified Polymorphic DNA (RAPD), เครองหมาย Restriction Fragment Length Polymorphisms

(RFLP) และ เครองหมาย Simple sequence repeats (SSR) หรอเครองหมาย Microsatellite ซง

เครองหมายโมเลกลแตละระบบมขอดและขอเสยทแตกตางกน ตวอยางเชน เมอศกษาการเปรยบเทยบ

เครองหมายโมเลกล RAPD, RFLP, AFLP และ SSR ในการศกษาความหลากหลายของขาวโพดสตวในเขต

รอน จากผลการทดลองพบวา เครองหมาย RFLP และ SSR แสดงคาของ polymorphism information

content (PIC) สงกวาคาเฉลยของเครองหมาย RAPD และ AFLP (Garcia et al. 2004) เนองจาก

เครองหมาย RFLP มขอไดเปรยบคอ สามารถวเคราะหจากสวนใดของพชกไดไมขนกบเนอเยอ ระยะการ

เจรญเตบโต และ สภาพแวดลอมและ SSR เปนเทคนคทใชหลกการของการกระจายตวของเบสซ าใน

สงมชวตซงมความแมนย าสง (สรพร, 2546) จงท าใหม คา PIC สง แตอยางไรกตามเครองหมาย RAPD และ

AFLP (dominant marker) กใหคา coefficients of variation (CV) ทต ากวาเครองหมาย RFLP และ SSR

ผลจากการศกษาชใหเหนวา เครองหมายโมเลกลทงหมด ยกเวน เครองหมาย RAPD (ซงเปนเทคนคทม

ความสม าเสมอนอย ท าซ าจะไดขอมลไมเหมอนเดม (Li and Quiros , 2001)) มประสทธภาพในการทจะ

น ามาใชประโยชนในการปรบปรงพนธพชทมฐานพนธกรรมกวางได จากเครองหมายโมเลกลทงหมดทน ามา

เปรยบเทยบ พบวา เครองหมาย AFLP เปนทางเลอกทดทสดส าหรบการประเมนความหลากหลายและการ

ประเมนความสมพนธทางพนธกรรมระหวางสายพนธขาวโพดในเขตรอน เนองจาก ม multiplexing ratio สง

สามารถตรวจสอบดเอนเอไดหลายต าแหนงพรอม ๆ กนและครอบคลมทงจโนมและท าไดโดยไมตองทราบ

ขอมลล าดบเบสของสงมชวตมากอน (Garcia et al. 2004)

เครองหมายโมเลกล Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)

เครองหมายโมเลกลชนด SRAP เปนเครองหมายโมเลกลดเอนเอทถกคดคนและพฒนาโดย Li and Quiros. (2001) โดยอาศยหลกการเพมปรมาณดเอนเอโดยปฏกรยาลกโซหรอ เทคนค PCR มวตถประสงคเพอจบกบล าดบเบสในบรเวณ open reading frames (ORFs) โดยใชไพรเมอร 2 ชนดไดแก forward primer ทมขนาด 17 เบส ประกอบดวยสวนทเรยกวา core sequence 14 เบสโดยชวงแรกเปนล าดบเบสทไมมอะไรเปนพเศษจ านวน 10 เบส เรยกวา filler sequence ตามดวยเบส CCGG และเบสทเลอกไดหรอเปลยนแปลงได อก 3 เบสตอมาทางปลาย 3’ และ reverse primer มขนาด 18 เบส ประกอบดวยสวนทเรยกวา core sequence ม 15 เบส โดย 11 เบสแรก เรมตนจากปลาย 5’ เรยกวา filler sequence (ล าดบเบสตางจาก filler Sequences ของไพรเมอรชนด forward) ตามดวยเบส AATT และเบสทเลอกไดอก 3 เบสดานปลาย 3’ (ชลนท, 2546; Li and Quiros , 2001)

โดยไพรเมอรทออกแบบไวเมอจบกบล าดบเบสในบรเวณทเปน ORFs จะถกเพมปรมาณดเอนเอ

ดวยวธ PCR โดยใชอณหภมเรมตน ในขน annealing ท 35 องศาเซลเซยส ด าเนนปฏกรยาจนครบ 35 รอบ หลงจากนนแยกชนสวนโดยใช เจลโพลอะครลาไมลทมสารทท าใหดเอนเอเสยสภาพ (Denaturing polyacrylamide gle)

เครองหมายโมเลกลนถกทดสอบโดยการหาล าดบเบสในลกผสมของ Brassica oleracea L.

ระหวางสายพนธดงเดมและสายพนธทเปน double haploid หลงจากการศกษาล าดบเบสแลวประมาณ 45 เปอรเซนตของล าดบเบสทหาไดจะมความคลายคลงกบล าดบเบสของยนใน GenBank (ชลนท, 2546) และ 20 เปอรเซนต ของเครองหมาย SRAP แสดงการขมแบบขมรวมกน (co-dominant) จงตรวจสอบในรปของการมหรอไมมแถบดเอนเอทต าแหนงตรงกน นอกจากนยงน าเทคนค SRAP ไปใชในการสรางลายพมพดเอนเอในพชอน ๆ อก เชน มนฝรง ขาว กระเทยม แอปเปล Chinese cabbage (Brassica rapa L.), rapeseed (Brassica napus L.) citrus และ celery (Li and Quiros , 2001)

ขอดของเครองหมาย SRAP คอท าไดงาย รวดเรว และมประสทธภาพในการน ามาปรบใชกบความ

หลากหลายของพชทแตกตางกน ไมตองทราบขอมลล าดบเบสของสงมชวตทตองการศกษา และเปนการ

ตรวจสอบดเอนเอครงละหลายต าแหนงพรอมกน ใกลเคยงกบทตรวจสอบโดยเทคนค AFLP แตท าไดงายและ

รวดเรวกวา (สรนทร, 2552)

การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมพชดวยเครองหมายโมเลกลชนด SRAP

ดลรตน และคณะ (2553) ไดศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของแกนตะวนจากแหลงพนธกรรม Plant Gene Resources of Canada จ านวน 47 สายพนธ ดวยเครองหมายโมเลกลชนด SRAP พบวา ไพรเมอร 9 ค สามารถสงเคราะหแถบดเอนเอจากแกนตะวนทง 47 สายพนธได จ านวนอยระหวาง 12 ถง 37 แถบ มคาเฉลยเทากบ 24.33 แถบ ซงมแถบดเอนเอทแตกตางกน (polymorphic DNA) มคาเฉลยเทากบ 21.11 แถบ โดยมคาอยระหวาง 10 ถง 36 แถบ โดยมขนาดของแถบดเอนเออยระหวาง 95 ถง 2,000 คเบส คา PIC จากแถบดเอนเอทสงเคราะหไดจากแกนตะวน 47 สายพนธ มคาเฉลยเทากบ 0.955 จากการวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมของแกนตะวนดวยวธ UPGMA สามารถแบงแกนตะวน 47 พนธ ออกเปน 7 กลม แสดงใหเหนวาลายพมพดเอนเอทไดจากการศกษาดวยเทคนค SRAP-PCR สามารถบงบอกความแตกตางทางพนธกรรมไดด

วารน (2545) ใชเครองหมายโมเลกล SRAP ศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของยางกรวด ยาง

พลวง และลกผสม พบวา จากการศกษาคาดชนความเหมอน (similarity index) คาความแตกตางทางพนธกรรม (genetic distance) และ Phylogenetic tree สามารถแบงตวอยางไดเปน 3 กลมอยางชดเจน คอ กลมยางกรวด กลมยางพลวง และกลมยางทคาดวาเปนลกผสม

ชลนท (2546) ใชเครองหมายโมเลกล SRAP ทดสอบความหลากหลายทางพนธกรรมของหญารซ

รวมกบ marker ทพฒนาขน เพอใชเปนขอมลเพมเตมในการตรวจสอบความหลากหลายของหญารซ จากการใช SRAPไพรเมอร 26 ค พบวา ม 4 คไพรเมอร ทใหผลการวเคราะหลายพมพดเอนเอของหญารซทสมบรณทง 25 ตวอยาง โดยรปแบบของลายพมพดเอนเอทไดจากเทคนค SRAP ใหแถบดเอนเอจ านวนมากกวา marker ทพฒนาขน แตใหผลการทดลองเชนเดยวกน คอหญารซมความหลากหลายทางพนธกรรมสงมากและไมสามารถจดกลมไดอยางชดเจน

Muluvi et al. (1999) ไดศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมดวยเทคนค AFLP จ านวน

140 ตวอยางจาก 7 ประชากร พบวาจาก 4 ไพรเมอรใหแถบดเอนเอทแตกตางกน 157 แถบ จากทงหมด 236 แถบ คดเปน 66.5% เมอน ามาวเคราะหขอมลดวยวธ AMOVA สามารถแยกความแตกตางระหวางพนทกบประชากรได

Kaur et al. (2004) วเคราะหความหลากหลายทางพนธกรรมของ Brassica rapa จ านวน 19 พนธ

ซงมความทนทานตอธาตโบรอนแตกตางกนดวยเทคนค SRAP พบวา มไพรเมอร 14 คทใหความแตกตางของแถบดเอนเอทงหมด 128 แถบเมอน าขอมลมาวเคราะหขอมล สามารถแบงกลมพนธของ B. rapa ทม

ความตานทานและไมตานทานตอธาตโบรอนออกจากกนได ท าใหสามารถคดเลอกคผสมของพอแม เพอสรางประชากรทใชส าหรบท าแผนทยนทตานทานตอธาตโบรอน

อปกรณและวธการ

ตวอยางพชทใชในการศกษา

เมลดตวอยางมะรม จ านวน 20 ตวอยาง ซงรวบรวมจากจงหวดนครปฐม เมลดมะรมอนเดย 3

ตวอยาง และเมลดมะรมอนโดนเซย 2 ตวอยาง (ตารางท 1) เพาะกลา ณ แปลงทดลองของภาควชาพชไรนา

คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน เกบใบออนมะรมปลายยอดสดท

แผกางเตมท น าไปสกดดเอนเอ

การสกดดเอนเอ

การสกดดเอนเอของมะรมโดยประยกตจากวธของ Agrawal et al. (1992) โดยการตดใบออนของมะรมเปนชนเลก ๆ ดวยกรรไกรใสในโกรงทแชเยนบดใหละเอยดจนเปนผง เตมไนโตรเจนเหลวและเตม CTAB 600 ไมโครลตร ผสมกบ mercaptoethanal 5 ไมโครลตร ใสในหลอดขนาด 1.5 มลลลตร แลวตกตวอยางทบดแลวใสลงไปในหลอด 1.5 มลลลตรทเตรยมไวแลว ผสมใหเขากน น าไปบมไวใน water bath ทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง (เขยาทก ๆ 10 นาท) จากนนน ามาวางใหเยน แลวเตมสารละลาย chloroform:isoamylalcohol อตราสวน 24:1 ปรมาตร 600 ไมโครลตร พลกหลอดกลบไปมาเบา ๆ น าไปปนเหวยงดวยความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ดดสวนใสใหไดอยางนอย 450 ไมโครลตร ใสในหลอดขนาด 1.5 มลลลตรใหม เตมสารละลายโซเดยมคลอไรด (5M NaCl) ปรมาตร 5 ไมโครลตร และเตมไอโซโพรพานอล (isopropanal) ทแชเยน ปรมาตร 450 ไมโครลตร พลกหลอดกลบไปมาเบา ๆ จากนนน าไปแชเยนท -20 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท เพอใหดเอนเอตกตะกอนมากขน จากนนท าการปนเหวยงเพอตกตะกอนดวยความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท แลวเทสวนใสทง ตากตะกอนใหแหง แลวเตม TE buffer ปรมาตร 300 ไมโครลตร ผสมกบ RNase A ปรมาตร 2 ไมโครลตรผสมใหเขากนเพอใหดเอนเอละลาย incubate ท 37 องศาเซลเซยส ขามคน จากนนเตม Phenol:chroloform:isoamylalcohol ปรมาตร 500 ไมโครลตร เพอก าจดโปรตน แลวน าไปปนเหวยงดวยความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ดดสวนใสดานบนปรมาตร 450 ไมโครลตร ใสในหลอดปรมาตร 1.5 มลลลตรใหม แลวเตม chloroform:isoamylalcohol อตราสวน 24:1 ปรมาตร 450 ไมโครลตร ผสมใหเขากนน าไปปนเหวยงอก 10 นาท ดดสวนใสปรมาตร 300 ไมโครลตรใสหลอดปรมาตร 1.5 มลลลตรใหม เตมสารละลายเกลอโซเดยมอะซเตต (3M CH3COONa) ปรมาตร 3 ไมโครลตร แลวเตม absolute ethanol ปรมาตร 600 ไมโครลตร พลกหลอดกลบไปมา เกบดเอนเอทอณหภม –20 องศาเซลเซยส ขามคน เพอใหดเอนเอตกตะกอนมากขน จากนนน าดเอนเอมาปนเหวยงดวยความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาทเพอตกตะกอนดเอนเอ เทสวนใสออก จากนนลางตะกอนดเอนเอดวย 70% ethanol ปรมาตร 300 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงอก 5 นาท แลวเทสวนใสทง ตากดเอนเอทอณหภม 37 องศาเซลเซยส จนแหง จากนนละลายตะกอนดวย TE

buffer (10mM Tris-HCL, EDTA 1 ml) pH 8 ปรมาตร 60 ไมโครลตร แทปหลอดใหดเอนเอละลาย เกบดเอนเอทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

ตารางท 1 ตวอยางมะรม 25 ตวอยาง ทใชในการสกดดเอนเอ

ล าดบท ชอตวอยาง สถานททเกบตวอยาง จงหวด

1 M014 อ.บางเลน นครปฐม

2 M023 อ.ก าแพงแสน นครปฐม


4 M025 อ.เมอง นครปฐม









13 M063 อ. เมอง นครปฐม

14 M064 อ. เมอง นครปฐม







21 M002 กรงเทพฯ อนเดย

22 M103 unknown อนเดย

ตารางท 1 (ตอ) ตวอยางมะรมทง 25 ตวอยาง ทใชในการสกดดเอนเอ

ล าดบท ชอตวอยาง สถานททเกบตวอยาง จงหวด

23 M104 Karangasem, Eastern Bali อนโดนเซย

24 M105 Karangasem, Eastern Bali อนโดนเซย


วดปรมาณดเอนเอและปรบความเขมขนของดเอนเอ

วธวดการดดกลนแสงหาความเขมขนสารละลายดเอนเอโดยใชเครอง spectrophotometer ท าได

โดยเจอจางสารละลายดเอนเอตวอยาง โดยใชน ากลนเปนตวท าละลายใหมปรมาตร 100 ไมโครลตร

อตราสวนดงนคอ ดเอนเอ 2 ไมโครลตร น ากลน 98 ไมโครลตร จากนนวดการดดกลนแสงทความยาวคลน

260 และ 280 นาโนเมตร โดยใชน ากลนวดกอน แลวจดปรมาณความเขมขนดเอนเอจากการอานของเครอง

หรออาจค านวณหาความเขมขนของสารละลายดเอนเอโดยใชสตร

ความเขมขนของดเอนเอ (µg/ml) = A260 x dilution factor x 50

จากนนปรบความเขมขนของดเอนเอเปน 50 นาโนกรมตอไมโครลตร ปรมาตร 100 ไมโครลตรเพอ

ใชเปน working solution ซงค านวณไดจากสตร

การตรวจสอบคณภาพของดเอนเอโดยวธอเลกโทรโฟรซส

หลอมอะกาโรสเจล (1% agarose) 0.5 กรม ในบฟเฟอร 1x TBE 50 มลลลตร ตงทงไวสกพกจนอน แลวเทลงใสถาดเทเจลทเตรยมไวเสยบหวใหตรงต าแหนง ปลอยใหเจลแขงตวประมาณ 30 นาท เมอเจลแขงตวดงหวออกแลวน าถาดเจลใสในเครองอเลกโทรโฟรซสในทศทางจากลบไปบวก เตมบฟเฟอร 1x TBE buffer ใหทวมเจล จากนนเตรยมตวอยางดเอนเอส าหรบการท าอเลกโทรโฟรซส โดยใชดเอนเอ 3ไมโครลตร loading dye 1 ไมโครลตรและน า 3 ไมโครลตรใชไมโครปเปตดดขนลงเพอใหดเอนเอและสผสมกนอยางด แลวดดตวอยางดเอนเอทละตวอยาง คอย ๆ หยอดในหลมเจลทเกดจากหวทเสยบไว จากนนประกอบเครองอเลกโทรโฟรซสแลวตอเขากบกระแสไฟฟา ปลอยใหดเอนเอเคลอนทประมาณ 20 นาท แลวน าเจลมายอม

N1V1 = N2V2

ดวยเอธเดยมโบรไมดเพอดการเรองแสงของดเอนเอ โดยน าเจลไปแชในสารละลายเอธเดยมโบรไมด ประมาณ 10 นาท โดยตองสวมถงมอตลอดการปฏบตการ ตกเจลไปแชในน าสะอาด นาน 10 นาท เพอลางเอธเดยมโบรไมดสวนเกนออกไป หลงจากนนตรวจสอบการเรองแสงของดเอนเอดวยเครอง gel documentation และถายภาพเกบไว การสรางลายพมพดเอนเอโดยเทคนค SRAP-PCR

การท าปฏกรยาพซอารดวยเทคนค SRAP ไพรเมอรทใชเปนชนดส าเรจรป ซงจะตองท าการเจอจาง

ไพรเมอรดวย TE buffer ทผานการฆาเชอกอน จากนนค านวณหาปรมาตรไพรเมอรตามปรมาตรทตองการใช

โดยไพรเมอรทใชมจ านวน 10 ไพรเมอร ประกอบดวย forward primer 5 ไพรเมอรและ reverse primer 5

ไพรเมอรแลวท าการจบคไพรเมอรเขาดวยกนในขนตอนของการท าปฏกรยาพซอารไดทงหมดจ านวน 25 ค

(ตารางท 2) โดยมองคประกอบของปรมาณสารทใช ดงตารางท 3 อณหภมและเวลาทใชในปฏกรยาพซอาร

ดงตารางท 4 โดยจะท าปฏกรยา 37 รอบ หลงจากนนตรวจสอบผลพซอาร.

ตรวจสอบพซอารโดยการท าโพลอะครลาไมดเจลอเลกโทรโฟรซส

การเตรยมกระจก

ลางกระจกใหสะอาดและเชดกระจกทงสองแผนดวยเอธานอล 95 เปอรเซนต แผนละ 500 ไมโครลตร โดยใชกระดาษทชชไรขน (kimwipes) แลวเชดกระจกหกระตายดวย clear view 1 ครงโดยใชกระดาษไรขน (kimwipes) ทงไวใหแหงเพอใหเจลไมเกาะตดกบกระจก จากนนฉดดวยน า dH2O เพอลางคราบ clear view สวนเกน ทงไวใหแหงสนท ระหวางรอ เตรยม Glass bond (adherent coating) โดยใช Glass bond 1 ไมโครลตร เอทานอล 95 เปอรเซนต 500 ไมโครลตร และ gracial acetic acid 2.5 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น ามาเชดกระจกแผนหลงใหทวทงแผนจนแหงเพอใหเจลเกาะตดกระจก เมอกระจกทงสองแผนแหงสนทวาง spacer ดานขางทงสองดาน แลวน ากระจกหกระตายดานทเชด clear view มาคว าลงบนกระจกแผนทเชด Glass bond ไว ประกบใหแนนและใหเสมอกนจากนนตดขอบกระจกทงสามดานดวยกระดาษกาว ยด spacer ทงสองดานดวยคลปหนบใหแนนสนทเพอปองกนเจลไหลออก

การเตรยมเจล

เตรยม 6 % acrylamide gel โดยชงยเรย 13.5 กรม ใสในบกเกอรขนาด 50 มลลลตร เตมน ากลน 8.5 มลลลตร และ 5X TBE 6 มลลลตร หลอมแลวน ามาปนดวย magnetic stirrer เพอผสมกนจนกระทงเกลดยเรยละลายหมด จากนนเตม acrylamide gel ความเขมขน 30 เปอรเซนต (19:1) 4.5 มลลลตร ammonium persulfate ความเขมขน 10 เปอรเซนต 400 ไมโครลตร และ TEMED 20 ไมโครลตร ผสม

สวนผสมทงหมดใหเขากน คอย ๆ เทเจลลงทมมดานหนงของหว ระวงอยาใหมฟองอากาศ เอยงกระจกใหเปนแนวระนาบ เมอเทเจลจนเตมแผนกระจกแลว เสยบหวทดานบนใหเปนแนวเสนตรง วางแผนกระจกทงไวใหเจลแขงอยางนอย 3 ชวโมงหรอขามคน ปดหนาเจลดวย wrap เพอปองกนหนาเจลแหง

การท าอเลกโทรโฟรซส

ดงกระดาษกาวออก ลางกระจกดานนอกใหสะอาด ดงหวดานบนออก ลางเศษเจลทตดอยออกใหหมด ประกอบเจลกบเครองอเลกโทรโฟรซส ใสสารละลาย TBE ความเขมขน 1 เทา ดานบนใหพอทวมเจลและดานลางใหพนขอบกระจกขนมา แลวตอเครองเขากบเครองจายกระแสไฟฟาความตางศกย 250 โวลต เพอปรบอณหภมของเจลใหเหมาะสม (pre-run) อยางนอย 30 นาท ระหวางท pre-run ใหเตรยมตวอยางดเอนเอโดยใชดเอนเอ 5 ไมโครลตร และ AFLP dye 3 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลวน าไปตมในน าเดอดนาน 5 นาท เพอใหดเอนเอเสยสภาพและแชในน าแขงทนท กอนจะหยอดตวอยางดเอนเอ ใชหลอดฉดยาไลยเรยทผวหนาเจลและในแตละหลมใหหมด แลวคอย ๆ หยอดดเอนเอในแตละหลมโดยใชปเปตปลอยอยางชา ๆ หลงจากนนปดฝาดานบนตอเขากบเครองจายกระแสไฟฟาทท า pre-run ปลอยใหกระแสไฟวงผานประมาณ 4 ชวโมง ใหแถบสดานลางใกลจะหลดจากแผนกระจก ปดเครองเปดฝาดานบน น ากระจกออกมาคอย ๆ ใชแผนเหลกปลายแบนงดกระจกทงสองแผนออกจากกน ดง spacer ออก การยอมซลเวอรไนเตรต

น าแผนกระจกดานทมเจลแชลงในน ากลน (dH2O) โดยหงายดานทมเจลขนเพอปองกนหนาเจล เขยานาน 5 นาท เพอลางสและยเรยออก แลวเปลยนมาเขยาในสารละลาย CTAB ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต (ชง CTAB 0.25 กรม ผสมกบน า (dH2O) 250 มลลลตร) เขยาเบา ๆ 30 นาท จากนนน าเจลมาแชลงในสารละลาย ammonia ความเขมขน 0.3 เปอรเซนต (ตวงน า (dH2O) 250 มลลลตร และ Ammonia 750 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวย magnetic stirrer ) เขยาเบา ๆ 15 นาท หลงจากนนน าเจลมายอมในสารละลายซลเวอรไนเตรตทเตรยมใหม ๆ (ชง Silver 0.4 กรม ผสมกบน า (dH2O) 250 มลลลตร เตม 1 M NaOH 1 มลลลตร และเตม Ammonia 1500 มลลลตร ผสมใหเขากน) เขยาเบา ๆ ใหทวทงแผนเจล นาน 20 นาท สดทายน าแผนเจลมาลางดวยน า (dH2O) ปรมาตร 200 มลลลตร อก 2 ครงและแชในสารละลาย developer ทเตรยมใหม (ชง Na2CO3 5 กรม ผสมกบน า (dH2O) ทเยนจด 250 มลลลตร ผสมใหเขากน แลวเตม formaldehyde 50 ไมโครลตร ลงไปผสมใหเขากน) เขยาเบา ๆ จนกระทงมองเหนแถบดเอนเอชดเจน แตไมควรนานเกนไป เพราะจะท าใหพนหลงเจลเปนสด า แลวน าแผนเจลมาหยดปฏกรยา โดยแชในน า (dH2O) นาน 30 นาท และตากใหแหง

ตารางท 2 ไพรเมอร SRAP และล าดบเบส ทใชในปฏกรยาพซอาร

SRAP primers

Sequence

SRAP primer

Sequence

(forward ) (reverse )

Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT

Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC

Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC

Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA

Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC

ตารางท 3 ความเขมขนและปรมาณของสารทใชในปฏกรยาพซอาร

PCR reaction used (µl)

DNA ( 50 ng/µl)

2

10X PCR buffer

2

2 mM dNTP

2

25 mM MgCl2

1

100 ng primer (forward)

1

(reverse)

1

Tag polymerase

0.2

H2O

10.8

Total volume 20

ตารางท 4 ขนตอนและอณหภมทใชในปฏกรยาพซอาร

ขนตอน อณหภม เวลา (นาท)

pre-denaturing 94 3

denaturing 94 1

annealing 47 1

extension 72 1

final extension 72 5

holding 10 120

วเคราะหกลมขอมล (cluster analysis)

ท าการบนทกแถบดเอนเอทแตกตางกน (Polymorphic band) ของแตละไพรเมอร ท าขอมลใหอยใน

รปของขอมลไบนาร (binary data) ทตรวจสอบได 2 ลกษณะ คอ ม หรอไมม (กหลาบ, 2553) โดยใหแถบด

เอนเอทปรากฏในต าแหนงหนง ๆ มคาเปน 1 และแถบดเอนเอทไมปรากฏในต าแหนงเดยวกนมคาเปน 0 แลว

น ามาค านวณหารอยละของจ านวนแถบดเอนเอทแสดงโพลมอรฟซม (percentage of polymorphism) จาก

สตร

percentage of polymorphism = จ านวนของยนหรอแถบดเอนเอทแสดงโพลมอรฟซม x 100 จ านวนของยนหรอแถบดเอนเอทงหมดทศกษา

จากนนน าขอมลทอยในรปไบนารมาวเคราะหโดยใชโปรแกรม Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS-pc) version 2.01e (Rohlf, 2009) แลวค านวณหาคาสมประสทธความคลายคลงทางพนธกรรมโดยเลอกใช Dice simirality coefficient (Dice, 1945) ซงเปนการค านวณโดยพจารณาจ านวนแถบดเอนเอทปรากฎ แลวน าขอมลทไดจากการค านวณมาสราง dendrogram โดยใชวธ Unweighted pair group method with arithenetic arerages (UPGMA) (Sakal and Michener, 1958)

ผลการทดลอง

จากการท าปฏกรยา PCR จากคไพรเมอรทเลอกใชจ านวน 25 คไพรเมอร พบวา ม 13 คไพรเมอรท

แสดงลายพมพดเอนเอทแตกตางกนจากจ านวตวอยางทง 25 ตวอยาง ไดแก คไพรเมอร ME1/EM1, ME1/EM2, ME2/EM1, ME2/EM2, ME2/EM3, ME2/EM4, ME2/EM5, ME4/EM2, ME5/EM2, ME3/EM3, ME3/EM5, ME4/EM4 และ ME4/EM5 โดยใหแถบดเอนเอทแตกตางกน (polymorphic band) 52 แถบ จากแถบทงหมด 114 แถบ) ซงคดเปน 45.54 เปอรเซนต (ตารางท 5 )โดยคไพรเมอร ME2/EM1 แสดงแถบดเอนเอทแตกตางกนมากทสด เทากบ 6 อลลล และ คไพรเมอร ME2/EM5, ME5/EM2 และ ME4/EM4 แสดงแถบดเอนเอทแตกตางกนนอยทสด เทากบ 2 อลลล และเมอวเคราะหโดยใชโปรแกรม NTSYS-pc version 2.01e พบวา มคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficients) อยในชวง 0.74-0.94 และท าการจดกลมในรปของ dendrogram โดยใชวธ UPGMA (ภาพท 1) พบวา สามารถแยกความแตกตางได 4 กลม ทคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficients) เทากบ 0.82 โดยกลมท 1 ประกอบดวยตวอยางมะรมรวบรวมจากจงหวดนครปฐม (M014, M023, M024, M025, M029, M039, M042 M049, M064, M090, M099, M101, M102 และM103) โดยทตวอยางมะรมหมายเลข M024 และ M025 ทมคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficients) สงถง 0.94 กลมท 2 ประกอบดวยตวอยางมะรมรวบรวมจากจงหวดนครปฐม (M063, M066 และ M109) กลมท 3 ประกอบดวยตวอยางมะรมจากอนเดยและอนโดนเซย (M002, M104, M105 และ M106) และกลมท 4 ประกอบดวยตวอยางมะรมทไมสามารถจดเขากลมได (outgroup) ไดแก ตวอยางมะรมหมายเลข M028, M036, M038 และ M058

ตารางท 5 จ านวนแถบดเอนเอทเกดขนและรอยละของจ านวนแถบดเอนเอทแสดงความแตกตาง

ไพรเมอร จ านวนแถบดเอนเอ % polymorphism

ทเหมอนกน ทแตกตางกน

Me1/Em1

6 5 4.38

Me1/Em2

12 4 3.5

Me2/Em1

13 6 5.26

Me2/Em2

6 5 4.38

Me2/Em3

12 5 4.38

Me2/Em4

7 5 4.38

Me2/Em5

8 2 1.75

Me4/Em2

6 3 2.63

Me5/Em2

8 2 1.75

Me3/Em3

8 4 3.5

Me3/Em5

8 5 4.38

Me4/Em4

11 2 1.75

Me4/Em5 9 4 3.5

รวม 114 52 45.54

ภาพท 1 Dendrogram ของมะรมทรวบรวมจากจงหวดนครปฐม มะรมอนเดย และมะรมอนโดนเซยจ านวน

25 ตวอยาง ทไดจากเทคนค SRAP และจดกลมดวยวธ UPGMA ทคา สมประสทธความเหมอน

(similarity coefficients) เฉลยเทากบ 0.82

บางเลน

ก าแพงแสน


เมอง

อนเดย

เมอง


บางเลน


เมอง



เมอง

เมอง


เมอง


เมอง


อนเดย

อนโดนเซย

อนเดย

อนโดนเซย


บางเลน

0.82

กลม 1

กลม 2

กลม 3

outgroup

outgroup

outgroup

วจารณผลการทดลอง

จากการท าปฏกรยา PCR จากคไพรเมอรทเลอกใชจ านวน 25 คไพรเมอร พบวา ม 13 คไพรเมอรทแสดงลายพมพดเอนเอทแตกตางกนจากจ านวตวอยางทง 25 ตวอยาง และเมอวเคราะหความสมพนธโดยใชโปรแกรม NTSYS-pc version 2.01e พบวา มคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficients) อยในชวง 0.74-0.94 และท าการจดกลมในรปของ dendrogram โดยใชวธ UPGMA พบวา สามารถแยกความแตกตางได 4 กลม ทคาสมประสทธความเหมอนเฉลย (similarity coefficients) เทากบ 0.82 โดยกลมท 1 ประกอบดวยตวอยางมะรมรวบรวมจากจงหวดนครปฐม (M014, M023, M024, M025, M029, M039, M042 M049, M064, M090, M099, M101, M102 และM103) โดยทตวอยางมะรมหมายเลข M024 และ M025 ทมคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficients) สงถง 0.94 ซงแสดงใหเหนวามะรมทงสองตวอยางมความใกลชดทางพนธกรรมมาก อาจมแหลงทมาของเมลดพนธจากแหลงเดยวกน กลมท 2 ประกอบดวยตวอยางมะรมรวบรวมจากจงหวดนครปฐม (M063, M066 และ M109) กลมท 3 ประกอบดวยตวอยางมะรมจากอนเดยและอนโดนเซย (M002, M104, M105 และ M106) และตวอยางมะรมทไมสามารถจดเขากลมได (outgroup) ไดแก ตวอยางมะรมหมายเลข M028, M036, M038 และ M058

จาก dendrogram จะเหนไดวา กลมท 1 และกลมท 2 สามารถแยกกลมออกจากกลมท 3 ไดอยาง

ชดเจน เนองจากกลมท 1 และกลมท 2 เปนตวอยางมะรมททรวบรวมในประเทศไทย สวนกลมท 3 เปน

ตวอยางมะรมจากตางประเทศ คอมะรมอนเดย ซงมฐานพนธกรรมแตกตางกนมาก ท าใหเกดการแยกกลมได

อยางชดเจน และเมอวเคราะหความสมพนธภายในกลมท 1 พบวา มความสมพนธทางพนธกรรมใกลเคยง

กนมากเนองจากแหลงทมาของตวอยางอยในแถบบรเวณใกลเคยงกน สอดคลองกบการศกษาของ Loveless

(1992) ซงรายงานวา พนธมะรมทมาจากแหลงเดยวกนหรอใกลเคยงกน เนองจาก สภาพภมอากาศท

คลายคลงกน และการจ ากดการแลกเปลยนพนธกรรมเฉพาะภายในกลมพนธท าใหความแตกตางทาง

พนธกรรมระหวางพนธมะรมไมมากนก และสอดคลองกบรายงานของ Schaal et al. (1998) คอ กลมพนธ

มะรมทมาจากแหลงเดยวกนหรอใกลเคยงกน มความแตกตางทางพนธกรรมระหวางกนนอย เนองจากกลม

พนธดงกลาวอาจมบรรพบรษรวมกนมากอน ท าใหมฐานพนธกรรมใกลเคยงกนมากกวากลมพนธมะรมทจาก

ตางแหลงปลก (ประเทศ) ขณะทมะรมอนเดย (M103) มความใกลชดทางพนธกรรมสงกบมะรมไทย (M042)

สนนษฐานวา เมลดมะรมอนเดยทไดรบเปนเมลดทผานการผสมขามกบมะรมไทย ท าใหเกดการแลกเปลยน

พนธกรรมระหวางมะรมไทยและมะรมทน าเขาจากอนเดยเกดขน สงผลท าใหความแตกตางทางพนธกรรม

ลดลง

จากการศกษาครงนพบวา ความสมพนธของมะรมในแถบจงหวดนครปฐมมความใกลชดทาง

พนธกรรมกนคอนขางสง ดวยคาสมประสทธความเหมอนเทากบ 0.74-0.94 เพอใหการจดกลมมะรมท

รวบรวมจากจงหวดนครปฐมชดเจนมากขน ควรเพมจ านวนไพรเมอร หรอมการน าเอาเครองหมายโมเลกล

แบบอนเขามาใชรวมกนในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมตอไป แตจ านวนไพรเมอร

ดงกลาวสามารถแยกกลมมะรมอนเดยและอนโดนเซยออกจากกลมไดชดเจน

สรปผลการทดลอง

การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมดวยการตรวจสอบลายพมพดเอนเอของมะรมทง 25

ตวอยาง ดวยเทคนค Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) โดยใชไพรเมอรจ านวน 25 ค

ไพรเมอร พบวา 13 ไพรเมอร (45.54 เปอรเซนต) ทสามารถแยกความแตกตางทางพนธกรรมระหวางตวอยาง

ได และสามารถแบงกลมตวอยางมะรมออกเปน 4 กลม ทคาสมประสทธความเหมอนเทากบ 0.82

นอกจากนยงพบวา ตวอยางมะรมในแถบจงหวดนครปฐมมความหลากหลายทางพนธกรรมคอนขางต า และ

แยกออกจากกลมตวอยางมะรมจากอนเดยและอนโดนเซยได

เอกสารอางอง

กหลาบ เหลาสาธต. 2553. ความหลากหลายทางพนธกรรมของวานชกมดลก (Curcuma sp.) ในประเทศ

ไทยทตรวจสอบโดยเอเอฟแอลพ. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

กองกานดา ชยามฤต และ ลนา ผพฒนพงษ. 2545. สมนไพรไทย ตอนท 7. โรงพมพบรษท ประชาชน จ ากด, กรงเทพฯ.

จตราภรณ ธวชพนธ. 2548. หลกอนกรมวธานพช. พมพครงท 1, ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

ชลนท รอดสวาง. 2546. การพฒนา Marker ส าหรบศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของหญาเน

เปยร (Pennisetum purpureum) และหญารซ (Brachiaria ruziziensis). วทยานพนธปรญญาโท.

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

ดลรชต สดหลา, ปรยา พวงส าล หวงสมนก, พเชษฐศกด ศรวงศ, พนจ หวงสมนก, สนน จอกลอย, และ อารนต พฒโนทย. 2553. ความหลากหลายของแกนตะวนจากการวเคราะหดวยเครองหมายโมเลกล SRAPs. การประชมวชาการเกษตร, คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน, ขอนแกน. 476-481.

นจศร เรองรงษ และ ธวชชย มงคละคปต. 2547. สมนไพรไทย เลม 1. ส านกพมพบเฮลต, กรงเทพฯ.

รฐศกด พลสงห. 2552. มะรมพชมหศจรรยสมนไพรครอบจกรวาล. วารสารกสกร. 82(2) : 61-68.

ลลดา อาจสงเนน. 2552. การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอพนธกรรมทานตะวน

(Helianthus annuus L.) สายพนธแทโดยใชลกษณะทางสณฐานวทยารวมกบเครองหมายเอแอฟ

แอลพ. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

วทย เทยงบรณธรรม. 2542. พจนานกรมสมนไพรไทย. ส านกพมพอกษรพทยา, กรงเทพฯ.

วรรณภา เสนาด. 2552. มะรมพชผกเปนยาราคาเยา. วารสารเคหเกษตร. 33(12) : 167-170.

วารน วรรณประโพธ. 2545. การใชลายพมพดเอนเอตรวจสอบยางกรวด ยางพลวง และยางทคาดวาเปน

ลกผสม. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

สรพร แจงสทธวรวฒน. 2544. การจ าแนกปอสาโดยเทคนคพนธศาสตรโมเลกล. วทยานพนธปรญญาโท.


สรนทร ปยะโชคณากล. 2552. เครองหมายดเอนเอ : จากพนฐานสการประยกต. ส านกพมพ


สรพร เกตงาม. 2546. เครองหมายดเอนเอในงานปรบปรงพนธพช. วารสารวชาการ ม.อบ. 5(2) : 37-58.

วไลวรรณ อนสารสนทร. 2552. รลกเรองมะรม. โรงพมพบรษท ฟาอภย จ ากด, กรงเทพฯ.

Dice, L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology. 26(3), 297-302.

Garcia, A. F., L. Luciana, M.M. Antônia, I.O. Geraldi, L. Cláudio and P. de Souza Anete. 2004. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines. Genetics and Molecular Biology. 27(4), 579-588.

Kaur, S., R. Ford, M. Nicolas, R. Norton and P. W.J. Taylor. 2004. Selection of parents for studying B tolerance in Brassica rapa. New directions for a diverse planet:Proceedings for the 4thInternational Crop Science Congress. Available http://www.cropscience.org.au/icsc2004, March 21, 2006.

Li, G. and C.F. Quiros. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103, 455-461.

Loveless, M.D. 1992. Isozyme variation in tropical tree: patterns of genetic organization. New Forests. 6, 67-94.

Muluvi, G.M., J.I. Sprent, N. Soranzo, J. Provan, D. Odee, G. Folkard, J.W. Mcnicol and W.

Powell. 1999. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis of genetic variation in Moringa oleifera Lam. Molecular. Ecology. 8, 463-470.

Roholf, F.J. 1997, NTSYS-PC NumericalTaxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.01. Exseter Software, New York: Setauket.

Sakal, R.R. and C.D. Michener. 1958. A statistic method for evaluating systematic relationships.Univ. of Kansas Sci. Bul. 28: 1409-1438.

Schaal, B.A., D.A. Hayworth, K.M. Olsen, T. Rauscher and W.A. Smith. 1998. Phylogenetic

studies in plant: problems and prospects. Molecular Ecology. 7, 465-474.

Wang, L.L., Z.L. Ping, G.Y. Qin, W.M. Xia, C.L. Ming, Y.J. Lan, W. Yan, Y.F. Min and W.L. Zhi. 2008. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late-bolting radish cultivar with RAPD, ISSR and SRAP markers. Scientia Horticulturae. 116, 240-247.

วันที่ - lib.kps.ku.ac.th€¦ · genetic diversity of moringa oleifera lam. collected...

Documents