ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวด กาญจนบร โดยใช

เครองหมายโมเลกลชนด SRAP

Genetic Diversity of Moringa oleifera Lam. Collected from Kanchanaburi Province Using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers

โดย

นางสาววนตรา เชงแกว

ควบคมและอนมตโดย

วนท..........เดอน......................พ.ศ.............. (ดร.บบผา คงสมย)

วนท..........เดอน......................พ.ศ.............. (ดร.อญมณ อาวชานนท)

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบร

โดยใชเครองหมายโมเลกล SRAP

นางสาววนตรา เชงแกว

บทคดยอ

มะรม Moringa oleifera Lam. เปนไมยนตน ปลกทวไปในบรเวณบานของไทย สามารถรบประทานไดหลายสวนทงยอด ดอก และฝกเขยว ปจจบนไดพฒนาผลตภณฑจากมะรมเพอเปนยารกษาโรค และน ามนมะรมเชงการคามากขน แตความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทปลกในภมภาคตาง ๆ ของประเทศไทยมขอมลนอยมาก ดงนนการศกษานจงมวตถประสงคเพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบรเปรยบเทยบกบมะรมสายพนธจากอนเดย และมะรมสายพนธจากบาหล ประเทศอนโดนเซย จ านวน 20 ตวอยาง โดยใชเครองหมายโมเลกล SRAP จ านวน 25 คไพรเมอร พบวา ม 13 คไพรเมอร ทใหความแตกตางของแถบดเอนเอ เมอศกษาลายพมพดเอนเอทเกดขน พบวาใหแถบของดเอนเอทงหมด 114 แถบ (เฉลย 8 แถบ/ไพรเมอร) แตเปนแถบของดเอนเอทมความแตกตางกน 52 แถบ (45.6%) เมอวเคราะหคาดชนความเหมอนดวยวธ SimQual พบวา มความใกลชดทางพนธกรรมอยระหวาง 0.74 – 0.92 และจดกลมตวอยางดวยวธ UPGMA สามารถแบงมะรมไดเปน 5 กลมและ Out group ทคา Dice similarity coefficient เทากบ 0.81 คอ กลมท 1, 4 และ 5 เปนตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบร กลมท 2 เปนตวอยางมะรมจากอนเดย กลมท 3 มะรมจากอนเดยและอนโดนเซย และกลมทกระจายนอกกลมตวอยางมะรมอน ๆ (out group) เปนตวอยางมะรมจากกาญจนบรและอนโดนเซย จากคา Dice similarity coefficient ของการศกษาน พบวา สามารถจดกลมของตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบร อนเดย และอนโดนเซยไดชดเจน โดยมความใกล ชดกนทางพนธกรรมของมะรม ทรวบรวมจากกาญจนบ รคอนขางสง

ค าส าคญ: มะรม, Moringa oleifera Lam., ความหลากหลายทางพนธกรรม, SRAP ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา: ดร. บบผา คงสมย, ดร.อญมณ อาวชานนท ปทพมพ : 2554 จ านวนหนา : 25

Genetic diversity of Moringa oleifera Lam. collected from Kanchanaburi province using sequence related amplified polymorphism (SRAP) markers

Miss Winittra Cherngkaew

Abstract

Moringa Oleifera Lam. planted in the area of Thailand can be eaten in many parts such as the shoot, flower, and green pods the genetic diversity of moringa is grown in different regions of the country have very little information. Therefore, the genetic diversity among 20 samples of Moringa oleifera Lam. collected from Kanchanaburi province compared with those collected from India and Indonesia was investigated using SRAP-PCR technique. It was found that only 13 out of 25 primers produced 52 polymorphic bands (45.6%) from total of 114 bands (averaged 8 bands / primers). According to the genetic relationship among Moringa samples and cluster analysis using UPGMA, the similarity coefficient ranged from 0.74 to 0.92. It produced four groups with similarity coefficients of 0.81. The group 1, 4, and 5 was the samples collected from Kanchanaburi province. The second group was those collected from India. The last group was those collected from India and Indonesia. Dice similarity coefficient value showed that clustering of the samples collected from Kanchanaburi, India and Indonesia areas. The closeness of the genetic information gathered from Moringa is high.

Key words: Drumstick, Moringa oleifera Lam., genetic diversity, SRAP

Degree: Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology,

Faculty of Agriculture KamphaengSaen, Kasetsart University

Advisor: Buppa Kongsamai, Ph.D., Anyamanee Auvuchanon, Ph.D.

Year: 2011

Pages: 25

ค านยม

ปญหาพเศษฉบบนส าเรจลลวงไปไดดวยด โดยไดรบการกรณาอยางยงจาก อาจารย ดร.บบผา

คงสมยและอาจารย ดร.อญมณ อาวชานนท อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทไดใหการชวยเหลอ และให

ค าปรกษาชแนะแนวทางในการปฏบตงาน ตลอดจนแกไขขอบกพรองจนประสบความส าเรจ และ

ขอขอบพระคณ นสตปรญญาโท ภาควชาพชสวนทใหการชวยเหลอในดานการทดลอง และใหค าแนะน า

ในดานตางๆรวมทงพๆนองๆสาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตรทใหความชวยเหลอ ทงก าลงกายและ

ก าลงใจดวยดตลอดมา และกราบขอบพระคณคณพอ คณแม ทคอยเอาใจใสสอบถามความคบหนา และ

เปนก าลงใจใหตลอดมา ขอขอบคณทกทาน ณ โอกาสนดวย

นางสาววนตรา เชงแกว

มนาคม 2555

สารบญ

หนา

สารบญ (1)

สารบญตาราง (2)

สารบญภาพ (3)

ค าน า 1

วตถประสงค 2

ตรวจเอกสาร 3

อปกรณและวธการ 10

ผลการทดลอง 17

วจารณผลการทดลองและขอเสนอแนะ 20

สรปผลการทดลอง 21

เอกสารอางอง 22

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ตวอยางมะรมทใชในการศกษาจ านวน 20 ตวอยาง 10 2 แสดงความเขมขนทใชในการท าปฏกรยาดวยเทคนค PCR 13 3 ล าดบการเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR 14 4 แสดง SRAP primer ทใชในการท าปฏกรยา PCR 14 5 จ านวนและขนาดแถบดเอนเอทไดจากการตรวจสอบ- 18 ลายพมพดเอนเอมะรมดวย SRAP โดยใช 13 คไพรเมอร

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 แสดงการจดกลมของมะรม 20 ตวอยาง ทคา Dice similarity coefficient 19

เฉลยเทากบ 0.81

ค าน า

มะรม (Moringa oleifera Lam.) จดอยในวงศ Moringaceae มลกษณะเปนไมยนตน ผลดใบ

ถนก าเนดอยในประเทศแถบเอเชย เชนอนเดย ศรลงกา เอเชยไมเนอร และแอฟรกา (Makkar and Becker, 1996) ปลกงาย เจรญไดดในดนทกชนด ตองการน าและความชนในปรมาณปานกลาง ขยายพนธดวยการเพาะเมลดและการปกช ากง ในประเทศไทยมะรมเปนพชผกพนบานทถกปลกไวในบรเวณบานไทยมาแตโบราณ สามารถกนไดหลายสวนทงยอด ดอก และฝกออน จงสามารถพบไดทกภาคในประเทศไทย ขณะททกสวนของตนมะรมมสรรพคณเปนยารกษาโรคมาตงแตสมยโบราณ มคณประโยชนในทางการแพทยซงจะใชเปนยาปฏชวนะชวยเพมและเสรมสรางภมคมกนใหแกรางกาย ผลตภณฑจากมะรมทผลตขนเพอการคาในปจจบน เชน ชาใบมะรม น ามนมะรม เปนตน (วชร, 2548)

จากประโยชนของมะรมดงทกลาวมาขางตนในประเทศไทยยงไมมการปลกหรอขยายพนธมะรมในเชงพาณชย ดงนนเพอเปนแนวทางทจะพฒนาสายพนธจงตองศกษาขอมลทางพนธกรรมของมะรมเพอใชในการปรบปรงสายพนธของมะรม ซงจากการรวบรวมสายพนธของมะรมทอยในจงหวดตางๆของประเทศไทย พบวา ลกษณะของมะรมมความคลายคลงกนเปนอยางมาก ซงในประเทศไทยยงไมมการจดจ าแนกสายพนธของมะรม ปจจบนไดมการน าเอาเทคโนโลยโมเลกลเครองหมาย เชน RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSR (microsatellite DNA หรอ simple sequence repeat), SRAP (sequence related amplified polymorphism), AFLP (amplified fragment length polymorphism) เปนตน (William et al., 1990) มาชวยในการสนบสนนการระบชนดหรอพนธของพช ซงจากคณสมบตของมะรมในการศกษาครงนจงไดเลอกใชเทคนค SRAP (sequence related amplified polymorphism) เพอทจะศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมและใชบงบอกถงความแตกตางของพนธมะรมในแตละพนทและสามารถใชเปนขอมลพนฐานในการปรบปรงพนธพชและเพมประสทธภาพของมะรม ซงขอมลเหลานจะเปนประโยชนตอการพฒนาสายพนธของมะรมตอไป

วตถประสงค

1. เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมโดยใชเครองหมายโมเลกล SRAP marker

2. เพอหาความแตกตางทางพนธกรรมของมะรมในจงหวดกาญจนบร

สถานทท าการทดลอง

1. แปลงทดลอง ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขต

ก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

2. หองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาพชสวน คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาท าการทดลอง

ระหวางเดอนตลาคม 2553-เดอนสงหาคม 2554

ตรวจเอกสาร

มะรมมชอวทยาศาสตรวา Moringa oleifera Lam. วงศ Moringaceae ชอพนเมอง ผกอฮม ผกอ

ฮม มะคอมกอน กาแนงเดง ผกเนอไก (วชร, 2548) เปนไมยนตนขนาดกลางทถกปลกไวในบรเวณบานไทยมาแตโบราณสามารถกนไดหลายสวน ตนมะรมสามารถพบไดทกภาคในประเทศไทย มถนก าเนดในแถบเอเชย เชน อนเดย ศรลงกา และยงแพรกระจายทวในเขตอนเดย ซาอดอาราเบย กลมประเทศเอเชยไมเนอร และแอฟรกา (วชร, 2548)

1. ลกษณะทวไปของมะรม

ลกษณะเปนไมยนตนขนาดกลาง มสง 5-10 เมตร ผลดใบ ไมมหใบ ใบประกอบมใบยอย 2-4 ค แกนกลางใบบวมทขอตดเวยนสลบ เปนดอกสมบรณเพศมสมมาตรดานขาง กลบเลยงและกลบดอกมอยางละ 5 กลบ กลบแยกจากกนตดตรงขามกบเกสรเพศผ รงไขตดเหนอวงกลบม 1 ชอง ไขออนมจ านวนมากตดทผนงโดยรอบรงไข ผลเปนแบบแหงแตกรปยาวแคบเมลดมปก เสนผาศนยกลางของเมลดประมาณ 1 ซม. ใบประกอบ ฝกจะมรสหวาน (วชร, 2548) สามารถเจรญเตบโตไดดในดนทกประเภท ปลกงาย ทนแลงไดด ตองการน าและปรมาณความชนปานกลาง (สถาบนการแพทยแผนไทย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข, 2542 )

2. คณคาทางอาหารและสรรพคณทางยา

มะรมมธาตอาหารปรมาณสงเปนพเศษทชวยปองกนโรค เชน วตามนเอ บ ารงสายตามมากกวาแครอท 3 เทา วตามนซ ชวยปองกนหวด 7 เทาของสม แคลเซยม บ ารงกระดกเกน 3 เทาของนมสด โพแทสเซยม บ ารงสมองและระบบประสาท 3 เทาของกลวย (สธาทพย, 2550) ใยอาหารและพลงงานไมสงมากเหมาะกบผ ทควบคมน าหนก มะรมยงมสรรพคณทางยาเชน ชวยรกษาปวดบวมตามขอ บ ารงหวใจ ชวยบ ารงสายตา ระบบทางเดนอาหาร (กองกานดาและลนา, 2545) เมลดเมอน ามาสกดจะใหน ามนหรอ ben oil ซงมคณสมบตคลายกบน ามนมะกอก สามารถน ามาใชในการประกอบอาหารไดและน าไปเปนสวนประกอบในอสาหกรรมของเครองส าอางบางชนดได (กรมวชาการเกษตร, 2548)

มะรมเปนพชมหศจรรย มคณคาทางโภชนาการสงสด กลาวถงในคมภรใบเบลวาเปนพชทรกษาทกโรค ใบมะรมมโปรตนสงกวานมสด 2 เทา การกนใบมะรมตามชนบทของประเทศก าลงพฒนาและประเทศโลกท 3 เปนการเพมโปรตนคณภาพสงราคาถกใหกบอาหารพนบานไดเปนอยางด (สธาทพย, 2550)

มรายงานพบสาร Nitrile, mustard oil glycosides และ thiocarbamate glycosides ทแยกสกดไดจากใบมะรมมฤทธในการลดความดนโลหตซงสารในกลม glycosides ทผานปฏกรยา acetylation และพบปรมาณนอยในธรรมชาตแตมความส าคญทางการแพทยและ ท าการสกดใบมะรมดวยตวท าละลาย ethanolgrnjv แยกสารส าคญพบสารบรสทธ 4 ชนด ไดแก niazinin A, niazinin B, niazimicin และ niazinin A+B ซงสารเหลานแสดงฤทธในการลดความดนโลหตในหนทดลอง (Jansakul et al., 1997) Mulvi (1998) ไดวเคราะหความแปรปรวนทางพนธกรรมของมะรมโดยเทคนค amplified fragment length polymorphism (AFLP) ซงในการวเคราะหพนธกรรมของ 7 ประชากร โดยการใช AFLP marker(amplified fragment length polymorphism) และจากเทคนค AFLP marker (amplified fragment length polymorphism) (Pst I/MseI) ม 4 คไพรเมอรจากทงหมด 236 Amplification ซงคดเปน 157 หรอ 66.5 เปอรเซนต ทมความแตกตางกนระหวางประชากรหรอภายในประชากร การวเคราะหความแปรปรวนในระดบโมเลกลพบวา มความแตกตางกนระหวางประชากรและประชากร ถงแมวาจะมการผสมขามสายพนธแตกเปนไมยนตนทคาดวานาจะรกษารปแบบไวไดมากทสดภายในประชากร จากแผนภาพตนไมทแสดงถงความสมพนธระหวางประชากรอยางนอง 2 แหลงทมา ทจะน าไปใชเปนแหลงพนธกรรมในเคนยา ซงในการตรวจสอบระดบสงของความแตกตางของประชากรทถกตดออก แสดงใหเหนวาแหลงทมาเปนปจจยทส าคญในการอนรกษและใชประโยชนของมะรมตอไป

เครองหมายดเอนเอ (DNA Markers)

เครองหมายดเอนเอ (DNA Markers) หมายถง ล าดบเบสชวงหนงของดเอนเอทใชเปนเครองหมายบงชความเปนเอกลกษณของสงมชวต โดยอาจมต าแหนงบนโครโมโซม ในนวเคลยส (nuclear DNA) หรอใน ออรแกเนลล (mitochondria DNA หรอ chloroplast DNA) และสามารถถายทอดไปยงรนลกได พชแตละชนดแตละสายพนธ มการจดเรยงตวของนวคลโอไทดในโมเลกลของดเอนเอทเปนเอกลกษณ ความแตกตางหรอโพลมอฟซม (polymorphisms) ของล าดบเบสในโมเลกลของดเอนเอนเอง ทท าใหสงมชวตมความแตกตางกน และสามารถน ามาประยกตใชเปนเครองหมายโมเลกลได การใชดเอนเอเปน เครองหมายในการบงบอกความแตกตางของสงมชวต สามารถท าไดโดยการเปรยบเทยบลกษณะของดเอนเอของสงมชวตนนๆ โดยเทคนคทางอณวทยา ซงเปนทรจกกนโดยทวไปวา “ลายพมพดเอนเอ” (DNA Fingerprinting) ซงความแตกตางทเกดขน หมายถง แบบแผนดเอนเอทจ าเพาะของสงมชวตหนงๆ นนเอง สามารถน ามาตรวจสอบความแตก-ตางหรอโพลมอรฟซมของสงมชวตหรอสายพนธพชทตองการตรวจสอบได (สรพร, 2546)

ประเภทของเครองหมายดเอนเอ

สามารถแบงออกเปนประเภทใหญๆ ได 2 ประเภท คอ 1. Hybridization-based marker

เปนเครองหมายดเอนเอ ซงพฒนาขนโดยอาศยหลกการเขาคของ ล าดบเบสดเอนเอทเปนคสม

กนระหวางดเอนเอตรวจสอบ (probe) กบดเอนเอทตองการตรวจสอบ โดยใชเทคนคไฮบรไดเซชน (hybridization) ตวอยางไดแก เครองหมาย อารเอฟแอลพ (RFLP marker) (Tanksley et al., 1989, McCouch and Tankslay, 1991, Kochert,1994)

1.1 เทคนค Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) RFLP หมายถง ความแตกตางหรอความหลากหลายของขนาดดเอนเอทเกดจากการตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ (restriction enzyme) วธการเรมจากการตดดเอนเอดวยเอนไซมตดจ าเพาะ แลวแยกขนาดของชนดเอนเอ ดวยวธอเลกโทรโฟรซส หลงจากนนแยกดเอนเอจากแผนเจลมาไวบนแผนเมมเบรน แลวใชโพรบหรอดเอนเอตรวจสอบทตดฉลากส าหรบตดตาม เพอบอกความแตกตางของจโนม ความแตกตางของชนสวนดเอนเอทผานการตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะของเทคนค RFLP เกดจากดเอนเอมการเปลยนล าดบเบสตางไปจากเดม โดยมสาเหตเนองมาจาก

1.1.1 เกด point mutation ท าใหต าแหนงจดจ าของเอนไซมหายไปหรอเพมขนมา

1.1.2 เกดการเพมขนหรอขาดหายไปของดเอนเอบางสวนในบรเวณทอยระหวางต าแหนงจดจ าของเอนไซม มผลใหชนดเอนเอทตดไดมขนาดตางไปจากเดม

1.1.3 เกดการหายไปของดเอนเอในสวนทมต าแหนงจดจ าของเอนไซม ซงมผลท าใหต าแหนง

จดจ าหายไป (วารน, 2545; มะลวลย, 2546)

2. PCR-based marker

เปนเครองหมายโมเลกลดเอนเอทพฒนาขน โดยอาศยหลกการเพมปรมาณดเอนเอโดยปฏกรยาลกโซจ าลองตวดเอนเอ หรอ เทคนคพซอาร (Polymerase chain reaction (PCR) technique) ตวอยางเครองหมายดเอนเอทนยมใชในงานปรบปรงพนธพช ไดแก เครองหมาย RAPD (random amplified polymorphic DNA) (William et al., 1990) เครองหมาย AFLP (amplified fragment length polymorphism) (Vos et al., 1995) และเครองหมาย SSR (microsatellite DNA หรอ simple sequence repeat) (Brown et al., 1996, Powell et al., 1996) เปนตน 2.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR หรอเรยกอกชอวา in vitro enzymatic gene amplification เปนวธการเพมปรมาณดเอนเอเฉพาะบรเวณทตองการท าการศกษาใหมปรมาณสงกวาเดมหลายลานเทา โดยใชวธการในหลอดทดลอง เทคนคนถกคนพบโดย Kary Mullis ในป ค.ศ.1983 (วชรและมนตร,2536) หลกการท าพซอาร คอ น าดเอนเอทสกดไดมาเปนดเอนเอตนแบบ (DNA template) ซงในปฏกรยาพซอารตองมองคประกอบเหลาน คอ ดเอนเอตนแบบ, นวคลโอไทดทง 4 ชนด, ไพรเมอร, เอนไซม Tag DNA polymerase และบพเฟอร (buffer) แลวน ามาเพมปรมาณชนสวนดเอนเอโดยใสเครอง Thermal Cycle ซงการเพมปรมาณดเอนเอจะท าเปนรอบๆ โดยแตละรอบจะม 3 ขนตอนคอ Denaturation เกดขนทอณหภมสงประมาณ 90

– 95 องศาเซลเซยส Annealing ไพรเมอรจะขาไปจบกบเบสทเปนคผสมของเบสแตละตวบนดเอนเอของแมพมพทเปนสายเดยว เกดขนทอณหภมทเหมาะสมในชวง 40 – 60 องศาเซลเซยส Extension เปนการสงเคราะหดเอนเอใหสมบรณตอเนองจากจดทไพรเมอรเขาไปจบกบดเอนเอตนแบบ ท 72 องศาเซลเซยส 2.1.1 Random amplified polymorphic DNA, RAPD

เปนโมเลกลเครองหมายทพฒนาขนโดย Williams et al. (1990) เปนการเพมปรมาณดเอนเอแบบสมโดยใชไพรเมอรสายสนๆความยาวประมาณ 10 เบส ทมล าดบเบสเปนแบบสมไมจ าเพาะเจาะจงกบยน และแสดงผลในรปของการเกดหรอไมเกดแถบดเอนเอในต าแหนงหนง ๆ คณสมบตทส าคญของการใชเทคนคน คสะดวก รวดเรว ไมจ าเปนตองใชขอมลจากล าดบเบสของดเอนเอ และใชปรมาณดเอนเอเรมตนนอยเปนดเอนเอเครองหมายแบบ dominant marker คอ อาจสงเคราะหดเอนเอไดเฉพาะบางอลลลเทานน ดงนนจงไมสามารถแยกความแตกตางของอลลลทเปนโฮโมไซกส และเฮทเทอโรไซกสได (สรนทร, 2552)

2.1.2 Simple seguence repeat, SSR หรอ microsatellite

เปนโมเลกลเครองหมายทใชหลกการของการกระจายตวของเบสซ าในสงมชวต ลกษณะทส าคญของเบสซ าน คอ การมล าดบเบสจ าเพาะอยบรเวณหวทายของเบสซ า ซงเบสจ าเพาะเหลานสามารถน ามาใชสรางเปนไพรเมอรขนาดประมาณ 20 เบส เพอใชขยายปรมาณเบสซ าในต าแหนงทตองการ โดยใชหลกการของพซอาร จากนนน าไปแยกความแตกตางโดยเทคนคอเลกโทรโฟรซส ซงความแตกตางของแถบดเอนเอทไดเกดจากความแตกตางของจ านวนเบสซ าในแตละสงมชวต คณสมบตทส าคญของเทคนคน คอ ความจ าเพาะเจาะจงของต าแหนงโมเลกลเครองหมายบนจโนม และจ านวนของรปแบบของอลลลทสามารถตรวจสอบได และเปนดเอนเอเครองหมายแบบ codominant marker (สมวงษ, 2540)

2.1.3 Amplified fragment length polymorphism, AFLP

เปนการสรางลายพมพดเอนเอโดยการรวมวธ RFLP และ RAPD เขาดวยกน ซงรปแบบ polymorphism ทเกดขนกบความแตกตางของล าดบเบสบรเวณทถกตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะเหมอนกบเทคนค RFLP และสามารถตรวจสอบการเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR เหมอนกบเทคนค RAPD ท าไดโดยการสกดดเอนเอแลวตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ จากนนเชอมตอกบดเอนเอชนสน ๆ เรยกวา adapter เขาทปลายทง 2 ดานของชนดเอนเอ เพอใหไพรเมอรเขามาเกาะ ท าใหเพมปรมาณดเอนเอได เมอดเอนเอทใชเปนไพรเมอรมล าดบเบสเปนคสมกบ adapter ทบรเวณดานปลาย 3’ ของไพรเมอร และมล าดบเบสทเปนสวนของต าแหนงจดจ าของเอนไซมตดจ าเพาะ เพมเบสอก 2-3 นวคลโอไทป เพอใหเกดการเลอกจบของเบสทเปนคสมกน ซงเปนการลดจ านวนของชนดเอนเอ โดยชนดเอนเอทสามารถเพมปรมาณไดเปนชนดเอนเอทมล าดบเบสสวนทตดกบบรเวณจดจ าของเอนไซมทสามารถเขาคไดกบไพรเมอรทเลอกเทานน การเกด polymorphism เกดจากการเปลยนแปลงของล าดบเบส ท าใหต าแหนงตดจ าเพาะเปลยนไป เกดการหายไปหรอเพมขนของต าแหนงตดจ าเพาะ หรอเกดจากการจดเรยงตวใหมของดเอนเอ ท าใหขนาดของดเอนเอเปลยนแปลงไป ขอดของเทคนค AFLP คอ ไมตองทราบขอมลของล าดบเบส สามารถท าไดรวดเรวเกด polymorphism จ านวนมาก ใชปรมาณดเอนเอเรมตนนอย และใชไดกบสงมชวตชนดใดกได ทมสวนของล าดบเบสทเปนคสมกบ adapter ขอจ ากดของเทคนคน คอ คาใชจายสง ตองการดเอนเอทมความบรสทธสง แอลลลสวนใหญเปนแบบขม ท าใหวเคราะหผลยาก (Li and Quiros, 2001)

Muluvi et al. (1999) จากการใชเทคนค AFLP marker (amplified fragment length polymorphism) วเคราะหลกษณะทางพนธกรรมของ 7 ประชากร และจากเทคนค AFLP marker (Pst I/MseI) พบวาม 4 คไพรเมอรจากทงหมด 236 Amplification ซงคดเปน 157 หรอ 66.5 เปอรเซนต มาวเคราะหความแปรปรวนในระดบโมเลกลพบวา ใหความแตกตางกนระหวางประชากรหรอภายในประชากร ถงแมวาจะมการผสมขามสายพนธแตกเปนไมยนตนทคาดวานาจะรกษารปแบบไวไดมากทสดภายในประชากร

2.1.4 Sequence related amplified polymorphism, SRAP

เปนโมเลกลเครองหมายทพฒนาขนโดย Li and Quiros (2001) โดยออกแบบไพรเมอร 2 ชนด ชนด forward มขนาด 17 เบส ทประกอบดวยล าดบเบสแกน (core sequence) ทเหมอนกนยาว 14 เบส เปนสวนของล าดบเบสทไมมอะไรพเศษเรยกวา filler ยาว 10 เบส ตอดวยเบส CCGG เพอใหจบไดกบสวนเอกซอน (exon) หรอ ORF ซงมกเปนบรเวณทมองคประกอบของเบสเปน GC สง (GC rich) ตรงปลาย 3’ ของไพรเมอรเปนเบสคดเลอก (selective base) อก 3 เบส ทเปลยนแปลงได โดยอาศยหลกการเดยวกบไพรเมอรของเครองหมายเอเอฟแอลพ สวน reverse มขนาด 18 เบส ประกอบดวยล าดบเบสแกนทเหมอนกนยาว 15 เบส เปนสวน filler ยาว 11 เบส ตอดวยเบส AATT เพอใหจบไดกบดเอนเอในจโนมบรเวณ AT สง ซงมกพบในสวนอนทรอน (intron) และโพรโมเตอรของยนตรงปลาย 3’ ของไพรเมอรเปนเบสคดเลอกทเปลยนแปลงไดอก 3 เบส การเพมปรมาณดเอนเอตวอยางใชวธ step up PCR คอ ใชอณหภม annealing ต าท 35 องศาเซลเซยส 5 รอบเพอใหไพรเมอรจบกบดเอนเอเปาหมายไดดแลวจงเพมอณหภมใหสงขนตามปกตอก 30-35 รอบ เพอใหเกดการเพมปรมาณดเอนเอเฉพาะสวนทมาจาก 5 รอบแรกเทานน ท าใหผลทไดมความคงทหลงจากนนตรวจสอบผลดวยเจลพอลอะครลาไมด ผลทไดจะพบวาสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดหลายต าแหนงพรอมกน โดยการปรากฏหรอไมปรากฏแถบดเอนเอ (สรนทร, 2552)

วารน (2545) ท าการตรวจสอบลายพมพดเอนเอของยางกราด ยางพลวง และลกผสมดวยเทคนค SRAP รวมกบการศกษาสณฐานวทยา พบวา สามารถแบงตวอยางออกเปน 3 กลมไดอยางชดเจนคอ กลมยางกราด กลมยางพลวง และกลมยางทคาดวาเปนลกผสม จงคาดวายางทง 3 กลมเปนคนละชนดกน

จรพนธ (2546) ท าการศกษาลายพมพดเอนเอในกลวยไขพนธกลาย ก.บ. 1 ก.บ.2 ก.บ.3 ก.บ.4 และ ก.บ.5 พบวา เทคนค SRAP สามารถแยกความแตกตางของแตละพนธออกจากกนไดอยางชดเจน

โดยใชไพรเมอร A7B5 สวนเทคนค RAPD พบวา สามารถเพมปรมาณดเอนเอได เมอใชไพรเมอรขนาด 10 นวคลโอไทด แตไมพบความแตกตางของแตละพนธ

Ferriol et al. (2003) ไดน า Cucurbita pepo 69 ตวอยาง ทมความหลากหลายทางพนธกรรมและสณฐานวทยา มาทดสอบโดยใชลายพมพดเอนเอจากเทคนค SRAP และ AFLP พบวา สามารถแยกตวอยางทตาง subspecies กนไดชดเจนทง 2 เทคนค และยงพบวาความสมพนธทางพนธกรรมทไดจากเทคนค SRAP มความสอดคลองกบลกษณะทางสณฐานวทยามากกวาเทคนค AFLP

Ferriol et al. (2004) ศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของ Cucurbita moschata จ านวน

250 ตวอยาง ทมาจากถนก าเนดตางกน 4 แหง ดวยเทคนค SRAP และ AFLP พบวา ทงสองเทคนคสามารถใชลายพมพดเอนเอจดกลมตวอยางจากความสมพนธทางพนธกรรมไดสอดคลองกบถนก าเนดของตวอยางทน ามาศกษา โดยเทคนค SRAP สามารถแยกความแตกตางทมาจากอเมรกาใตออกจากกลมอนๆ ได และเทคนค AFLP สามารถแยกกลมของอเมรกากลางและอเมรกาใตออกจากกลมตวอยางทมาจากประเทศสเปนได

อปกรณและวธการ

ตวอยางพชทใชในการศกษา

เมลดพนธมะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบร 15 ตวอยาง เมลดพนธมะรมจากประเทศอนเดย 3 ตวอยาง และเมลดพนธมะรมทเกบจากบาหล ประเทศอนโดนเซย 2 ตวอยาง รวม 20 ตวอยาง โดยก าหนดชอตวอยางทรวบรวมเปนชอจงหวดและหมายเลขล าดบการเกบ (ตารางท 1) ตารางท 1 ตวอยางมะรมทใชในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม จ านวน 20 ตวอยาง

แหลงทมา จ านวน รหสตวอยาง

อ. เมอง จ. กาญจนบร อ.พนมทวน จ. กาญจนบร

4

6

MR 005, MR 033, MR 065, MR 089 MR 012, MR 030, MR 032, MR 048, MR 005, MR 061

อ.ทามวง จ.กาญจนบร 3 MR 011, MR 018, MR 075

อ.ทามะกา จ.กาญจนบร 2 MR 017, MR 060

มะรมอนเดย 3 MR 002, MR 103, MR 106

มะรมอนโดนเซย 2 MR 104, MR 105

รวม 20

การเตรยมตวอยางพช

น าเมลดมะรมเพาะในกระบะเพาะช า รดน าเชา-เยน ประมาณ 2 สปดาห ยายกลามะรมลงถงเพาะช าขนาด 2.5 นว รดน าเชา-เยน ระยะเวลาประมาณ 3-4 สปดาห

การเตรยมดเอนเอ

สกดดเอนเอจากใบออนมะรมซงเปนใบบนสดของยอดทแผกางเตมท น ามาบดในโกรงทมไนโตรเจนเหลวจนละเอยด แลวเตมตวอยางลงในหลอด Microtube 1.5 มลลลตร จากนนเตม CTAB ( 2x CTAB buffer 100 ml,1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCL pH 8.0, 1% Polyvinyl pyrollidone, 2-Mercaptoethanol) ปรมาตร 600 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง โดยกลบหลอดไปมาทกๆ 10 นาท น าออกมาตงทงไวใหเยน จากนนเตม Chloroform: Isoamylalcohol ทอตราสวน 24:1 ปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ดดสวนใสปรมาตร 450 ไมโครลตร ใสในหลอดใหมทม 5M NaCl 5 ไมโครลตร แลวเตม Isopropanol ปรมาตร 450 ไมโครลตร เพอตกตะกอนดเอนเอไดดขน จากนนเกบท อณหภม –20 องศาเซลเซยส เปนเวลาขามคน น าตวอยางออกมาปนเหวยง 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท เทสวนใสทงตากตะกอนใหแหง จากนนเตม RNase A ปรมาตร 300 ไมโครลตร ทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเคาะหลอดเบาๆ เพอละลายตะกอนดเอนเอไดดขน เกบท อณหภม -20 องศาเซลเซยส น าออกมาท าใหละลาย จากนนเตม Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol ในอตราสวน 25 : 24 : 1 ปรมาตร 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากนน าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท ดดสวนใสดานบนใสหลอดใหมปรมาตร 450 ไมโครลตร แลวเตม Chloroform : Isoamylalcohol ปรมาตร 450 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท จากนนดดสวนใสปรมาตร 300 ไมโครลตรใสในหลอดทม CH3COONa ปรมาตร 3 ไมโครลตรในหลอดใหม เตม Absolute ethanol ปรมาตร 600 ไมโครลตร กลบหลอดไปมา เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส น าออกมาปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท เทสวนใสทงเตม ethanol 70 % ทแชเยน ปรมาตร 300 ไมโครลตร เพอลางตะกอนของเกลอ น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท เทสวนใสทงตากตะกอนใหแหงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ละลายตะกอนดวย TE buffer ปรมาตร 60 ไมโครลตร และเกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยสเพอใชตอไป

การตรวจสอบคณภาพดเอนเอ

1. การวเคราะหและแยกขนาดดเอนเอโดยวธอะกาโรสเจลอเลคโตรโฟรซส

ชง Agarose 1 g ใสลงใน 1x TBE buffer 100ml น าไปอนใหละลายแลวเทลงในพมพ ทงใหเยน

ทอณหภมหอง โดยจะใชเวลาประมาณ 20-30 นาท ผสมดเอนเอตวอยาง ปรมาตร 3 ไมโครลตร น ากลน

ปรมาตร 3 ไมโครลตรและ loading dye ปรมาตร 1 ไมโครลตร ใสในหลอด Microtube 1.5 มลลลตร แลว

หยอดลงในชองเจลทเตรยมไวและหยอดดเอนเอมาตรฐานททราบขนาดและความเขมขนปดฝาเครองและ

เปดกระแสไฟฟาใหวงจากขวลบไปขวบวก โดยใชกระแสไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท ปด

กระแสไฟฟาน าแผนเจลทไดไปยอมดวยเอธเดยมโบรไมด นาน 10-15 นาท น าแผน เจลออกมาลางดวย

น าเปลา 5 นาท แลวน าแผนเจลทไดไปสองดภายใตแสงอลตราไวโอเลตบนทกภาพ

2. การวดปรมาณและคณภาพของสารละลายดเอนเอโดยวดจากคาการดดกลนแสง

น าสารละลายดเอนเอทละลายอยใน TE buffer ปรมาตร 2 ไมโครลตร เจอจางในน ากลนนงฆาเชอ

98 ไมโครลตร โดยจะใชน ากลนทนงฆาเชอเปนมาตรฐาน (blank)

3. วดคาการดดกลนแสงของสารละลายดเอนเอทเจอจางแลวทความยาวคลน 260 นาโนเมตร และ 280

นาโนเมตร แลวน าผลทไดมาค านวณความเขมขนของสารละลายดเอนเอจากสตร

ความเขมขนของดเอนเอ (mg/ml) = 50 x dilution factor x OD260

4. ตรวจสอบคณภาพโดยดจากอตราสวนของคา A260 / A280 คาทไดมคาระหวาง 1.8-2.0 แสดงวาดเอน

เอทสกดไดนนเปนดเอนเอบรสทธ หากคานอยกวา 1.8 แสดงวามโปรตนเจอปนอยในสารละลาย และหาก

คาทไดมากกวา 2.0 แสดงวาสารละลายดเอนเอมอารเอนเอเจอปนอย

การเพมปรมาณโดยเทคนค PCR

น าดเอนเอของมะรมมาเพมปรมาณโดยเทคนค PCR โดยจะใชไพรเมอร Forward และ Reward ส าหรบเพมปรมาณดเอนเอ ความเขมขนของสารตางทใชในปฏกรยาพซอาร ดงน ตารางท 2 ความเขมขนทใชในการท าปฏกรยาดวยเทคนค PCR

สารทใช ปรมาตร(ไมโครลตร)

ดเอนเอมะรม (50ng/µl) 2

10x PCR buffer 2

dNTP 2

25mM MgCl2 1

Primer Forward 1

Primer Reword 1

Taq Polymerase 0.2

dH2O 10.8

รวม 20

เมอผสมสารตาง ๆ เขากนแลวน าไปใสในเครองเพมปรมาณดเอนเอ โดยจะใชอณหภมและเวลา

ส าหรบเพมปรมาณดงตาราง

ตารางท 3 ล าดบการเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR อณหภม (oซ) เวลา (นาท)

Pre – denaturation 94 3

Denaturation 94 1

Annealing 47 1

Extension 72 1

final extension 72 5

ตารางท 4 SRAP primers ทใชในการท าปฏกรยา PCR

SRAP primer Sequence primer

Me1 5-TGAGTCCAAACCGGATA-3 Me2 5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3 Me3 Me4 Me5 Em1 Em2 Em3 Em4 Em5

5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3 5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3

5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3 5-GACTGCGTACGAATTAAT-3 5-GACTGCGTACGAATTAAT-3

5-GACTGCGTACGAATTGAC-3 5-GACTGCGTACGAATTTGA-3 5-GACTGCGTACGAATTGCA-3

5. ตรวจสอบการเพมปรมาณดเอนเอดวย denaturing polyacrylamind gel electrophoresis

5.1. การเตรยมกระจกส าหรบเทเจล

น าแผนกระจกส าหรบเตรยมเจลมาลางใหสะอาดตากใหแหง แลวเชดดวย 95 เปอรเซนต เอธานอล ปรมาตร 500 ไมโครลตร ใหสะอาดทงสองแผน กระจกทมลกษณะเปนหกระตายเชดดวย Clear view จนแหง ลางดวยน ากลนตากใหแหงใชปากกาขดไวทหดานขวาเปนสญลกษณ เชดกระจกอกอนดวย Glass bond (alcohol 95%, glacial acetic acid 2.5 ไมโครลตร, Glass bond 1 ไมโครลตร) ใหทวกระจก แลวน ากระจกทง 2 แผนมาประกอบกนโดยวาง spacer ไวทงสองขางเพอใหเกดชองวางระหวางกระจกโดยหนดานทเชดดวย Clear view และ Glass bond เขาหากน ใชคลปหนบไวใหแนนแลวใชเทปกาวตดปดดานลางและดานขางทงสองขาง

5.2. การเตรยมเจล Polyacrylamind

เตรยมเจลโพลอะครลาไมดปรมาตร 30 มลลลตร โดยชงยเรย 13.5 กรม น ากลน 8.5 มลลลตร 5x TBE buffer ปรมาตร 6 มลลลตร ผสมสารละลายในบกเกอรน าไปท าใหละลาย เตมอะครลาไมดเจลปรมาตร 4.5 มลลลตร 10% แอมโมเนยมเปอรซลเฟต ปรมาตร 400 ไมโครลตรจากนนเตม TEMED ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนอยางรวดเรวแลวเทลงในชองระหวางกระจกจนเตม แลวใสหวเขาดานบนระวงอยาใหเกดฟองอากาศปลอยใหเจลแขงตวทอณหภมหองทงไวขามคนโดยใชพลาสตกหออาหารปดหนาเจลเพอใหมความชนอยทเจล

5.3. การท าอเลคโตรโฟรซส

น าเจลทแขงตวแลวมาลางน าโดยลางดานนอกดงเทปกาวและหวออก ประกอบกระจกเขากบเครองอเลคโตรโฟรซสแลวเตม TBE buffer ลงในชองดานบนและดานลาง ใชเขมฉดยาดดบพเฟอรมาลางยเรยทอยในชองหวแตละชองออกใหหมดแลวตอสายไฟเขากบเครองอเลคโตรโฟรซสเปดกระแสไฟฟา 295 โวลต ท า pre-run เปนเวลา 30 นาท ในขณะทรอ pre-run เตรยมดเอนเอทเพมปรมาณโดยเทคนคพซอารโดยดดดเอนเอ ปรมาตร 5 ไมโครลตรผสมกบ loading dye ปรมาตร 3 ไมโครลตรในหลอด Microtubeขนาด 1.5 มลลลตร จากนนน าไปตมในน าเดอดเปนเวลา 5 นาท แลวแชในน าแขงทนท เมอ pre-run เรยบรอยปดกระแสไฟฟา น าดเอนเอทตมแลวไปหยอดลงในชองๆละ 8 ไมโครลตรจากนนเปดเครองอเลคโตรโฟรซสใชกระแสไฟฟา 250 โวลต เปนเวลา 3-4 ชวโมงหรอจนกวาสของดรายจะเลอนลง

มาลางสด เมอครบเวลาปดเครองน ากระจกทง 2 แผนออกจากเครอง แยกกระจกทง 2 แผนออกจากนเจลจะตดอยกบกระจกทเปนรปสเหลยม น าเจลไปยอมดวยสารละลายซลเวอรไนเตรท

5.4. ขนตอนในการยอมเจล

น าแผนกระจกทมเจลตดอยมาลางในน ากลนปรมาตร 200 มลลลตร เขยาเบาๆ เปนเวลา5 นาท น าไปแชใน 0.1 % CTAB (CTAB 0.25g+dH2O 250 ml) เขยาเบาๆอยางตอเนอง เปนเวลา 30 นาท แลวแชแผนเจลใน 0.3 % Ammonia (ammonia750 ไมโครลตร+dH2O 250 ml) เขยาเบาๆ อยางตอเนองเปนเวลา 15 นาทหลงจากนนแชแผนเจลใน Silver Nitrate (0.4 g silver + dH2O 250 ml,1M NaOH 1ml, ammonia 1500ไมโครลตร) เปนเวลา 20 นาทเขยาอยางตอเนองแลวน าแผน เจลออกมาลางดวยน ากลน 2 ครง แลวแชแผนเจลในสารละลาย developer แชเยน (2% Na2CO3+ dH2O 250 ml+formaldehyde 50 ไมโครลตร) เขยาอยางสม าเสมอจนกวาจะเหนแถบดเอนเอจงน าแผนเจลมาลางดวยน ากลนและหยดปฏกรยาดวยน ากลนโดยแชแผนเจลในน ากลนเปนเวลา 30 นาท ตากแผนเจลใหแหงในอากาศ

6. การวเคราะหขอมล

ลายพมพดเอนเอของตวอยางมะรมทงสามสายพนธ ทไดรบการตรวจสอบโดยเทคนค SRAP

(sequence related amplified polymorphism) จะน ามาใชเปนขอมลส าหรบวเคราะหความสมพนธทาง

พนธกรรม โดยจะเปรยบเทยบแถบของดเอนเอทต าแหนงเดยวกนของมะรมทกตวอยาง ถามแถบดเอนเอ

ใหใชสญลกษณเปน 1 ถาไมมแถบดเอนเอใหใชสญลกษณเปน 0 เมอไดขอมลแลวน ามาวเคราะหคาดชน

ความเหมอน (Dice similarity coefficient) ดวยวธ SimQual จดกลมตวอยางดวยวธ UPGMA

(unweighted pair group method using arithmetic average) ซงจะแสดงผลในรปแบบของ

dendrogram โดยใชโปรแกรมส าเรจรป NTSYSpc-2.01e

ผลการทดลอง

จากการทดลองเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR โดยใชเทคนค SRAP marker ในมะรม 20 ตวอยาง โดยใชไพรเมอร 25 คไพรเมอร พบวา มเพยง 13 คไพรเมอร (45.6 เปอรเซนต) ทแสดงแถบดเอนเอทแตกตาง (Polymorphism) ในประชากร (polymorphic band) ได 52 แถบ จากทงหมด 114 แถบหรอเฉลย 8 แถบตอไพรเมอร (ตารางท 5) โดยมจ านวนแถบดเอนเอทแตกตางกนอยระหวาง 6-13 แถบ ซง ไพรเมอร S1และ S15 มคานอยทสดคอ 6 แถบ สวน primer S2 มคามากทสดคอ 13 แถบ

เมอน าขอมลมาวเคราะหคาสมประสทธความเหมอน (Dice similarity coefficient) จดกลม

ตวอยางดวยวธ UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average) ซงแสดงผลใน

รปแบบของ dendrogram โดยใชโปรแกรมส าเรจรป NTSYSpc-2.01e พบวา ความสมพนธของมะรมทง

20 ตวอยาง มคาสมประสทธความเหมอนระหวาง 0.74 ถง 0.92 โดยทคาสมประสทธความเหมอนเฉลย

เทากบ 0.81 สามารถแบงมะรมไดเปน 5 กลม และ Out group 2 ตวอยาง คอ กลมท 1 ประกอบดวย

ตวอยางมะรมทมาจากกาญจนบร (M005, M012, M033, M048, M065, M017, M032, M089, M011,

M030) กลมท 2 ประกอบดวยมะรมอนเดย (M002, M103) out group ประกอบดวยตวอยางมะรมทมา

จากกาญจนบรและอนโดนเซย (M1075, M104) กลมท 3 ประกอบดวยมะรมอนเดยและอนโดนเซย

(M105, M106) กลมท 4 ประกอบดวยตวอยางมะรมทมาจากกาญจนบร (M018, M055) และกลมท 5

ประกอบดวยตวอยางมะรมจากจงหวดกาญจนบร (M060, M061) (ภาพท 1) เมอตรวจสอบคา

สมประสทธความเหมอนแลวจะเหนไดวา ตวอยางมะรมทมาจากกาญจนบรมความใกลชดกนทาง

พนธกรรมสง เนองจากมะรมเปนพชผกยนตนทปลกตามบาน ไดรบการคดเลอก พนธหรอตนทมลกษณะ

ฝกตามความตองการของผบรโภค เชน ลกษณะฝกทมเนอมาก รสชาตอรอย ขณะทฝกคอด เลกเรยวถก

คดทง โดยผปลกมานาน อาจเปนสาเหตส าคญท าใหความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทปลกใน

ประเทศไทยลดลง นอกจากนยงพบวา มะรมทรวบรวมจากจงหวดกาญจนบรมลกษณะพนธกรรม

แตกตางจากมะรมอนเดยและอนโดนเซยอยางชดเจน

ตารางท 5 จ านวนและขนาดแถบดเอนเอทไดจากการตรวจสอบลายพมพดเอนเอมะรมดวยเทคนค SRAP โดยใช 13 คไพรเมอร

ไพรเมอร คไพรเมอร จ านวนแถบดเอนเอ ทงหมด (แถบ)

จ านวนแถบดเอนเอ ทแตกตาง (แถบ)

S1 ME1EM1 6 5 S2 ME1EM2 12 4 S3 ME2EM1 13 6 S4 ME2EM2 6 5

S8 ME2EM3 12 5 S9 ME2EM4 7 5

S10 ME2EM5 8 2 S15 ME4EM2 6 3 S16 ME5EM2 8 2

S17 S19 S21 S22

ME3EM3 ME3EM5 ME4EM4 ME4EM5

8 8

11 9

4 5 2 4

ผลรวม 114 52

ภาพท 1 การจดกลมของมะรม 20 ตวอยาง ทคาสมประสทธความเหมอน คา Dice similarity

coefficient เทากบ 0.81

Coefficient = 0.81

MR005 เมอง MR012 พนมทวน

MR033 เมอง

MR048 พนมทวน MR045 เมอง MR017 ทามะกา

MR032 พนมทวน MR089 เมอง

MR011 ทามวง MR030 พนมทวน

MR002 อนเดย

MR103 อนเดย MR075 ทามวง

MR104 อนโดนเซย MR105 อนโดนเซย

MR106 อนเดย MR018 ทามวง

MR055 พนมทวน MR060 ทามะกา

MR061 พนมทวน

Group 1

Group 2

Out Group

Group 3

Group 4

Group 5

0.74 0.78 0.83 0.88 0.92

Coefficient

วจารณผลการทดลอง

ในการทดลองใชไพรเมอรจ านวน 25 คไพรเมอร พบวามเพยง 13 คไพรเมอรทมแถบดเอนเอ

ปรากฏขนจะแสดงใหเหนวาในแคละคไพรเมอรทมล าดบนวคลโอไทดตางกนจะมประสทธภาพในการ แยกความแตกตางทตางกนไปดวย

เครองหมายโมเลกลทมคา Polymorphism สงจะแสดงใหเหนวาเครองหมายโมเลกลสามารถใช

ในการตรวจสอบความแปรปรวนและบอกความแตกตางทางพนธกรรมไดด แลวยงสามารถน ามาใชในการตรวจสอบความแตกตางทางพนธกรรมและสามารถจดจ าแนกพนธของมะรมไดตอไป

นอกจากนยงมการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของ Cucurbita moschata โดย Ferriol et al. (2004) ไดน าตวอยางของ Cucurbita moschata จ านวน 250 ตวอยาง ทมาจากถนก าเนดทแตกตางกน 4 แหง มาศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมดวยเทคนค SRAP และ AFLP พบวา ทงสองเทคนคสามารถใชลายพมพดเอนเอมาจดกลมตวอยางจากความสมพนธทางพนธกรรมไดสอดคลองกบถนก าเนดของตวอยางทน ามาศกษา โดยเทคนค SRAP จะสามารถแยกความแตกตางของ Cucurbita moschata ในแตละพนทไดด การทดลองในครงนไดท าการศกษาไพรเมอรจ านวน 25 คไพรเมอร และพบวามเพยง 13 ค ไพรเมอรทแสดงแถบของดเอนเอทมความแตกตางกน ดงนนจงควรเพมจ านวนของไพรเมอรและพนธของมะรมใหมากขนหรอเพมเทคนคโมเลกลเครองหมายชนดอนๆเขามาชวยในการปรบปรงและหาความหลากหลายทางพนธกรรมตอไป

สรปผลการทดลอง

จากการตรวจสอบลายพมพดเอนเอของตวอยางมะรมทมาจากกาญจนบร มะรมอนเดย และ

อนโดนเซย จ านวน 20 ตวอยาง โดยใชเทคนค Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP)

พบวามเพยง 13 คไพรเมอร (45.6 เปอรเซนต) จาก 25 คไพรเมอรทแสดงแถบของดเอนเอทแตกตางกน

และมคาสมประสทธความเหมอนระหวาง 0.74-0.92 สามารถแบงมะรมไดเปน 5 กลม และ Out group 2

กลม ทคา Dice similarity coefficient เฉลยเทากบ 0.81 มะรมอนเดยและอนโดนเซย ความใกลชดกน

ทางพนธกรรมของมะรมพนธทมาจากกาญจนบร

เอกสารอางอง

กรมวชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ. 2548. ผกพนเมอง : เฉลมพระเกยตรสมเดจพระเทพ รตนราชสดาฯ สยามบรมราชกมาร 50 พรรษา 2 เมษายน 2548. โรงพมพชมนมสหกรณ การเกษตรแหงประเทศไทย. กรงเทพฯ. 74-75 น. กองกานดา ชยามฤตและลนา ผพฒนพงศ. 2545. สมนไรไทย ตอนท 7 . ฝายพฤกษศาสตรปาไม

กองบ ารง กรมปาไม, กรงเทพฯ. เกรก ทวมกลาง. 2547. เทคนคการปลกผกพนบาน ผกรมรว. สถาพรบคส, กรงเทพฯ. จรพนธ ศรทองกล. 2546. ลกษณะ ผลผลต และลายพมพดเอนเอในกลวยไขพนธกลาย. วทยานพนธ

ปรญญาโท มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. วารน วรรณประโพธ. 2545. การใชลายพมพดเอนเอตรวจสอบยางกราด ยางพลวง และยางทคาด วาเปนลกผสม. วทยานพนธปรญญาโท มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. วชร ประชาศรยสรเดช. 2548. ผกพนเมอง. โรงพมพชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย.

กรมวชาการเกษตร, กรงเทพฯ. วชร อตถทพพหลคณ และ มนตร อตถทพพหลคณ. 2536. ทฤษฎการประยกตใชประโยชน PCR Technology. คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยมหดล, กรงเทพฯ. ธระชย ธนานนต, สรนทร ปยะโชคณากล และ สมศกด อภสทธวาณช. 2543. การตรวจสอบ

ดเอนเอของสมโอโดยเทคนคพซอาร. รายงานการวจย. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะ วทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยธรรมศาสตร ศนยรงสต รวมกบ ภาควชาพนธ- ศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. มะลวลย กอสกล. 2546. ความผนแปรของสณฐานวทยา กายวภาควทยาและรปแบบดเอนเอของ หมอน. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ .

สถาบนการแพทยแผนไทย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข. 2542 ผกพนบานภาคเหนอ. โรงพมพองคการสงเคราะหทหารผานศก. กรงเทพฯ. 189 น. สธาทพย ภมรประวต. 2550. มะรมลดไขมน ปองกนมะเรง. วารสาร หมอชาวบาน. 29(338) : 28-32 สมวงษ ตระกลรง. 2540. Molecular marker technology, น. 122 - 129. ใน เอกสารประกอบการ ฝกอบรมเชงปฏบตการ National Training Course on “Crop Improvement by Using Mutation Technique and Biotechnology” 10-14 พฤศจกายน 2540. มหาวทยาลย เกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. สรพร เกตงาม. 2546. เครองหายดเอนเอในงานปรบปรงพนธพช. วารสารวชาการ. ภาควชาพชไรนา คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยอบลราชธาน, อบลราชธาน. Brown, S.M., A. K. Szewc-McFadden, and S. Kresovish. 1996. Development and application of simple sequence repeat (SSR) loci for plant genome analysis. In. Methods of plant genome analysis : Their merits and pitfalls. Jauhar, P.P. (ed.). CRS Press, Boca raton, FL. U.S.A. Pp. 147-159. Ferriol, M., B. Pico and F. Nuez. 2003. Genetic diversity of a germplasm collection Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor. Appl. Genet. 107: 271-282. _______, P. F. de Cordova and F. Nuez. 2004. Molecular diversity of a germplasm collection of squash (Cucurbita moschata) determined by SRAP and AFLP markers. Crop Sci. 44: 653-664. Jansakul, C., A. W. Noi, K. Croft and L. Byrne. 1997. Pharmacological studies of thiocarbamate glycosides isolated from Moringa oleifera. J. Sci. Soc. Thailand 23 : 335 - 346.

Hittalmani, S., M.R. Foolad, T. Mew, R.L. Rodriguez and N. Huang. 1995. Development of a PCR-based marker to identify rice blast resistance gene, Pi-2 (t), in a segregating population. Theor. Appl. Genet. 91: 9-14 Makkar H P S and K. Becker. 1996 Nutritional value and antinutritional components of whole and ethanol extracted Moringa oliefera leaves. Animal feed science tecthnology: 63 211 – 228. Kochert, G. 1994. RFLP technology. In DNA-based markers in plants. Phillips, R.L. and

I.K. (eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. The Netherlands. Pp.8-38.

Li, G and C.F. Quiros. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103: 455 – 461. Lin, Z., D. He, X. Zhang, Y. Nie, X. Guo, C. Feng and J. McD. Stewart. 2005. Linkage map

construction and mapping QTL for cotton fibre quality using SRAP SSR and RAPD. Plant Breeding 124: 180-187.

McCouch, S. and S.D. Tankslay. 1991. Development and use of restriction fragment length

polymorphisms in rice breeding and genetic. In. Rice biotechnology. Khush, G.S. and

Toenniessen, G.H. (eds.) CAB International. Wallingford. Oxon, UK. Pp. 109- 133.

Powell, W., C. Machray and J. Provan. 1996. Polymorphism revealed by simple sequence

repeats. Trends in Plant Sci. 1: 215-222.

Tankslay, S.D., N.D. Young, A.H . Paterson and M.W. Bonierbale. 1989. RFLP mapping in

plant breeding: New tools for an old science. Biotechnology. 7:257-264.

Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. A Hornes Frijters. J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper. and M. Zebeau. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprintings. Nucleic. Acids. Res. 23:4407-4414. Williams, J.G.K., A.R.Kubelik, K. J. Livak, J.A. Rafalski, and S.U. Tingey. 1990. DNA

polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic

Acids Res. 8 (22): 6531-6535.