27

บทท 3

อปกรณ และวธการ

การทดลองท 1 : การทดสอบความตานทานของเชอรา Colletotrichum spp. สาเหตโรค แอนแทรคโนสพรกตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซม

1.1 การแยกเชอราบรสทธ และเกบรวบรวมเชอรา Colletotrichum spp. สาเหตโรคแอนแทรคโนสพรก

เกบตวอยางโรคแอนแทรคโนส จากแปลงปลกพรกของเกษตรกรทใชสารกาจดเชอรา คารเบนดาซม ในการควบคมโรคแอนแทรคโนสในเขต อ.สนทราย อ.แมรม และสมเกบตวอยางผลพรกจากตลาดในจงหวดเชยงใหมนามาแยกเชอสาเหตตามลกษณะอาการทปรากฏ โดยแบงวธการแยกเชอออกเปน 2 วธการดงน การแยกเชอจากตวอยางทไมปรากฏสปอรบนบาดแผลตามวธการของ Photita et al. (2005) โดยนาสวนของพชอาศยมาลางดวยนาไหลเปนเวลาประมาณ10 นาท เพอลางสงปนเปอนตางๆออก ตดชนพชบรเวณแผลกบเนอเยอปกตใหมขนาดเลกประมาณ 0.5 x 0.5 เซนตเมตร ฆาเชอทผวโดยจมชนพชใน 10% Clorox (1% sodium hypochlorite) เปนเวลา 1-3 นาท (ขนอยกบความหนาบางของชนพช) ลางดวยนากลนฆาเชอประมาณ 3-5 นาท ซบชนพชใหแหงดวยกระดาษชาระทฆาเชอแลว จากนนนาชนพชวางลงบนอาหาร PDA (potato dextrose agar) บมไวทอณหภมหอง (28 + 2๐C) ประมาณ 3-4 วน จงเขยบรเวณปลายเสนใยมาเลยงบนอาหาร PDA ใหม จากนนเลยงเชอลงในหลอดอาหาร PDA ทผวหนาเอยง เกบทอณหภม 4OC เพอใชเปน stock culture การแยกเชอจากตวอยางทปรากฏสปอรบนผลพรกทมลกษณะแผลชาน า กลมสปอรมสชมพ-สม (single-spore) ตามวธการของ Choi et al. (1999) โดยใช loop ทผานการฆาเชอแลวแตะลงบนสปอร (spore masse) นามา streak บนอาหาร PDA บมทอณหภมหอง เมอเชอเจรญใชเขมเขย เขยเสนใยมาเลยงบนอาหาร PDA จากนนเลยงเชอลงในหลอดอาหาร PDA ทผวหนาเอยง เกบทอณหภม 4OC เพอใชเปน stock culture (ภาพ 2) สวนการแยกเชอจากสปอรบนผลพรกทมลกษณะแผลแหง กลมสปอรมสดาเรยงซอนกนเปนวง แยกโดยนาตวอยางทไดมาสองภายใตกลองสเตอรโอทกาลงขยาย 40X โดยใชปากคม (forcep) ปลายแหลมทผานการฆาเชอแลว นาโครงสรางสปอร วางบนอาหาร PDA บมทอณหภมหองจนกวาเชอราเจรญ ใชเขมเขย เขยเสนใยมาเลยงบนอาหาร PDA จากนนเลยงเชอลงในหลอดอาหาร PDA เกบทอณหภม 4OC เพอใชเปน stock culture (ภาพ 3) ตอไป

28

ภาพ 2 การแยกเชอรา Colletotrichum sp. ดวยวธ streak plate

ภาพ 3 การแยกเชอรา Colletotrichum sp. ภายใตกลองสเตอรโอ

1.2 การประเมนระดบความตานทานของเชอรา Colletotrichum spp. ตอสารปองกนกาจด เชอราคารเบนดาซม

เตรยมอาหารเลยงเชอ PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมทระดบความเขมขนตางๆ ดงนคอ 0, 0.1, 1, 10, 100, 500 และ 1000 μg/ml (ภาคผนวก ก) โดยเทอาหารใสจานอาหารเลยงเชอทมเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร จานละประมาณ 10 มลลลตร (ทงไวจนผวหนาอาหารแหง) ทดสอบความตานทานตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซมดวยวธ culture disc technique โดยใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร ตดปลายเสนใยของเชอราแตละไอโซเลท ทแยกไดมาเลยงบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมความเขมขนตางๆ โดยทาการทดลองความเขมขนละ 3 ซาตอไอโซเลท (ภาพ 4) บนทกลกษณะโคโลนของเชอรา และการเจรญของ เชอรา โดยวดขนาดเสนผานศนยกลางโคโลนของเชอราเมอเชอราชดควบคมเจรญเตมท โดยบนทกทงในแกน x และ แกน y แลวหาคาเฉลยการเจรญเสนใยของเชอรา จากนนนาขอมลทไดมาประเมนตามหลกเกณฑในขอ 1.2.1 และ 1.2.3

เชอสาเหตบนอาหาร PDA slant tube

เชอสาเหตบนอาหาร PDA slant tube

29

ภาพ 4 ลกษณะการวางเชอราบนอาหารเลยงเชอทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซม

หลกเกณฑในการประเมนระดบความตานทานของเชอราตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซม พจารณาจาก (ดดแปลงจาก Farungsang and Farungsang (1992), Koenraadt et al. (1992) และ Peres et al. (2004))

1.2.1 ความสามารถเจรญไดบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมทระดบความเขมขนตางๆ

เมอเลยงเชอรา Colletotrichum spp. เปนเวลา 7 วน หรอจนกวาเชอราในชดควบคมเจรญเตมจานอาหารเลยงเชอนาเชอราจากทกไอโซเลทมาจดระดบความตานทานตอสารกาจด เชอราคารเบนดาซม 4 ระดบ ดงนคอ

เชอราทออนแอตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซม (sensitive: S) คอเชอราทไมสามารถเจรญไดหรอเจรญไดเพยงเลกนอยบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบความเขมขน < 1 μg/ml

เชอราทตานทานตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบตา (weakly resistant: WR) คอ เชอราทเจรญไดบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบความเขมขน ≤ 10 μg/ml

เชอราทตานทานตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบปานกลาง (moderately resistant : MR) คอเชอราทเจรญไดบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบความเขมขน ≤ 100 μg/ml

เชอราทตานทานตอสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบสง (highly resistant : HR) คอเชอราทสามารถเจรญไดบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมระดบความเขมขน ≥ 500 μg/ml

เชอราทดสอบ

μg/ml

30

ตาราง 2 ระดบความตานทานสารกาจดเชอราคารเบนดาซม 4 ระดบ

ระดบความตานทาน1 ความเขมขนของสารปองกนกาจดเชอราคารเบนดาซม (μg/ml) 0.1 1 10 100 5003 1,000

Sensitive (S) 2 X X X X X

X X X X Weakly resistant (WR) X X X Moderately resistant (MR) X X

Highly resistant (HR) X

1S; ≤ 1 μg/ml, WR; ≤ 10 μg/ml, MR; ≤ 100 μg/ml, HR; ≥ 500 μg/ml 2 = เชอราทเจรญไดตงแต 10% ขนไป เมอเทยบกบชดควบคม X = เชอราทเจรญไมได หรอเจรญไดนอยกวา 10 % เมอเทยบกบชดควบคม 3อตราแนะนา

1.2.3 เปอรเซนตการเจรญของเชอราบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมทระดบความเขมขนตางๆ

นาคาเฉลยการเจรญของเชอราทไดจากการทดสอบมาประเมนหาอตราการเจรญเตบโตของเชอราบนอาหาร PDA ทผสมสารกาจดเชอราคารเบนดาซมในแตละความเขมขน โดยเปรยบเทยบกบชดควบคม คานวณจากสมการ ดงน

เปอรเซนตการเจรญของเชอรา = คาเฉลยเสนผานศนยกลางโคโลนชดทดสอบ x 100 (เทยบกบชดควบคม) คาเฉลยเสนผานศนยกลางโคโลน ชดควบคม

จากนนนาเปอรเซนตการเจรญเตบโตของเชอราทไดมาเปรยบเทยบอตราการเจรญเตบโต

ของเชอราในแตละความเขมขน 5 ระดบการเจรญ ดงนคอ - = เชอราทเจรญได ≤ 10 % เมอเทยบกบชดควบคม + = เชอราทเจรญได 35% ≤ 10% เมอเทยบกบชดควบคม ++ = เชอราทเจรญได 65% ≤ 35% เมอเทยบกบชดควบคม +++ = เชอราทเจรญได 90% ≤ 65% เมอเทยบกบชดควบคม ++++ = เชอราทเจรญได ≥ 90% เมอเทยบกบชดควบคม

31

การทดลองท 2 : การศกษาลกษณะทางพนธกรรมของเชอรา Colletotrichum spp. ทตานทานตอ

สารกาจดเชอราคารเบนดาซม

2.1 เพมปรมาณยน beta-tubulin ดวยเทคนค Nested PCR

2.1.1 เตรยมเสนใยเชอรา และสกดดเอนเอ

เลยงเชอรา Colletotrichum spp. (ตาราง 3) บนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 7 วน หรอจนเชอเจรญเตมจานอาหารเลยงเชอ จากนนใช spatula ทผานการฆาเชอแลว ขดเสนใยเชอราลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร ปรมาณ 0.1-0.2 กรม จากนนนามาสกดดเอนเอดวยชด Nuclospin Plant Kit® โดยนาเสนใยเชอราทเตรยมไวใสในโกรงทอบฆาเชอแลว เตมไนโตรเจนเหลวลงไป เพอใหเสนใยแขงตว จากนนบดเสนใยใหเปนผง ตกใสหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร เตม PL1 buffer ปรมาตร 200 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex เตม RNaseA ปรมาตร 10 ไมโครลตร และ PL1 ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 30 วนาท บมทอณหภม 65OC เปนเวลา 10 นาท นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท จากนนประกอบชดทดลองสาเรจรป (ชด kit) และดดของเหลวใสทไดใสใน column สมวง นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 2 นาท ดดสวนใสดานบนใสหลอด Eppendorf ใหม จากนนเตม PC buffer ปรมาตร 450 ไมโครลตร ใช pipette ดดขนลง 5 ครง จากนนประกอบชด kit และดดของเหลวใสทไดใสใน column สเขยว นาไปปนเหวยงความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวในหลอดทง จากนนลางซลกา เมมเบรน (silica membrane)ใน column สเขยว ดวย PW buffer ปรมาตร 400 ไมโครลตร ลงใน column สเขยว นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทง แลวเตม PW2 buffer ปรมาตร 700 ไมโครลตร ใน column สเขยว นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท เทของเหลวทง แลวเตม PW2 buffer อก 200 ไมโครลตร ลงใน column สเขยว นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 2 นาท แลวเตม PE elution buffer (อนท 70OC มากอน) ปรมาตร 25 ไมโครลตร ลงใน column สเขยว บมทอณหภม 70OC เปนเวลา 5 นาท เพอละลายเอาสวนของดเอนเอจากซลกาเมมเบรนของ column สเขยว นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท แลวเตม PE elution buffer อก 25 ไมโครลตร ลงใน column สเขยวอกครง บมทอณหภม 70OC เปนเวลา 5 นาท นาไปปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท จากนนเกบดเอนเอทไดไวทอณหภม 20OC จนกวาจะนามาใชในการทดลองขนตอไป

32

ตาราง 3 เชอรา Colletotrichum spp. ทนามาสกดดเอนเอ

ลาดบท ไอโซเลท2 ชนดของเชอรา ระดบความตานทาน1

1 Cc8 C. capsici 2 Cg24 C. gloeosporioides S 3 Cg30 C. gloeosporioides 4 Cc1 C. capsici

WR 5 Cc9 C. capsici 6 Cg46 C. gloeosporioides MR 7 Cg5 C. gloeosporioides

HR

8 Cg22 C. gloeosporioides 9 Cg14 C. gloeosporioides 10 Cg23 C. gloeosporioides 11 Cg27 C. gloeosporioides 12 Cg28 C. gloeosporioides 13 Cg40 C. gloeosporioides 14 Cg44 C. gloeosporioides 15 Cc43 C. capsici 16 Cc53 C. capsici 17 Cg60 C. gloeosporioides 18 Cg73 C. gloeosporioides 19 Cg75 C. gloeosporioides 20 Cg78 C. capsici 21 Cg86 C. capsici

1 S = Sensitive (≤ 1 μg/ml) WR = Weakly resistant (≤ 10 μg/ml), MR = Moderately resistant (≤ 100 μg/ml), HR = Highly resistant (≥ 500 μg/ml) 2Cc = Colletotrichum capsici, Cg = Colletotrichum gloeosporioides

33

2.2.2 ตรวจสอบคณภาพ และปรมาณดเอนเอดวยวธ agarose gel electrophoresis

ตรวจสอบคณภาพของดเอนเอทสกดไดโดยการทาอเลกโทรโฟรซสใน 1% agarose gel โดยชง agarose 1 กรม เตม running buffer (50x TAE buffer) 100 มลลลตร หลอมเจลใหละลายดวยไมโครเวฟ เมอเจลมอณหภมประมาณ 60OC เตม 1x ethidium bromide (EtBr) ปรมาตร 7 ไมโครลตร ผสมใหเขากน จากนนเทลงในถาดเจลใหมความหนาประมาณ 0.5 เซนตเมตร ระวงอยาใหเกดฟองอากาศ เสยบหวทปลายขางหนงของถาดเจล เพอใหเกดชองเลกๆ (well) สาหรบใสตวอยาง ทงไวประมาณ 1 ชวโมง เพอใหเจลแขง คอยๆ ดงหวออก นาถาดเจลใสลงไปในเครอง อเลกโทรโฟรซสโดยใหดานทมชองสาหรบหยอดตวอยางอยทางขวลบ เตม 50x TAE buffer ลงไปพอทวมแผนเจล จากนนดดดเอนเอผสมกบ loading dye ในอตราสวน 2:1 ไมโครลตร หยอดลงใน well และเปรยบเทยบกบดเอนเอมาตรฐาน (marker) ใชกระแสไฟฟาความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท นาไปตรวจดภายใตแสงอลตราไวโอเลต และบนทกภาพ

จากนนนาดเอนเอทไดมาเพมปรมาณดเอนเอตรงตาแหนงบางสวนของยน beta-tubulin ดวยเทคนค Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) ซงอาศยการทา PCR 2 ขนตอนดวย ไพรเมอร 2 ค โดยไพรเมอรคแรกจะใชสาหรบทา PCR ขนตอนแรก (1st PCR) คอ ไพรเมอร TB2L forward (5′-GTT TCC AGA TCA CCC ACT CC-3′) และ TB2R reverse (5′-TGA GCT CAG GAA CAC TGA CG-3′) ทผลตโดยบรษท iNtRON BIOTECHNOLOGY, INC. ซงไพรเมอรคแรกจะเพมปรมาณดเอนเอบรเวณรอบนอกรวมถงตาแหนงยน beta-tubulin ซงมกจะพบในเชอราทตานทานตอสารปองกนกาจดเชอราเบโนมล (Peres et al., 2004) ออกแบบไพรเมอร โดยใช ไพรเมอร 3 software ซงอาศยตนแบบจากลาดบนวคลโอไทดจากยน beta-tubulin ของเชอรา Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene (GenBank accession no. U14138) (ภาพ 5) เตรยมสวนผสมการทา PCR ขนแรก (1st PCR) ในหลอด PCR ขนาด 0.5 มลลลตร ตามตาราง 4

34 1 GCTTCCGGCAACAAGTACGTGCCCCGTGCCGTCCTCGTCGATTTGGAGCCCGGTACCATG 60 54 A S G N K Y V P R A V L V D L E P G T M 73 61 GACGCCGTCCGTGCTGGTCCTTTCGGCCAGCTGTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGC 120 74 D A V R A G P F G Q L F R P D N F V F G 93 121 CAGTCTGGTGCCGGCAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACCGAGGGTGCCGAGCTAGTC 180 94 Q S G A G N N W A K G H Y T E G A E L V 113 181 GACCAGGTTCTCGATGTTGTCCGCCGCGAGGCTGAGGGCTGCGACTGCCTCCAGGGTTTC 240 114 D Q V L D V V R R E A E G C D C L Q G F 133 241 CAGATCACCCACTCCCTCGGTGGTGGTACCGGTGCCGGTATGGGTACCCTCCTGATCTCC 300 134 Q I T H S L G G G T G A G M G T L L I S 153 301 AAGATCCGTGAGGAGTTCCCCGACCGCATGATGGCCACCTTCTCCGTCGTTCCCTCCCCC 360 154 K I R E E F P D R M M A T F S V V P S P 173 361 AAGGTCTCCGACACCGTTGTCGAGCCCTACAACGCCACTCTCTCCGTCCACCAGCTGGTC 420 174 K V S D T V V E P Y N A T L S V H Q L V 193 421 GAGAACTCCGACGAGACCTTCTGCATTGACAACGAGGCTCTCTACGACATTTGCATGCGT 480 194 E N S D E T F C I D N E A L Y D I C M R 213 481 ACCCTCAAGCTGTCCAACCCCTCTTACGGCGACCTGAACCACCTGGTCTCTGCTGTTATG 540 214 T L K L S N P S Y G D L N H L V S A V M 233 541 TCCGGTGTCACTACCTGCCTGCGTTTCCCGGGTCAGCTGAACTCTGACCTGCGCAAGCTG 600 234 S G V T T C L R F P G Q L N S D L R K L 253 601 GCTGTCAACATGGTTCCTTTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATGGTCGGCTTCGCTCCCCTG 660 254 A V N M V P F P R L H F F M V G F A P L 273 661 ACCAGCCGTGGCGCCCACTCTTTCCGCGCCGTCAGTGTTCCTGAGCTCACCCAGCAGATG 720 274 T S R G A H S F R A V S V P E L T Q Q M 293 721 TTCGACCCCAAGAACATGATGGCTGCTTCTGACTTCCGCAACGGTCGCTACCTGACCTGC 780 294 F D P K N M M A A S D F R N G R Y L T C 313 781 TCTGCCATC 789 314 S A I 316

ภาพ 5 ลาดบนวคลโอไทดและลาดบกรดอะมโนของยน beta-tubulin (TBU2)(2) ของเชอรา Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene สายพนธปกต (sensitive)

(1)Peres et al. (2004)

(2)Buhr and Dickman (1994)

TB2L primer (1st PCR)

target site for benomyl(1)

CTB2F1 primer (2nd PCR)

CTB2R1 primer (2nd PCR)

TB2R primer (1st PCR)

35

ตาราง 4 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ขนตอน 1stPCR ในการเพมปรมาณบางสวนของยน beta-tubulin

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) 10x PCR buffer dNTP mix Primer TB2L Primer TB2R DNA template นากลนทฆาเชอแลว Blend Taq DNA Polymerase (TOYOBO)

5.0 5.0 1.0 1.0 1.0 36 1

ปรมาตรรวม 50

เมอเตมสวนผสมทกอยางครบแลว นาหลอด PCR tube ทเตรยมพรอมแลวไปเขาเครอง thermal cycler Programmable Thermal Controller PTC-200TM thermocycler (MJ Research, Inc., Watertown, MA) โดยกาหนดอณหภม และเวลาแตละขนตอนดงน

1. initial denaturation ทอณหภม 95OC เวลา 5 นาท 2. template denaturation ทอณหภม 95OC เวลา 1 นาท

primer annealing ทอณหภม 35OC เวลา 1 นาท extension ทอณหภม 72OC เวลา 1 นาท 3. primer extension ทอณหภม 72OC เวลา 5 นาท

จากนนตรวจสอบผล PCR (1st PCR) ดวยวธอเลกโทรโฟรซสโดยผสมผลผลต PCR ครงท 1 (1stPCR) กบ 6X loading dye ในอตราสวน 5:1 ไมโครลตร เทยบกบดเอนเอมาตรฐาน ซงใช λ DNA digested by Hind III ตอ 6X loading dye ในอตราสวน 8:2 ไมโครลตร จากนนตอเครองอเลคโทรโฟรซสเขากบเครองกาเนดไฟฟา ใชกระแสไฟ 80 โวลต 400 มลลแอมป เปนเวลา 40 นาท จากนนนาเจลไปตรวจดภายใตแสงอลตราไวโอเลต และบนทกภาพ

30 รอบ

36

นาผลผลต PCR ทไดจากการเพมปรมาณในขนตอนท 1 (1st PCR) มาเพมปรมาณบรเวณบางสวนของยน beta-tubulin ในขนตอน PCR ท 2 (2nd PCR) ดวยไพรเมอรคท 2 คอ CTB2F1 forward (5′-TCC AAG ATC CGT GAGG -3′) และ CTB2R1 reverse (5′-AAG AAG TGG AGA CG -3′) ทออกแบบใหเพมปรมาณดเอนเอในตาแหนง beta-tubulin ทอยถดเขาไปจากไพรเมอรคแรก (ภาพ 5) โดยเตรยมสวนผสมการทา PCR ขนตอนท 2 (2ndPCR) ในหลอด PCR ขนาด 0.5 มลลลตร ตามตาราง 5

ตาราง 5 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ขนตอนท 2 (2nd PCR) ในการเพมปรมาณบางสวนของยน beta-tubulin

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) 10x PCR buffer dNTP mix Primer CTB2F1 Primer CTB2R1 DNA template นากลนทฆาเชอแลว Blend Taq DNA Polymerase (TOYOBO)

5.0 5.0 1.0 1.0 1.0 36 1

ปรมาตรรวม 50 เมอเตมสวนผสมทกอยางครบแลว นาหลอด PCR tube ทเตรยมพรอมแลวไปเขาเครอง

thermal cycler Programmable Thermal Controller PTC-200TM thermocycler (MJ Research, Inc., Watertown, MA) โดยกาหนดอณหภม และเวลาแตละขนตอนดงน

1. initial denaturation ทอณหภม 95OC เวลา 5 นาท 2. template denaturation ทอณหภม 95OC เวลา 1 นาท

primer annealing ทอณหภม 50OC เวลา 1 นาท extension ทอณหภม 72OC เวลา 1 นาท 3. primer extension ทอณหภม 72OC เวลา 5 นาท

30 รอบ

37

จากนนตรวจสอบผลผลต PCR ครงท 2 (2nd PCR) ดวยวธอเลกโทรโฟรซสโดยผสมผลผลต PCR ครงท 2 กบ 6X loading dye ในอตราสวน 5:1 ไมโครลตร เทยบกบดเอนเอมาตรฐาน ซงใช λ DNA digested by Hind III ตอ 6X loading dye ในอตราสวน 8:2 ไมโครลตร จากนนตอเครองอเลคโตรโฟรซสเขากบเครองกาเนดไฟฟา ใชกระแสไฟ 80 โวลต 400 มลลแอมป เปนเวลา 40 นาท แลวนาเจลตรวจดภายใตแสงอลตราไวโอเลต และบนทกภาพ

2.2 การทา Transformation และ colony direct PCR นาผลผลตจาก 2nd PCR ทไดมาโหลดบน 1% low melting point gel (Invitrogen®) โดยโหลด 2nd PCR product กบ 6X loading dye ในอตราสวน 20:3 ไมโครลตร เทยบกบดเอนเอมาตรฐานตอ 6X loading dye ในอตราสวน 8:2 ไมโครลตร จากนนตอเครองอเลกโทรโฟรซสเขากบเครองกาเนดไฟฟา เตม 50X TAE ใหทวมเจล ใชกระแสไฟ 80 โวลต 400 มลลแอมป เปนเวลา 60 นาท แลวนาเจลตรวจดภายใตแสงอลตราไวโอเลต ใชใบมดทผานการฆาเชอแลว ตดเจลบรเวณแถบดเอนเอทตองการ (ขนาด 341 bp) ลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร นาเจลมาหลอมใหละลาย ทอณหภม 65OC เปนเวลา 5 นาท หรอจนกวาเจลจะหลอมหมด จากนนดดเจลทหลอมมา ปรมาตร 1 ไมโครลตร ใสลงใน T-vector pGEM®Easy 0.5 ไมโครลตร (ภาพ 6) ทเตมนากลนทฆาเชอแลวปรมาตร 2.5 ไมโครลตร, 2x ligation buffer ปรมาตร 5 ไมโครลตร และ T4 DNA ligase ปรมาตร 1 ไมโครลตร (โดยทาบนนาแขง) จากนนนาไปบมทอณหภม 15OC เปนเวลา 12 ชวโมง เตรยม competent cell (Escherichia coli) ทแชแขงท -80OC มาทาใหละลายโดยแชในนาแขง จากนนหลอมเจลทบมไวเปนเวลา 12 ชวโมงอกครง ทอณหภม 65OC เปนเวลา 1-2 นาท ดดลงใน competent cell แชในนาแขงเปนเวลา 30 นาท จากนนนาไปแชใน water bath ทอณหภม 42OC เปนเวลา 40 วนาท จากนนนามาแชในนาแขงเปนเวลา 2 นาท เตรยม SOC medium (Super Optimal broth with Catabolite repression) (Invitrogen®) 800 ไมโครลตร ในหลอดอาหาร (tube) จากนนดด competent cell ใสลงใน SOC medium บมทอณหภม 37OC เขยาทความเรว 200 รอบ/นาท เปนเวลา 1 ชวโมง เทอาหารแขง LB (Luria-Bertani) ทผสม 130 mM ampicillin ปรมาตร 50 ไมโครลตร ลงบนจานอาหารเลยงเชอ จากนนหยด X-gal และ IPTG อยางละ 30 ไมโครลตร ใชแทงแกวรปตวเอลเกลยใหแหง ดด SOC medium ทมสวนผสมของ competent cell มา 200 ไมโครลตร หยดลงบนอาหาร LB ทเตรยมไว ใชแทงแกวรปตวแอลเกลยใหผวหนาอาหารแหง นาไปบมทอณหภม 37OC เปนเวลา 12 ชวโมง

38

ภาพ 6 แผนทพลาสมดเวกเตอร (T-vector pGEM®Easy)

39

เลอกโคโลนสขาวทขนบนอาหาร LB ทไดโดยใชไมจมฟนทผานการฆาเชอแลวแตะ

โคโลนสขาว แลวนามาเลยงบนอาหารแขง LB ทผสมสาร 130 mM ampicillin ปรมาตร 50 ไมโครลตร (ภาพ 7) หลงจากนนใชไมจมฟนทแตะโคโลนจมลงในหลอด PCR ทผสมสารดงตาราง 6 (colony direct PCR) นาไปเขาเครอง PCR (สมเลอก 4 โคโลนตอ 1 ตวอยาง) เพอเปนการตรวจสอบเบองตนวาโคโลนทเลอกมาเลยงบนอาหารแขง LB มสวนของ insert gene beta-tubulin หรอไม

ภาพ 7 การเลยง Escherichia coli บนอาหารแขง LB (Luria-Bertani) ทผสมสาร 130 mM ampicillin

จากนนนา PCR product ทไดมาโหลดบน 1% agarose gel โดยมสวนผสมของ PCR product ตอ 6xloding dye ในอตราสวน 5:2 ไมโครลตร หากปรากฏแถบดเอนเอตรงตาแหนง 341 bp แสดงวาโคโลนทเลอกมามสวนของ insert gene beta-tubulin อย จากนนใชไมจมฟนทฆาเชอแลวแตะโคโลนทเลยงไวบนอาหาร LB โดยเลอกโคโลนทปรากฏแถบดเอนเอในขนตอนการทา colony direct PCR มาเลยงในหลอดอาหารเหลว LB ปรมาตร 4 มลลลตร ทผสม 130 mM ampicillin แลว โดยใสไมจมฟนลงไปดวย บมทอณหภม 37OC เขยาดวยความเรว 200 รอบ/นาท เปนเวลา 10-12 ชวโมง จากนนดดใสหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร นาไปปนเหวยงทความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท ดดสวนใสทงเกบตะกอนไว จากนนสกด plasmid E. coli ดวย NucleoSpin® plasmid Kit โดยเตม P1 buffer ปรมาตร 250 ไมโครลตร ลงในหลอด Eppendorf ทมตะกอนอย ผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex เพอใหเซลล membrane แตก เตม P2 buffer ปรมาตร 250 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยกลบหลอดไปมาประมาณ 5 ครง เตม N3 buffer ปรมาตร 350 ไมโครลตร ผสมใหเขากน ปนเหวยงดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใสลงใน column สขาว ปนเหวยงดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท ทงสารละลายสวนใส เตม PE buffer ปรมาตร 500 ไมโครลตร ปนเหวยงดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท ทงสารละลายสวนใส นา column ไปปนเหวยงใหแหง ดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท นา column ทไดใสในหลอด Eppendorf เตมนากลนทฆาเชอแลว

1 x x x x 2 x x x x 3 x x x x 4 x x x x 5 x x x x

40

50 ไมโครลตร นาไปปนเหวยงดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท เปนเวลา 1 นาท ทง column สขาวเกบหลอด Eppendorf ทมสวน plasmid ของแบคทเรยไวเพอนาไปทา PCR ในขนตอนตอไป เตรยม master mix (ตาราง 7, 8) โดยแยกหลอดออกเปน 2 หลอด คอหลอดทผสมไพรเมอร T7 และ ไพรเมอร Sp6 ดดตวอยางทได 1 ไมโครลตร ลงในหลอด PCR ทผสม master mix ไวแตละหลอดแลว นาไปเขาเครอง PCR

ตาราง 6 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ในขนตอนการทา colony direct PCR

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) นากลนทฆาเชอแลว 10X PCR buffer dNTP ไพรเมอร T7 primerSp6 Taq (Blend Taq (TOYOBO))

3.72 0.5 0.5 0.1 0.1

0.08 ปรมาตรรวม 5

1. initial denaturation ทอณหภม 94OC เวลา 5 นาท 2. template denaturation ทอณหภม 94OC เวลา 30 วนาท

primer annealing ทอณหภม 50OC เวลา 15 วนาท extension ทอณหภม 72OC เวลา 1 นาท 3. primer extension ทอณหภม 72OC เวลา 5 นาท

ตาราง 7 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ในขนตอนการหาลาดบนวคลโอไทดโดยใชไพรเมอร T7

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) นากลนทฆาเชอแลว buffer ไพรเมอร T7 Big Dye template

13 3 1 2 1

ปรมาตรรวม 20

40 รอบ

41

ตาราง 8 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ในขนตอนการหาลาดบนวคลโอไทดโดยใชไพรเมอร Sp6

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) นากลนทฆาเชอแลว buffer ไพรเมอร Sp6 Big Dye template

13 3 1 2 1

ปรมาตรรวม 20 1. initial denaturation ทอณหภม 96OC เวลา 2 นาท 2. template denaturation ทอณหภม 96OC เวลา 30 วนาท

primer annealing ทอณหภม 50OC เวลา 15 วนาท extension ทอณหภม 60OC เวลา 4 นาท ดด PCR product ทไดลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร เตม sodium 2 ไมโครลตร และ 100% เอทานอล ทอณหภม 4OC ปรมาตร 50 ไมโครลตร นาไปผสมใหเขากนโดยเครอง Vortex เกบทอณหภม -30OC เปนเวลา 1 ชวโมง ปนเหวยงดวยความเรว 13,000 รอบ/นาท ทอณหภม 4OC เปนเวลา 30 นาท ดดสารละลายใสทง เตม 70% เอทานอล ทอณหภม 4OC ปรมาตร 300 ไมโครลตร ปนเหวยงดวยความเรว 13,200 รอบ/นาท ทอณหภม 4OC เปนเวลา 10 นาท ดดสารละลายสวนใสทง ผงตะกอนดเอนเอใหแหง จากนนนาไปหาลาดบนวคลโอไทด

2.3 การวเคราะหลาดบนวคลโอไทด และเปรยบเทยบลกษณะทางพนธกรรม เตม buffer Hi-Di TM formamide ปรมาตร 20 ไมโครลตร ลงในตะกอนดเอนเอ ผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex เพอใหดเอนเอแยกเปนสายเดยว จากนนเปลยนหลอด Eppendorf เปนหลอดสาหรบใชทา sequence นาไปบมทอณหภม 96OC เปนเวลา 3 นาท จากนนนาสารละลายดเอนเอไปตรวจสอบลาดบเบสดวยเครอง ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer โดยตงคาตางๆ ตามคมอการใชทบรษทผผลตแนะนา โดยเครองจะทางานประมาณ 3 ชวโมงตอการอานคา 1 ตวอยาง การทางานของเครองจะเปนไปแบบอตโนมต และบนทกผลโดยเครองคอมพวเตอรทตอกบเครองหาลาดบเบส ซงเมอเสรจสนการทางานของเครองแลวสามารถนาขอมลออกจากเครองคอมพวเตอร

30 รอบ

42

เพอใชในการวเคราะหผลตอไป โดยเปรยบเทยบขอมลนวคลโอไทดทไดทงหมดกบขอมลจาก National Center for Biotechnology Information (NCBI) ทเวปไซต http://www.ncbi.nlm.gov/Genbank เขาไปในสวนของ BLAST นาขอมลนวคลโอไทดวางลงในโปรแกรม เลอก nucleotide blast เลอก nucleotide collection (nr/nt) จากนนทาการ sequence alignment โดยเลอกท BLAST จะไดขอมลสาหรบการเปรยบเทยบนวคลโอไทดออกมา จากนนเลอกใหแสดงตาแหนงของกรดอะมโนเทยบกบขอมลของลาดบนวคลโอไทด โดยเลอก Reformat these results เลอก CDS feature เลอก view report จะไดขอมลของการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดและกรดอะมโน นาลาดบนวคลโอไทดทไดมาเปรยบเทยบความเหมอนกนระหวางลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน beta-tubulin ของทกตวอยาง โดยใชคอมพวเตอรโปรแกรม BioEdit และเปรยบเทยบความเหมอนกนระหวางกรดอะมโนของทกตวอยางโดยใชโปรแกรม CLUSTAL W การทดลองท 3: การทดสอบประสทธภาพของอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสในการยบยงการ

เจรญเตบโตเชอรา Colletotrichum sp และการจดจาแนกเชอแอคตโนมยซส

3.1 การเกบตวอยาง และการแยกเชอแอคตโนมยซสจากดน

เกบตวอยางดนจากบรเวณเขตอทยานแหงชาตดอยปย พนทสงกาแล และจากแปลงปลกพรกใน อ. สนทรายจานวน 7 ตวอยาง โดยเกบตวอยางใสถงพลาสตกใสตวอยางละ 1 กโลกรม ผงตวอยางดนใหแหงเปนเวลา 7-10 วน จากนนบดใหละเอยด กรองดวยตะแกรงขนาด 3 มลลเมตร นาไปอบฆาเชอโดยใชดนตวอยางละ 1 กรม ทอณหภม 2 ระดบคอ 60OC เปนเวลา 24 ชวโมง และ 120OC เปนเวลา 1 ชวโมง โดยดดแปลงจากวธการของ Li-Hua and Cheng-Lin (1996) นาตวอยางดนทอบฆาเชอแลวมาเกลยลงบนผวหนาอาหาร 4 ชนด ไดแก CSA (caseine starch agar), CA (chitin agar), OMA (oatmeal agar) และ SEA (soil extract agar) (ภาพ 8) โดยบมทอณหภมหอง เมอเชอเจรญสมเกบโคโลนทเจรญบนอาหารชนดตางๆ โดยนาโคโลนทไดมา streak ลงบนอาหาร CSAจากนน restreak เพอใหไดเชอบรสทธ และเกบในหลอดอาหาร Emerson’s agar (Rothrock and Gottlieb, 1981) เพอใชในการศกษาตอไป

43

3cm 1.5cm

ภาพ 8 การเกลยตวอยางดนลงบนผวหนาอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสชนดตางๆ

3.2 การทดสอบประสทธภาพของเชอแอคตโนมยซสในการยบยงการเจรญเตบโตของเชอรา Colletotrichum sp.

เลยงเชอแอคตโนมยซสไอโซเลทตางๆ ทแยกไดบนอาหาร glucose yeast malt agar (GYM) เนองจากอาหาร GYM เปนอาหารทเหมาะสมตอการเจรญของเชอแอคตโนมยซส และ เชอรา Colletotrichum sp. โดยใชไมจมฟนทผานการฆาเชอแลว แตะผงสปอรของเชอแอคตโนมยซส streak ลงบนผวหนาอาหาร โดยใหหางจากจดศนยกลาง 3 เซนตเมตร (ภาพ 9) ทาการทดลอง ไอโซเลทละ 3 ซา บมทอณหภมหองเปนเวลา 7 วน เพอใหเชอแอคตโนมยซสสามารถเจรญเตบโต และสรางสารทตยภม เนองจากเชอแอคตโนมยซสเจรญเตบโตชากวาเชอราสาเหต จากนนใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 มลลเมตร ทผานการฆาเชอแลวเจาะบรเวณขอบเสนใยของเชอรา Colletotrichum sp. เพอใชเปนชดทดสอบ สวนชดควบคมใหวางเชอราลงบนอาหาร GYM ทไมมเชอแอคตโนมยซส บมทอณหภมหองจนกวาเชอราในชดควบคมเจรญถงตาแหนงทวางเชอ แอคตโนมยซส บนทกผลโดยวดเสนผานศนยกลางโคโลนของเชอรา จากนนคานวณหาประสทธภาพของเชอแอคตโนมยซสในการยบย งการเจรญของเชอราสาเหต โดยคานวณหาเปอรเซนตการยบย ง

44

เชอแอคตโนมยซสไอโซเลท 1 เชอแอคตโนมยซสไอโซเลท 2 เชอราสาเหต

ชดควบคม ชดทดสอบ

ภาพ 9 การทดสอบประสทธภาพของเชอแอคตโนมยซส ในการยบย งการเจรญของเชอราสาเหต

โรคพช โดยวธ dual culture สตรคานวณเปอรเซนตการยบยง (percent inhibition of radial growth: PIRG)

เปอรเซนตการยบย ง =

โดยประมาณคาการยบยงดงน (เกษม, 2532) 3.3 การคดเลอกเชอแอคตโนมยซสทผลตเอนไซมไคตเนส

R1 = ความยาวรศมของโคโลน เชอราสาเหตในชดควบคม

R2 = ความยาวรศมของโคโลน เชอราสาเหตในชดทดสอบ

(R1-R2) × 100 R1

> 75 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งสงมาก 61-75 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งสง 51-60 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งปานกลาง < 50 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งต า

45

เตรยม colloidal chitin (Hsu and Lockwood, 1975) โดยละลายผงไคตนทไดจากเปลอกป (Fluka) 10 กรม ดวยกรดเขมขน H3PO4 ปรมาตร 100 มลลลตร เกบในตเยนทอณหภม 4 OC เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนเตมนาปรมาตร 500 มลลลตร ทงไวเปนเวลา 10 นาท ใชแทงแกวคนใหเขากน กรองดวยผาขาวบางและลางดวยนาสะอาดจนกวาจะได pH 6.2-7.2 นา colloidal chitin ทไดไปนงฆาเชอทอณหภม 121OC ความดน 15 ปอนด/ตารางนว เปนเวลา 20 นาท เกบรกษา colloidal chitin ทไดไวทอณหภม 4OC เพอใชในการเตรยม colloidal chitin agar ตอไป (ภาคผนวก ก) เตรยม 15% colloidal chitin agar (CCA) (Hsu and Lockwood, 1975) (ภาคผนวก ก) โดยเทลงในจานอาหารเลยงเชอทอบฆาเชอแลว จากนนใชไมจมฟนทอบฆาเชอแลวแตะผงสปอรของเชอแอคตโนมยซสทแยกไดจากดนอบฆาเชอทอณหภม 60OC เปนเวลา 24 ชวโมง และ 120OC เปนเวลา 1 ชวโมง ทมประสทธภาพในการยบย งการเจรญของเชอรา Colletotrichum spp.โดยคดเลอกเฉพาะไอโซเลททมเปอรเซนตการยบย งไดมากกวา 75% แตะลงบนอาหาร 4 จดตอ 1 จานอาหารเลยงเชอ (ทาการทดลองไอโซเลทละ 3 ซา) บมเชอทอณหภมหอง และสงเกตวงใส (clear zone) ทเกดขนบนอาหาร CCA บนทกผลการทดลองโดยวดขนาดเสนผานศนยกลางของวงใสทเกดขน

3.4 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสในการยบยงการเจรญเตบโตเชอรา Colletotrichum spp. นาเชอแอคตโนมยซสจานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34 SEA120-4, SEA120-28 และ SEA120-38 ทมประสทธภาพในการควบคมเชอรา Colletotrichum spp. สาเหตโรคแอนแทรคโนสพรก ซงมเปอรเซนตการยบย งเชอราสาเหตได 100% ในหองปฏบตการ และสามารถผลตเอนไซมไคตเนสบนอาหารแขง 15% colloidal chitin agar โดยเลยงเชอแอคตโนมยซสทง 6 ไอโซเลท ในอาหารเหลว enzyme production medium (EPM) (ภาคผนวก ก) ปรมาตร 50 มลลลตร ทมเปลอกกงเปนแหลงคารบอนในขวดชมพ (flask) ขนาด 250 มลลลตร โดยใช cork borer เจาะเชอแอคตโนมยซสทเลยงบนอาหาร glucose yeast malt agar (GYM) (ภาคผนวก ก) มาจานวน 10 ชน ลงในอาหารเหลว EPM นาไปบมทอณหภม 35OC เขยาดวยความเรว 150 รอบ/นาท เปนเวลา 15 วน จากนนนาอาหาร EPM ทเลยงเชอแอคตโนมยซสเปนเวลา 15 วน มาปนแยกเอาสวนตะกอนของเชอแอคตโนมยซสออก ดวยความเรว 6,000 รอบ/นาท ทอณหภม 4OC เปนเวลา 20 นาท นาสวนใสทไดเกบทอณหภม 4OC และอกสวนหนงนามากรองดวยชดกรองแบคทเรย (Minisart®) ขนาดเสนผานศนยกลางรกระดาษกรอง 0.2 ไมครอน (ดดแปลงจาก ศรลกษณ, 2542) เทอาหารเลยงเชอ PDA ลงบนจานอาหารเลยงเชอขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร โดยเทชนแรกใหมความหนาประมาณ 0.1 เซนตเมตร และชนทสองหนาประมาณ 0.5 เซนตเมตร

46

(double layer) รอจนผวหนาอาหารแหงใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร เจาะลงบนอาหารเลยงเชอหางจากเสนผานศนยกลาง 3 เซนตเมตร โดยเจาะ 4 ตาแหนงเพอใชสาหรบหยอดอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซส จากนนใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร ตดขอบโคโลนของเชอรา Colletotrichum spp. จานวน 5 ไอโซเลท ไดแก Cg24 (S), Cg49 (WR), Cc11 (MR), Cc53 (HR) และ Cg60 (HR) วางตรงกลางจานอาหารเลยงเชอ PDA ทเตรยมไว ใช ไมโครไปเปตดดอาหารเลยงเชอทไมกรองเชอแอคตโนมยซสออก (NF) และอาหารเลยงเชอทกรองเชอแอคตโนมยซสออก (F) อยางละ 20 ไมโครลตร หยอดลงในหลม สวนชดควบคมหยอดเชอ Bacillus subtilis ผลตภณฑทางการคา ตามอตราแนะนาเทากบ 1×109 CFU/g ปรมาตร 20 ไมโครลตร และอาหาร EPM ปรมาตร 20 ไมโครลตร (ภาพ 10) ทาการทดสอบไอโซเลทละ 3 ซา บมทอณหภมหอง และวดการเจรญของเชอราสาเหต จากนนนามาคานวนหาเปอรเซนตการยบย งดงน

สตรคานวณเปอรเซนตการยบยง (percent inhibition of radial growth: PIRG)

เปอรเซนตการยบย ง =

โดยประมาณคาการยบย งดงน (เกษม, 2532) เชอราทดสอบ

นากรองเลยงเชอแอคตโนมยซส นาเลยงเชอแอคตโนมยซส Bacillus subtilis (ทใชทางการคา) อาหารเลยงเชอแอคตโนมยซส EPM (enzyme production medium)

(R1-R2) × 100 R1

> 75 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งสงมาก 61-75 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งสง 51-60 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งปานกลาง < 50 เปอรเซนต = มประสทธภาพในการยบย งต า

R1 = ความยาวรศมของโคโลนเชอราสาเหตในชดควบคม R2 = ความยาวรศมของโคโลนเชอราสาเหตในชดทดสอบ

47

ภาพ 10 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสในการยบย งการเจรญของเชอ สาเหตโรคพช

3.5 การจาแนกชนดของเชอแอคตโนมยซส ศกษาและจาแนกชนดของเชอแอคตโนมยซส จานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34, SEA120-4 และ SEA120-28 ทสามารถยบย งการเจรญเตบโตเชอรา Colletotrichum spp. และผลตเอนไซมไคตเนสดวยเทคนค inclined coverslip โดยใช forcep จมแอลกอฮอลผานไฟฆาเชอคบกระจกปดสไลด (cover slip) ปลอดเชอปกลงในอาหารเปนมม 45 องศา ใหลกลงไปในเนอวนประมาณครงแผน ในแตละสวนของจานอาหารเลยงเชอ inhibitory mold agar (2IMA-2) (ภาพ 11) จากนนใช loop เขยเชอทตองการศกษาขดบนผวหนาอาหารบรเวณทสมผสกบกระจกปดสไลด บมทงไวทอณหภมหองจนกวาเชอเจรญบนอาหาร จากนนนากระจกปดสไลด ทไดมายอมสแบบ simple stain โดยหยดดวยสารละลาย 0.1% crystal violet ทงไวประมาณ 3 นาท ใชกระดาษทชชซบนาออกใหแหง นาไปตรวจดลกษณะสปอรภายใตกลองจลทรรศนทมกาลงขยาย 100X งามนจ (2539) โดยเปรยบเทยบลกษณะตางๆตามเอกสารของ Miyadoh (1997) และ Stanley et al. (1989) เพอจาแนกสกลของเชอแอคตโนมยซส

ภาพ 11 การเลยงเชอแอคตโนมยซสดวยเทคนค inclined coverslip เพอศกษาลกษณะสปอรของ เชอแอคตโนมยซส

3.5.1 การวเคราะหองคประกอบผนงเซลล diaminopimelic acid (DAP) ของเชอ แอคตโนมยซส

กระจกปดสไลด อาหาร IMA-2

3 cm

48

นาเชอแอคตโนมยซสจานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34, SEA120-4, SEA120-28 และ SEA120-38 มาวเคราะหหา diaminopimelic acid (DAP) ซงเปนองคประกอบภายในผนงเซลลของเชอแอคตโนมยซส (ดดแปลงจากวธการของ Lechevalier และ Lechevalier, 1970) โดยใชวธการแยกสของสารละลายมาตรฐานจากเทคนคโครมาโทกราฟ thin layer chromatography (TLC) เทยบกบสารละลายมาตรฐาน 0.01 M LL and meso – A2pm เลยงเชอแอคตโนมยซสในอาหารเลยงเชอ non-sporulating medium (ภาคผนวก ก) เชอเจรญเตบโตเตมทใชระยะเวลาประมาณ 1-2 สปดาห ใชปลาย loop ทผานการฆาเชอขดโคโลนของเชอแอคตโนมยซสทเจรญบนผวหนาอาหาร non-sporulating medium ประมาณ 100 มลลกรม ลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร ทบรรจ 6 N HCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex เปนเวลา 6 นาท นาไปนงฆาเชอ ท 120OC ภายใตความดน 15 ปอนด/ตารางนว เปนเวลาประมาณ 20 นาท แลวแยกสวนทเปนของเหลว (supernatant) โดยนาไปปนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท จะไดสารละลายทไดใชเปนตวอยางในการวเคราะห DAP จากนนหยดสารละลายตวอยาง 3 ไมโครลตร และสารละลายมาตรฐาน ปรมาตร 1 ไมโครลตร ลงบนฐานของ แผน TLC (TLC plate) จากนนนาแผน TLC ทไดแชใน TLC tank ทบรรจ solvent system (methanol-distilled:water:HCl 6 N:pyridine อตราสวน 80:26:4:10 v/v) โดยใชเวลาประมาณ 3-6 ชวโมง นาแผน TLC ออกมาทาใหแหงใน fume hood ประมาณ 3-5 นาท แลวฉดพนดวยสารละลาย 0.20% ninhydrin ใหทวแผน นาไปบมท 100OC เปนเวลา 5 นาท 3.5.2 การจาแนกชนดของเชอแอคตโนมยซสดวย 16S rDNA 3.5.2.1 การเตรยมเชอแอคตโนมยซส และ การสกดดเอนเอ เลยงเชอแอคตโนมยซสจานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34, SEA120-4, SEA120-28 และ SEA120-38 ใน flask ทบรรจอาหารเหลว yeast malt extract broth (YM broth) ปรมาตร 50 มลลลตร เขยาทความเรว 150 รอบ/นาท ทอณหภมหองเปนเวลา 7 วน ใชไมโครไปเปตดดเชอแอคตโนมยซสทเลยงในอาหารเหลว YM ปรมาตร 1 มลลลตร ใสในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร ปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใสทง เตม 10.3% sucrose in water ปรมาตร 1 มลลลตร เพอลางเซลล ปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใสทง เตม TSE-sucrose ปรมาตร 650 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยใชเครอง vortex เตม 500 mM EDTA ปรมาตร 50 ไมโครลตร เตม lysozyme (10 mg/ml in TSE-sucrose) ปรมาตร 200 ไมโครลตร บมในเครองเขยา (shaker) ทอณหภม 37OC เปนเวลา 40 นาท เตม proteniase K (5 mg/ml in TSE) ปรมาตร 100 ไมโครลตร บมในเครองเขยา ท

49

อณหภม 60OC เปนเวลา 30 นาท เตม 10% SDS ปรมาตร 100 ไมโครลตร บมในเครองเขยา ทอณหภม 60OC เปนเวลา 30 นาท จากนนนามาบมทอณหภม 95OC เปนเวลา 10 นาท แชไนโตรเจนเหลว 3 นาท บมทอณหภม 95OC เปนเวลา 10 นาท แชไนโตรเจนเหลว 3 นาท (ทาซากนประมาณ 5 ครงจนสงเกตเหนวาสารละลายทไดมความหนด) จากนนบมในเครองเขยาทอณหภม 37OC เปนเวลา 60 นาท นามาบมท 4OC เปนเวลา 12 ชวโมง จากนนปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 20 นาท ดดสารละลายทไดปรมาตร 800 ไมโครลตร ลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร ปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท (ถามตะกอนใหดดสวนใสใสลงในหลอด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร อกครง) เตมเอทานอล 800 ไมโครลตร กลบหลอดไปมาใหสารเขากนบมทอณหภม -80OC เปนเวลา 2 ชวโมง ปนเหวยงดวยความเรว 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 15 นาท ดดสวนใสทง จากนนผงตะกอนดเอนเอใหแหง และละลายตะกอนดเอนเอดวยนากลนทฆาเชอแลว ปรมาตร 10-20 ไมโครลตร

3.5.2.2 เพมปรมาณยนตาแหนง 16S rDNA ดวยเทคนค PCR (polymerase chain reaction)

นาดเอนเอของเชอแอคตโนมยซส จานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34, SEA120-4, SEA120-28 และ SEA120-38 มาเพมปรมาณดเอนเอตรงตาแหนงยน 16S rDNA ดวยเทคนค PCR โดยใชไพรเมอร 27f forward (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG -3′) และ 1492r reverse (5′-GGC TAC CTT GTT ACG ACTT-3′) โดยผสมสาร ดงตาราง 9

ตาราง 9 สวนผสมของปฏกรยา Polymerase Chain Reaction ในการเพมปรมาณบางสวนของยน 16S rDNA

50

สารประกอบ ปรมาตร (ไมโครลตร) 10x PCR buffer dNTP mix 27f 1492r DNA template นากลนทฆาเชอแลว Taq DNA Polymerase

5.0 5.0 1.0 1.0 1.0 36 1

ปรมาตรรวม 50

เมอเตมสวนผสมทกอยางครบแลว นาหลอด PCR tube ทเตรยมพรอมแลวไปเขาเครอง thermal cycler Programmable Thermal Controller PTC-200TM thermocycler (MJ Research, Inc., Watertown, MA) โดยกาหนดอณหภม และเวลาแตละขนตอนดงน

1. initial denaturation ทอณหภม 96OC เวลา 5 นาท 2. template denaturation ทอณหภม 94OC เวลา 1 นาท

primer annealing ทอณหภม 55OC เวลา 1 นาท extension ทอณหภม 72OC เวลา 2 นาท 3. primer extension ทอณหภม 72OC เวลา 3 นาท

จากนนตรวจสอบผลผลต PCR ดวยวธอเลกโทรโฟรซส โดยผสมผลผลต PCR ทไดกบ 6X loading dye ในอตราสวน 5:1 ไมโครลตร เทยบกบดเอนเอมาตรฐาน ซงใช λ DNA digested by Hind III ตอ 6X loading dye ในอตราสวน 8:2 ไมโครลตร จากนนตอเครองอเลกโทรโฟรซสเขากบเครองกาเนดไฟฟา ใชกระแสไฟ 100 โวลต เปนเวลา 40 นาท แลวนาเจลตรวจดภายใตแสง อลตราไวโอเลต และบนทกภาพ จากนนนาผลผลต PCR ทไดมา purification ดวยชด NucleoSpin®Extract II จากนนนาไปวเคราะหลาดบนวคลโอไทดดวยเทคนค 16S rDNA

3.5.2.3 วเคราะหหาระดบความสมพนธของเชอแอคตโนมยซส (phylogenetic)

เมอไดขอมลทเปนลาดบนวคลโอไทดของเชอแอคตโนมยซส นาขอมลทไดไปวเคราะหหา

35 รอบ

51

ชนดของเชอแอคตโนมยซส โดยอาศยฐานขอมลจากอนเทอรเนตของ National Center for Biotechnology Information ไปทเวปไซต http://www.GenBank.ncbi.nlm.nih.gov) และ Ribosomal Database Project (www.rdp.cme.msu.edu) โดยเลอก BLAST ในการคนหาและวเคราะหชนดของจลนทรย คดเลอกเชอทไดจากการวเคราะห เพอนามาเปนขอมลอางองในการทา phylogenetic tree จากนนนาขอมลทไดมาเขาโปรแกรม Phydit เพอจดเรยงขอมล (alignment) จากนนนาผลทไดไปวเคราะหหาระดบความสมพนธของเชอ ดวยโปรแกรม Treecon โดยกาหนดคา Bootstrap เทากบ 1000

การทดลองท 4: การทดสอบประสทธภาพของอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซส กบเมลดพนธพรก

และตนกลาพรก

4.1 การทดสอบประสทธภาพของอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสกบเมลดพนธพรก บนจานอาหาร เลยงเชอ เลยงเชอแอคตโนมยซสจานวน 6 ไอโซเลท ไดแก OMA60-1, OMA60-7, SEA60-34, SEA120-4, SEA120-28 และ SEA120-38 ในอาหารเหลว EPM (ภาคผนวก ก) ปรมาตร 50 มลลลตร ทมเปลอกกงเปนแหลงคารบอนในขวดชมพ (flask) ขนาด 250 มลลลตร โดยใช cork borer เจาะเชอแอคตโนมยซสทเลยงบนอาหาร glucose yeast malt agar (GYM) (ภาคผนวก ก) มาจานวน 10 ชน ลงในอาหารเหลว EPM นาไปบมทอณหภม 35OC เขยาดวยความเรว 150 รอบ/นาท เปนเวลา 15 วน จากนนนาอาหาร EPM ทเลยงเชอแอคตโนมยซสเปนเวลา 15 วน มาปนแยกเอาสวนตะกอนของเชอแอคตโนมยซสออก ดวยความเรว 6,000 รอบ/นาท ทอณหภม 4OC เปนเวลา 20 นาท นาสวนใสทไดเกบทอณหภม 4OC (อาหารเลยงเชอทไมกรองเชอแอคตโนมยซสออก (NF)) และอกสวนหนงนามากรองดวยชดกรองแบคทเรย Minisart® ขนาดเสนผานศนยกลางรกระดาษกรอง 0.2 ไมครอน (อาหารเลยงเชอทกรองเชอแอคตโนมยซสออก (F)) ดดแปลงจาก ศรลกษณ, 2542 นาเมลดพรกหนมพนธพนเมอง และพนธการคา ฆาเชอทผวเมลดตามวธการของ Errakhi et al. (2007) โดยแชในสารละลาย 2% sodium hypochlorite เปนเวลา 3 นาท ลางออกดวยน ากลนฆาเชอ 3-4 ครง ผงใหแหง จากนนนามาแชดวยอาหารลยงเชอแอคตโนมยซสชนด NF และ F

52

ไอโซเลท OMA60-7, SEA60-34 และ SEA120-28 โดยแชเมลดจานวน 100 เมลด ในแตละกรรมวธดงน

กรรมวธท 1: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธพนเมอง ในนากลนทฆาเชอแลว เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 2: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธการคา ในนากลนทฆาเชอแลว เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 3: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธพนเมอง ในอาหารเลยงเชอ EPM เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 4: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธการคา ในอาหารเลยงเชอ EPM เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 5: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน B. subtilis* ผลตภณฑทางการคา ตามอตรา

แนะนา เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 6: ชดควบคม แชเมลดพรกพนธการคา ใน B. subtilis ผลตภณฑทางการคา ตามอตรา

แนะนา เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 7: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน NF ไอโซเลท OMA60-7 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 8: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน F ไอโซเลท OMA60-7 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 9: แชเมลดพรกพนธการคา ใน NF ไอโซเลท OMA60-7เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 10: แชเมลดพรกพนธการคา ใน F ไอโซเลท OMA60-7เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 11: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน NF ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 12: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน F ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 13: แชเมลดพรกพนธการคา ใน NF ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 14: แชเมลดพรกพนธการคา ใน F ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 15: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ใน NFไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 16: แชเมลดพรกพนธพนเมอง ในF ไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 17: แชเมลดพรกพนธการคา ใน NF ไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 18: แชเมลดพรกพนธการคา ใน F ไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง * Basillus subtilis = อตราแนะนาเทากบ 1×109 CFU/g จากนนนาเมลดพนธพรกทผานการแชในอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสชนด NF และ F ไอโซเลทตางๆ มาผงใหแหงในตถายเชอ กอนนาไปเพาะบนกระดาษชน (blotter method) โดยนาเมลดพรกวางบนกระดาษเพาะในจานอาหารเลยงเชอขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร ซงภายในบรรจกระดาษกรอง Whatman No.1 จานวน 1 แผน ไวดานบนกระดาษฟาง 3 แผน ทชบน า

53

จนชมไวดานลาง วางเมลดพรกจานวน 25 เมลดตอจาน โดยทาการทดลอง 4 ซ า ตรวจสอบการงอกของเมลดพรก และวเคราะหหาเปอรเซนตการงอกเปรยบเทยบกบชดควบคม

4.2 การทดสอบประสทธภาพของอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสในการควบคมเชอรา Colletotrichum spp. กบตนกลาพรก ในสภาพโรงเรอน

4.2.1 การทดสอบกบตนกลาพรกทเมลดผานการแชในอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซส

นาเมลดพรกหนมพนธพนเมอง และพนธการคา มาฆาเชอทผวเมลดตามวธการของ Errakhi et al. (2007) โดยแชในสารละลาย 2% sodium hypochlorite เปนเวลา 3 นาท ลางออกดวยนากลนฆาเชอ 3-4 ครง ผงใหแหง จากนนนามาแชดวยอาหารลยงเชอทไมกรองเชอ แอคตโนมยซสออก (NF) และอาหารเเลยงเชอทกรองเชอแอคตโนมยซสออก (F) ไอโซเลท จานวน 3 ไอโซเลท ไดแก OMA60-7, SEA60-34 และ SEA120-28 จากนนนาเมลดพรกมาเพาะในดนทอบฆาเชอแลว ทดสอบการเกดโรคกบตนกลาพรกอาย 45 วน ทไดจากการเพาะเมลดพรกทแชในอาหารเลยงเชอแอคตมยซส โดยเตรยม spore suspension เพอใชเปน inoculum ของเชอรา Colletotrichum sp. ไอโซเลท Cg60 (HR) โดยเลยงเชอรา Colletotrichum sp. ไอโซเลท Cg60 (HR) บนอาหารเลยงเชอ PDA เปนเวลา 7 วน หรอจนกวาเชอราเจรญเตมจานอาหารเลยงเชอ จากนนเทนากลนทฆาเชอแลวปรมาตร 10 มลลลตร ลงบนผวหนาอาหารทมเชอราสาเหตเจรญอย ใชแผนสไลดขดโคโลนของเชอรา เพอใหสปอรของเชอราหลดออก จากนนกรองเอาเสนใยของเชอราสาเหตออกดวยผาขาวบางทผานการฆาเชอแลว ตรวจนบความเขมขนของสปอรเชอราดวย haemacytometer ปรบความเขมขนใหไดประมาณ 106 สปอร/มลลลตร ผสมสารจบใบ Tween-20 จานวน 3 หยด/10 มลลลตร เพอชวยในการกระจายตวของสปอรเชอรา และการเกาะตดผวใบพช จากนนพน inoculum บนตนกลาพรกททาแผลจานวน 20 แผล/ใบ โดยทา 4 ใบ/ตน กรรมวธละ 5 ซา จากนนใชถงพลาสตกคลมตนกลาพรกเพอรกษาความชน บนทกผลการเกดโรคภายหลงการปลกเชอราสาเหตเปนเวลา 10 วน และคานวนเปอรเซนตการเกดโรค วางแผนการทดลองแบบ Factorial in CRD สงเกตการเกดโรค บนทกอาการและประเมนความรนแรงของโรค จากนนนาขอมลทไดมาทาการวเคราะหทางสถต

การประเมนการเกดโรคโดยใหระดบตางๆ ดงน (สบศกด, 2540) ระดบ 0 = ไมแสดงอาการของโรค ระดบ 1 = จานวนแผลทเกดบนใบ 1-25%

54

ระดบ 2 = จานวนแผลทเกดบนใบ 26-50% ระดบ 3 = จานวนแผลทเกดบนใบ 51-75% ระดบ 4 = จานวนแผลทเกดบนใบ 76-100%

การคานวณหาเปอรเซนตการเกดโรค (สบศกด, 2540) เปอรเซนตการเกดโรค (%) = ผลรวมของการเปนโรคแตละระดบ x 100 จานวนตนพชทสม ระดบสงสดของการเปนโรค 4.2.2 การฉดพนอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสกบตนกลาพรก นาตนกลาพรกหนม พนธการคาอาย 45 วน มาทดสอบประสทธภาพของอาหารเลยงเชอทไมกรองเชอแอคตโนมยซสออก (NF) และอาหารเลยงเชอทกรองเชอแอคตโนมยซสออก (F) โดยฉดพนอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสกอน หรอหลงการปลกเชอรา Colletotrichum sp. ไอโซเลท Cg60 (HR) เปนเวลา 12 ชวโมง โดยเตรยม spore suspension ตามวธการในขอ 4.2.1 จากนนใชถงพลาสตกคลมตนกลาพรกเพอรกษาความชน กรรมวธในการทดลองมดงน

กรรมวธท 1: ชดควบคม ไมทาการปลกเชอรา Colletotrichum sp. กรรมวธท 2: ชดควบคม ทาแผล แลวปลกเชอรา Colletotrichum sp. สาเหตโรคแอนแทรคโนสพรก กรรมวธท 3: ชดควบคม ทาแผล แลวฉดพนอาหารเหลว EPM กรรมวธท 4: ชดควบคม ฉดพน B. subtilis ผลตภณฑทางการคา ตามอตราแนะนา เปนเวลา

12 ชวโมง แลวปลกเชอราสาเหต กรรมวธท 5: ชดควบคม ปลกเชอราสาเหตเปนเวลา 12 ชวโมง แลวฉดพน B. subtilis ผลตภณฑ

ทางการคา ตามอตราแนะนา เปนเวลา 12 ชวโมง กรรมวธท 6: ฉดพน NF ไอโซเลท OMA60-7 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 7: ฉดพน NF ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 8: ฉดพน NF ไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 9: ฉดพน F ไอโซเลท OMA60-7 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 10: ฉดพน F ไอโซเลท SEA60-34 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 11: ฉดพน F ไอโซเลท SEA120-28 เปนเวลา 12 ชวโมง ทาแผล และปลกเชอสาเหต กรรมวธท 12: ทาแผล และปลกเชอราสาเหต เปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน NF ไอโซเลท OMA60-7 กรรมวธท 13: ทาแผล และปลกเชอราสาเหต เปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน NF ไอโซเลท SEA60-34 กรรมวธท 14: ทาแผล และปลกเชอราสาเหต เปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน NF ไอโซเลท SEA120-28

55

กรรมวธท 15: ทาแผล และปลกเชอราสาเหต เปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน F ไอโซเลท OMA60-7 กรรมวธท 16: ทาแผล และปลกเชอราสาเหตเปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน F ไอโซเลท SEA60-34 กรรมวธท 17: ทาแผล และปลกเชอราสาเหต เปนเวลา 12 ชวโมง ฉดพน F ไอโซเลท SEA120-28 * Basillus subtilis = อตราแนะนาเทากบ 1×109 CFU/g

วางแผนการทดลองแบบ Factorial in CRD โดยทาการทดลองกรรมวธละ 3 ตน โดยทาแผล 4 ใบ/ตน จานวน 20 แผล/ใบ สงเกตการเกดโรค บนทกอาการและประเมนความรนแรงของโรค จากนนนาขอมลทไดมาทาการวเคราะหทางสถต

4.3 ทดสอบการกอใหเกดโรคของอาหารเลยงเชอแอคตโนมยซสกบตนกลาพรก ในสภาพโรงเรอน การทดสอบการเกดโรคของอาหารเลยงเชอทไมกรองเชอแอคตโนมยซสออก (NF) และอาหารเลยงเชอทกรองเชอแอคตโนมยซสออก (F) จานวน 6 ไอโซเลท โดยทาแผลตนกลาพรกทมอาย 45 วน จานวน 20 แผล/ใบ โดยทาแผล 4 ใบ/ตน กรรมวธละ 3 ตน หลงจากฉดพนดวย NF และ F ใชถงพลาสตกคลมตนกลาพรกเพอรกษาความชน

กรรมวธท 1: ชดควบคม ไมทาการปลกเชอรา Colletotrichum sp. กรรมวธท 2: ชดควบคม ฉดพนดวยอาหารเหลว EPM กรรมวธท 3: ฉดพนดวย NF ไอโซเลท OMA60-7 กรรมวธท 4: ฉดพนดวย F ไอโซเลท OMA60-7 กรรมวธท 5: ฉดพนดวย NF ไอโซเลท SEA60-34 กรรมวธท 6: ฉดพนดวย F ไอโซเลท SEA60-34 กรรมวธท 7: ฉดพนดวย NF ไอโซเลท SEA120-28 กรรมวธท 8: ฉดพนดวย F ไอโซเลท SEA120-28