บทท 3 วธด าเนนการวจย การเกบและเตรยมตวอยางพช

เกบตวอยางดอกดาวเรองสดทเหลอจากการเกบเกยวของเกษตกร หมบานเกาะฝาย อ.ขาณวรลกษบร จ.ก าแพงเพชร เกบเมอ เดอนธนวาคม พ.ศ 2557

เตรยมตวอยางดอกดาวเรองสด โดยน ามาแกะเอาเฉพาะกลบดอกแลวป นใหละเอยดดวยเครองป น

ภาพ 22 ตวอยางดอกดาวเรอง

เครองมอและสารเคม เครองมอ

เครอง เขยา เครอง ไมโครเพลท รดเดอร (รน SEECTROstar Nano บรษท ไซแอนตฟค โปรโมชน จ ากด) เครองระเหยสญญากาศแบบหมน (Rotary evaporator) (ยหอ Buchi รน R-124) เครอง ยวสเปกโตรโฟโตมเตอร (รน Lamda 25 บรษท Perkin Elmer) เครองไออา (รน Nicolet iS5 ยหอ Thermo Scientific) เครองชงวเคราะหทศนยม 4 ต าแหนง เครอง NMR 400 MHz ยหอ Bruker เครอง MS ยหอ Perkin Elmer เครองวด pH

สารเคม สารเคมทใชในงานวจย ไดแก 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) จากประเทศ

Germany, สารมาตรฐาน Gallic acid, เอทานอล (EtOH), เฮกเซน (Hexane) บรษท เวลลเคมคอลเซนเตอร, เอทลอะซเตท (EtOAc) บรษทททเค ซายเอนซ, โซเดยมคารบอเนต (Na2CO3), อลมเนยมคลอไรด (AlCl3.6H2O) reagent, ฮอรโมน จบเบอเรลลดแอซด บรษท ฟลาย เคมคลส จ ากด, สารละลายธาตอาหาร เอ บ บรษท เซยพานช พษณโลก , ซลกา เจล, 4-methoxy-benzaldehyde, H2SO4

24

วธการด าเนนการวจย ศกษาระบบตวท าละลายทเหมาะสมในการสกดสารประกอบฟลาโวนอยด

เนองจากพชแตละชนดมสารไมเหมอนกนท าใหการเลอกตวท าละลายทใชในการสกดตางกนดวย ดงนนจงตองศกษาหาระบบตวท าละลายทเหมาะสมเพอใหไดสารปรมาณมากและตรงเปาหมาย ส าหรบเปาหมายในครงนคอ สารประกอบฟลาโวนอยด โดยใชอตราสวนของตวท าละลายทตางกน ตวท าละลายทใชคอ เอทานอล เอทลอะซเตด และน า ในอตราสวนผสมท ต า ง ก น ด การเตรยมตวอยางดอกดาวเรองส าหรบศกษาระบบตวท าละลายทเหมาะสม เกบดอกดาวเรองน าหนกสด 2 กโลกรม เลอกและแกะเอาเฉพาะกลบดอก จากนนป นใหละเอยด เตรยมขวดรปชมพขนาด 250 ml 22 ใบ ใสดอกดาวเรองสดน าหนก 50 กรม ลงในแตละใบ (แตละความเขมขนท าสามซ า) จากนนใสตวท าละลายทเตรยมไว 11 ระบบ ดงตาราง 1 จ านวน 150 ml แสดงดงภาพ 23

ภาพ 23 ขนตอนการเตรยมตวอยาง

ตาราง 1 ระบบตวท าละลายทใชในการสกด

ล าดบ ระบบตวท าละลาย ล าดบ ระบบตวท าละลาย 1 100% EtOAc 7 20% H2O/EtOH 2 20% EtOH/EtOAc 8 40% H2O/EtOH 3 40% EtOH/EtOAc 9 60% H2O/EtOH 4 60% EtOH/EtOAc 10 80% H2O/EtOH 5 80% EtOH/EtOAc 11 100% H2O 6 100% EtOH

25

วธการสกด แบงเปน 2 ขนตอน คอการสกดแบบแชในระบบตวท าละลายทตางกนดวยเครองเขยา และน าสารสกดทไดมาสกดตอดวยการสกดแบบแบงสวนดวยกรวยสกด ตอนท 1 น าตวอยางทเตรยมไวมาสกดโดยใชเครองเขยา ทอณหภม 45 oC เปนเวลา15 ชวโมง เสรจแลวทงไวใหเยนสกคร น ามากรองดวยผาขาวบาง แลวน าไประเหยตวท าละลาย ออกดวยเครอง rotary evaporator จนเหลอเฉพาะน า แสดงดงภาพ 24

ภาพ 24 ขนตอนการสกดตอนท 1

ตอนท 2 น าชนน าทไดใสกรวยสกด 100 ml แลวสกดดวยตวท าละลาย 20%

EtOH/EtOAc 100 ml เนองจาก ระบบนเปนระบบทสามารถดงสารออกมาไดมากทสดและแยก

ชนกบชนน าได ท า 3 ครง แสดงดงภาพ 25

ภาพ 25 ขนตอนการสกดตอนท 2

ตวอยางทเตมตวท าละลายดวยระบบตางๆ สกดโดยใชเครองเขยา

น ามากรองดวยผาขาวบาง ระเหยตวท าละลายออกจนเหลอแตน า

น าชนน ามาสกดดวย 20% EtOH/EtOAc ระเหยตวท าละลายออกจะไดสารสกด

26

การศกษาปรมาณสารประกอบฟนอลรวม ดวยวธ Folin-Ciocalteu Colorimatric assay (Anna Pekal , Krystyna Pyrzynska. 2004) วเคราะหปรมาณสาร ประกอบฟนอลรวมของสารสกดทงหมด 11 ตวอยางดวยวธ Folin-Ciocalteu reagent ซงเปนสารละลายทมสเหลอง เมอเตมสารลงไป สารละลายจะเปลยนเปนสมวงหรอน าเงน โดยมขนตอนดงน

1. เตรยมสารสกดตวอยางทงหมด 11 ตวอยาง (10mg/ml) ปรมาตรทใช 20 µl 2. เตมสารละลาย 20% Na2CO3 ปรมาตรทใช 80 µl 3. เตมสารละลาย Folin Ciocalteu reagent ปรมาตรทใช 100 µl 4. ผสมใหเขากน ตงทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาทและวดคาการดดกลนแสงทความ

ยาวคลน 765 nm ดวยเครอง Microplate reade เทยบกบน ากลน น าคาทไดค านวณหาปรมาณสารประกอบฟนอลรวม เทยบกบกราฟมาตรฐาน Gallic acid

ภาพ 26 ขนตอนการศกษาปรมาณสารประกอบฟนอลรวม

การศกษาปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยดรวม โดยใชวธ Aluminium chloride colorimetric assay (Ordonez et al. 2006) การตรวจสอบหาปรมาณสารประกอบ ฟลาโวนอยดรวม ขนอยกบการกอตวของสารประกอบเชงซอน aluminium-flavonoid วดดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer

1. เตรยมสารสกดตวอยางทงหมด 11 ตวอยาง (10mg/ml) ปรมาตรทใช 1 mL 2. เตม 2%AlCl3 ปรมาตรทใช 0.5 mL 3. เตมน ากลน ปรมาตรทใช 0.5 mL 4. ทงไวอณหภมหอง 10 น. แลวน าไปวดทความยาวคลน 425 nm น าคาการดดกลน

แสงทไดไปค านวณหาปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยดรวมเทยบกบกราฟมาตรฐานของ Quercetagetin

27

ภาพ 27 ขนตอนการศกษาปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยดรวม

F ทดสอบฤทธตานอนมลอสระ การเตรยมสารสกด สารทไดจากการสกด 11 ระบบ ชงน าหนกแตละระบบ 10 mg ละลายดวยเอทานอล 1 ml การเตรยม DPPH (11.8 mg/100ml) 1) ชง DPPH ใส ขวดขนาดเลก 11.8 mg 2) ละลายดวยเอทานอล จนกวาสารจะละลายหมด โดยเตรยมใส Volumetric flask ขนาด 100 ml แลวปดดวยฟอยดใหสนทเพอปองกนแสง ด การทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดทงหมดโดยใช DPPH reagent ซงเปนสารละลายทมสมวง เมอเตมสารลงไป สารละลายจะเปลยนเปนสเหลอง วดคาการดดกลนทความยาวคลน 517 nm โดย

1. เตมเอทานอล 200,180,100,80 µl ตามล าดบ 2. เตมสารสกดตวอยางลงในเพลท (96-well plate) ปรมาตร 20 µl 3. เตมสารละลาย DPPH reagent ปรมาตร 100 µl ตงทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท

และวดคาการดดกลนแสง ดวยเครอง Microplate reader เทยบกบกราฟมาตรฐาน Gallic acid

ภาพ 28 ขนตอนการทดสอบฤทธตานอนมลอสระ

28

เปรยบเทยบผลของสารสกดดวยเทคนคทตางกนตอการเจรญเตบโตของผก กาดหอม น าระบบตวท าละลายทดทสดซงศกษามาแลวเบองตนจากการสกดเพอหาระบบตวท าละลายทเหมาะสมจากขอมลขอ 3.3.1 คอ 20%EtOH/EtOAc และ 60%H2O/EtOH ซงมปรมาณสารสกดมากทสด มปรมาณสารประกอบฟนอลรวมและสารประกอบฟลาโวนอยดรวมมากทสด สกดดวยเทคนคทตางกน คอ สกดแบบการองดวยไอน า สกดดวยเทคนคอลตราโซนก สกดดวยเทคนคไมโครเวฟ ซงวธการสกดเหลานเปนวธท งาย รวดเรว ประหยดคาใชจาย การเตรยมสารสกด 1. เกบดอกดาวเรองดงขอมลขอ 3.1 2. เตรยมตวอยางโดยแกะเอาเฉพาะกลบดอกแลวป นใหละเอยด ใสขวดขนาด 1000 ml 200 g ทงหมด 6 ขวด 3. เตมตวท าละลายเทคนคละ 2 ระบบ คอ 60%H2O/EtOH และ 20%EtOH/EtOAc 4. สกดดวยเทคนคทตางกน

องดวยไอน า 1 ชม.

ภาพ 29 เทคนคการสกดแบบการองดวยไอน า

สกดดวยเทคนคอลตราโซนก เปนเวลา 1 ชม

ภาพ 30 วธการสกดแบบอลตราโซนก

29

สกดดวยเทคนคไมโครเวฟ ก าลงไฟฟา 460 w เวลา 10 นาท

ภาพ 31 วธการสกดแบบไมโครเวฟ

5. กรองเอากากดอกดาวเรองออก 6. น าสารสกดทไดระเหยตวท าละลายออก 7. ไดสารสกดแลวน าไปชงน าหนกและเตรยมสารสกดทความเขมขน 0.4 mg/ml เพอใชส าหรบการทดสอบตอการเจรญเตบโตของผกกาดหอม ขนตอนการทดสอบสารสกดตอการเจรญเตบโตของผกกาดหอม การเพาะเมลด 1. เพาะเมลดในกระบะเพาะ โดยใชฟองน าส าหรบเพาะเมลด น าฟองน ามาแชน าและกดฟองน าใหน าซมทวทงฟองน า 2. ใสเมลดพนธทตองการเพาะลงในฟองน า โดยใหเมลดจมลงในฟองน าเพยงครงเมลด 3. เทน าลงในกระบะเพาะ รกษาระดบน าประมาณ 3/4 ของความสงของฟองน า 4. น ากระบะทลงเมลดแลวเกบใหพนแสงแดด เยน และชน โดยไมตองปดฝากระบะเพาะ 5. หลงจาก 1-2 วน สงเกตเมอเมลดเรมงอก ใหน ากระบะเพาะออกไปตากแดด เปนแดดตอน เชา แลวเกบเขาทรมโดยไมตองเกบในทมด ขนตอนการปลก 1. ท าตามขอ 5. ไปจนตนกลาไดอายประมาณ 7 วน นบจากวนทงอกโดยทกๆวนใหหมนเตมน า 3/4 ของฟองน า 2. ตนกลาอาย 8 วน สงเกตวาตนกลาเรมมใบท 3 งอกออกมาจากนนใหเตมสารละลายธาตอาหาร A,B 3. ท าตามขอ 2. ไปจนตนกลาอาย 14 วน โดยรกษาระดบสารอาหาร สงเกตวาตนกลาเรมมใบท 4 สมบรณ และมรากงอกออกมาจากฟองน า 4. น าตนกลาทงอกสมบรณแลวยายลงกลองปลก ซงปรมาตรรวม ตอ 1 กลอง คอ 8

30

ลตร ซงในการปลกตองมกลองส าหรบทดสอบสารและกลองทมสารควบคมซงม negative control และ positive control 5. ดแลเตมน า รกษาคา pH และคา EC ใหเหมาะสม

ภาพ 32 ตวควบคมในการปลกพช

ขนตอนการทดสอบสารสกด ดแลเตมน า รกษาคา pH ของสารละลายใหอยในชวง 5.5-6.5 และรกษาธาตอาหารคา EC ใหอยในชวง 0.8 - 1.2 ms/cm จนอายครบ 30 วน เตมสารทตองการทดสอบ(sample ความเขมขน 0.4 mg/ml, positive control) วดความสงของพช และเกบผกกาดหอมเมอผกครบ 45 วน ตวอยางการวเคราะหผล 1. วดความสงของผกกาดหอม เมอผกเจรญเตบโตได 15, 30 และ 45 วน โดยวดจากสวนเหนอดน 2. ชงน าหนกสด เกบผกกาดหอมเมอครบ 45 วน มาชงน าหนกสดโดยแยกสวนเหนอดน และสวนราก 3. ชงน าหนกแหง น าผกกาดหอมทไดไปอบใหแหงทอณหภม 45 oC จนแหงแลวชงน าหนกแหงโดยแยกสวนเหนอดนและสวนราก ศกษาองคประกอบทางเคมของดอกดาวเรองสด จาการศกษาระบบตวท าละลายทเหมาะสมและเทคนคการสกด ขอ 3.3.1, 3.3.2 พบวา ตวท าละลายทดคอ 60%H2O/EtOH และเทคนค คอ การองดวยไอน า ดงนน การศกษาในหวขอนจะเลอกเทคนคการแชหมก มาใชแทนการองดวยไอน า เนองจากตวอยางดอกดาวเรองทใชมปรมาณทมากและตองการปรมาณสารสกดทเพยงพอตอการศกษา ดอกดาวเรองสดเกบจากหมบานเกาะฝาย อ.ขาณวรลกษบร จ.ก าแพงเพชร เกบเมอ เดอนมกราคม พ.ศ. 2558 น าหนกประมาณ 10 กโลกรม น ามาแกะเอาเฉพาะกลบดอกแลวป นใหละเอยด แชหมกดวยตวท าลายปรมาตร 5.5 ลตร 1 สปดาห จากนน น ามากรองเอากากดอกดาวเรองออกแลวน าสารละลายทกรองไดไประเหยตวท าละลายออกจนเหลอเฉพาะน า น าชนน าทไดใสกรวยสกด แลวสกดดวยตวท าละลาย 20%EtOH/EtOAc ระเหยตวท าละลายออกดวยเครองระเหยความดนต าแบบหมนจะไดสารสกดหยาบเพอน าไปศกษาในขนตอนของการแยกดวยคอลมนโครมาโตกราฟตอไปแสดงดงภาพ 33

H2O H2O+ปย AB+Hormone H2O+สารสกด H2O+Hormone H2O+ปย AB

31

ภาพ 33 ขนตอนการสกดเพอศกษาองคประกอบทางเคม การแยกดวยเทคนคคอลมนโครมาโตกราฟ

1. เลอกขนาดของคอลมนใหเหมาะสมกบน าหนกของสารสกด 2. น าสารสกดทได 20.08 g มาคลกกบซลกาเจลจนซลกาเจลแหงเปนผง 3. เฟสคงท คอ ซลกาเจล โดยผสมเฟสคงทกบตวท าละลาย 60%EtOAc/Hexane จน

มลกษณะขนเหลว 4. คอยๆเทเฟสคงท ทเตรยมไวลงในคอลมนทมส าลอดทปลายดานในโดยระวงไมให

ตวท าละลายไหลออกและควรเคาะคอลมนเบาๆ เพอไลฟองอากาศออกใหหมด 5. ปลอยใหเฟสคงทนอนกน (โดยท าจนไดความสงของเฟสคงทสงตามตองการ) 6. เปดใหตวท าละลายไหลออกจนเหลอพอกบทจะบรรจสารสกดตวอยางลงไป 7. บรรจสารสกดทเตรยมไดจากขอ 2. ลงในคอลมนแลวเปดใหตวท าละลายไหลลงจน

ผวหนาเกอบแหง แลวชะสารในคอลมนดวยตวท าละลายเลกนอยท าซ าจนแนใจวาสารตวอยางถกลางลงสเฟสคงทหมดแลว จากนนเตมตวท าละลายไดมากๆ

8. เกบและรวม Fraction โดยตรวจสอบดวย UV-visible และ anisaldehyde reagent

32

ภาพ 34 รปการแยกสารสกดดวยเทคนคโครมาโตกราฟ

การพสจนโครงสรางสารทแยกไดดวยเทคนคทางสเปกโทรสโกป 1. Infrared Spectroscopy(IR) น าสารบรสทธทแยกไดตกสารเพยงเลกนอยวางบนชองวางส าหรบวางสารจากนนวดดวยเครอง Infrared Spectroscopy

ภาพ 35 ขนตอนการวดสารบรสทธดวยเทคนค IR

2. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) น าสารบรสทธทแยกไดใสขวดขนาดเลกประมาณ 1-10 mg ละลายดวยตวท าละลายส าหรบ NMR เชน CDCl3, CD3CD, DMSO-d6 แลววดดวยเครอง NMR วเคราะหผลโครงสรางจาก NMR spectrum (1H-NMR, 13C-NMR)

3. Mass spectroscopy น าสารบรสทธทแยกไดใสขวดขนาดเลกประมาณ 0.5 mg ละลายดวยตวท าละลายส าหรบ MS แลววดดวยเครอง MS วเคราะหผลโครงสรางจาก MS โดยยนยงผลจาก IR และ NMR

33

ศกษาผลของสารสกดและสารบรสทธตอสารควบคมการเจรญเตบโตของพช การศกษาประกอบดวยหวขอดงน การปลกพชมวธปลกเหมอนกนกบขอมลขอ 3.3.2.2 แตกตางกนในสวนของการใสสารและความเขมขนของสารสกดและสารบรสทธ 1. ศกษาความเขมขนทตางกนของฮอรโมน(0.004, 0.02 และ 0.04 mg/ml) สารสกด(0.2, 0.3และ 0.4 mg/ml)

2. สารสกด(0.4 mg/ml) และสารบรสทธ(0.02 และ 0.04 mg/ml)

ฤทธตานอนมลอสระของผกกาดหอมทไดจากการปลกดวยสารสกดดอกดาว เรองโดยวธไฮโดรโปนกต ทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดทงหมดโดยใช DPPH reagent วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 517nm โดยใชสารมาตรฐาน Gallic acid เปนสารมาตรฐาน เตม เอทานอล 200,180,100,80 µl ตามล าดบ เตมสารสกดตวอยาง(10mg/ml) ลงในเพลท (96-well plate) ปรมาตร 20 µl เตมสารละลาย DPPH reagent ปรมาตร 100 µl ตงทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาทและวดคาการดดกลนแสง ดวยเครอง Microplate reader วธการเตรยมตวอยางผกเพอทดสอบฤทธ 1. อบผกใหแหงทอณหภม 45 ºC 2. ป นผกทแหงใหละเอยด 3. สกดดวยเอทานอลเปนเวลา 2 สปดาห ในอตราสวน (1 g / 6 ml) วธการเตรยมตวอยางเพอทดสอบฤทธ 1. ปเปตสารสกดผก 1 ml ใส eppendorf tube รอใหแหง 2. ชงน าหนกสารทแหงแลวเตมเอทานอล 10 mg/ml 3. น าไปทดสอบฤทธตานอนมลอสระหาคา %Inhibition แสดงดงภาพ 36

34

ภาพ 36 ขนตอนการเตรยมตวอยางผกกาดหอมเพอทดสอบฤทธตานอนมลอสระ การศกษาปรมาณสารทถกพชดดซมของสารสกดน าทใชในการปลกผกกาดหอมดวยระบบไฮโดรโปนกส (เรมตนและสดทายจากการเกบผก) จากการศกษาปรมาณสารทถกพชดดซมของสารสกดน าทใชในการปลกผกกาดหอมทไดจากการเกบน าจากกลองทปลกผกกาดหอม 2 ครง คอตอนใสสารสกด(เรมตน) และหลงจากการเกบผก(สดทาย) สารละลายมาตรฐานคอ Quercetagetin วดดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer สารสกดตวอยางหรอสารมาตรฐาน 1 mL เตม 2%AlCl3 0.5 mL น ากลน 0.5 mL ทงไวอณหภมหอง 10 น. วดทความยาวคลน 425 nm และน าคาการดดกลนแสงทไปค านวณหาปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยดรวมเทยบจากกราฟสารละลายมาตรฐานของ Quercetagetin

ผกอบจนแหง ป นใหละเอยด

วดดวยเครอง Microplate

rEtOAcder

สกดดวยตวท าละลาย เอทานอล

ปเปตสารสกดใส eppendorf ทงไวใหแหง

ชงน าหนกแลวละลายดวยเอทานอล

อบผกใหแหงแลวป นใหละเอยด

วดดวยเครอง Microplate

rEtOAcder

35

ภาพ 37 การทดสอบปรมาณสารของน าผกกอนและหลงปลก

ระเหยตวท าละลาย ไดสารสกดน าสาร

สกดทดสอบคาการดดกลนแสงดวย

UV-vis Spectrophotometer

น าผกเรมตนและสดทาย สกดดวย Ethanol:Ethyl acetate