ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การศกษาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมา

สาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง Study on nucleotide sequence of SecY gene of Phytoplasma associated with Sunn hemp

phyllody (Crotalaria juncea)

โดย

นางสาวสจณณา เดชะพรรค

ควบคมและอนมตโดย

.………………………………………….. วนท ........เดอน ........................พ.ศ. ............. (ผชวยศาสตราจารยสภาพร กลนคง)

การศกษาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมา สาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง

นางสาวสจณณา เดชะพรรค

บทคดยอ

โรคแตกพมฝอยทเกดจากเชอไฟโตพลาสมาทพบในปอเทอง กอใหเกดความเสยหายตอปอ

เทอง โดยแสดงอาการแตกของตายอดและตาขางมากกวาปกต จากการส ารวจเกบตวอยางปอเทองในแปลงทแสดงอาการแตกพมฝอยมาจ าแนกและจดกลมเชอสาเหตโรคแตกพมฝอย โดยการสกดดเอนเอจากแพงพวยทท าการปลกเชอและสงเคราะห SecY gene ของเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR) โดยใชไพรเมอร AYsecYF1 / AYsecYR1 ทจ าเพาะตอยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมา พบวาสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดขนาดประมาณ 1.3 กโลเบส น าชนสวนดเอนเอมาท าการโคลนและวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทด เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาทเปนตวแทน 4 กลม ทมรายงานใน GenBank จดกลมหาความสมพนธทาง phylogenetic tree ผลการวเคราะหไดล าดบนวคลโอไทด 1,360 นวคลโอไทด เมอน ามาเปรยบเทยบขอมลล าดบนวคลโอไทดของเชอไฟโตพลาสมาทง 4 กลม พบวาเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง อยในกลมเดยวกบ Aster yellows ทมคาความเหมอนเทากบ 92 เปอรเซนต ค าส าคญ : ไฟโตพลาสมา, โรคแตกพมฝอย, ปอเทอง, ยน SecYและการวเคราะหล าดบ นวคลโอไทด ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ผชวยศาสตราจารยสภาพร กลนคง ปทพมพ : 2550 จ านวนหนา : 39

Study on nucleotide sequence of SecY gene of Phytoplasma associated with

Sunn hemp phyllody (Crotalaria juncea)

Miss Sujinna Dachapak

Abstract

Sunn hemp phyllody caused by phytoplasma is one of a important disease of sunn hemp.. Sunn hemp showing phyllody symptom was collected and transmitted to periwinkle by dodder (Cuscuta sp.). A DNA fragment about 1.3 kb was amplified from DNA extract of infected periwinkle by Polymerase Chain Reaction (PCR) with SecY specific primer, AYsecYF1 / AYsecYR1. The fragment were ligated and transformed to E.coli strain DH5. The DNA fragment was sequenced after cloning is 1,360 bp. The nucleotides were compare with 4 groups of SecY that had reported in GenBank (SecYI, SecYIV, SecYV and SecYXII groups). Phylogenetic tree showed that the phytoplasma associated with sunn hemp phyllody closely related to SecYI group (Aster yellows) at 92 percent similarity levels. Key words : Phytoplasma, Phyllody, Sunn hemp, SecY gene and Nucleotide Sequencing Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture Kamphaeng Saen, Kasetsart University Advisor : Assistant Professor Supaporn KlinKong Year : 2007 Page : 39

ค านยม

ขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารยสภาพร กลนคง อาจารยทปรกษาปญหาพเศษในความกรณาใหความร ค าปรกษา ค าแนะน า ชวยเหลอการท าปญหาพเศษดวยความเอาใจใสอยางดยง ชแนะแนวทางในการหาขอมลเพอประกอบการท าปญหาพเศษและตรวจทางแกไขปญหาพเศษใหมความถกตองมากยงขน ขอขอบพระคณอาจารยทกทานในหลาย ๆ วชาทชวยอบรมสงสอน ใหความรตาง ๆ จนขาพเจาประสบความส าเรจในการศกษา ขอขอบคณ ศนยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทอ านวยความสะดวกใหความอนเคราะห สถานท อปกรณ เครองมอในการท างานวจย ขอขอบคณ คณกลนท ศรจนทรอนทร ทใหความชวยเหลอและเปนทปรกษาในการท าปญหาพเศษมาโดยตลอด ตลอดจนพๆ เจาหนาทหองปฏบตการทดลองภาควชาโรคพช เพอน ๆและนอง ๆ ทคอยเปนก าลงใจชวยเหลอการท าปญหาพเศษครงนดวย สดทายนขอกราบขอบพระคณ คณพอ คณแมและพสาวทสนบสนนการศกษา และเปนก าลงใจอนส าคญยงของขาพเจาเสมอมา สจณณา เดชะพรรค มนาคม 2551

สารบญ

เรอง หนา สารบญ (1) สารบญตาราง (2) สารบญภาพ (3) ค าน า 1 วตถประสงค 2 การตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการทดลอง 18 ผลการทดลอง 25 วจารณผลการทดลอง 31 สรปผลการทดลอง 32 เอกสารอางอง 33

(1)

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1. ตารางแสดงคาการวเคราะหความตางของกลมของเชอไฟโตพลาสมา 29 สาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองและตวแทนกลมเชอ 4 กลม

(2)

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1. ภาพโครงสรางแสดงแผนทวงกลม pGEM®- T Easy Vector 21 2. การเพมปรมาณของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอย 26 ของปอเทอง โดยใชไพรเมอร AYsecYF1 / AYsecYR1 จากเทคนค PCR 3. ล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอย 28 ของปอเทอง 4. Phylogenetic tree แสดงความสมพนธของล าดบนวคลโอไทดของยน SecY 30 ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองกบขอมลของเชอ ไฟโตพลาสมาทมรายงานใน Genbank

(3)

ค าน า ปอเทอง (Crotalaria juncea) สามารถพบเหนไดทวไปในประเทศไทยและประเทศเขตรอน เนองจากปลกไดดในสภาพทวไป ทนแลง สภาพพนทเปนทดอน (มกดา, 2548) ปอเทองเปนพชบ ารงดนทส าคญอกประเภทหนง ประโยชนของปอเทองไดแก นยมปลกเพอเปนปยพชสดโดยปลกกอนปลกพชหลก 50-65 วนแลวไถกลบ เนองจากปอเทองใหธาตไนโตรเจนประมาณ 10-20 กโลกรม/ไร มกปลกในชวงฤดฝน ปลกเพอใชในอตสาหกรรมกระดาษ เนองจากล าตนแหงของปอเทองมลกษณะของเยอกระดาษทด ปลกเพอเปนอาหารสตวและยงปลกเปนสถานททองเทยวเพอเพมรายไดใหกบทองถนอกดวย ปอเทองมโรคทเกดจากหนอนและแมลงเปนพาหะของโรค โดยตนปอเทองทเปนโรคจะแสดงอาการใบเหลอง แตกยอดมากและใบมขนาดเลกกวาปกต ปลองสน ลกษณะอาการดงกลาวบงชวาปอเทองถกเชอไฟโตพลาสมาเขาท าลายในปรมาณมากพอท าใหพชแสดงอาการออกอยางชดเจน แมวาปอเทองจะไมใชพชเศรษฐกจทส าคญ แตกมความใกลชดและมความสมพนธกบพชเศรษฐกจทส าคญอกหลาย ๆ ชนด ดงนนหากปอเทองไดรบเชอไฟโตพลาสมา อาจถายทอดโรคไปยงพชเศรษฐกจทอยในบรเวณใกลเคยงและกอใหเกดความเสยหายทางเศรษฐกจได ในปจจบนยงมผศกษาเกยวกบเชอไฟโตพลาสมาในปอเทองนอยมาก ประกอบกบวธการตรวจวนจฉยโรคทมความยงยากและใชเวลานาน รวมทงไมสามารถระบชนดและสายพนธของเชอไฟโตพลาสมา จงไดท าการทดลองศกษาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง โดยใชเทคนคทางชวโมเลกล การสกดดเอนเอจากตวอยาง การเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR การโคลนชนสวนดเอนเอ และการหาล าดบนวคลโอไทด เขามาชวยในการจดกลมเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง และบอกความแตกตางของเชอไฟโตพลาสมาในปอเทองกบเชอไฟโตพลาสมากลมอน ๆ โดยผลการทดลองสามารถน าไปเปนขอมลเบองตนเพอพฒนาเปนชดตรวจสอบ (ชด Kit) ประยกตวธการในการตรวจสอบ รวมถงการสรางไพรเมอรทมความจ าเพาะกบเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองไดอกดวย

วตถประสงค

เพอศกษาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง เพอใชจ าแนกชนด และเพอเปรยบเทยบความสมพนธของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง

สถานทท าการทดลอง

หองปฏบตการโรคพช อาคารปฏบตการวจยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาท าการทดลอง

มนาคม 2550 ถง กมภาพนธ 2551

การตรวจเอกสาร

ลกษณะทวไปของปอเทอง ชอวทยาศาสตร : Crotalaria juncea วงศ : FABACEAE ชอสามญ : Sunn hemp, ปอเทอง

เปนพชดงเดมในเขตรอนมประมาณ 600 ชนด สวนใหญพบในทวปอเมรกา จดเปนพชตระกลถว (Leguminosae) (กรมพฒนาทดน, 2541) มชอสามญวา Sunn hemp ชอวทยาศาสตร คอ Crotalaria juncea เปนพชตระกลถวตามประวตครงแรกน าเขามาจากประเทศฟลปปนส กอนพ.ศ. 2485 ปลกครงแรกทแมโจ จงหวดเชยงใหม (กรมพฒนาทดน, 2550) ลกษณะทางพฤกษศาสตร ปอเทอง (Crotalaria juncea) เปนพชฤดเดยว ล าตนตงตรงแตกกงกานสาขามากสงประมาณ 180 - 300 เซนตเมตร ใบเปนใบเดยวยาวร ชอดอกเปนแบบราซม (racemes) ซงอยปลายกงกาน สาขา ประกอบดวยดอกยอย 8 -20 ดอก ดอกสเหลองมการผสมขามฝกเปนทรงกระบอกยาว 3 - 6 เซนตเมตร กวาง 1 - 2 เซนตเมตร หนงฝกมประมาณ 6 เมลด เมอเขยาฝกแกจะมเสยงดงเนองจากเมลดกระทบกนเมลดมรปรางคลายหวใจสน าตาลหรอด า เมลดหนงกโลกรมจะมเมลดจ านวน 40,000 - 50,000 เมลด หรอหนงลตรจะมประมาณ 34,481 เมลด (กรมพฒนาทดน, 2541) ลกษณะทางพชไร สภาพภมอากาศและดน ปอเทองขนไดดในสภาพอากาศทว ๆ ไป ทนแลง สภาพพนทเปนทดอน การระบายน าด (มกดา, 2548) ปอเทองสามารถขนไดในดนเหนยว ดนรวน ดนทราย หรอดนลกรง แตไมชอบขนในดนทชนและมน าขง พนธ มอยเพยงชนดเดยวทใชประโยชนอยในไทยขณะน (กรมพฒนาทดน, 2541)

ฤดปลก ในกรณทปลกเพอไถกลบเปนปยพชสดในรปแบบของพชหมนเวยนสลบกบพชหลก จะปลกในชวงตนฤดฝน กอนปลกพชหลกประมาณ 2.0-2.5 เดอน ในระบบพชแซมจะปลกพชหลกกอนประมาณ 1-2 สปดาห ในระบบพชเหลอมฤด จะปลกปอเทองในระยะใกลหรอรอการเกบเกยว แตในกรณทปลกเพอเกบเมลดพนธ จ าเปนอยางยงทจะตองก าหนดชวงปลกใหเหมาะสมมฉะนนจะไดผลผลตนอยหรอไมไดเลย โดยทวไปในภาคตะวนออกเฉยงเหนอจะปลกเดอนสงหาคม-กนยายน ในภาคกลางควรปลกปลายฤดฝนชวงเดอนกนยายน-ตลาคม (กรมพฒนาทดน, 2541)

การขยายพนธ ปอเทองขยายพนธโดยใชเมลด เมลดปอเทองงอกงาย มเปอรเซนตความ

งอกทวไปคอนขางสง การเตรยมดนและการปลก การเตรยมดนมความส าคญมากตอการใหผลตอบแทนทงในรป

ของปยพชสดและเมลดพนธ การปลก ทใชปฏบตกนม 3 วธดงน

1.ปลกแบบหวานเปนวธทสะดวก ประหยดเวลาและแรงงาน โดยการน าเอาเมลดพนธทเตรยมไวหวานลงในแปลงใหทว ในอตรา 5 กโลกรมตอไร

2. ปลกแบบโรยเปนแถว โดยใชเมลดโรยลงในแถว ระยะระหวางแถว 75 เซนตเมตร เมอโรยเมลดลงในแถวแลวกลบเมลดดวยดนบาง ๆ ใชอตราเมลด 3-5 กโลกรมตอไร การปลกโดยวธนคอนขางชาและสนเปลองแรงงานกวาวธแรก แตไดปอเทองทขนเปนแถวอยางมระเบยบ 3. ปลกแบบหยอดเปนหลมวธนลาชาและไมสะดวกในทางปฏบตอกทงยงสนเปลองแรงงาน ไมเปนทนยมใชในกรณทมเมลดพนธจ ากดมากใชระยะปลก 50x100 เซนตเมตร หยอด 2-3 เมลดตอหลม ใชอตราเมลด 1-3 กโลกรมตอไร หลงจากปอเทองออกดอกชวงอายประมาณ 50-60 วนกไถกลบ การไถกลบควรท าขณะทมความชนอยในดนพอสมควร

การปลกเพอเกบเมลดพนธ จะตองมการเตรยมดนทด โดยการไถ 1 ครง ทงไวประมาณ 1 สปดาห เกบวชพชในแปลงออกใหหมด และไถแปรตามหรอคราดอกครง เมอความชนในดนพอเหมาะกปลกได การปลกเพอเกบเมลดพนธท าไดหลายวธ ดงน 1. ปลกแบบโรยเปนแถว ระยะระหวางแถว 75-100 เซนตเมตร ใชอตราเมลด ประมาณ 3-5 กโลกรมตอไร 2. หยอดเปนหลม หลมละประมาณ 3-5 เมลด ระยะระหวางตน 50-75 เซนตเมตร ใชอตราเมลด 3-5 กโลกรมตอไร การดแลรกษา เมอปอเทอง 2-3 สปดาห ท าการแยกใหเหลอหลมละ 1-2 ตน พรวนดนกลบโคนตน ก าจดวชพช และใสปยทเนนฟอสฟอรสตามสตรทกรมวชาการเกษตรแนะน า คอ สตร 3-9-6 หรอสตรใกลเคยง ในอตรา 20-25 กโลกรมตอไร ปอเทองเปนพชทตอบสนองตอปยฟอสฟอรสไดด ดงนนอาจใชเพยงปยฟอสฟอรสหรอหนฟอสเฟตในอตรา 5-10 กโลกรมตอไร พนยาปองกนและก าจดวชพช เพอปองกนหนอนกนใบและฝก นอกจากนปอเทองยงมโรคทเกดจากไวรส โดยมแมลงเปนพาหะ ลกษณะอาการคอ ใบจะเลก ดอกเปนฝอย ไมตดฝก สามารถปองกนไดโดยหลกเลยงการปลกซ าพนทเดม ควรมการตรวจหนอนและแมลงใหทวแปลง ตงแตเรมออกดอกไปจนถงระยะตดเมลด โดยตรวจดตอนเชากอนมแสงแดด

การใชประโยชน ปลกเพอใชเปนปยพชสด นยมปลกเปนปยพชสดในสภาพพนทดอน โดยปลกในรปแบบของพชหมนเวยน โดยหวานหรอโรยเมลด กอนการปลกพชหลก เชน ขาวโพด มนส าปะหลง ออย เปนตน อยางนอย 2.0-2.5 เดอน แลวไถกลบปอเทองทอายประมาณ 50-60 วน ในขณะทดนยงมความชนแลวทงไว 7-10 วน กอนปลกพชหลก หรออาจปลกปลกในรปแบบของพชแซม โดยปลกระหวางแถวพชหลก ปลกหลงจากพชหลกประมาณ 1-2 สปดาห หรอในรปแบบการปลกพชเหลอมฤด โดยปลกปอเทองเปนพชทสอง ระหวางแถวของพชหลกในขณะทพชหลกยงไมไดเกบเกยว แตใกลระยะหรอรอเกบเกยว เพอเปนการประหยดเวลาตอเนองระหวางการปลกปอเทองเพอเปนปยพชสดกบพชหลก สามารถปลกพชหลกในเวลาถดไปไดทนฤดกาลในขณะดนมความชนอย และปอเทองจะเปนพเลยงใหกบพชหลกทปลกในระยะแรกเรม ปอเทองใหน าหนกสดประมาณ 1.5-3.0 ตน/ไร ใหธาตไนโตรเจนประมาณ 10-20 กโลกรม/ไร เทยบกบปยยเรยและแอมโมเนยซลเฟตไดประมาณ 23-48 และ 47-95 กโลกรม หรอมเปอรเซนต ไนโตรเจน, ฟอสฟอรส และโพแทสเซยม ประมาณ 2.00-2.95, 0.30-0.40 และ 2.20-3.00 ตามล าดบ อยางไรกตามน าหนกมวลชวภาพและปรมาณธาตอาหารขนกบปจจยของดนและการจดการ

ปลกเพอเกบเมลดพนธ การปลกปอเทองเพอเกบเมลดพนธนยมปลกในสภาพพนทดอน โดยปลกหมนเวยนกบพชหลกในชวงฤดฝน ขอควรระวงในการผลตเมลดพนธปอเทองกคอ ตองปลกในชวงทเหมาะสมและหลกเลยงฝนปรมาณมากในชวงทเรมออกดอก ตดฝกและเกบเกยว มฉะนนจะไมไดผลผลตหรอไดนอยมาก เพราะปอเทองจะถกรบกวน โดยศตรพชมาก อายเกบเกยวประมาณ 120-150 วน ใหผลผลตเฉลย 80-120 กโลกรม/ไร

ปลกเพอใชในอตสาหกรรม ท ากระดาษโดยใชล าตนแหงสงโรงงานท ากระดาษ ซงเปนเยอ

กระดาษด (กรมพฒนาทดน, 2541)

ไฟโตพลาสมา ไฟโตพลาสมา (phytoplasma)เปนจลนทรยโปรคารโอท เดมรจกกนในชอของ มายโค พลาสมา (Mycoplasma-like organism ; MLO) จดอยใน Class Mollicutes (สพฒน,2528 ; Freundt, 1981) ในป ค.ศ. 1995 เปลยนชอเปนเชอไฟโตพลาสมาและจดอยในยนส Phytoplasma โดยขอตกลงของ International Committee on Systematic Bacteriology (ICSB, 1995) และตอมาในป ค.ศ. 1997 ไดมการเสนอใหจดล าดบโดยมชอยนสเปน Candidatus Phytoplasma เชนเดยวกบทมรายงานในเชอไฟโคพลาสมา 4 ชนด คอ Ca. phytoplasma aurantifolia, Ca. Phytoplasma australiense, Ca. Phytoplasma Australia และ Ca. phytoplasma fraxini (ICSB, 1997) ในปจจบนมการศกษาความสมพนธทางววฒนาการและสามารถจดจ าแนกเชอไฟโตพลาสมาไดถง 27 ชนด (Lee และคณะ, 1994, 2000 and Seemuller และคณะ, 1994, 1998) ในการจดกลมเชอไฟโตพลาสมา อาศยขอมลล าดบนวคลโอไทดของยน โดยขอตกลงของ International Research Program on Comparative Mycoplasmology (IRPCM, 2004) ทท าการศกษาเชอไฟโตพลาสมาไดจดจ าแนกไวใน Class : Mollicutes Order : Acholeplasmatales Family : Acholeplasmataceae ประกอบดวย 2 ยนส คอ Phytoplasma และ Acholeaplasma

เชอไฟโตพลาสมารายงานครงแรกโดย Doi และคณะ เมอป ค.ศ.1967 โดยศกษาโรคเตยแคระของหมอน โรคพมแจของมนฝรงและโรคเหลองแอสเตอร และพบวาเชอไฟโตพลาสมาเปนสาเหตโรคพชทสรางความเสยหายใหกบพชหลาย ๆ ชนดอกดวย เชน มะพราว ยาสบ ล าไย ออย ขาว หญาบางชนด เปนตน คณสมบตและลกษณะของเชอไฟโตพลาสมา การศกษาลกษณะสณฐานวทยาอาศยการตรวจเนอเยอทออาหารพชทถกเชอเขาท าลาย และในเยอเยอของแมลงพาหนะดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอน ซงพบวามลกษณะสณฐานวทยาเชน เดยวกบ Mycoplasma โดย Hayflick and Chanock (1965), Hull (1971) และ Hull (1972) ไดอธบายคณสมบตของเชอมายโคพลาสมา ดงน ไมมผนงเซลล เซลลหมเมมเบรน 3 ชน มชวงหางประมาณ 7.5-10 นาโนเมตร สามารถเจรญบนอาหารเลยงเชอได สามารถถกยบย งการเจรญโดยเตตราไซคลน (tetracycline) ทมความเขมขนต าและแอนตบอด (antibody) ของตวเองเทานน มความตานทานตอสารปฏชวนะบางชนดเชน เพนนซลลน ขนาดของเซลลทเลกทสดทใชในการขยายพนธจะอยใน ชวง 100-150 นาโนเมตร เกอบทกสปชส (species) สามารถแยกไดยกเวน M. laidlawii ตองการ sterol และโปรตนในการเจรญ มายโคพลาสมาเทาทพบในปจจบนไมสามารถเปลยนเปนแบคทเรยได องคประกอบหลกทมอยภายในเซลลไฟโตพลาสมาไดแก สารพนธกรรม (DNA และ RNA) ไซโตพลาสซม (cytoplasm) ไรโบโซม (ribosome) ท าใหเซลลมรปรางไมแนนอน (pleomorphic หรอ polymorphism) มรปรางตงแตกลม (spherical bodies) ร เปนแทงยาว เปนเกลยว เปนเสนยาว ๆ (elongated forms หรอ filamentous) จนถงแตกเปนเสนสาย หรออาจมรปรางคลายผลฝรง มรปรางตอกนคลายลกปด (bead string) มเสนผานศนยกลาง 0.2-0.8 ไมครอน จนกระทงเปนเสนสายยาวถง 3 ไมโครเมตร ขยายพนธโดยการแตกหนอ (budding) และมการแบงตวจากหนงเปนสอง (binary fission) (McCoy, 1984; สพฒน, 2528; สวณ, 2532; พรทพย, 2533) สามารถพบเชอไฟโตพลาสมาในเซลลพชท sieve element, parenchyma และ companion cell ของ phloem มรปรางแตกตางกนออกไปแลวแตชนดของเชอและพช มขนาดเสนผาศนยกลางตงแต 50-800 ไมโครเมตร มเยอหมเซลล (membrane) 3 ชน โดย 2 ชนนอกเปนชนทบแสงของอเลคตรอน (electron dense layer) ถดเขาไปเปนชนโปรงแสงของอเคตรอน ภายในเซลลจะพบสาร

พนธกรรมทงดเอนเอ (DNA) และอารเอนเอ (RNA) พบเมลดคลายไรโบโซม (70s ribosome) และ fibrillar flame work และไมสามารถตานทานความรอนและการเปลยนแปลงของแรงดนออสโมตก (osmotic pressure) อยางรวดเรว ในประเทศไทยพบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมาเปนครงแรกเมอ พ.ศ.2513 ในงาทเปนโรคแตกพมฝอย (phyllody) (ดวงใจ, 2513) ปจจบนพบวาเชอไฟโตพลาสมาท าใหเกดโรคกบพชไดมากกวา 200 ชนด (ธระ,2532) มรายงานเกยวกบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมาในพชเศรษฐกจทส าคญหลายชนด ไดแ ขาว ออย งา ล าไย พชตระกลถว และไมดอกไมประดบ รวมทงวชพชในแปลงปลกพชซงเปนแหลงสะสมโรคทส าคญ การเพมปรมาณเชอไฟโตพลาสมา ไฟโตพลาสมาสามารถเพมปรมาณไดโดยการแตกหนอ (budding) (พรทพย, 2533; McCoy, 1984) และมการพบการแบงตวจากหนงเปนสอง (binary fission) ซงทงสองวธเปนการเพมปรมาณของเซลลโดยทไมอาศยเพศ ท าใหอตราการกลายพนธต ากวาจลนทรยชนดอน ๆ ทสามารถสบพนธโดยอาศยเพศ เชน แบคทเรยและเชอรา อกทงยงเปนเชอสาเหตโรคทไมสามารถเลยงบนอาหารสงเคราะห แตเปนจลนทรยทมความไวตอสารปฏชวนะพวกเตตราซยคลน (tetracycline) แตตานทานตอเพนนซลลน การเจรญเตบโตของเชอไฟโตพลาสมาในพช เชอไฟโตพลาสมาเปนเชอสาเหตโรคทพบไดในบรเวณทออาหารของพช (Lee และคณะ, 1992; Raychaudhuri และ Mitra, 1993) ซงในเซลลจะประกอบดวยน าตาล เกลอตาง ๆ กรดอะมโน ระดบ pH ตลอดจนความดนออสโมตก (osmotic potential) ซงเปนสารจ าเปนส าหรบเชอไฟโตพลาสมา (McCoy, 1984) ท าใหเปนขอจ ากดการแพรกระจายของเชอในตนพช สงผลถงแมลงพาหะทจะถายทอดโรคจงตองเปนแมลงปากเจาะดดเทานน การเคลอนยายของเชอสามารถพบไดทกสวนของพช เพราะเชอเคลอนทไปพรอมกบการเคลอนยายอาหารของพช

การถายทอดเชอไฟโตพลาสมา เชอไฟโตพลาสมาสามารถถายทอดได 3 วธ คอ 1. การถายทอดโดยฝอยทอง ไดมรายงานการถายทอดเชอสาเหต โรคแตกพมฝอยของงาและปอเทองโดยการใชฝอยทอง (dodder 3 species คอ Cuscuta campestris, Cuscuta subinclusa, Cuscuta odorata) ไปยงพงพวยท าใหเกดอาการดอกเขยวและแตกพมฝอย (สภาพร, 2533) ขอส าคญคอฝอยทองตองเกาะพชทงสองชนดและมชวตอยไดจงจะประสบความส าเรจ 2. การถายทอดโดยแมลงพาหะ ตดไปกบแมลงพาหะพวกทเปน phloem-feeding เชน เพลยจกจน (leaf hopper) เพลยกระโดด (plant hopper) และเพลยไกฟา (phyla) เปนตน โดยในประเทศไทยไดมรายงานถงการถายทอดโดยแมลงพาหะในกลมของเพลยจกจน (Matsumuratetrix hierogly phicus. Mat) ถายทอดโรคใบขาวของออย (ธระ, 2532) 3. การถายทอดโดยตดไปกบสวนขยายพนธ การทาบกง ตดตา (grafting) ท าไดโดยเชอมตอระบบเซลลทออาหาร ในพชตระกลเดยวกนหรอชนดเดยวกน ซงสามารถใชเวลาถายทอดเชอไดในเวลาไมนาน บางกรณการถายทอดเชอสามารถเกดขนไดแมไมเกดการเชอมตอ (graft union) ของเนอเยอทงสอง (Bos, 1983) การถายทอดโรคโดยวธกล เชน ตดไปกบเครองมอทางการเกษตร ไมวาจะเปน กรรไกร มด หรอไถ เปนไปไดนอยมาก เนองจากคณสมบตของเชอชนดนทไมทนทานตอสภาพแวดลอมภายนอกและสามารถสลายตวไดงายเมออยเดยว ๆ และการเกบรกษาเชอไฟโตพลาสมาในสภาพมชวตสามารถท าไดโดยการเกบในพชอาศย เชน พงพวย (Catharanthus roseus L.) โดยใชฝอยทองถายทอดเชอจากตนเปนโรคสพงพวยปกต แลวเกบไวในสภาพเรอนทดลองปองกนแมลง (Alma และคณะ, 1996) หรอในระบบเพาะเลยงเนอเยอพชอาศย (Davies และ Clark, 1994) ซงเกบรกษาเชอไวไดนานถง 3 ป โดยพบวาปรมาณเชอในพชทเพาะเลยงเนอเยอสงกวาในสภาพแปลงธรรมชาต เชอไฟโตพลาสมามการสบพนธแบบไมอาศยเพศ (Asexual reproduction) โดยการแตกหนอ (Budding) (พรทพย, 2533 และ McCoy, 1984) ภายในทออาหารของพชอาศย เชอไฟโตพลาสมาอาจมรปรางเปนแบบดมเบล เนองจากการยดตวออกเมอมการแบงตวจากหนงเปนสองเซลล (ไพโรจน, 2525)

ลกษณะอาการของพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา เชอไฟโตพลาสมาเปนสาเหตของโรคพชจ านวนมาก พชทถกเชอไฟโตพลาสมาเขาท าลายสามารถแสดงอาการใหเหนไดแตกตางกนไป ประกอบดวย

1. มการแตกยอดมากกวาปกตจนมลกษณะคลายไมกวาด ดงนนอาจเรยกอาการแบบนไดวา โรคพมไมกวาด (witches’ broom) ลกษณะทเหนเดนชดคอ ยอดหรอตาขางทแตกออกมานนจะไมเจรญเตบโต กลบชะงกงนหลงจากแตกออกมาไดไมนานนก ปลองสน ใบมขนาดเลกมากจนแทบไมเหนลกษณะของใบอยางใบอยางเดนชด เชน ในกรณของโรคพมไมกวาดของล าไย ยอดทแตกออกมามกมลกษณะคอนขางแขงกวาปกต และคอนขางเปราะ พชทแสดงอาการของโรคอาจเปนไดทงไมเนอแขง เชน ล าไย apple จนทน เปนตน หรอไมลมลก เชน มนฝรง มะเขอเทศ หรอถวเหลองกได 2. อาการเหลอง อาการแบบนมกพบทใบ แตบางครงกพบทกลบดอกไดเชนกน อาการเหลองนมกจะท าใหสบสนกบอาการทเกดจากเชอไวรสไดมาก ทเหนไดชดคอ สวนคลอโรฟลด ของพชจะถกท าลาย ท าใหใบมสซดมากกวาปกต เชน โรคเหลองเตยของขาว หรอบางครงมสขาวไปทงใบกได เชน ในโรคใบขาวของออย อาการทพบในดอกมกท าใหสกลบดอกซดไมมสตามปกต เชน มสเหลองซดหรอสเขยวออน เชน โรค aster yellow ของเบญจมาศและแอสเตอร เปนตน 3. อาการเตยแคระ อาการนพบคกบอาการเหลอง ตนทเปนโรคจะไมเจรญเตบโต เชน โรคแคระของหมอน บางครงอาจพบวาสวนของยอดหรอเยอเจรญจะเรมตาย และลามลงไปดานลาง ท าใหตนไมทรดโทรม 4. อาการดอกเขยว (virescence) อาการแบบนจะพบสวนทสวนของกลบดอกเทานน โดยจะมสเขยวเหมอนกบสของใบ เชน โรค Sesamum phyllody หรอ Strawberry phyllody (ประสาทพร, 2527; Martha และคณะ, 1989; Hsu และคณะ, 1990; Overman และคณะ, 1992 และ Marcone และคณะ, 1996)

การปองกนและก าจดโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา ก าจดแมลงพาหะน าโรค เพลยจกจน หรอเพลยกระโดด ใชสารปฏชวนะ เชน สารออกซเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด หรอ คลอโรเตตราไซคลน ไบซลเฟต จมแชรากพชในอตราเขมขน 10-1000 ppm หรอฉดเขาสตนโดยตรงแลวแตชนดของพช การปฏบตอน ๆ คลายวธการควบคมโรคทเกดจากไวรส (ไพโรจน, 2525) ท าลายพชทเปนโรคทง โดยการถอน เผา เมอพบพชทแสดงอาการ ท าลายแหลงทมเชอโรคอย โดยก าจดวชพชและพชอาศย เพอปองกนไมใหพชหลกตดเชอในฤดปลก ท าความสะอาดเครองมอเครองใชทางการเกษตร โดยท าการฆาเชอดวยความรอน หรอสารเคม ใชชนสวนพชทปราศจากโรค หลกเลยงสถานททมประวตการเกดโรค ท าการควบคมสถานทเพาะปลกพช ใหปราศจากโรค ไมน าชนสวนพชทเปนโรคเขาสแปลงปลก การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา เดมใชคณสมบตทางชววทยา เชน การศกษาลกษณะอาการของโรคทเกดบนใบพช แมลงพาหะ การตอบสนองตอสารปฏชวนะเตตราไซคลนของพชอาศย ถาพบพชทสงสยวาถกเชอโรคเขาท าลายมอาการดขนเมอใหเตตราไซคลน เชอโรคพชนนอาจจะเปนเชอไฟโตพลาสมาได (McCoy และคณะ, 1989) วธการดงกลาวใหผลทไมแนนอนและใชเวลาในการหาขอสรปนาน ตอมาไดมการพฒนาเทคนคทางดานกลองจลทรรศนอเลคตรอน สามารถน ามาใชในการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาในเนอเยอพชดวยสารเรองแสงบางชนด เชน 4,6-diamidino-2-phehylindole (DAPI) (Seemuller, 1976) แตทงสองวธจะใหผลชดเจนเมอเนอเยอพชมเชอในปรมาณมาก จงเปนขอจ ากดประการหนงส าหรบเชอไฟโตพลาสมาทพบเฉพาะในทออาหารของพชเทานน สงผลใหพบปรมาณเชอไดนอยเมอเปรยบเทยบกบเชอสาเหตโรคพชชนดอน ๆ ทสามารถเขาท าลายพชไดทกสวน และทงสองวธนไมเฉพาะเจาะจง ไมสามารถบอกชนดของเชอไฟโตพลาสมาไดเพราะเมอดดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนเหนเพยงรปรางภาย นอก ซงเชอไฟโตพลาสมาแตละชนดทเขาท าลายพชตางชนดกน เมอดรปรางภายนอกจะพบวาเหมอนกน สวนผลของ DAPI จะเหนเพยงวาทบรเวณทออาหารของพชมดเอนเอซงนาจะเปนของเชอไฟโตพลาสมา แตไมสามารถบอกไดวาเปนเชอไพโตพลาสมาชนดใด (Harrison, และคณะ, 1996) เทคนควธการดานซรมวทยาทงโพลโคลนอลแอนตบอด (polyclonal antibody) และโมโนโคลนอลแอนตบอด (monoclonal antibody) ไดน ามาใชในการศกษาตรวจเชอไฟโตพลาสมาในรปแบบของ ELISA (Enzyme-Link Immunosorbent Essay) แตมกประสบปญหาในการแยกเชอไฟ

โตพลาสมาใหบรสทธและมปรมาณมากเพยงพอทจะนาใชในการฉดสตวทดลอง เพอชกน าใหรางกายสตวทดลองสรางแอนตบอด (Errampalli และ Fletcher, 1993; Shen และ Lin, 1993) บางครงพบวาอาการผดปกตของพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา มลกษณะอาการคลายการขาดธาตอาหารของพชและสาเหตจากสงไมมชวตอน ๆ ดงนนจงตองท าการถายทอดโรค และศกษาลกษณะอาการของโรคในแพงพวย เนองจากแพงพวยเปนพชอาศยทดของเชอไฟโตพลาสมา โดยจะแสดง อาการดอกเขยวภายในเวลา 1-2 สปดาห หลงจากไดรบเชอ และเชอสามารถเพมปรมาณไดดในแพงพวย สามารถน าไปตรวจสอบเชอโดยวธอน ๆ ตอไป (สภาพร, 2542) เมอมการพฒนาเทคนคทางดานพนธวศวกรรม มการประยกตและเทคนคตาง ๆ มาใชในการศกษาเชอไฟโตพลาสมา เชน PCR (Polymerase Chain Reaction) และ Hybridization ท าใหการวนจฉยโรคและชวยในการจดจ าแนกเชอไดอยางถกตองรวดเรว แตอยางไรกตามขอมลพนฐานทางดานชววทยาและสณฐานวทยาของเชอไฟโตพลาสมา กยงมความจ าเปนทจะน ามาประกอบการตรวจวนจฉยเพอความถกตองแมนย า นาเชอถอ การตรวจเนอเยอพชดวยกลองจลทรรศน 1. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนแบบ dark field หรอ phase contrast 2. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนฟลออเรสเซนต 3. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบล าแสงสองผาน (TEM) การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนคทางซรม (Serology)

1. Enzyme-linked immunosorbent assay 2. Immunogold-labelling

การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนคทางโมเลกล

1. Polymerase chain reaction 2. DNA probe

การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reacrtion (PCR) มความส าคญในการใชเพมปรมาณดเอนเอเปาหมายโดยการสกดดเอนเอจากเนอเยอพชทเปนกรดมาท าปฏกรยาในหลอดทดลอง เนองจากพบวายนทควบคมขอมลการสงเคราะหยน16S rDNA (16S rDNA gene) มลกษณะอนรกษ (conserved) ในเชอไฟโตพลาสมาจงไดมการสงเคราะหไพรเมอร (primer) ซงเปนดเอนเอเรมตนสายสนๆ ทมล าดบ นวคลโอไทดเปนเบสคสมกบดเอนเอตนแบบ ไพรเมอรนไดมาจากโคลนของ MLO หรอจากล าดบนวคลโอไทดบางสวนของยน 16S rDNA มายโคพลาสมาในสตวและของไฟโตพลาสมา (Lee และคณะ, 1993) จนถงปจจบนนกวทยาศาสตรทดลองและพฒนาไพรเมอรขนมาเปนจ านวนมากเพอใชในการเพมปรมาณยนของเชอไฟโตพลาสมาเพอประโยชนในการตรวจเชอและการจดจ าแนกไดดยงขน เชน rpI gene, tuf gene และ SecY gene เปนตน โดยไพรเมอรทผลตนนมทงไพรเมอรทจ าเพาะเจาะจง (specific primer) และไพรเมอรชนดทไมจ าเพะเจาะจง (universal primer) ใชเพมปรมาณดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมา ขนาดของดเอนเอทเพมไดแตกตางกนตงแต 0.5-1.4 กโลเบส ขนอยกบไพรเมอรทใชเรมตนสงเคราะห (Ahrens และ Seemuller, 1992; Gibb และคณะ, 1998; White และคณะ, 1998) การตรวจเชอไฟโตพลาสมาโดยใชเทคนค Dot blot hybridization เทคนคไฮบรไดเซชน (Hybridization) สามารถตรวจเชอไฟโตพลาสมาไดแมมปรมาณนอย ตองมการผลตดเอนเอตวตรวจ(DNA probe) ทเตรยมไดจากโครโมโซมของเชอ ซง DNA probe ชนดนจะมความจ าเพาะเจาะจงตอเชอทน ามาท าตวตรวจ (probe) ดวยไพรเมอรทไมจ าเพาะเจาะจงน ามาท าตวตรวจกจะสามารถใชตรวจสอบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา โดยอาศยหลกการจบกนของกรดนวคลอกของเชอไฟโตพลาสมา ซงหลกการของการตรวจหาดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาในพช ท าไดโดยการน าชนสวนของดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาทจะใชเปนตวตรวจ ซงอยในรปเสนตรงสายคมาแยกออกเปนเสนเดยวแลวสรางดเอนเอสายใหมทตดฉลากดวยอนพนธของกรดนวคลอกทเชอมตอกบสารไดกอกซเจนน (dUTP spacer-sterosis hapten digoxigenin; DIG-dUTP) เมอจดใหดเอนเอตวตรวจทตดฉลากจบคกบดเอนเอในตวอยางแลว ท าการตรวจตดตามดเอนเอทตดฉลากดวยวธ ELISA ทใช anibody conjugate (antidigoxigenin alkaline phosphatase conjugate) โยใหเอนไซมท าปฏกรยากบสารประกอบ คอ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate (X-phosphate) และ nitroblue tetrazolium salt (NBT) แลวใหสมวงน าเงน (Mathews, 1992) เทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) เทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) เปนเทคนคทสามารถน ามาใชประโยชนในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอไฟโตพลาสมา โดยดความแตกตางของขนาดดเอนเอทไดจากการยอยชนสวน 16S rDNA ดวยเอนไซมตดจ าเพาะ (restriction enzyme) อาศยหลกการขอมลทางพนธกรรมของสงมชวตอยในรปของดเอนเอ สามารถจ าลองตวเองไดอยางถกตองแมนย า เพอถายทอดสเซลลรนลกใหคงลกษณะทเหมอนเดม แตบางครงอาจมการเปลยนแปลงเบสภายในดเอนเอ เนองจากสงแวดลอมหรอขอผดพลาดของเซลลเอง การเปลยนแปลงสามารถสงผลใหเกดการหายไป (deletion) การจดเรยงตวใหม (rearrangement) หรอมการเปลยนต าแหนงของดเอนเอบางสวนภายในโครโมโซม (transposition) ผลทไดจากการเปลยนแปลงนท าใหเกดความหลากหลายของสงมชวตแตละชนด ซงสามารถตรวจพบไดโดยการหาล าดบเบสของดเอนเอ (sequencing) แลวน ามาเปรยบเทยบกน แตเปนวธทท าไดยากและใชเวลามาก วธทงายกวาคอการน าดเอนเอทตองการหาความแตกตางนนมายอยดวยเอนไซมตดจ าเพาะบางชนด แลวเปรยบเทยบชนสวนดเอนเอทถกตดโดยเอนไซมนน (สรนทร, 2539; Toth และคณะ, 1994) เทคนค การโคลนยน (gene cloning, DNA cloning หรอ molecular cloning) การโคลนยน หรอ เทคโนโลยการสรางดเอนเอสายผสม (recombinant DNA technology) หมายถง การเคลอนยายชนสวนดเอนเอทสนใจของสงมชวตชนดหนงเขาไปยงสารพนธกรรมทสามารถจ าลองตวเองได (self-replicating genetic element) เชน พลาสมดของแบคทเรย แลวชนสวนของดเอนเอนนกสามารถแพรกระจาย (propagate) ไปกบเซลลเจาบานได (host cell) ได การสรางดเอนเอสายผสมท าไดโดยการตดหรอแยกยนทตองการศกษาน ามาเชอมตอกบดเอนเอพาหะหรอเวคเตอร (vector) แลวถายโอนดเอนเอทไดสเซลลเจาบานใหมการเพมจ านวนชดของดเอนเอจนมปรมาณมากพอตามความตองการในการน าไปใชงาน

การศกษาเพอจดจ าแนก Lee และคณะ (1993) รายงานวาสามารถใชเทคนค Polymerase chain reaction (PCR) เพมปรมาณยน 16S rDNA บางสวนของเชอไฟโตพลาสมาได 40 ชนด โดยใช universal prime (R16F2 / R16R2) และเปรยบเทยบความแตกตางของยน 16 S rDNA ขนาด 1.2 กโลเบส ดวยเทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ซงจดกลมของเชอทง 40 ชนดไดเปน 9 กลม และ 14 กลมยอย Marcone และคณะ (1997b) ศกษาหญาแพรกขาวในอตาลและลกษณะส าคญทเกยวของกบเชอไฟโตพลาสมา โดยใชเทคนคทางดาน PCR เพมปรมาณชนสวนดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาดวยไพรเมอรทจ าเพาะเจาะจง พบวาในหญาทแสดงอาการใบขาวทน ามาทดสอบทงหมดใหผลบวก สวนหญาปกตไมพบแถบดเอนเอจากการท า PCR สภาพร และคณะ (2540) ศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอไฟโตพลาสมาทพบในโรคพช 8 ชนด คอ โรคใบขาวของออย หญาแพรก และหญา Brachiaria โรคเหลองเตยของขาว โรคแตกพมฝอยของงา ปอเทอง และผกเสยนผ และดรคดอกเขยวของแพงพวย โดยเทคนค PCR ในการเพมปรมาณดเอนเอ ใชไพรเมอร (R16F2 / R16R2) ทจ าเพาะเจาะจงส าหรบเพมปรมาณยน 16S rDNA บางสวนของเชอไฟโตพลาสมาและใชดเอนเอทสกดจากใบพชเปนโรคเปนตนแบบ พบวาสามารถเพมปรมาณดแอนเอทไดจากตวอยางโรคแตกพมฝอยของงา น ามาตดฉลากดวยสารไดกอกซเจนน เพอใชเปนดเอนเอตวตรวจส าหรบวนจฉยโรค ดวยเทคนค dot blot และ Southern blot hybridization พบวาดเอนเอตวตรวจสามารถท าปฏกรยากบดเอนเอทสกดจากใบพชทเปนโรคทกชนดและกบดเอนเอขนาด 1.2 กโลเบส ทเพมปรมาณจากตวอยางทกโรค และพบวาสามารถจดกลมได 4 กลม คอ กลมโรคใบขาวของออย หญาแพรก และหญา Brachiaria, กลมโรคแตกพมฝอยของงา ปอเทอง และผกเสยนผ, กลมโรคเหลองเตยของขาวและกลมดอกเขยวของแพงพวย Lee และคณะ (1998) ศกษาการจดกลมของเชอไฟโตพลาสมาโดยการเปรยบเทยบล าดบ นวคลโอไทดของยน 16S rDNA และแบงเปน 14 กลม ไดแก 16SrI-16SXIV และ 41 กลมยอย Marcone และคณะ (1999) ศกษาและรายงานขนาดโครโมโซมของเชอไฟโตพลาสมาเพอจดกลมความสมพนธทางววฒนาการเปนกลมใหญและกลมยอย สามารถแยกออกไดเปน 12 กลม

เชน เชอไฟโตพลาสมาทมขนาดจโนม 600-1,130 กโลเบส จดอยในกลม aster yellows phytoplasma ขนาดจโนมทอยในชวง 860-1,350 กโลเบส จดอยในกลม stolbur phytoplasma หากขนาดจโนมอยในชวง 670-1,075 กโลเบส สามารถพสจนไดวาจดอยในกลม X-disease เปนตน SecY gene SecY gene พบในสงมชวตจ าพวกแบคทเรยท าหนาทสราง SecY protein ทเปน Secretion protein จดอยใน Sec translocate system อยในบรเวณชนของ lipid bilayer ของ membrane ของเชอไฟโตพลาสมา เพอท าการควบคมการสงออกของสารจ าพวกโปรตนทจ าเปนตอการเจรญเตบโตของเซลลออกส cytoplasm ผานทางชอง protein-conducting (Margaret และคณะ, 2005) โดย Sec transloate system ประกอบไปดวย SecA, SecB และ SecY complex ซง SecY complexประกอบดวย 3 subunits ไดแก -subunit (รปราง helices), β-subunit (รปราง simple helix) และ γ-subunit (รปราง L-shaped) มขนาดของชองภายใน SecY complex เพอใหโปรตนถกสงออก เทากบ 16 Ao (Pu Tian และคณะ, 2006)

กลไกการท างาน เมอม precursor protein ทจะสงออกไปยงภายนอกผาน membrane จะถกจบดวย SecB ทท าหนาทเปนสาร chaperon ใชในการสงออกโดยเฉพาะ จากนน SecA จะเขามาจบกบ precursor protein และ SecB เพอรวมตวกลายเปน ternary complex แลวถกสงออกผานทางชองทเกดจาก SecY complex (Margaret และคณะ, 2005)

ความแตกตางระหวาง 16S rDNA และ SecY gene วธการจดจ าแนกเชอไฟโตพลาสมาทนยมใช คอ วธการ RFLP โดยใช 16S rDNA ในการจดจ าแนก แตเนองจาก 16S rDNA มคาความคลายคลงกน (homologies) เทากบ 98.5% - 99.5% ทคอนขางสง ท าใหจดจ าแนกไดไมละเอยด โดยเฉพาะในกลมเชอทเปนสาเหตใหกบพชหลายชนด เชน Aster yellows เปนตน จงท าการคนควาหา gene ชนดใหม ทสามารถแยกไดละเอยดยงกวา คอ SecY gene มคาความคลายคลงกนเทากบ 94.7% - 98.8% ซงนอยกวา 16S rDNA ท าใหสามารถจดจ าแนกแบงกลมเชอโรคไดอยางละเอยด (Lee และคณะ, 2005)

Lee และคณะ (2005) ศกษาการจดกลมของเชอไฟโตพลาสมาในกลมของ Aster yellows โดยใชยน SecY ท าการเปรยบเทยบ พบวาสามารถแบงกลมยอยของ Aster yellows ได 10 กลมจาก 20 ตวอยางไดละเอยดและหลากหลายมากกวาใชยน 16S rDNA Arnaud และคณะ (2007) ศกษาการจดกลมของ flavescence dorée (FD)ของเชอไฟโตพลาสมาในองนในประเทศฝรงเศสและสเปน โดยใชเทคนค RFLP และใช SecY หาความสมพนธและความหลากหลาย พบวาสามารถแบงออกเปน 3 กลมทมความสมพนธกน ในกลมแรก (FD1) มความหลากหลายคอนขางนอย และพบเปน 17% ขององนทเปนโรคทางตะวนตกเฉยงใตในประเทศฝรงเศส กลมท 2 ไมมความหลากหลายและพบในองนทเปนโรค 83% ทงในฝรงเศสและอตาล ในกลมท 3 พบความหลากหลายมากทสดในองนของประเทศอตาล และเมอน ามาท า phylogenetic tree ระหวาง flavescence dorée (FD), German Palatinate grapevine yellows phytoplasmas (PGY) และ alder phytoplasmas (AldY) สามารถสรปไดวา FD, PGY และ AldY จดอยในกลมเดยวกนซงมถนก าเนดอยในยโรป

อปกรณและวธการทดลอง 1.การเกบตวอยางพชเพอใชในการทดลอง เกบตวอยางพงพวยทไดรบการถายทอดเชอไฟโตพลาสมาจากปอเทองซงปลกในโรงเรอนทดลองส าหรบโรคไฟโตพลาสมา ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลย เกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน โดยการเกบตวอยางเฉพาะสวนของใบทแสดงอาการโรค เพอน ามาสกดดเอนเอ 2.การสกดดเอนเอจากใบพงพวย สกดดเอนเอจากใบพงพวยโดยวธ DNA minipreparation ตดเอาเฉพาะสวนของเสนกลางใบพงพวยประมาณ 0.3 กรม ใสโกรงบดดวยไนโตรเจนเหลวใหละเอยด ถายตวอยางลงในหลอดไมโครทวบขนาด 1,500 ไมโครลตร เตม DNA Extraction buffer (100mM Tris HCl pH8, 50mM EDTA pH8, 500mM NaCl) 1000 ไมโครลตร ผสมใหเขากนน าไปปนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท เกบสวนใสใสหลอดไมโครทวบใหม แลวเตม sodium dodesyl sulfate (20% SDS) ปรมาตร 40 ไมโครลตร บมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เตม 5M potassium acetate (CH3COOK) ปรมาตร 48 ไมโครลตร (จะสงเกตเหนตะกอนโปรตนเปนสขาว ๆ) หลงจากนนน าไปปนเหวยง 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท เทสวนใสทง ซบปากหลอดไมโครทวบและตากตะกอนใหแหงทอณหภมหองนานขามคน จากนนละลายตะกอนดวย 1x TE buffer ปรมาตร 20ไมโครลตร โดยใชไมโครปเปตดดขนลงเบาๆ เกบไวท 4 องศาเซลเซยส ส าหรบน าไปใชขนตอไป 3.การเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR น าดเอนเอทสกดไดจากพงพวย มาท าปฏกรยา PCR เพอเพมปรมาณดเอนเอเปาหมายคอ ยน SecY โดยใชไพรเมอร AYsecYF1 / AYsecYR1 ทมความจ าเพาะเจาะจงกบยน SecY เปนตวเรมตนในการเพมปรมาณยน ซงมล าดบเบสดงน AYsecYF1 5’ - CAGCCATTTTAGCAGTTGGTGG - 3’ AYsecYR1 5’ - CAGAAGCTTGAGTGCCTTTACC - 3’

สวนผสมของปฏกรยา PCR ปรมาตรรวม 25 ไมโครลตร ไดแก 10x buffer 2.5 ไมโครลตร MgCl2 (25 mM) 2 ไมโครลตร dNTP (10 mM) 2 ไมโครลตร ไพรเมอร reverse (AYsecYR1) และ forward (AYsecYF1) (10 pmol/ µl) อยางละ 0.5 ไมโครลตร Taq DNA polymerase (0.1 unit/µl) 0.25 ไมโครลตร น ากลนนงฆาเชอ 16.25 ไมโครลตร และดเอนเอตนแบบ 1 ไมโครลตร น าปฏกรยาทเตรยมไว ท าปฏกรยาเพอเพมปรมาณดเอนเอในเครองควบคมอณหภมอตโนมต PTC 100 โดยมการตงโปรแกรมการเปลยนอณหภมไวดงน อณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท ในรอบแรก ตงแตรอบท 2 เปนตนไปนาน 1 นาท อณหภม 50 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงหมด 35 รอบ ตามดวย อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท หยดปฏกรยาท อณหภม 10 องศาเซลเซยส ในรอบสดทาย นาน 10 นาท น าผลตภณฑจากปฏกรยา PCR ทไดน าไปแยกแถบดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ใน 0.5x TBE buffer แบงผลตภณฑ PCR ทไดมา 5 ไมโครลตร ผสมกบ 6x loading dye 2 ไมโครลตร เปรยบเทยบกบ 100 bp DNA Ladder plus 1 ไมโครลตร น า agarose gel ผานกระแสไฟฟาตรง ความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 40 นาท แลวน าแผน agarose gel มายอมดวย ethidium bromide นาน 10 นาท และแชน าอก 5 นาท ตรวจดแถบดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต (UV) และบนทกภาพดวยเครอง gel documentation 4. การสกดดเอนเอจากเจลโดยใชชดส าเรจรป Qui น าผลตภณฑทไดจากปฏกรยา PCR ไปแยกขนาดของดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ใน 0.5x TBE buffer โดยน าผลตภณฑ PCR 5 ไมโครลตร ผสมกบ 6x loading dye 2 ไมโครลตร ใชไฟฟากระแสไฟฟาตรง ความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 40 นาท แลวน ามาแผน agarose gel มายอมดวย ethidium bromide นาน 10 นาท และน ามาแชน านาน 5 นาท ตรวจดแถบดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต และถายภาพดวยเครอง gel documentation และตดบนเครอง UV transilluminator น าเจลทตดไดใสลงในหลอดไมโครทวบ ขนาด 1,500 ไมโครลตร ทไดชงน าหนกไวแลว น าไปชงน าหนก เพอหาน าหนกของเจลทตดไดหนก 133 มลลกรม จากนนเตม QG buffer 399 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท โดยน าออกมาเขยาบนเครอง vortex ทก ๆ 3 นาท จะไดสารละลายสเหลอง เตม Isopropanol

133 ไมโครลตร เทตวอยางลงใน minicolumn น าไปหมนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส เตม QG buffer 500 ไมโครลตร น าไปหมนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส เตม PE buffer 750 ไมโครลตร ตงทงไว 2-3 นาท น าไปหมนเหวยงท13,000 รอบตอนท เปนเวลา 1 นาท และน าไปหมนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ยาย minicolumn ลงในไมโครทวบ ขนาด 1,500 ไมโครลตร เตม EB buffer 50 ไมโครลตร ตงทงไว 2 นาท น าไปหมนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทง minicolumn เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ส าหรบน าไปใชตอไป น าดเอนเอทสกดไดมาตรวจผล โดยน าผลตภณฑทไดจากปฏกรยา PCR และทไดจากการสกดจากเจล ไปแยกขนาดของดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ใน 0.5x TBE buffer โดยน าผลตภณฑ 5 ไมโครลตรผสมกบ 6x loading dye 2 ไมโครลตร น าแผน agarose gel มายอมดวย ethidium bromide นาน 10 นาท และแชน าอก 5 นาท ตรวจดแถบดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต (UV) และบนทกภาพดวยเครอง gel documentation 5. การโคลนดเอนอของเชอไฟโตพลาสมา 5.1 การเชอมตอชนสวนของดเอนเอกบพลาสมดพาหะ น าผลตภณฑทไดจากปฏกรยา PCR เชอมตอกบพลาสมดพาหะ (pGEM®-T Easy vector) (ภาพท 1) โดยใช ผลตภณฑ PCR 5 ไมโครลตร T4 DNA ligation 2x buffer 5 ไมโครลตร T4 DNA Ligase (3 wiess unit/µl) 1 ไมโครลตร pGEM®-T Easy vector (ภาพท 1) (50 ng) 1 ไมโครลตร และน า RO นงฆาเชอ 1 ไมโครลตร ผสมใหเขากนภายในหลอดไมโครทวบขนาด 1,500 ไมโครลตร หมปากหลอดดวยพาราฟนและน าหลอดปฏกรยาบมพรอมเขยาท 10 องศาเซลเซยส นานขามคน

ภาพท 1 ภาพโครงสรางแสดงแผนทวงกลม pGEM®- T Easy Vector 4.2 การน าพลาสมดดเอนเอสายผสมเขาสเซลลแบคทเรย น าพลาสมดดเอนเอสายผสมเขาสเซลล E.coli สายพนธ DH5 ดวยวธ heat shock transformation (Sambrook และ Russell, 2001) โดยน าดเอนเอสายผสมทไดจากการเชอมตอกบ พลาสมดพาหะใสลงไปในหลอดไมโครทวบ ทมเซลลแบคทเรย E.coli สายพนธ DH5 ทเปน competent cell ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลวน าไปแชน าแขงเปนเวลา 30 นาท จากนนน าไปแชน าอนอณหภม 42 องศาเซลเซยส เปนเวลา 45 วนาท แลวน ากลบมาแชน าแขงทนทอกครงนาน 5 นาท แลวเตมอาหาร LB ทยงไมไดเตมแอมพซลลน ปรมาตร 1 มลลลตร น าไปบมพรอมเขยาท 200 รอบตอนาท ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง ท าการตกตะกอนเซลลโดยการปนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทอาหารในหลอดทง เตมอาหารเหลว LB 150 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แบงเชอ E.coli ในหลอดมาปรมาตร 75 ไมโครลตร มา spread บนอาหารแขง LB ทเตมแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครลตรตอมลลลตร เตม 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (x-gal) ความเขมขน 20 มลลกรมตอไมโครลตร ปรมาตร 40 ไมโครลตร และเตม Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) ความเขมขน 10 มลลโมลาร ปรมาตร 40 ไมโครลตร (รอใหผวหนาอาหารแหง) น าไปบมทอณหภม 37 องศา

เซลเซยส เปนเวลา 16 ชวโมง เมอครบเวลาน าไปเกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ส าหรบน าไปใชตอไป 4.3 การคดเลอกโคโลนของเซลลแบคทเรยทคาดวาไดรบพลาสมดดเอนเอ คดเลอกโคโลนสขาวทเจรญบนอาหาร LB ทเตมแอมพซลลน ใชไมจมฟนทอบฆาเชอแลวแตะโคโลนสขาวแลวน ามาเลยงบนอาหารแขง LB ทผสมสารแอมพซลลน 100 มลลกรมตอไมโครลตร น าไปเกบทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16 ชวโมง เพอใชเปน master plate 4.4 การตรวจสอบโคโลนของเซลลแบคทเรยทไดรบพลาสมดสายผสม ใชไมจมฟนทผานการนงฆาเชอแลวมาเขยโคโลนบน master plate แลวน ามาจมลงในไมโครทวบ ขนาด 1,500 ไมโครลตรทมน ากลนนงฆาเชอ 20 ไมโครลตร และแบงมา 1 ไมโครลตรผสมกบ 10x buffer 2.5 ไมโครลตร 25mM MgCl2 2 ไมโครลตร 10mM dNTP 2 ไมโครลตร ไพรเมอร forward (AYsecYF1) และไพรเมอร reverse (AYsecYR1) (10pmol/µl) อยางละ 0.5 ไมโครลตร Taq DNA polymerase (0.1 unit/µl) 0.25 ไมโครลตร น ากลนนงฆาเชอ 16.25 ไมโครลตร น าปฏกรยาทเตรยมไว ท าปฏกรยาเพมปรมาณดเอนเอ ในเครองควบคมอณหภมไวดงนอณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท ในรอบแรก ตงแตรอบท 2 เปนตนไปนาน 1 นาท อณหภม 50 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงหมด 35 รอบ ตามดวย อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท น าผลตภณฑทไดจากปฏกรยา PCR ไปแยกขนาดของดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ใน 0.5x TBE buffer โดยน าผลตภณฑ PCR 5 ไมโครลตรผสมกบ 6x loading dye 2 ไมโครลตร น าแผน agarose gel มายอมดวย ethidium bromide นาน 10 นาท และแชน าอก 5 นาท ตรวจดแถบดเอนเอภายใตแสงอลตราไวโอเลต (UV) และบนทกภาพดวยเครอง gel documentation

5. การสกดพลาสมด 5.1 การเลยงเซลลแบคทเรย ใชไมจมฟนทผานการนงฆาเชอแลวมาเขยโคโลนบน master plate โดยเลอกโคโลนเดยวกบทน าไปแยกขนาดของดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis จากผลตภณฑ PCR ใสลงในไมโครทวบ ขนาด 1,500 ไมโครลตร ทมอาหาร LB เหลวปรมาตร 800 ไมโครลตรทเตมสารปฏชวนะแอมพซลลน ความเขมขน 100 ไมโครลตรตอมลลลตร หมปากหลอดดวยพาราฟน น าไปบมพรอมเขยาท 200 รอบตอนาท อณหภมท 37 องศาเซลเซยส นานขามคน 5.2 การสกดพลาสมดโดยใชชดส าเรจรป Genelute plasmid mini-prep น าเซลลแบคทเรยทเลยงไวมาหมนท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เตมสวนผสมระหวาง resuspension solution 200 ไมโครลตร และ RNase A 1.3 ไมโครลตร แลวเตม lysis solution 200 ไมโครลตร กลบหลอด 1- 2 ครง ตงทงไว 5 นาท เตม Neutralization solution 350 ไมโครลตร กลบหลอด 4-5 ครง น ามาหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท เตรยมคอลมนใหชมโดยใส miniprep blinding column ลงใน 2 มลลลตร ของ collection tube และเตม Column preparation solution 500 ไมโครลตร น ามาหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาทเปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง จากนนเทสวนใสทไดจากการหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ลงในคอลมนทเตรยมไว น าไปหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง ใส Optional wash solution 500 ไมโครลตร น ามาหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง เตมสวนผสมระหวาง wash solution 350 ไมโครลตร และ 100% Ethanol ทเยน 350 ไมโครลตร น ามาหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง และน ามาหมนเหวยงท 12,0000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ยาย miniprep blinding column ลงในไมโครทวบขนาด 1,5000 ไมโครลตร เตม Elution solution 35 ไมโครลตร ตงทงไว 3 นาทและน ามาหมนเหวยงท 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ส าหรบน าใชตอไป ท าการตรวจสอบพลาสมดสายผสม โดยใชเทคนค PCR สวนผสมปฏกรยา PCR ปรมาตร รวม 25 ไมโครลตร ประกอบดวย 10x buffer 2.5 ไมโครลตร MgCl2 (25mM) 2 ไมโครลตร dNTP

(10mM) 2 ไมโครลตร ไพรเมอร reverse (AYsecYR1) และ forward (AYsecYF1) (10 pmol/µl) อยางละ 5 ไมโครลตร Taq DNA polymerase (0.1 unit/µl) 0.25 ไมโครลตร น า RO ทนงฆาเชอ 16.25 ไมโครลตร และดเอนเอตนแบบ 1 ไมโครลตร น าปฏกรยา PCR ทเตรยมไว ท าปฏกรยาเพมปรมาณดเอนเอในเครองควบคมอณหภมอตโนมต PTC 100 ตงโปรแกรมการเปลยนอณหภมในแตละขนตอนไวดงน อณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท ในรอบแรก ตงแตรอบท 2 เปนตนไปนาน 1 นาท อณหภม 50 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท ทงหมด 35 รอบ ตามดวย อณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ตรวจสอบขนาดของชนดเอนเอโดยเทคนค Electrophoresis น าผลตภณฑทไดจากการท า PCR มาท าการแยกขนาดของชนสวนดเอนเอ โดยใช 1% agarose gel ใน 0.5x TBE buffer โดยน าผลตภณฑ PCR 5 ไมโครลตร ผสมกบ 6x loading dye 2 ไมโครลตร เปรยบเทยบกบ 100 bp DNA Ladder plus 1 ไมโครลตร ทความตางศกย 100 โวลต นาน 40 นาท ยอมดวย ethidium bromide ตรวจดภายใตแสงอลตราไวโอเลต และถายภาพดวยเครอง gel documentation 6. การวเคราะหล าดบนวคลโอไทดและการจดกลมเชอไฟโตพลาสมา จากนนน าขอมลล าดบนวคลดอไทดทไดมาวเคราะหเปรยบเทยบกบขอมลล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมา และจดกลมตามเชอไฟโตพลาสมาทเปนตวแทนของ 4 กลม (SecYI, SecYIV, SecYV และ SecYXII) ทมรายงานใน GenBank โดยใชโปรแกรม Clastal W และ CLC Free Workbench

ผลการทดลอง การสกดดเอนเอและการตรวจสอบดเอนเอ เมอน าดเอนเอทสกดไดจากพงพวยทไดรบการถายเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองไปตรวจสอบขนาดของชนสวนของดเอนเอ ดวยวธ gel electrophresis โดยใช 1% agarose พบวาปรากฏแถบดเอนเอทมขนาดใหญอยในระดบทสงกวา marker ซงแถบดเอนเอทปรากฏนคอ Genomic DNA การเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR เมอท าการสกดดเอนเอจากตวอยางพงพวยแลว น าดเอนเอทไดเปนตนแบบ ในการเพมปรมาณยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาดวยวธ PCR โดยไพรเมอร AYsecYF1 / AYsecYR1 จากการวเคราะหขนาดดเอนเอทไดดวย 1% agarose gel electrophoresis พบวาแถบดเอนเอมขนาด 1.3 กโลเบส ซงมขนาดใกลเคยงกบตวอยางพงพวยทเปนโรคดอกเขยว นอกจากนยงไมพบการปนเปอนในปฏกรยา PCR เนองจากไมพบดเอนเอในตวอยางทเปนน ากลนฆาเชอ (ภาพท 2) การโคลนชนดเอนเอ การโคลนชนดเอนเอขนาดประมาณ 1,200 bp เชอมตอเขากบพลาสมด pGEM®-T Easy vector ทต าแหนงของเอนไซมตดจ าเพาะของ EcoRI และตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ PstI กอนทจะเชอมตอพลาสมดทมชนสวนดเอนเอใหเปนวงกลม เพอถายเขาสเซลลแบคทเรย Escherichia coli สายพนธ DH5 การทดลองนสามารถคดเลอก recombinant clone ซงเปนโคโลนสขาวทเจรญบนอาหาร LB ทเตมสารปฏชวนะแอมพซลลน, X-Gal และ IPTG น ามาสกดพลาสมดและหาขนาดดเอนเอโดยใชเทคนค PCR ทใชไพรเมอรจ าเพาะตอยน (AYsecYF1 / AYsecYR1) วเคราะหหาโคลนทไดจาก recombinant clone ทคดเลอกไดดวยวธ 1% agarose gel electrophoresis

ภาพท 2 การเพมปรมาณของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง โดยใชไพรเมอร AYsecYF1 / AYsecYR1 จากเทคนค PCR M = Marker 100 bp DNA Ladder plus N = Negative control พงพวยปกต P = Positive control พงพวยทเปนโรคดอกเขยว Su = Sunn hemp ตวอยางพงพวยทแสดงอาการโรคแตกพมฝอยของปอเทอง H2O = น ากลนนงฆาเชอ

M N P Su H2O

1,200 bp

การวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทด หาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ทไดจากการโคลนยนตวอยางพงพวยซงมขนาดประมาณ 1,300 bp วเคราะหดวยโปรแกรม DNASTAR พบวาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY สาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองมขนาดเทากบ 1,360 bp (ภาพท 3) น าไปวเคราะหและเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของเชอไฟโตพลาสมาทเปนตวแทนของ 4 กลม คอ SecYI, SecYIV, SecYV และ SecYXII ทมรายงานใน GenBank ดวยโปรแกรม ClustalW ท าAlignmentและ Phylogenetic tree ดวยโปรแกรม CLC Free Workbench พบวามความเหมอนกนในระดบ 92 เปอรเซนต (ตารางท 1) และอยในกลมเดยวกนกบเชอไฟโตพลาสมาในกลม Aster yellows (SecYI) (ภาพท 4 และตารางท 1)

CAGCCATTTT AGCAGTTGGT GGAAATATAG AGGTAATTTA AAGATGAAAC GTCAATTAAA 60 ATTAGTTTTA GGCAATCGTA AATTAATGTT TCAAATCTTT TTTACCTTAT TTATTATTTC 120 TATTGTTTGT TTAGGAACTT CTTGGCCTCT TCCTTTTATT AATACTAAAT CCCTTGATTT 180 GCCCAAACTT TTTGGGGTTT TTTCCATAAA TACTGGTACT CTTTTTGGAT TGGGAATCAC 240 TCCTTACATC ACTGCTTCCA TTGTAGTGCA ATTTTTGCAA AAACTTCTTC CTATTTGTCG 300 CGAATGGAAA GACCAAGGAC AAATGGGCAA ACGCAAACTT AATCTTTTAA CACGTAGTCT 360 TGCCTTATTG TTTGCTTTTG GGCAATCTTT TGCTTTTTTG AACAGTTATT CAAAACTTTT 420 TGTCACATCA ATAAGTACAA GCCAACTGTT TTTGTTAGCT TTAATTGCTA CTGCAGGAGT 480 TGCTATTTTA ATTTGGTTTG CTGACCTTAT CAATTCCAAA GGTATTGGAA ACGGGACTTC 540 TATTTTAATT GGTGTTTCGA TGAGCCACAG CCTAATTAAT CTATTTGTAA ATCTGACGAA 600 TCATATTTAT CTCAAAAACA ATTTTTTAAC TTTGGAAAAC TTTTAATTTG GCAAGGAATG 660 GGTCCTTTAC CTCCCCTAAT TTTAAATTTT ACCGGGAGGG GGGCAATAAA CCTCCTTAAA 720 AAATCCCTAC CAATTATGCG CGCAATCCAA GTGCAGGGGA AAAGCTACAT TCCATTAAAA 780 TTTAATAGGC GGGAGTATGC CAGTTATTTG GGCATCTGTT TTATTGCACC TTTTCCAGAT 840 GTTAGCAGGA GTTATGGGGA ATACAAATTT TACAGATTAG TAGATTTTTT TGCCAAAACT 900 AACTTTCCTG AAACCCAAAT TAACTTTTTT GCCATAGGCT TTTTAGTCTT GTTAGTAATG 960 GTTTTTTCTT TCTTTTCTGC TTTTATGAAT GTCAATCCTG AAGATATTTC AGAACATTTA 1020 TCCAAACAAG ATGCCTATAT TGCAGGTTTA AGACCAGGTG AACAAACTAC TCGTTATTTA 1080 GCTAATACCT TATTTAAAAT CACTGTTTTA GGAACTGTTT TTATTGCTGC TCTTGTTGTA 1140 ACACCTATTC TTATGGAACA TTTTTTAGGT TTGAAAGATA TGAAATTAGG AGGAACCAGT 1200 TTGCTTATTA TTGTTAGTGT AGCCCTTGAA ACTATCCAAC GCATCAAAGC TACTGCCAAC 1260 AAAAAAGAAT ATCAAAAATT ATTTTAATTA AGCCAACAAG ACAATATGAT ACTAATATTA 1320 TTAGGACCGC CCGGAATTGG TAAAGGCACT CAAGCTTCTG 1360

ภาพท 3 ล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของ ปอเทอง

ตารางท 1 ตารางแสดงคาการวเคราะหความตางของกลมของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพม ฝอยของปอเทองและตวแทนกลมเชอ 4 กลม

Group Similarity with different phytoplasma SecY gene (%)

1 2 3 4 5

SU 100 92 59 53 58

SecYI 100 60 57 57

SecYIV 100 92 95

SecYV 100 92

SecYXII 100

ภาพท 4 Phylogenetic tree แสดงความสมพนธของล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโต พลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองกบขอมลของเชอไฟโตพลาสมาทมรายงาน ใน GenBank

0.350

0.178

SecYI

SecYV

SecYIV SecYXII

SU

0.243

0.151

0.712

0.031 0.058

0.007

0.007

0

วจารณผลการทดลอง

จากผลการทดลองในกระบวนการเพมปรมาณดเอนเอของแพงพวยทไดรบการถายทอดเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง ดวยเทคนค PCR พบวา แถบดเอนเอทมขนาดประมาณ 1.3 กโลเบส ซงคาดวานาจะเปนชนสวนของยน SecY ทตองการเมอน ามาเปรยบเทยบกบแถบดเอนเอของแพงพวยทเปนโรค เนองจากไพรเมอรทใชคอ AYsecYF1 / AYsecYR1 เปน specific primer ทมความจ าเพาะกบยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาโดยเฉพาะ จากการวเคราะหขอมลนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง เมอน ามาเปรยบเทยบกบขอมลล าดบนวคลโอไทดทง 4 กลม ของเชอไฟโตพลาสมาทมรายงานในฐานขอมล GenBank โดยใชโปรแกรม Clustal W และท า phylogenetic tree พบวาเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทองมความสมพนธใกลชดและถกจดไวในกลม SecYI หรอ Aster yellows ทระดบความเหมอน 92 ปอรเซนต โดยผลการทดลองครงนอางองการจ าแนกเชอไฟโตพลาสมากลม Aster yellowsโดยใชเทคนคทางดานโมเลกลของ Lee และคณะ (2005) Lee และคณะ (2005) ไดท าการศกษาการจดจ าแนกเชอไฟโตพลาสมากลม Aster yellows ซงเปนสาเหตทกอใหเกดโรคกบพชเศรษฐกจมากกวา 100 ชนด โดยใชเทคนค RFLP ดวยการใชยน SecY เปนตวจดจ าแนกและเปรยบเทยบกบล าดบเบสของยน 16S rDNA, ยน tuf และยน rp จาก 20 ตวอยางในกลม Aster yellows พบวา สามารถจดกลมเชอไฟโตพลาสมากลมยอยของกลม Aster yellows ได 10 กลมยอยทมความหลากหลายและละเอยดมากกวาใชยน 16S rDNA เนองจาก SecY มคาความคลายคลงทต ากวา 16S rDNA

สรปผลการทดลอง

จากการศกษาล าดบนวคลโอไทดของยน SecY ของเชอไฟโตพลาสมา สาเหตโรคแตกพมฝอยของปอเทอง ซงไดถายทอดเชอและเกบไวในพงพวย พบวามขนาด 1,360 bp และเมอท าการวเคราะหเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของตวอยางกบเชอไฟโตพลาสมาทมฐานขอมลอยใน GenBank ทง 4 กลม พบวามความใกลชดและมคาความเหมอนทระดบ 92 เปอรเซนตกบเชอทอยในกลม SecYI (Aster yellows)

เอกสารอางอง

กรมพฒนาทดน. กระทรวงเกษตรและสหกรณ. Available : www.ldd.go.th/Lddwebsite/web_ord/ Technical/pdf/P_Technical11002.pdf [23 ตลาคม 2550] กรมพฒนาทดน. 2541. พชตระกลถวเพอการปรบปรงดน. เฟรสเพรส, กรงเทพฯ. น.69-72. ดวงใจ ชปญญา, ถวล ศรสมชย และ ชวลตร พรเมอง. 2513. ความสมพนธระหวาง Mycoplasma กบ โรค phyllody ของงา. รายงานประจ าป 2513 ศนยเกษตรภาคตะวนออกเฉยงเหนอ ส านกงานปลดกระทรวงเกษตรและสหกรณ. 449-456 น. ธระ สตะบตร. 2532. โรคไวรสและโรคคลายไวรสของพชส าคญในประเทศไทย. ฟนนงพบลชชง. กรงเทพฯ. 310 น. ประสาทพร สมตะมาน. 2527. โรคพชวทยา. ภาควชาโรคพช คณเกษตรศาสตร มหาวทยาลย ขอนแกน,ขอนแกน. 271 น. พรทพย วงศแกว. 2533. โรคพชวทยาขนสง. หางหนสวนจ ากด ฟนนพบลชชง, กรงเทพฯ. 282 น. ไพโรจน จวงพานช. 2525. หลกวชาโรคพช. สารมวลชน, กรงเทพฯ. 344 น. มกดา สขสวสด. 2548. ปยอนทรย ใน ชดคมอการเกษตร ล าดบท 1. อมรนทรพรนตงแอนดพบลช ชง, กรงเทพฯ. น.150-152. ส านกสงเสรมและฝกอบรมสถานวทย ม.ก. Available : www.eto.ku.ac.th/neweto/e-book/other/ other5.pdf [22 ตลาคม 2550] สชาดา บญญเลสนรนตร. 2542. เอกสารประกอบการสอนวชา 03-43-302 พชน ามน (Oil Crop). สถาบนวจยและฝกอบรมการเกษตรล าปาง สถาบนเทคโนโลยราชมงคล กระทรวง ศกษาธการ, ล าปาง. 211 น.

สพฒน อรรถธรรม. 2528. โรคพชทเกดจากเชอไวรส. ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลย เกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. สภาพร กลนคง. 2533. การถายทอดเชอมายโคพลาสมาโรคแตกพมฝอยของงาและปอเทองโดยการ ใชฝอยทอง (Cuscuta sp.) ใน เทคนคของวธการทางวทยาศาสตรชวภาพ, รายงานการ ประชมวชาการครงท 9 ระหวางวนท 19-21 พฤศจกายน 2533. ณ ศนยปฏบตการวจยและ เรอนปลกพชทดลอง สถาบนวจยและพฒนาฯ มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขต ก าแพงแสน นครปฐม. น. 51. สภาพร กลนคง. 2542. การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา. ในการวนจฉยโรคพช. ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. น. 150-155. สภาพร กลนคง, พสสวรรณ เจยมสมบต, สพฒน อรรถธรรม และรงโรจน อทศน. 2540. ความ หลากหลายทางพนธกรรมของเชอไฟโตพลาสมาสาเหตโรคพชบางชนดทพบในประเทศ ไทย, น. 418-425. ใน การประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 35 สาขาพช สงเสรมและนเทศศาสตรเกษตร อตสาหกรรมเกษตร วนท 3-5 กมภาพนธ 2540. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. สรนทร ปยะโชคคณากล. 2539. พนธวศวกรรมเบองตน. ภาควชาพนธศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. สวณ สภเวชย. 2532. มยโคพลาสมา, น.169-175. ใน นรกล สระพฒน, จนทรเพญ ววฒน, ปรชา พทธาวฒไกร, สวณ สภเวชย และ ประมวญ เทพชยศร (ผรวบรวม). จลชววทยาทาง การแพทย. กรงเทพเวชสาร, กรงเทพฯ. Ahrens, U. and E. Seemuller. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasma-like organisms by a polymerase chain reaction that amplified a sequence of 16S rDNA gene. Phytopathol. 82 : 828-832.

Alma, A., R.E. Davis, M. Vibio, A. Danielli, D. Bosco, A. Arzone and A. Bertaccini. 1996. Mixed infection of grapevines in Northern Italy by phytoplasma including 16s rRNA RFLP subgroup 16srl-B strains previously unreported in this host. Plant Dis. 80 : 418- 421. Arnaud, G., S.M. Maher, P. Salar, P. Bonnet, M. Maixner, C. Macrone, E.B. Padieu and X. Foissac. 2007. Multilocus sequence typing confirms the close genetic interrelatedness of three distinct Flavescence Dorée Phytoplasma Strain Clusters and Group 16SrV Phytoplasmas Infecting Grapevine and Alder in Europe. Appl Environ Microbiol. 73(12): 4001–4010. Bos, L. 1983. Introduction to Plant Virology. Longman, London and New York. 160 p. Davies, D.L. and M.F. Clark. 1994. Maintenance of mycoplasma-like organism occurring in Pyrus species by micropropagation and their elimination by tetracycline therapy. Plant Path. 43 : 819-823. Doi, Y.M. Teranaka and H. Asuyama. 1967. Mycoplasma or PLT group-like microorganism found in the phloem elements of plant infected with mulberry dwarf, potato witches’ broom. Ann. Phytopath. Soc. Japan. 33 : 259-266. Freundt, E.A. 1981. Isolation, characterization and identification of spiroplasma and MLOs, pp. 1-34. In K. Maramorosch and S.P. Raychaudburi (eds.). Mycoplasma Diseases of Tree and Shrubs. Academic Press Inc., New york. Gibb, K.S., B. Schneider and A.C. Padovan. 1998. Differential detection and genetic relatedness of phytoplasma in papaya. Plant Path. 47 : 325-332.

Harrison, N.A., P.A. Richardson, J.H. Tsai, M.A. Ebbert and J.B. Kramer. 1996. PCR assay for detection of the phytoplasma associated with maize bushy stunt disease. Plant Dis. 80 : 263-269. Hayflick, L. and R.M. Chanock. 1965. Mycoplasma species of man. Bact. Rev. 29 : 185-221. Hsu, H.T., I.M. Lee, R.E. Davis and Y.C. Wang. 1990. Immunization for generation of hybridoma antibodies specifically reacting with plant infect with a mycoplasma-like organism (MLO) and their use in detection of MLO antigens. Phytopath. 80 : 946-950. Hull, R. 1971. Mycoplasma-like organism in plants. Rev. Pl. Path. So : 121-130. ______. 1972. Mycoplasma and plant disease. PANS 18 : 154-160. International Committee on Systematic Bacteriology, Sub-committee on the taxonomy of Mollicutes. 1995. Minute of the Imterim meetings, 17 and 26 July, 1994, Bordeaux, France. Internation of Systematic Bacteriology. 47 : 911-914 Lee, I.M., R.E. Davis, T.A. Chen, L.N. Chiykowski, J. Fletcher, C. Hiruki and Schaff. 1992. A genetype-based system for identification and classification of mycoplasma-like organisms (MLOs) in the aster yellows MLOs strain cluster. Phytopathology. 82 : 977- 986. Lee, I.M., R.W. Hammond, R.E. Davis and D.E Gundersen. 1993. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasma-like organisms. Phytopathol. 83 : 834-842. Lee, I.M., D.E. Gundersen-Rinal, R.E. Davis and I.M. Bartoszyk. 1998. Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences. Int. J. Syst. Bacterial. 48 : 1153-1169.

Lee, I.M., R.E. Davis, D.E. Gundersen-Rindal. 2000. Phytoplasma : Phytopathogenic mollicutes. Annual Review of Micrology. 54 : 221-225. Lee, I.M., Y. Zhao and K.D. Bottner. 2005. SecY gene sequence analysis for finer differentiation of diverse strains in the aster yellows phytoplasma group. [Online], 20 (2006) 87-91. Available : http://www.elsevier.com/locate/ymcpr [2007, October 21] Margaret A.S., M.C. William, J.D. Cathrine and M.F Ann. 2005. Modeling the effects of prI mutations on the Escherichia coli SecY complex. Journal of Bacteriology. 187 : 6454- 6465. Marcone, C., A. Ragozzino, B. Schneider, W. Smart and E. Seemuller. 1996. Genetic characterization and classification of two phytoplasmas associated with spartium witches’ broom disease. Plant. Dis. 80 : 365-371. Marcone, C.A. Ragozzino and E. Seemuller. 1997b. Detection of Bermuda grass white leaf disease in Italy and characterization of the associated phytoplasma by RFLP analysis. Plant Dis. 81 : 862-866. Marcone, C.H.A. Neimark, U. Ragozzino. Lauer and E. Seemuller. 1999. Chromosome Sizes of Phytoplasmas Composing Major Phylogenetic Groups and Subgroup. Bacteriology. 89 : 805-810. Martha, A.F., J.D. Castello and M.A. Sinclair. 1989.Effect of virus and mycoplasma-like organism infection on green and white ash. Phytopath. 79 : 579-583. Mathews, R.E. 1992. Fundamentals of Plant Virology. Academic Press, San Diego. 403 p.

McCoy, R.E. 1984. Mycoplasma-like organisms of plant and Invertebrates, pp. 792-793. In B. Transill (ed.). Bergay’s Manual of Systemic Bacteriology Vol.12nd ed. Williams and Wilking, Baltimore. McCoy, R.E., Caudwell, A., Chang, C.J., Chen, T.A., Chiykowshi, L.N., Cousin, M.T., Dale, J.L., De Leeuw, G.T.N., Golino, D.A., Hackett, K.J., Kirkpatrick, B.C., Marwitz, R., Petzold, H., Sinha, R.C., Sugiura, M., Whitcomb, R.F., Yang, I.L., Zhu, B.M. and Seemuller, E. 1989. Plant disease associated with mycoplasma-like organisms. In The Mycoplasma, Vol.5 (Whitcomb, R.F. and Tully, J.G. eds.), Academic Press, New York, pp. 545-640. Overman, M.A., N.J. Ko and J.H. Tsai. 1992. Identification of virus and mycoplasma in maize by use light microscopy. Plant Dis. 76 : 318-322. Pu Tian and Andricioaei Ioan. 2006. Size, motion and function of the SecY revealed by the molecular dynamics stimulations with virtual probes. Biophysial Journal. 90 : 2718 - 2730. Raychaudhuri, S.P. and D.K. Mitra. 1993. Mollicute Disease of Plants. International Science Publisher, New York. 113 p. Seemuller, E. 1976. Investigations to demonstrate mycoplasma-like organisms in disease plants by fluorescence microscopy. Actahortic. 67 : 109-112 Seemuller, E., B. Schneider, R. Maurer and 7 other authors. 1994. Phylogenetic classification of phytopathogenic mollicutes by sequence analysis of 16S ribosomal DNA. Int. J. System. Bacteriol. 44 : 440-446. Seemuller, E., C. Marcone, U. Lauer U., A. Ragozzino, M. Goschl. 1998. Current syayus of molecular classification of the Phytoplasmas. Journal of Plant Pathology. 80 : 671-675.

Shen, W.C. and C.P. Lin. 1993. Production of monoclonal antibodies against a mycoplasma-like organisms associated with sweet potato witches’ broom. Phytopathol. 83 : 671-675. The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team-Phytoplasma taxonomy group : Candidatus Phytoplasma, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. www.en.wikipedia.org /wiki/phytoplasma. 2006. Toth, K.F., N. Harrison and B.B. Sears. 1994. Phylogenetic relationships among members of the Class Mollicutes deduced from rps3 gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 44 : 119-124. White, D.T., L.L. Blackall, P.T. Scott and K.B. Waish. 1998. Phylogenic positions of phytplasma associated with dieback, yellow crinkle and mosaic disease of papaya, andtheir proposed inclusion in Candidatous phytoplasma australiense and new taxon, Candidatus phytoplasma Australasia. Int.J.Syst. Bacteriol. 48 : 941-951.