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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS – UFMG
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
FLAVIANA RIBEIRO FERNANDES
AÇÃO DA ACETONA SOBRE AS CORRENTES DE SÓDIO EM
NEURÔNIOS DOS GÂNGLIOS DAS RAIZES DORSAIS DE RATOS
Belo Horizonte
2008
Livros Grátis
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ii
FLAVIANA RIBEIRO FERNANDES
AÇÃO DA ACETONA SOBRE AS CORRENTES DE SÓDIO EM
NEURÔNIOS DOS GÂNGLIOS DAS RAIZES DORSAIS DE RATOS
Dissertação submetida ao Departamento de
Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Miguel José Lopes
Colaboradora: Profa. Dra. Maria Carolina Doretto
Belo Horizonte
2008
iii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Flávio e Francisca, por serem os meus
exemplos de vida, meus melhores amigos, que sempre me apoiaram e incentivaram
a seguir sempre em frente, pelos conselhos e por serem os grandes orientadores da
minha vida.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a cima de tudo a Deus, e aos meus Santinhos, que me iluminaram por
toda vida.
Ao André, meu amorzinho, pela paciência imensurável, pelo incentivo nas horas
mais difíceis, pelo amor e carinho.
Ao meu querido orientador, Miguel, pela credibilidade e confiança depositada, pelos
muitos ensinamentos e conselhos.
Às professoras Maria Carolina Doretto e Lígia Naves pela colaboração e amizade.
Aos professores Christopher Kuschmerick, Sílvia Guatimosim, Maria Aparecida
Vieira e Leida Botiom pela contribuição científica, pela amizade e por estarem
sempre dispostos a ajudar.
Aos professores do LAMEX, Paulo Beirão e Jader Cruz, pelo apoio, por ceder o
laboratório para a realização de parte dos meus estudos e pela amizade.
Ao meu grande amigo, meu irmão Rafael Machado pela amizade, companheirismo e
muita paciência demonstrada ao longo dessa jornada.
Aos meus grandes amigos do Laboratório Eletrocel e Cardiomol, Priscila Elisa,
Verônica, Naiara, Jussara, Daniella Almeida, Fabíola, Marcinha, Marina Ladeira,
Fabrício, Pedro, Enéas, Mariana Gaviolli, Mariana Rosa, Amanda, Juliana, Léo e
Aline por tornarem o dia a dia super agradável.
Ao Ricardo Lima, meu cearense preferido, pela amizade, apoio e pelos grandes
ensinamentos.
Ao Adriano, pela amizade, apoio, pelas boas conversas e risadas.
v
Aos meus queridos irmãozinhos, Éder e Anita, pela amizade, compreensão,
generosidade, conselhos e incentivo.
Aos meus amigos dos Laboratórios de Renal, Metabolismo Celular, LAMEX, NNC,
Farmacologia, Angiogênese, Biofísica de Sistemas Nanoestruturados, Hipertensão e
Endócrino.
Aos meus queridos tios, pelas orações e apoio.
À Rose, pelos conselhos e amizade.
À Rose, da limpeza, pelo carinho e por sua alegria contagiante.
Aos professores do Departamento de Fisiologia e Biofísica e de Farmacologia, pelos
ensinamentos e pela contribuição do meu amadurecimento científico.
E a todos que de alguma forma me ajudaram.
vi
SUMÁRIO
LISTAS DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS........................................... vii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... viii
LISTA DE TABELAS............................................................................................... ix
RESUMO................................................................................................................ x
ABSTRACT............................................................................................................. xi
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................ 14
3 JUSTIFICATIVA................................................................................................... 24
4 OBJETIVOS......................................................................................................... 25
5 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 26
6 RESULTADOS..................................................................................................... 34
7 DISCUSSÃO........................................................................................................ 52
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 56
vii
LISTAS DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico
AMPc Adenosina Monofosfato cíclico
ATP Adenosina Trifosfato
ASICs Canais Iônicos sensíveis a Ácido (do inglês, Acid-sensing Ion
Channels)
BKCa Canais para Potássio sensíveis ao Cálcio
DRG Gânglio da Raiz Dorsal (do inglês, Dorsal Root Ganglions)
GABA Ácido γ-aminobutírico
GMPc Guanosina Monofosfato cíclico
IC50 Concentração necessária para inibir 50% dos canais
KD Dieta cetogênica (do inglês, Ketogenic Diet)
NaV Canais para Sódio dependentes de Voltagem
NAN Canais para Sódio dependentes de Voltagem isoforma 1.9 (Nav 1.9)
NMDA N-metil-D-aspartato
NMDG N-metil-D-glucamina
PTZ Pentilenotetrazol
PUFAS Ácidos Graxos Poliinsaturados (do inglês, Poly-unsaturated fatty acids)
SNS Canais para Sódio dependentes de Voltagem isoforma 1.8 (Nav 1.8)
TEA Tetraetilamônio
TTX Tetrodotoxina
TTX-R Canais para Sódio dependentes de Voltagem resistentes à
tetrodotoxina
TTX-S Canais para Sódio dependentes de Voltagem sensíveis à tetrodotoxina
V50 Potencial necessário para que 50% dos canais alcancem a ativação ou
inativação
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Organização das subunidades dos canais para sódio....................... 17
Figura 2 Curva concentração-resposta da acetona sobre as correntes de
sódio de corpos celulares de gânglios da raiz
dorsal.................................................................................................. 35
Figura 3 Registros representativos de correntes de sódio em neurônios dos
gânglios da raiz dorsal........................................................................ 37
Figura 4 Relação condutância - voltagem do processo de ativação das
correntes de sódio totais (na ausência de tetrodotoxina)................... 39
Figura 5 V50 do processo de ativação dos canais para sódio........................... 40
Figura 6 Dependência de voltagem do processo de inativação no estado
estacionário das correntes de sódio totais (na ausência de
tetrodotoxina)...................................................................................... 42
Figura 7 V50 do processo de inativação dos canais para sódio........................ 43
Figura 8 Registros representativos de correntes de sódio TTX-R em
neurônios dos gânglios da raiz dorsal................................................ 45
Figura 9 Dependência de voltagem do processo de ativação das correntes
de sódio TTX-R, na ausência e na presença de 20 mM de
acetona............................................................................................... 47
Figura 10 Dependência de voltagem do processo de inativação no estado
estacionário das correntes de sódio TTX-R, na ausência e na
presença de 20 mM de acetona......................................................... 49
Figura 11 Registros dos potenciais de ação em neurônios DRGs..................... 51
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela I Características dos canais para sódio em neurônios DRGs............ 21
Tabela II Solução de dissociação dos corpos celulares de DRGs.................. 26
Tabela III Solução de pipeta empregada para medida de correntes de sódio. 30
Tabela IV Solução de banho empregada para medida de correntes de sódio. 31
Tabela V Solução de Ringer............................................................................ 31
Tabela VI Solução de pipeta (KCl) empregada para o registro de potenciais
de ação.............................................................................................
32
x
RESUMO
Os corpos cetônicos, acetona, 3-D-hidroxibutirato e acetoacetato, encontram-se
aumentados no plasma de pacientes tratados com a dieta cetogênica, empregada
como terapia alternativa para o tratamento de epilepsia resistente às drogas. Para
testar a hipótese de que a acetona está atuando sobre a excitabilidade celular,
avaliamos seu efeito sobre os canais para sódio dependentes de voltagem, quando
administrada agudamente, em corpos neuronais do gânglio da raiz dorsal (DRG) de
ratos. Para o registro das correntes foi utilizada a técnica de “patch-clamp” na
configuração “whole-cell”. Como os corpos celulares dos neurônios DRGs
apresentam diferentes isoformas de canais para sódio dependentes de voltagem,
sendo alguns deles sensíveis (TTX-S) e outros resistentes à tetrodotoxina (TTX-R),
realizamos medidas na presença e ausência desta toxina (250 nM). A acetona
diminuiu as correntes de sódio com uma IC50 de 21,5 mM. Na análise dos processos
de ativação e inativação no estado estacionário, a acetona demonstrou dois efeitos
distintos sobre os canais para sódio. O V50 do processo de ativação das correntes de
sódio, na ausência de TTX mostrou-se mais despolarizado: -29,8±1,03 mV para o
controle e -24,0±0,87 mV para acetona 20 mM. Na presença de tetrodotoxina não
houve diferença significativa no processo de ativação das correntes TTX-R,
enquanto que no processo de inativação, o V50 tornou-se mais hiperpolarizado: -
39,40±0,20 mV para o controle e -46,69±0,32 mV para acetona 20 mM. Concluímos
que a acetona exerce um efeito duplo sobre a excitabilidade celular, dificultando o
processo de ativação das correntes TTX-S e facilitando o processo de inativação das
correntes TTX-R.
xi
ABSTRACT
A high fat, very low carbohydrate diet is effective to treat drug resistant epilepsy.
Such a diet produces increased plasma levels of ketone bodies (acetone, 3-D-
hydroxybutyrate, and acetoacetate). To test the hypothesis that acetone per se can
decrease cellular excitability, we measured sodium currents present in dorsal root
ganglia (DRG) neurons cells of rats using the whole-cell configuration of the patch
clamp technique. DRG neurons express a mixture of both tetrodotoxin-sensitive
(TTX-S) and tetrodotoxin-resistant (TTX-R) sodium current that arises from distinct
sodium channel isoforms. To distinguish these, we measured sodium currents in the
presence or absence of TTX (concentration 250 nM). Acetone (21.5 mM) reduced the
amplitude of the total sodium current (TTX-S and TTX-R) by 50%, independent of the
voltage used to elicit current. Acetone also shifted the half-activation voltage to
depolarized values (-29.8±1.03 mV control vs -24.0±0.87 mV with 20 mM acetone).
In contrast, when measured in the presence of tetrodotoxin, acetone caused no
significant effect on the voltage dependence of activation, but shifted the half-
inactivation voltage to more negative values: (-39.40±0.20 mV in control vs -
46.69±0.32 mV in 20 mM acetone). We conclude that acetone has a dual effect on
the cell excitability, hindering the process of activation of current TTX-S and
facilitating the process of inactivation of the current TTX-R.
12
1 INTRODUÇÃO
Canais iônicos são proteínas integrais de membrana fundamentais para o
funcionamento celular. Entre todos, os canais para sódio dependentes de voltagem
constituem um grande grupo que confere excitabilidade às células, desempenhando
um papel essencial na geração e propagação do potencial de ação em neurônios e
outras células excitáveis, como as de músculo estriado e algumas neuroendócrinas.
A expressão de isoformas diferentes de canais para sódio nas células determina sua
funcionalidade no que diz respeito à freqüência de disparo, velocidade de
propagação e reobase dos potenciais de ação. Os neurônios dos gânglios das
raízes dorsais (DRGs), responsáveis por transmitir informações sensoriais da
periferia para o sistema nervoso central, apresentam dois tipos de correntes de
sódio: as sensíveis à tetrodotoxina, representadas pelas isoformas Nav 1.1; 1.2; 1.3;
1.6 e 1.7 e as resistentes à tetrodotoxina representadas pelas isoformas Nav 1.5; 1.8
e 1.9, em proporções variáveis, dependendo do tamanho do corpo celular (ZHOU;
ZHAO, 2000).
A presença de múltiplas isoformas de canais para sódio nos neurônios DRG, garante
um controle preciso da excitabilidade celular, o que os tornam alvos terapêuticos,
pois os bloqueadores clássicos dos canais para sódio usados para reduzir a
excitabilidade celular, como os anestésicos locais, anticonvulsivantes e
estabilizadores de membrana apresentam pouca especificidade. Portanto, o modelo
apresenta amplas possibilidades para rastreamento de efeitos de drogas.
A dieta cetogênica tem sido empregada desde de 1920 como tratamento para casos
de epilepsia resistente às drogas. Trata-se de uma dieta rica em gordura e pobre em
carboidrato e proteínas. Porém, até os dias atuais, não se sabe ao certo qual é o
mecanismo de ação pelo qual essa dieta exerce seu efeito anticonvulsivante. Dentre
as várias hipóteses, o aumento da síntese de corpos cetônicos, composto por 3-D-
hidroxibutirato, acetoacetato e acetona, seria o responsável por modular a
excitabilidade celular (BOUGH; RHO, 2007).
Poucos trabalhos abordam o estudo funcional dos canais iônicos, mais
especificamente dos canais para sódio, sobre a excitabilidade dos neurônios
13
submetidos ao tratamento agudo com corpos cetônicos. Com base no exposto, a
proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da acetona, administrada agudamente,
sobre os canais para sódio dependentes de voltagem e para isto utilizamos corpos
celulares de neurônios DRGs de ratos.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CANAIS IÔNICOS
Os canais iônicos são complexos macromoleculares formados por proteínas
integrais de membrana que formam vias condutivas, de seletividade variada, que
permitem o fluxo de íons de um lado da membrana para o outro. As diferenças de
concentrações iônicas entre o líquido extracelular (LEC) e o líquido intracelular (LIC),
somadas à permeabilidade seletiva da membrana, resultam na geração de
gradientes de potenciais eletroquímicos para cada íon. As diferenças de potenciais
elétricos observados nas membranas são causadas pelo fluxo iônico a favor destes
gradientes eletroquímicos, e os tipos de canais existentes determinam as
características eletrofisiológicas de cada célula (HILLE, 2001). Além disso, o
gradiente eletroquímico determina o potencial de repouso da membrana celular, a
geração e propagação do potencial de ação, a regulação do volume celular, além do
transporte de substâncias. (ORLOV; HAMET, 2006).
Os canais iônicos podem ser classificados de acordo com os agentes químicos ou
físicos que controlam a sua a ativação, assim são divididos em grupos:
1. Canais ativados por variação do potencial de membrana, descritos como canais
ativados por (ou dependentes de) voltagem, estes apresentam uma seletividade a
um determinado íon específico (sódio, potássio ou cálcio) o que lhes confere suas
nomenclaturas, por exemplo, canais para sódio dependentes de voltagem.
2. Canais ativados por ligantes extracelulares, como os receptores para
neurotransmissores, por exemplo, receptor do tipo AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-
metil-4-isoxazolepropiônico) ativados por glutamato e os canais sensíveis a ácido
(ASICs, do inglês, Acid-sensing Ion Channels).
3. Canais ativados por segundos mensageiros ou ligantes intracelulares, como: íons
cálcio, ATP, AMPc ou GMPc, e incluem, por exemplo, os canais para potássio ou
cloreto ativados por cálcio.
15
4. Canais ativados por pressão ou deformação, por exemplo, os canais para cloreto
ativados por aumento de volume celular ou estiramento da membrana.
Alguns canais respondem a múltiplos estímulos, como por exemplo, o receptor
NMDA (N-metil-D-aspartato) que é ativado não apenas pela interação do ligante
glutamato, mas também por mudança do potencial de membrana e apenas conduz
quando o glutamato estiver ligado e a membrana estiver despolarizada. Outros
canais, como os canais para potássio sensíveis ao cálcio (BKCa), também podem ser
ativados pela despolarização da membrana.
Nos últimos anos houve uma expansão na descoberta de doenças causadas por
mutações nos genes que codificam as proteínas dos canais iônicos, que levam ao
desenvolvimento de fisiopatologias nas áreas neurológica, cardíaca, renal e
respiratória. As síndromes causadas por disfunção dos canais são referidas como
canalopatias (CATTERALL, 2000; GRAVES, 2006).
2.2 CANAIS PARA SÓDIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM
Os canais para sódio desempenham um papel essencial na geração e propagação
do potencial de ação em neurônios e em outras células excitáveis, como as
musculares cardíacas, as esqueléticas e as células neuroendócrinas (CATTERAL,
2000; CATTERAL et al., 2005)
Outros canais dependentes de voltagem como, por exemplo, canais para potássio
ou para cálcio, apresentam uma arquitetura semelhante ao canal para sódio que é
composto por uma subunidade α e uma ou mais subunidades β auxiliares (YU;
CATTERALL, 2003; CATTERALL et al., 2003). A principal subunidade do canal para
sódio, chamada subunidade α, é uma proteína transmembrana com
aproximadamente 2000 resíduos de aminoácidos (260 kDa), composta por quatro
domínios homólogos, e cada domínio contêm seis segmentos transmembranas (S1-
S6), os quatro domínios associados dentro da membrana formam o poro permeável
ao íon ( CATTERALL, 2000; GOLDIN, 2003), conforme observado na figura 1.
Stühmer e colaboradores, em 1989, demonstraram através de estudos mutagênicos
que o segmento S4, composto por resíduos de aminoácidos carregados
16
positivamente, funciona como sensor de voltagem. O movimento das cargas deste
sensor em resposta à despolarização da membrana está associado com a ativação
do canal.
Cada subunidade α está associada com uma ou mais subunidades β auxiliares (β1 a
β4), que são glicoproteínas compostas por um único domínio transmembrana com
um pequeno terminal-carboxila intracelular (33-36 kDa) (VIJAYARAGAVAN et al.,
2004). Elas influenciam o nível de expressão do canal na superfície celular, as
alterações cinéticas nas correntes geradas pela subunidade α e ainda a
dependência de voltagem. As subunidades β também funcionam como moléculas de
adesão celular, realizando interações com a matriz extracelular, e estão envolvidas
na regulação da migração e agregação celular e interação com proteínas do
citoesqueleto (ISOM et al., 1994; ISOM, 2002).
17
Figura 1 : Organização das subunidades dos canais para sódio.
Os 4 domínios homólogos da subunidade α estão representados por cilindros, que associados dentro da membrana formam o poro permeável ao sódio. Sombreamentos entre os segmentos S5-S6 estão localizados os resíduos de aminoácidos, que formam o filtro de seletividade iônica e o sítio de ligação da tetrodotoxina. Os segmentos S4 da subunidade α, carregados com cargas positivas representam o sensor de voltagem. Os cilindros das extremidades representam as subunidades β1 e β2. LEC representa o Líquido Extracelular e LIC, o Líquido Intracelular. Esta figura foi baseada em dados de CATTERALL, 2000 e MEISIER; KEARNEY, 2005.
IV III
II I
Inativação
LEC
Poro
Membrana
LIC
18
Variações do potencial de membrana podem abrir e/ou fechar os canais para sódio
dependentes de voltagem, causando uma mudança conformacional de sua estrutura
e esta transição ocorre numa escala temporal de milissegundos. A condutância dos
canais para sódio durante o potencial de ação é modificada transitoriamente. Após a
abertura, o canal para sódio é inativado quando o poro é ocluído por porções
citoplasmáticas do canal constituídas por três resíduos de aminoácidos hidrofóbicos
IFM (isoleucina-fenilalanina-metionina) (WEST et al., 1992; YU; CATTERALL, 2003),
presentes em uma região do canal diferente daquela que controla a ativação. Este
estado no qual o canal encontra-se não condutivo é chamado de inativação,
essencial para o retorno do potencial da membrana ao repouso (HILLE, 2001). Este
segmento é estruturalmente conservado em toda escala filogenética. O estado
inativado é distinto do estado fechado e a inativação é removida somente quando o
potencial de membrana retorna ao repouso. Dessa forma, a inativação contribui para
o surgimento dos períodos refratários, tempo após um potencial de ação onde um
neurônio se torna menos excitável ou não excitável, ou seja, período refratário
relativo e período refratário absoluto, respectivamente. Assim, a inativação também
contribui com a freqüência de potenciais de ação (CATTERALL et al., 2002;
CATTERALL et al., 2005). Como as informações no sistema nervoso são codificadas
pela freqüência de potenciais de ação, a cinética e a dependência de voltagem da
inativação são importantes parâmetros para entender a função fisiológica e
patológica dos canais para sódio.
Existem nove isoformas de canais para sódio dependentes de voltagem em
mamíferos (GOLDIN et al., 2000), sua nomenclatura foi baseada nos canais para
potássio dependentes de voltagem (CHANDY, 1991; CHANDY; GUTMAN, 1993),
onde é usado um sistema numérico para definir subfamília e subtipos baseado nas
similaridades entre a seqüência de aminoácidos dos canais. O nome consiste no
símbolo químico do principal íon permeante (sódio – Na+) com o principal regulador
fisiológico (voltagem) indicado como subscrito (Nav). O número seguinte ao subscrito
indica o gene da subfamília (normalmente Nav1), e o número seguinte ao ponto
decimal identifica a isoforma específica do canal (exemplo Nav1.1).
19
Fatores exógenos, como drogas e toxinas, podem afetar os sítios funcionais do
canal para sódio, se ligando a receptores específicos da molécula ou simplesmente
bloqueando a via condutiva, podendo alterar deste modo a permeação, a
dependência de voltagem e a cinética de ativação e inativação do canal (CESTÈLE;
CATTERAL, 2000).
A tetrodotoxina, utilizada como importante ferramenta para o estudo molecular e
eletrofisiológico dos canais para sódio, age como um bloqueador seletivo e
reversível em várias preparações de neurônios (NARAHASHI, 1988; ROY;
NARAHASHI, 1992). Baseado na diferença de sensibilidade à tetrodotoxina e na
cinética de ativação e inativação do canal, as correntes de sódio foram tipicamente
classificadas em: (SCHOLZ et al., 1998, CUMMINS et al., 1999; RENAGANATHAN
et al., 2000; RENAGANATHAN et al., 2002).
1) sensíveis à TTX (TTX-S) de ativação e inativação rápida,
2) resistentes à TTX (TTX-R) rápidas,
3) TTX-R de inativação lenta,
4) TTX-R persistentes.
Os canais para sódio TTX-S são bloqueados por concentrações nanomolares da
toxina, e de acordo com Elliott e Elliott (1993), 100 nM de tetrodotoxina são
suficientes para suprimir 97% das correntes TTX-S em neurônios.
Os canais para sódio TTX-R são representados por três isoformas do canal, Nav1.5,
Nav1.8 e Nav1.9. As correntes TTX-R rápidas apresentam propriedades biofísicas
semelhantes às das correntes TTX-S, e são compatíveis com as correntes geradas
pelos canais Nav 1.5. (RENAGANATHAN et al., 2000; RENAGANATHAN et al.,
2002; LAI et al., 2004; RUSH et al., 2007). As correntes TTX-R de inativação lenta
apresentam uma cinética de ativação e inativação relativamente lenta, porém sua
recuperação da inativação é rápida, permitindo assim uma atividade sustentada
enquanto outros subtipos de canais estão inativados. Os canais Nav1.8 (SNS)
exibem este tipo de corrente, importantes para a geração dos potenciais de ação
nos neurônios, enquanto os canais Nav1.9 (NaN) produzem as correntes TTX-R
persistentes que contribuem para a determinação do potencial de repouso da
membrana dos neurônios, modulando a sua excitabilidade, e também para a
20
despolarização associada a estímulos sublimiares (ELLIOT; ELLIOT, 1993; OGATA;
TATEBAYASHI, 1993; AKOPIAN et al., 1996, SANGAMESWARAM et al., 1996,
HERZOG et al., 2001). A cinética de ativação desta corrente é muito lenta, ela só se
torna ativa na fase de repolarização do potencial de ação, podendo prolongar essa
fase.
Existe ainda, outra corrente de cinética peculiar conhecida como corrente
ressurgente. Essa corrente exibe uma reativação e inativação lenta sobre a
repolarização rápida, sua expressão pode estar limitada a grandes neurônios DRGs.
Os canais Nav 1.2 e 1.6 podem produzir este tipo de corrente (RAMAN; BEAN,
1997, CUMMINS et al., 2005; RUSH et al., 2005; RUSH et al., 2007).
Os neurônios dos gânglios da raiz dorsal expressam uma variedade de isoformas de
canais para sódio, permitindo um preciso controle da excitabilidade celular (RUSH et
al., 2007). Os DRGs são estruturas que agregam os corpos celulares dos neurônios
que conduzem informações sensoriais da periferia para o sistema nervoso central.
Os corpos celulares destes neurônios constituem uma população com
características morfofuncionais heterogêneas, com os corpos celulares em ratos
adultos variando de tamanho entre 20 e 50 µm de diâmetro. Essas células
expressam dois tipos de correntes de sódio, TTX-S e TTX-R, em diferentes
proporções que dependem basicamente do diâmetro do corpo celular (ZHOU;
ZHAO, 2000). Kostyuk e colaboradores em 1981 foram os primeiros a analisar
eletrofisiologicamente os canais TTX-S e TTX-R em neurônios DRGs, na tabela 1
observa-se as diversas isoformas desses canais e suas características biofísicas,
porém os papéis destes dois tipos de correntes ainda não foram completamente
elucidados. (ROY; NARAHASHI, 1992; RENAGANATHAN et al., 2002; RUSH et al.,
2007).
21
Tabela I: Características dos canais para sódio em neurônios DRGs
Isoformas de Canais para sódio
Tipo (Cinética e Farmacologia)
Características Biofísicas em DRGs
Papel na geração do Potencial de Ação
Nav 1.1 TTX-S, rápida Desconhecido Desconhecido
Nav 1.2 TTX-S, rápida
Ativação/ Inativação em potenciais despolarizados,
pode produzir corrente ressurgente
Pode manter o disparo quando “expressados” em
neurônios danificados
Nav 1.3 TTX-S, rápida Corrente Persistente,
corrente de rampa e rápida recuperação
Disparos ectópicos quando “expressados” em neurônios
danificados
Nav 1.5 TTX-R, rápida Não foi caracterizado muito bem Desconhecido
Nav 1.6 TTX-S, rápida Corrente Persistente, rápida recuperação, pode produzir
corrente ressurgente
Mantém alta freqüência de disparo quando presente
Nav 1.7 TTX-S, rápida Início lento da inativação
levando a uma corrente de rampa, rápida recuperação
A corrente de rampa amplifica pequenas
entradas
Nav 1.8 TTX-R, lenta
Ativação/ Inativação em potenciais muito
despolarizados e rápida recuperação
Maior contribuinte para a fase de subida do potencial
de ação e disparos repetitivos em pequenos
neurônios
Nav 1.9 TTX-R, persistente
Ativação em potenciais hiperdespolarizados,
sobrepondo a curva de ativação/ intivação,
Inativação ultra-lenta
Contribui para a determinação do potencial de repouso da membrana, amplificação de entradas e manutenção da ativação
dos canais Nav 1.8
Tabela modificada de RUSH et al., 2007.
22
2.3 DIETA CETOGÊNICA
A dieta cetogênica (KD) é caracterizada por ser rica em lipídeos, balanceada em
proteínas (o suficiente para garantir o crescimento) e pobre em carboidratos, a qual
induz a uma cascata de mudanças metabólicas, incluindo o quadro de cetose e uma
mudança no metabolismo energético cerebral (SCHWARTZKROIN, 1999;
FREEMAN et al., 2006). Esta dieta tem sido empregada como terapia alternativa
para o tratamento de epilepsia resistente às drogas (refratárias) desde 1920, quando
observações na rápida supressão das crises epilépticas, foram correlacionados aos
altos níveis de corpos cetônicos no plasma de pacientes (SWINK et al., 1997). No
entanto poucos trabalhos abordam, na célula isolada, mecanismos pelos quais a KD
exerce o efeito anticonvulsivante (BOUGH; RHO, 2007).
Alguns mecanismos propostos para explicar este efeito incluem:
1. Mudança do pH cerebral, porém os estudos realizados por Al-Mudallal (1996),
sugerem que o efeito anticonvulsivante da KD é pouco provável de ser mediada pela
acidose cerebral;
2. Mudança no balanço hidroeletrolítico. Porém, estudos realizados por Appleton
e DeVivo em 1974 não confirmaram esta hipótese esta hipótese.
3. Ação inibitória direta dos ácidos graxos, como por exemplo, ácidos graxos
poliinsaturados (PUFAs), que são longas cadeias hidrocarbonadas com duas ou
mais duplas ligações e um grupamento carboxila terminal, são encontrados em
membranas biológicas por serem partes de moléculas de fosfolipídios e glicolipídios.
Possuem atividade anticonvulsivante por modular canais iônicos dependentes de
voltagem (VREUGDENHIL et al., 1996; CUNNANE et al., 2002). Os ácidos graxos
também induzem a atividade das proteínas desacopladoras mitocondriais,
resultando numa redução do gradiente de prótons através da membrana
mitocondrial interna, que entre outros efeitos, causaria uma redução na síntese de
ATP (HORVATH et al., 2003). Além disso, os canais para potássio sensíveis ao ATP
são modulados pela atividade metabólica da célula e, os baixos níveis de ATP
decorrentes da dieta cetogênica, resultam na abertura destes canais, e
23
hiperpolarização da membrana. Portanto, este efeito protegeria o cérebro contra o
estresse metabólico (SCHWARTZKROIN, 1999; VAMECQ et al., 2005).
4. Alteração da disponibilidade dos neurotransmissores. Em estudos realizados
por Cheng e colaboradores (2004), foi demonstrado que a restrição calórica
resultante da dieta cetogênica, aumentou a expressão da enzima ácido glutâmico
descarboxilase, responsável pela biossíntese do GABA (ácido γ-amino butírico),
sugerindo um aumento dos níveis desse neurotransmissor inibitório.
5. Altos níveis de corpos cetônicos mantidos durante a KD. Os corpos cetônicos
referem-se a três componentes: a acetona, o 3-D-hidroxibutirato, e o acetoacetato,
formados nas mitocôndrias dos hepatócitos a partir da acetil-CoA, resultante da β-
oxidação dos ácidos graxos e que podem ser utilizados por muitos tecidos, com
resultante formação de ATP. A demonstração de que o sistema nervoso central é
capaz de metabolizar os corpos cetônicos, sugere que estes poderiam estar
relacionados com o efeito da dieta (Owen et al., 1982).
A acetona é formada por uma reação espontânea de descarboxilação do
acetoacetato (acetoacetato acetona + CO2) e é eliminada nos pulmões e na
urina. Estudos recentes realizados por Likhodii e colaboradores (2000), sugerem que
a acetona apresenta efeitos sobre o sistema nervoso central, com efeitos
anticonvulsivantes, e, portanto, afeta a excitabilidade celular de alguma maneira.
24
3 JUSTIFICATIVA
Historicamente, desde os tempos bíblicos, o jejum foi associado ao poder de cura
das epilepsias e, ainda hoje, as dietas cetogênicas são utilizadas no seu tratamento,
principalmente nos casos refratários aos tratamentos farmacológicos. Nas alterações
do metabolismo da glicose, como no diabetes mellitus, a hipossensibilidade à dor
aparece como conseqüência da doença não controlada, permitindo-nos supor um
efeito direto dos corpos cetônicos sobre a excitabilidade celular.
Estudos realizados recentemente, demonstram a capacidade anestésica e
analgésica da acetona e do hidroxibutirato, sem entrar no mérito dos mecanismos
celulares. Por ser produzida em menor quantidade quando comparada aos outros
corpos cetônicos, a acetona não despertou muito interesse científico, o que pode
explicar o pequeno número de estudos eletrofisiológicos com esta substância
(LIKHODII; BURNHAM, 2002). A escolha da acetona para este estudo sustenta-se
no seu coeficiente de partição, igual a um, o que lhe confere uma ampla distribuição
nos compartimentos do organismo, sendo livremente difusível para o sistema
nervoso central, enquanto que o 3-D-hidroxibutirato e o acetoacetato requerem um
transportador para ácidos-monocarboxílicos para atravessar a barreira
hematoencefálica (MUSA-VELOSO, et al., 2006).
A escolha dos neurônios DRGs para os estudos eletrofisiológicos propostos, se faz
primeiramente pela dificuldade de se isolar células do Sistema Nervoso Central. E
também devido ao fato de que as células do cérebro de roedores imaturos
apresentam naturalmente um quadro de cetose, ocasionado pelo período de
amamentação, quando sua nutrição é predominantemente composta por lipídeos
(NEHLIG, 2004). Outro aspecto, que merece ser considerado, é que os canais para
sódio TTX-R são especificamente expressados em neurônios sensoriais
nociceptivos, o que nos permite supor que, na cetoacidose diabética, esta via de
sinalização não funcione adequadamente.
25
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito agudo da acetona sobre as correntes de sódio dependentes de
voltagem, usando como modelo corpos celulares de neurônios obtidos de gânglios
das raizes dorsais de ratos.
4.2 Objetivos Específicos
• Determinar o IC50 da acetona sobre as correntes de sódio de células DRGs.
• Determinar a dependência de voltagem da ativação e inativação das correntes
totais de sódio de células DRGs.
• Determinar a dependência de voltagem da ativação e inativação das correntes de
sódio resistentes à tetrodotoxina de células DRGs.
• Explorar alterações funcionais causados pela acetona na morfologia de
potenciais de ação de células DRGs, na presença ou não da tetrodotoxina.
26
5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos, com massa corporal variando entre 220 e 280
g, procedentes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais.
O projeto de pesquisa desenvolvido com esses animais foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais
com o protocolo número 43/2005.
5.2 CULTURA PRIMÁRIA 5.2.1 Dissociação de neurônios DRG
Os métodos utilizados para a dissociação de neurônios DRG foram baseados no
protocolo estabelecido por Eckert e colaboradores em 1997.
5.2.2 Soluções As seguintes soluções foram utilizadas na dissociação e cultura de neurônios DRGs.
Dissecação e Dissociação :
A tabela II apresenta a composição da solução de Ringer Mamífero, sem adição de
Ca2+ e Mg2+, utilizada para a dissociação celular.
Tabela II : Solução de Dissociação dos corpos celulares de DRGs (a)
(a) pH ajustado para 7,4 com NaOH e osmolalidade de 295 mOsm/Kg H2O
REAGENTES CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 140,0
KCl 2,5
Glicose 7,5
HEPES 10,0
27
Solução Enzimática 1 : Papaína (1 mg/mL), ativada pela adição de 0,1 mg de
cristais de cisteína diluídos em 3 ml de solução de Ringer filtrada.
Solução Enzimática 2 : Colagenase (2,5 mg/mL – Tipo IA, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA), diluída em 3 mL de solução de Ringer filtrada.
Plaqueamento dos Corpos Celulares : Meio de cultura F12 suplementado com
10% v/v de soro bovino fetal (inativado e estéril – Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e
1% v/v de antibiótico (100 U.I./mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina –
Sigma Chemical Company).
Alimentação dos Neurônios : Meio de cultura L15 suplementado com 10% v/v de
soro bovino fetal (inativado e estéril – Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 1% v/v de
antibiótico (100 I.U./mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina – Sigma).
5.2.3 Superfícies para plaqueamento
Lamínulas de vidro (5 mm de diâmetro) foram autoclavadas e cobertas com
aproximadamente 30 µl de poli-L-lisina (20 µg/mL – Sigma, St. Louis, MO, USA).
Estas foram mantidas a 4ºC por, no mínimo, 12 horas. Os discos foram lavados com
água deionizada estéril e estocados a 4ºC.
No dia em que foram utilizados para plaqueamento, os discos de vidro foram
cobertos com solução de laminina diluída em solução de Ringer (20 mg/mL) e
mantidos refrigerados por, no mínimo, 2 e, no máximo, 12 horas. A laminina foi
removida minutos antes do plaqueamento dos corpos celulares.
5.2.4 Dissecação
Os ratos foram mantidos com dieta comercial e água, ad libitum, até serem
decapitados por guilhotinamento. A pele do dorso foi removida, assim como a parte
anterior do gradil costal e vísceras torácicas. Também foram removidos os corpos
vertebrais, expondo a medula e os nervos que dela ermegem. Nos nervos
posteriores estão localizados os Gânglios da Raiz Dorsal.
28
Após a remoção do excesso de tecido conjuntivo e meninges, os gânglios foram
cortados ao meio para facilitar a ação das enzimas.
5.2.5 Dissociação
Os DRGs foram incubados a 37ºC em tubos tipo Falcon de 15 mL contendo 3 mL da
solução enzimática 1 por 20 minutos, gentilmente agitada a cada 5 minutos. Foram
centrifugados por 30 segundos a 3000 x g e o sobrenadante foi descartado.
A solução enzimática 2 foi adicionada, repetindo-se o procedimento de incubação e
centrifugação.
O processo enzimático era interrompido pela adição de 3 mL do meio de cultura F12
contendo 10% de soro bovino fetal, seguido de centrifugação e descarte de 2 mL do
sobrenadante. Os DRGs foram, então, submetidos à trituração mecânica com
pipetas Pasteur de vidro, com as pontas polidas em fogo, em 1 mL de F12.
Após a trituração mecânica, o meio de cultura encontrava-se repleto de corpos
celulares neuronais em suspensão. Esses neurônios foram transferidos para as
lamínulas de vidro previamente tratadas com poli-L-lisina e laminina e mantidos em
repouso por 2 horas, à temperatura de 37ºC, em atmosfera com 5% de gás
carbônico, para permitir a adesão dos corpos celulares aos discos de vidros. Após
este período foi adicionado meio de cultura L15 para nutrir os neurônios.
5.2.6 Alimentação dos neurônios
Os neurônios foram mantidos com meio de cultura L15 em temperatura ambiente por
24 horas, para que se tornassem viáveis para os registros eletrofisiológicos. Os
neurônios foram utilizados até 72 horas após o seu isolamento.
29
5.3 ELETROFISIOLOGIA
Os neurônios submetidos aos registros eletrofisiológicos foram previamente
transferidos, na lamínula, para uma câmara de superfusão confeccionada em
acrílico. As correntes de sódio foram registradas através da técnica de patch-clamp,
na configuração Whole-cell, em temperatura ambiente com variação entre 20-25ºC.
Os experimentos foram realizados em uma mesa anti-vibratória caseira, com
visualização em microscópio invertido modelo Olympus CK-2 (Japan) com oculares
de 10x e objetiva de 40x de aumento. O posicionamento da micropipeta era
realizado através de dois sistemas de micromanipulação independentes: um
mecânico Mitutoyo (Japan) e outro piezoelétrico (Newport M-42 – Irvine, CA, USA)
com controle remoto triaxial (PCS-201 – Burleigh Instruments Inc., Fishers, NY,
USA). As correntes foram registradas através de um amplificador Axopatch 200B
(Axon Instruments – USA), ligado a um conversor analógico-digital (Digitada série
1200B, Axon Instruments – USA), gerenciado pelo aplicativo pClamp7 (Axon
Instruments – USA). As pipetas foram acopladas ao sistema através de suporte com
hemi-célula de Ag/AgCl mergulhado na solução de pipeta. O circuito elétrico foi
fechado pelo eletrodo de referência de Ag/AgCl, que se encontrava mergulhado na
solução de banho.
As pipetas com resistência entre 1,0 e 3,0 MΩ foram fabricadas a partir de capilares
de vidro para micro-hematócrito (diâmetro interno: 1 mm e externo: 1,5 mm,
Perfecta, SP, Brasil), usando um estirador vertical de pipetas de dois estágios (PP
830 Narishige, Tokyo, Japan).
As correntes foram medidas na configuração whole-cell alcançada após a obtenção
de um selo de alta resistência, chamado de giga-selo, formado entre a membrana
celular e a parede da pipeta, com aplicação de uma pressão negativa e posterior
rompimento da membrana. Foi utilizado um sistema de compensação rápida do
amplificador, que neutralizava a capacitância da pipeta e a capacitância intrínseca
do pré-amplificador modelo CV203 (Axon instruments, CA, USA). A obtenção da
configuração whole-cell foi realizada a partir de uma sucção adicional através da
pipeta, causando uma ruptura da membrana celular e permitindo a difusão da
solução da pipeta para dentro da célula, enquanto a capacitância da membrana e a
30
resistência de acesso eram compensadas manualmente (HAMILL et at., 1981). O
transiente capacitivo foi cancelado e a resistência em série foi compensada em 40%,
quando a corrente encontrava-se exageradamente grande (acima de 3 nA).
5.3.1 Soluções do Banho e da Pipeta
As tabelas abaixo (III a VI) trazem a composição das soluções utilizadas nas
medidas eletrofisiológicas, o potencial de equilíbrio eletroquímico para o íon sódio
calculado de acordo com a equação de Nernst foi de 14,1 mV. Os reagentes
utilizados para a preparação das soluções foram obtidos da Sigma-Aldrich. A
osmolalidade das soluções foi medida, antes dos experimentos, em osmômetro de
pressão de vapor, VAPRO-5520 (Wescor, Logan, UT, USA).
Tabela III: Solução de Pipeta empregada para medida de correntes de Na+(b)
REAGENTES CONCENTRAÇÃO (mM)
CsF 100
NaCl 20
MgCl2 5
EGTA 11
TEA-Cl 10
HEPES 10 (b) pH ajustado para 7,2 com CsOH e osmolalidade de 295 mOsm/KgH2O
31
REAGENTES CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 140,0
KCl 2,5
MgCl2 1,0
CaCl2 1,8
HEPES 10,0
Glicose 7,5
REAGENTES CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 35,0
NMDG 107,5
KCl 2,5
MgCl2 1,0
TEA-Cl 20,0
CaCl2 1,8
CdCl2 0,2
NiCl2 0,2
HEPES 10,0
Glicose 7,5
Tabela IV: Solução de Banho empregada para medida de correntes de Na+(c)
(c) pH ajustado para 7,4 com HCl e osmolalidade de 305 mOsm/KgH2O
Tabela V: Solução de Ringer (d)
(d) pH ajustado para 7,4 com NaOH e osmolalidade de 305 mOsm/KgH2O
32
REAGENTES CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 2,5
KCl 140,0
MgCl2 1,0
NaATP 2,0
EGTA 0,5
HEPES 10,0
As correntes de potássio foram bloqueadas utilizando Cs+ como principal cátion
interno e pela presença de TEA na solução de pipeta e de banho. Os canais para
cálcio foram bloqueados por Cd2+ (0,2 mM) e Ni2+ (0,2 mM) na solução de banho,
por F- e EGTA na solução de pipeta e Mg2+ em ambas soluções (ELLIOTT;
ELLIOTT, 1993). Estas concentrações de Cd2+ e Ni2+ também reduzem a
condutância de canais TTX-R em neurônios do DRG e outros neurônios sensoriais
(IKEDA; SCHOFIELD, 1987; KUO et al., 2002) Entretanto, estes bloqueios não
alteraram os nossos resultados porque as correntes de sódio TTX-R remanescentes
ainda eram suficientemente grandes para a obtenção de registros eletrofisiológicos.
A concentração de sódio da solução de superfusato da tabela IV, foi utilizada para
evitar correntes do íon sódio exageradamente grandes. As correntes de sódio foram
isoladas com base nos estudos de Rush e Waxman (2005).
A concentração inicial de acetona no superfusato foi preparada a partir de estudos
de Likhodii e Burnham (2002), onde demonstraram que 10 mM de acetona no fluído
cerebroespinhal foi capaz de produzir um efeito anticonvulsivante significativo em
modelo de ratos PTZ (pentilenotetrazol). A partir deste dado, foi possível traçar a
curva concentração-resposta para a acetona, com uma concentração mínima de 5
mM e uma máxima de 60 mM, onde, na maior concentração, não foi possível manter
(e) pH ajustado para 7,3 com NaOH e osmolalidade de 295 mOsm/KgH2O
Tabela VI: Solução de Pipeta (KCl) (e)
33
um selo estável. A acetona foi diluída em solução de banho empregada para medida
de correntes de Na+ (tabela IV) e também na solução de ringer (tabela V).
5.4 ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os resultados foram analisados empregando-se o programa Clampfit (Axon
Instruments, CA, USA). Os ajustes das curvas concentração-resposta foram
calculados pelo modelo de regressão logístico, empregando-se a seguinte equação:
(1)
Onde: X, é o logarítmo da concentração; Y, é a resposta, e EC50 é a dose
responsável por 50% do efeito máximo observado. Também foram utilizados os
testes t de Student e ANOVA de uma entrada do programa Prism (Graphpad, USA)
com pós-teste de Dunnett, com nível de significância P < 0,05.
Y = Mínimo + (Máximo – Mínimo)
1 + 10
(Log E50 – X) Inclinição de Hill
34
6 RESULTADOS
As correntes de sódio foram registradas utilizando as soluções de pipeta e de banho
descritas na tabela III e IV, respectivamente. O íon NMDG foi utilizado na solução de
banho para substituir o sódio, em proporção equimolar, para manter uma
concentração final de sódio baixa (35 mM). Esta estratégia foi adotada para reduzir
as correntes de sódio e permitir um controle mais eficaz das voltagens estabelecidas
pela técnica de patch-clamp na configuração whole cell. As células foram mantidas a
-60 mV por pelo menos 10 minutos após a obtenção da configuração whole cell,
permitindo uma estabilização das correntes de sódio.
6.1 Efeito da acetona
O efeito de diferentes concentrações de acetona sobre as correntes de sódio é
mostrado na figura 2. As concentrações utilizadas foram: 5, 10, 15, 20, 30, e 40 mM
de acetona. As correntes foram registradas imediatamente após a superfusão da
acetona em concentrações molares crescentes. A concentração de acetona capaz
de promover a inibição de 50% dos canais para sódio foi calculada pelo ajuste da
curva concentração-resposta (equação 1) em 21,5 mM, não sendo observado
qualquer dependência de voltagem sobre a inibição das correntes (resultados não
mostrados). Nas concentrações de 30 e 40 mM, o selo mostrou-se instável, durando
menos que 10 minutos. Além disso, não foi possível registrar correntes de sódio em
doses maiores que 40 mM, invariavelmente por perda do giga-selo, denotando
possíveis modificações nas características físico-químicas da membrana celular. O
efeito máximo da acetona, calculado pela curva de ajuste, seria alcançado na
concentração de 250 mM, muito além da que utilizamos. Mesmo assim, este valor é
compatível com valores citados na literatura para anestesiar girinos em aquários
(YANG et al., 2007).
35
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.40
25
50
75
100
log [acetona]
I/Im
áx
Figura 2: Efeito inibitório da acetona sobre as correntes de sódio de corpos celulares de gânglios da raiz dorsal medidos na voltagem de -15 mV (N=8). A amplitude foi normalizada pela maior corrente. No inserto, apresentamos esquematicamente o protocolo utilizado: as células foram mantidas em -60 mV, hiperpolarizadas a -100 mV por 100 ms, e submetidas a pulsos de voltagem que variaram de -60 a +45 mV em incrementos de 15 mV por 40 ms, retornando ao potencial de manutenção de -60 mV.
-60 mV
-100 mV
+45 mV
36
6.2 Efeito da acetona nas correntes de sódio evocad as em neurônios DRGs
A figura 3 mostra registros representativos das correntes de sódio obtidas no
controle, na presença de 20 mM de acetona e após a lavagem da acetona. Os
neurônios DRGs foram submetidos a um pré-pulso hiperpolarizante de -100 mV por
100 ms, para garantir a remoção do estado de inativação dos canais, e as correntes
de sódio foram evocadas por uma sequência de pulsos de voltagem de -100 mV a
zero mV, em incrementos de 5 mV.
A acetona reduziu a amplitude da corrente de sódio e após a sua lavagem com
solução controle, mas não houve total recuperação. O efeito inibitório foi observado
imediatamente após a superfusão da acetona e, após um minuto, já registrávamos o
efeito máximo. Como padronização, as análises de todas as correntes de sódio
foram realizadas após um minuto de exposição à acetona. Para confirmar a
recuperação parcial a lavagem foi efetuada por mais de uma vez com solução
controle até um período máximo de 10 minutos, não houve diferença na amplitude
da corrente durante este tempo.
37
Figura 3: Registros representativos de correntes de sódio em neurônios DRGs. Os registros no canto inferior direito reproduzem os traços obtidos nas condições controle, acetona 20 mM, e recuperação, durante o pulso de -15 mV. No esquema superior, apresentamos o protocolo utilizado (descrito no texto). Nem todas as correntes foram representadas para melhor visualização.
-60 mV
100 ms -100 mV
0 mV
0,5nA
10 ms
Controle Acetona 20 mM
Recuperação Controle Recuperação Acetona 20 mM
38
6.3 Efeito da acetona sobre o V 50 do processo de ativação da corrente de sódio
A dependência de voltagem do processo de ativação das correntes de sódio totais
(TTX-S e TTX-R) das células DRGs está representada na figura 4. A condutância
(G) de sódio dependente de voltagem foi calculada usando-se a seguinte equação:
G = I / (Vm – ENa) (2)
Onde I é a amplitude da corrente, Vm é o potencial de membrana e o ENa é o
potencial de equilíbrio eletroquímico para o íon sódio, calculado de acordo com a
equação de Nernst. As curvas da dependência de voltagem da ativação da corrente
de sódio são ajustes da equação de Boltzmann aos pontos experimentais:
G / Gmax = 1 / (1 + exp ((V50 – Vm) / k)) (3)
Onde Gmax é a condutância máxima da série de pulsos, V50 é o potencial em que
G/Gmax alcança a metade do valor máximo e, k é o grau da inclinação que descreve
os passos da dependência de voltagem de ativação.
O protocolo utilizado na análise do processo de ativação, parte de um potencial
manutenção de -60 mV, apresenta um pré-pulso de -100 mV por 100 ms, e continua
com uma série de pulsos despolarizantes (-100 mV a 0 mV em incrementos de 5
mV) com duração de 100 ms.
A acetona causou modificação da relação condutância-voltagem, observada na
alteração dos valores de V50, de maneira dose-dependente, para potenciais mais
despolarizados. Observando os valores resumidos na figura 5, notamos que a menor
concentração de acetona efetiva, para este processo, foi de 20 mM, com reversão
parcial do efeito após a retirada da acetona por 10 minutos (período de
recuperação). Esta modificação certamente confere menor excitabilidade aos
neurônios DRGs.
39
-60 -50 -40 -30 -20 -100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0ControleAcetona 10 mMAcetona 20 mMAcetona 40 mMRecuperação
Vm-ENa
G/G
max
Figura 4: Relação condutância - voltagem do processo de ativação das correntes de sódio totais (na ausência de tetrodotoxina). A condutância foi normalizada pela a maior condutância e plotada em função da força motriz para o íon sódio (Vm-ENa). Algumas curvas foram omitidas para melhor visualização do gráfico. O esquema no topo da figura representa o protocolo utilizado (descrito no texto).
-60 mV
100 ms -100 mV
0 mV
40
V50 da Ativação
-35
-30
-25
-20ControleAcetona 5 mMAcetona 10 mMAcetona 20 mMAcetona 30 mMAcetona 40 mMRecuperação
** ****
*
mV
Figura 5: V50 do processo de ativação dos canais para sódio. O V50 obtido foi de -29,8±1,03 mV (13) para o controle, -30,7±1,24 mV (13) para acetona 5 mM, -27,7±0,86 mV (13) para acetona 10 mM, -24,0±0,87 mV (13) para acetona 20 mM, -22,8±1,06 mV (13) para acetona 30 mM, -21,1±1,06 mV (11) para a acetona 40 mM e -26,9±1,16 mV (9) para a recuperação. (*P<0,05, ** P< 0,001).
41
6.4 Efeito da acetona na dependência de voltagem da inativação no estado
estacionário das correntes de sódio
A dependência de voltagem do processo de inativação no estado estacionário das
correntes de sódio totais das células DRG está representada na figura 6. O protocolo
utilizado para verificar a fração disponível da corrente de sódio, consiste
basicamente por dois pulsos, o primeiro chamado de pré-pulso, é usado para
estabilizar a inativação no estado estacionário e o segundo pulso é usado para
avaliar a corrente disponível de sódio. As curvas da dependência de voltagem da
inativação da corrente de sódio representam ajustes calculados através da equação
de Boltzmann:
G / Gmax = 1 / (1 + exp ((Vm – V50) / k)) (4)
Onde Gmax é a condutância máxima da série, V50 é o potencial em que a razão
G/Gmax alcança a metade do valor máximo e, k é o grau da inclinação que descreve
os passos da dependência de voltagem na cinética de inativação.
Ao contrário do que vimos anteriormente, a acetona causou modificação da relação
condutância-voltagem, observado na alteração dos valores de V50, de maneira
dose-dependente, para potenciais mais hiperpolarizados. Observando os valores
resumidos na figura 7, notamos que a menor concentração de acetona efetiva, para
este processo, foi de 5 mM, com reversão parcial do efeito após a retirada da
acetona por 10 minutos. Assim como a modificação observada no processo de
ativação, esta também confere menor excitabilidade aos neurônios DRGs. Além
disso, este processo mostra-se mais sensível à ação da acetona, haja vista o efeito
significativo observado na concentração de 5 mM.
42
-60 -50 -40 -30 -20 -10 00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0ControleAcetona 10 mMAcetona 20 mM
Acetona 40 mMRecuperação
Vm-ENa
G/G
max
Figura 6: Dependência de voltagem do processo de inativação no estado estacionário das correntes de sódio totais (na ausência de tetrodotoxina) em solução controle (linha preta) e na presença de acetona 20 mM (linha azul). O protocolo utilizado na análise do processo de inativação, para medir a fração disponível da corrente de sódio, consiste de uma série de pré-pulsos (-100 mV a 0 mV em incrementos de 5 mV) por 100 ms, seguido por um pulso de 0 mV por 40ms. A condutância foi normalizada para a maior condutância da série e plotada contra a força motriz para o íon sódio (Vm-ENa).
-60 mV
-100 mV 100 ms 100 ms
0 mV
43
V50 da Inativação
-42.5
-40.0
-37.5
-35.0
-32.5
-30.0ControleAcetona 5 mMAcetona 10 mMAcetona 20 mMAcetona 30 mMAcetona 40 mMRecuperação
****
**
**
***
mV
Figura 7: : V50 do processo de inativação dos canais para sódio. O V50 foi de -32,2±0,19 mV (13) para o controle, -33,3±0,16 mV (13) para acetona 5 mM, -33,5±0,24 mV (13) para acetona 10 mM, -35,9±0,12 mV (13) para acetona 20 mM, -36.9±0,37 mV (12) para acetona 30 mM, -40,3±0,59 mV (10) para a acetona 40 mM e -35,7±0,24 mV (8) para a recuperação. (* P < 0,05, ** P<0,001).
44
6.5 Efeito da acetona sobre as correntes de sódio T TX-R evocadas em
neurônios DRGs
Como visto até agora, a acetona afetou tanto o processo de ativação quanto o
processo de inativação no estado estacionário das correntes totais de sódio, ambos
observados com a alteração do V50. É razoável supor que estas alterações
determinam menor excitabilidade aos neurônios DRGs. Para diferenciarmos o efeito
da acetona sobre as correntes de sódio TTX-S e TTX-R, utilizamos a tetrodotoxina
na concentração de 250 nM. As correntes de sódio TTX-R foram medidas sob
condições idênticas às correntes totais de sódio. A figura 8 mostra uma família de
correntes de sódio TTX-R, aqui denominada condição controle, e na presença de 20
mM de acetona. Assim como foi observado anteriormente nas correntes totais de
sódio, a acetona reduziu a amplitude das correntes de sódio TTX-R.
45
Figura 8: Registros representativos de correntes de sódio TTX-R em neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRGs). O registro inferior compara os traços de cada condição experimental, obtidos nas condições controle (TTX) e na presença de TTX mais acetona 20 mM, durante o pulso de -15 mV. O protocolo utilizado foi idêntico àquele utilizado nas correntes totais. (escala: 500 pA por 10 ms)
TTX 250 nM TTX (250 nM) + acetona (20 mM)
TTX TTX + acetona
46
6.6 Efeito da acetona na dependência de voltagem da ativação da corrente de
sódio TTX-R
A figura 9 mostra a dependência de voltagem do processo de ativação da corrente
de sódio TTX-R nas células DRGs. As curvas da dependência de voltagem da
ativação das correntes de sódio TTX-R foram ajustadas através da equação 3.
Como observado anteriormente, nas correntes totais, a acetona modificou o V50 de
ativação para valores mais despolarizados. Não houve diferença significativa do V50
entre as correntes de sódio TTX-R na ausência e na presença de acetona 20 mM.
Juntos, estes dados sugerem que a ação da acetona se dá sobre o processo de
ativação dos canais TTX-S, mas não sobre a ativação dos canais TTX-R.
47
-60 -50 -40 -30 -20 -100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
TTxTTx + Acetona
Vm-ENa
G/G
max
Figura 9: Dependência de voltagem do processo de ativação das correntes de sódio TTX-R, na ausência e na presença de acetona 20 mM, V50 (mV) = -36,37±0,20 (19) e -35,14±0,18 (19), respectivamente. O protocolo utilizado neste experimento foi o mesmo da dependência de voltagem no processo de ativação das correntes de sódio na ausência de tetrodotoxina.
-60 mV
100 ms -100 mV
0 mV
48
6.7 Efeito da acetona na dependência de voltagem da inativação no estado
estacionário da corrente de sódio TTX-R
As correntes macroscópicas foram registradas em células submetidas ao tratamento
com tetrodotoxina na ausência e na presença de acetona 20 mM. A dependência de
voltagem do processo de inativação no estado estacionário das correntes de sódio
TTX-R das células DRGs está representada na figura 10. O protocolo e a análise
dos dados foram os mesmos utilizados na dependência de voltagem da inativação
das correntes de sódio totais, para que pudéssemos comparar diretamente os
dados.
De acordo com o que observamos aqui, a acetona também causou modificação da
relação condutância-voltagem para potenciais mais hiperpolarizados, da mesma
magnitude daquele observado para o V50 das correntes totais. Assim, é razoável
atribuir o efeito observado anteriormente à ação da acetona sobre os canais TTX-R.
49
-70 -60 -50 -40 -30 -20 -100.0
0.5
1.0TTxTTx + Acetona
Vm -ENa
G/G
max
Figura 10: Dependência de voltagem do processo de inativação no estado estacionário das correntes de sódio TTX-R, na ausência e na presença de acetona 20 mM, V50 (mV) = -39,40±0,20 (19) e -46,69±0,32 (19)*, respectivamente (*P<0,001).
-60 mV
-100 mV 100 ms 100 ms
0 mV
50
Com o intuito de verificarmos possíveis efeitos sobre a morfologia dos potenciais de
ação, realizamos medidas de clampeamento de corrente. Para estudarmos o efeito
da acetona sobre os potenciais de ação utilizamos as soluções de banho e de pipeta
descritas nas tabelas V e VI, respectivamente. Os registros dos potenciais de ação
foram realizados através de dois protocolos de pulsos de corrente. Um protocolo
consistia em um único pulso despolarizante com duração de 1 ms, e o outro
(estímulo persistente) com duração de até um segundo. As análises dos parâmetros
de amplitude, duração, e taxa de despolarização (dV/dt) ficaram prejudicadas,
devido a grande variabilidade na morfologia dos potenciais de ação entre as células
e na densidade de corrente. (BLAIR; BEAN, 2002).
Como exemplo de efeito funcional sobre os potenciais de ação, a figura 11 mostra
registros de potenciais de ação deflagrados por estímulo persistente, obtidos na
condição controle, na presença de 250 nM de tetrodotoxina e na presença de 20 mM
de acetona mais 250 nM de tetrodotoxina. Podemos observar que a estimulação
persistente gera potenciais de ação repetitivos em todas as condições
experimentais, sem que as freqüências de disparos medidas do primeiro ao último
pico, apresentassem grandes diferenças. Como o esperado, os canais TTX-R foram
capazes de deflagrar uma seqüência de disparos maior que a do grupo controle,
condição que foi abolida na presença de acetona.
51
Controle TTX 250 nM
TTX + Acetona
Controle TTX 250 nM
TTX + Acetona
Controle TTX 250 nM
TTX + Acetona
Figura 11: Registros dos potenciais de ação em neurônios DRGs. O registro inferior mostra potenciais de ação submetidos à ação da acetona após 2 minutos de exposição. (escala: 20 mV por 0,2 s)
52
7 DISCUSSÃO
O mecanismo de ação pelo qual a dieta cetogênica atua como anticonvulsivante
ainda não é bem compreendido. Uma das hipóteses seria o aumento da síntese dos
corpos cetônicos, porém não existem estudos sobre o efeito desses compostos em
células isoladas, principalmente quanto a um possível efeito per se destas
substâncias sobre a excitabilidade celular. Nossos resultados demonstram
claramente que a acetona tem efeito inibitório direto sobre as correntes de sódio de
células DRGs.
Os corpos celulares dos neurônios DRGs expressam uma variedade de isoformas
de canais para sódio dependentes de voltagem (CATTERALL et al., 2005). De
acordo com os nossos experimentos, podemos admitir a presença de dois tipos de
canais para sódio: aqueles que demonstraram sensibilidade à TTX, cujas correntes
são geradas pelas isoformas Nav 1.1, Nav 1.6 e Nav 1.7 e as correntes geradas pelos
canais resistentes à TTX, representadas pelas isoformas Nav 1.8 e Nav 1.9 (RUSH et
al., 2007). A associação destas isoformas exibe um misto de suas características
(demonstrado na tabela I) durante os registros eletrofisiológicos.
De acordo com os nossos resultados, a acetona apresentou efeitos distintos sobre
as correntes de sódio. Nas correntes totais ocorreu uma alteração no processo de
ativação, e o V50 tornou-se mais positivo em relação ao controle. Este efeito não foi
observado na presença de tetrodotoxina, sugerindo uma ação direta da acetona
sobre o processo de ativação das correntes TTX-S, mas não das TTX-R. Por outro
lado, nas correntes de sódio TTX-R a acetona afetou somente o processo de
inativação no estado estacionário, o V50 tornou-se mais negativo, apresentando
mesma magnitude de variação que aquela observada nas correntes totais. A
combinação desses efeitos permite-nos concluir que a acetona exerce efeito
inibitório diferencial sobre os canais TTX-S e TTX-R.
A concentração equivalente ao IC50 (efeito inibitório sobre as correntes totais de
sódio) foi de 21,5 mM, suficiente para atuar sobre o processo de ativação das
correntes TTX-S (figura 2), na qual ainda conseguíamos reverter o efeito inibitório
sobre as correntes de sódio, ainda que parcialmente. Temos que considerar se o
53
efeito sobre a ativação das correntes totais carrega significado fisiológico, pois a
menor concentração efetiva da acetona foi de 20 mM, um valor que aparenta ser
muito elevado para uma condição de cetoacidose. Foi possível observar no entanto,
o efeito da acetona na concentração de 5 mM sobre o processo de inativação das
correntes TTX-R. Alguns estudos in vivo, têm demonstrado que a concentração de
acetona no plasma pode atingir valores iguais ou acima de 15 mM (SULWAY;
MALINS, 1970). Estes valores plasmáticos podem ser explicados pelo fato de que o
acetoacetato produzido em maior quantidade que a acetona, seria convertido em
acetona por uma reação de descarboxilação (REICHARD et al., 1979, OWEN et al.,
1982). Pacientes epilépticos que responderam favoravelmente à KD, apresentaram
aumento da concentração de acetona no cérebro acima de 1 mM (1mmol/Kg por
peso do cérebro), detectado por espectroscopia de ressonância magnética
(SEYMOUR et al., 1999). Mais recentemente Likhodii e Burnham (2002),
demonstraram que a administração aguda de acetona (10 mmol/Kg) em modelos de
ratos PTZ, elevou os níveis de acetona no fluido cerebroespinhal para 10,3 mM,
também detectado por espectroscopia de ressonância magnética. Nesta
concentração, a acetona foi capaz de produzir efeito anticonvulsivante significativo.
As concentrações de acetona no plasma e no fluido cerebroespinhal são similares e
diretamente proporcionais à dose injetada, possivelmente pelo fato da acetona não
se ligar significativamente a proteínas plasmáticas e por difundir-se livremente
através da barreira hematoencefálica, diferentemente dos outros dois corpos
cetônicos que requerem um transportador (LIKHODII et al., 2003; MUSA-VELOSO,
et al., 2006). Quando comparada com os demais corpos cetônicos, a concentração
plasmática da acetona sugere um papel fisiológico potencialmente importante para
esta substância.
Uma possível explicação para o mecanismo de ação da acetona, seria sua
capacidade de modificar a fluidez da membrana celular. Estudos realizados por
Overton (1901) e Meyer (1937) sugerem que a potência anestésica de uma
substância apresenta uma correlação direta com a sua lipossolubilidade. Segundo
esta hipótese, a presença destes agentes na bicamada lipídica produziria uma
mudança na fluidez da membrana. A acetona, além de possuir coeficiente de
partição igual a um, possui também propriedades anestésicas (MUSA-VELOSO et
al., 2006; TANII, 1996). Portanto, mudanças na fluidez de membrana alterariam as
54
propriedades dos canais para sódio, contribuindo para o efeito inibitório da acetona
sobre a excitabilidade de neurônios DRGs. Vários experimentos demonstram que a
fluidez de membranas de hemácias de diabéticos diminui com o aumento tanto da
concentração dos corpos cetônicos plasmáticos, como também da glicemia,
atribuindo-se a estes fatores o efeito observado (CANDILOROS et al.,1995)
Outros estudos sugerem que o efeito anestésico estaria correlacionado com a
habilidade da substância em se ligar a proteínas dos canais para sódio, diminuindo a
sua condutância (FRANKS; LIEB, 1984; LARSEN et al., 1996). No entanto, nossos
resultados admitem outra hipótese, pois a acetona atua em diferentes canais de
sódio e em processos distintos. O modelo de Hodgkin-Huxley assumia os
componentes de ativação e inativação como processos independentes na cinética
dos canais iônicos, mas atualmente vários estudos têm demonstrado que o processo
de inativação dos canais para sódio é independente de voltagem e promovido pela
ativação do canal (HODGKIN; HUXLEY, 1952; KUO; BEAN, 1994; BEAN, 2007).
Existem evidências de que a propriedade de proteção anticonvulsivante conferida
pela KD, dependeria das propriedades anestésicas dos compostos que contêm
grupos cetônicos (VAMECQ et al., 2005)
Os canais para sódio dependentes de voltagem em neurônios DRGs estão
envolvidos na percepção da dor associado com a inflamação ou lesão do nervo
(AMIR et al., 2006). Em pequenos neurônios DRGs, assumidos como nociceptores,
há um aumento na expressão das isoformas Nav 1.3, 1.7 e 1.8 em modelos de dor
inflamatória usando a carragenina (BLACK et al., 2004). A hiperexcitabilidade
observada em neurônios aferentes danificados está correlacionada com um aumento
das propriedades intrínsecas eletrogênicas de suas membranas e não devido a uma
ação sináptica, fazendo dos canais para sódio um contribuinte essencial para a dor
neuropática. Entre os fármacos utilizados para o alívio da dor neuropática estão os
estabilizadores de membrana como, por exemplo, os anestésicos locais (ex.
lidocaína) e anticonvulsivantes (ex. carbamazepina), que além de suprimir a
excitabilidade da membrana conferem uma ação analgésica (DEVOR, 2006).
Os canais TTX-R de inativação lenta apresentam uma recuperação rápida da
inativação, permitindo uma atividade sustentada em resposta a estímulos repetitivos,
55
desta forma, estes canais contribuem para o processo de adaptação lenta (ELLIOTT;
ELLIOTT, 1993). Pudemos observar na figura 11 eventos repetitivos por estímulos
persistentes, que devem ser mantidos pelos canais TTX-R. No entanto, na presença
de acetona, observamos a diminuição do número de disparos, denotando a
capacidade da acetona em minimizar possíveis aumentos na freqüência de
potenciais de ação. O mecanismo pelo qual a acetona exerce este efeito não está
restrito à diminuição da corrente iônica, podendo também haver a facilitação da
acomodação ao estímulo. Achamos pouco provável que haja comprometimento do
tempo de recuperação da inativação dos canais, visto que não houve diferenças
significativas na recuperação de correntes medidas no intervalo de 12 ms nas
condições controle e na presença de acetona 20 mM (resultados não mostrados).
Ainda de acordo com nossos resultados, a contribuição da acetona para o
mecanismo de ação da dieta cetogênica deve ser levado em consideração. Contudo,
é necessário maior esclarecimento sobre o efeito da acetona na recuperação das
correntes de sódio após a inativação, sobre os potenciais de ação, e também avaliar
o efeito crônico desta substância. Estudos sugerem que a acetona aumenta a
condutância de cloreto via receptores gabaérgicos e glicinérgicos e inibe a função
dos receptores de NMDA, produzindo uma hiperpolarização neuronal (YANG et al.,
2007), e se a expressão dos canais para sódio é afetada em longo prazo.
56
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKOPIAN, A. N.; SIVILOTTI, L.; WOOD, J. N. A tetrodotoxin resistant voltage-gated sodium channel expressed buy sensory neurons. Nature , v. 379, p. 257-262, 1996.
AL-MUDALLAL, A. S.; LAMANNA, J. C.; LUST, W. D.; HARIK, S. I. Diet-induced ketosis does not cause cerebral acidosis. Epilepsia , v. 37, p. 258-261, 1996. AMIR, R.; ARGOFF, C. E.; BENNETT, G. J.; CUMMINS, T.R.; DURIEUX, M. E.; GERNER, P.; GOLD, M.S.; PORRECA, F.; STRICHARTZ, G. R. The role of sodium cahannels in chronic inflammatory and neuropathic pain. J. Pain , v. 7, n. 5, p. S1-S29, 2006.
APPLETON, D. B.; DeVIVO, D. C. An animal model for the ketogenic diet. Epilepsia , v. 15, p. 211-227, 1974.
BEAN, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews/ Neuroscience , v. 8, p. 451-465, 2007. BLACK, J. A.; LIU, S.; TANAKA M.; CUMMINS, T. R.; WAXMAN, S. G. Change in the expression of tetrodotoxin-sensitive sodium channels wthin dorsal root ganglia neurons in inflammatory pain. Pain , v. 108, n. 3, p. 237-247, 2004. BLAIR, N.; BEAN, B. P., Roles of tetrodotoxin (TTX)-Sensitive Na+ current, TTX-Resistan Na+ current, and Ca+ current in the Action potentials of Nociceptive sensory neurons. The Journal of Neuroscience , v. 22, n. 23, p. 10277-10290, 2002.
BOUGH, K. J.; RHO, J. M. Anticonvulsant mechanisms of the ketogenic diet. Epilepsia , v. 48, p. 43-58, 2007. CANDILOROS, H.; MULLER, S.; ZEGHARI, N. Decreased Erythrocyte Membrane Fluidity in Poorly Controlled IDDM: Influence of Ketone Bodies. Diabetes Care, v. 18, n. 4, p. 549-551, 1995.
CATTERALL, W. A. From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels. Neuron , v. 26, p. 13-25, 2000.
CATTERALL, W. A.; TRAINER V. L.; BADEN, D. G. Molecular properties of the sodium channels. Novartis Found. Symp. , v. 24, p. 206-218, 2002.
CATTERALL, W. A.; GOLDIN, A. L.; WAXMAN, S. G. International Union of Pharmacology XXXIX: Compendium of voltage-gated ion channels: sodium channels. Pharmacology Reviews , v. 55, n. 4, p. 575-578, 2003.
57
CATTERALL, W. A.; GOLDIN, A. L.; WAXMAN, S. G. International Union of Pharmacology XLVII: Nomenclature and structure-function relationships of voltage-gated sodium channels. Pharmacology Reviews , v. 57, p. 397-409, 2005.
CESTÈLE, S.; CATTERALL, W. A. Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltage-gated sodium channels. Biochimie , v. 82, p. 883-892, 2000.
CHANDY, K. G. Simplified gene nomenclature. Nature , v. 352, p. 26, 1991.
CHANDY, K. G.; GUTMAN, G. A. Nomencalture for mammalian potassium channel genes. Trends Pharmacol. Sci. , v. 14, n. 12, p. 434, 1993.
CHENG, C. M.; HICKS, K.; WANG, J.; EAGLES, D. A.; BONDY, C. A. Caloric restriction augments brain glutamic acid decarboxylase-65 and -67 expression. J. Neurosci. Res. , v. 77, p. 270-276, 2004.
CUMMINS, T. R.; DIB-HAJJ, S. D.; BLACK, J. A.; AKOPIAN, A. N.; WOOD, J. N.; WAXMAN, S. G. A novel persistent tetrodotoxin-resistant ssodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. Journal of Neuroscience , v. 19, p. 1-6, 1999.
CUMMINS, T. R.; DIB-HAJJ, S. D.; HERZOG, R. I.; WAXMAN, S. G. Nav1.6 channels generate resurgent sodium currents in spinal sensory neurons. FEBS Letters , v. 579, p. 2166-2170, 2005.
CUNNANE, S. C.; MUSA, K.; RYAN, M. A.; WHITING, S.; FRASER, D. D. Potential role of polyunsaturates in seizure protection achieved with the ketogenic diet. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Ac ids , v. 67, p. 131-135, 2002. DEVOR, M. Sodium Channels and Mechanisms of Neuropathic Pain. The Journal of Pain , v. 7, n. 1S, p. S3-S12, 2006.
ECKERT, S. P.; TADDESE, A.; EDWIN, W.; McCLESKEY, E. W. Isolation and culture of rat sensory neurons having distinct sensory modalities. Journal of Neuroscience Methods , v. 77, n. 2, p. 183-190, 1997.
ELLIOTT, A. A.; ELLIOTT, J. R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia. Journal of Physiology , v. 463, p. 39-56, 1993. FRANKS,N. P.; LIEB, W. R. Do general anaesthetics act by competitive binding to specific receptors? Nature , v. 310, n. 5978, p. 599-601, 1984.
58
FREEMAN, J.; VEGGIOTTI, P.; LANZI, G.; TAGLIABLE, A.; PERUCCA, E. The ketogenic diet: from molecular mechanisms to clinical effects. Epilepsy Research , v. 68, p. 145-180, 2006. GOLD, M. S.; WEINREICH, D.; KIM, C. S.; WANG, R.; TREANOR, J.; PORRECA, F.; LAI, J. Redistribution of Na(V)1.8 in uninjured axons enables neuropathic pain. J. Neurosci. , v. 23, n. 1, p. 158-166, 2003.
GOLDIN, A. L. Mechanisms of sodium channel inactivation. Curr. Opin. Neurobiol. , v. 13, p. 284-290, 2003.
GOLDIN, A. L.; BARCHI, R. L.; CALDWELL, J. H.; HOFMANN, F.; HOWE, J. R.; HUNTER, J. C.; KALLEN, R. G.; MANDEEL, G.; MEISLER, M. H.; NETTER, Y. B.; NODA, M.; TAMKUN, M. M.; WAXMWN, S. G.; WOOD, J. N.; CATTERALL, W. A. Nomenclature of voltage-gated sodium channels. Neuron , v. 28, n. 2, 365-368, 2000.
GRAVES, T. D. Ion channels and epilepsy. Q. J. Med. , v. 99, p. 201-217, 2006.
HAMILL, O. P.; MARTY, A.; NEHER, E.; SAKMANN, B.; SIGWORTH, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch , v. 391, p. 85-100, 1981.
HERZOG, R. I.; CUMMINS, T. R.; WAXMAN, S. G. Persistent TTX-resistant Na+ current affects resting potential and response to despolarization in simulated spinal sensory neurons. Journal of Neurophysiology , v. 86, p. 1351-1364, 2001.
HILLE, B. Ionic channels of excitable membranes . 3. ed. Sinauer, Sunderland, MA, p. 607, 2001. HODGKIN, A. L.; HUXLEY, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. , v. 117, p. 500-544, 1952.
HORVATH, T. L.; DIANO, S.; BARNSTABLE, C. Mitochondrial uncoupling protein 2 in the central nervous system: neuromodulator and neuroprotector. Biochem. Pharmacol. , v. 65, p. 1917-1921, 2003
IKEDA, S. R.; SCHOFIELD, G. G. Tetrodotoxin-resistant sodium current of rat nodose neurons: monovalent cation selectivity and divalent cation block. Journal of Physiology , v. 389, p. 255-270, 1987.
ISOM, L. L. The role of sodium channels in cell adhesion. Front Biosci. , v. 7, p. 12-23, 2002.
59
ISOM, L. L.; DE JONGH, K. S.; CATTERALL, W. A. Auxiliary subunits of voltage-gated ion channels. Neuron , v. 12, p. 1183-1194, 1994.
KOSTYUK, P. G.; VESELOVSKY, N. S.; TSYNDRENDO, A. Y. Ionic currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons. Neuroscience , v. 6. p. 2423-2430, 1981. KUO, C. C.; BEAN, B. P. Na+ channels must deactivate to recover from inactivation. Neuron , v. 12, n. 4, p. 819-829, 1994.
KUO, C. C.; LIN, T. J.; HSIEH, C. P. Effect of Na+ flow on Cd2+ block of tetrodotoxin-resistant Na+ channels. Journal of General Physiology , v. 120, n. 2, p. 159-172, 2002.
LAI, J.; GOLD, M.S.; KIM, C.S.; BIAN, D.; OSSIPOV, M.H.; HUNTER, J. C.; PORRECA, F. Inhibition of neuropathic pain by decreased expression of the tetrodotoxin-resistant sodium channel, NaV1.8. Pain , v. 95, n. 1-2, p. 143-152, 2002.
LAI, J.; PORRECA, F.; HUNTER, J. C.; GOLD, M. S. Voltage-gated sodium channels and hyperalgesia. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. , v. 44, p. 371-397, 2004.
LARSEN, J.; GASSER, K.; HAHN, R. An analysis of dimethylsulfoxide-induced action potential block: a comparative study of DMSO and other aliphatic water soluble solutes. Toxicology and Applied Pharmacology , v. 140, p.296-314, 1996. LIKHODII, S. S.; BURNHAM, W. M. Ketogenic diet: does acetone stop seizures?. Med Sci Monit. , v. 8, n. 8, p. 19-24, 2002.
LIKHODII, S. S.;SERBANESCU, I.; CORTEZ, N. A.; MURPHY, P.; SNEAD, O. C.; BURNHAM, W. M. Anticonvulsant properties of acetone, a brain ketone elevated by the ketogenic diet. Ann. Neurol. , v. 54, p. 219-226, 2003.
LIKHODII, S. S.; MUSA, K.; MENDONÇA, A.; DELL, C.; BURNHAM, W. M.; CUNNANE, S. C. Dietary fat, ketosis and seizure protection in rats on the ketogenic diet. Epilepsia , v. 41, p. 806-811, 2000.
MEISIER, M. H.; KEARNEY, J. A. Sodium channel mutations in epilepsy and other neurological disorders. The Journal of Clinical Investigation , v. 115, n. 8, p. 2010-2017, 2005.
MEYER, K, H. Contributions to the theory of narcosis. Trans. Faraday Soc. , v. 33, p.
1062-1068, 1937.
60
MUSA-VELOSO, K.; LIKHODII, S. S.; RARAMA, E.; BENOIT, S.; LIU, Y. M.; CHARTRAND, D.; CURTIS, R.; CARMANT, L.; LORTIE, A.; COMEAU, F. J.; CUNNANE S. C. Breath acetone predicts plasma ketone bodies in children with epilepsy on a ketogenic diet. Nutriton , v. 22, p. 1-8, 2006.
NARAHASHI, T. Mechanisms of tetrodotoxin and saxitoxin action. In: Handbook of Natural Toxins (Tu A, ed), New York Dekker, p. 185-210, 1988.
NEHER, E.; SAKMANN, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature , v. 260, n. 5554, p. 799-802, 1976.
NEHLIG, A. Brain uptake and metabolism of ketone bodies in animal models. Prostaglandins, Leukotriens and Essential Fatty Aci ds , v. 70, p. 265-275, 2004.
OGATA, N.; TATEBAYASHI, H. Kinetic analysis of two types of Na+ channels in rat dorsal root ganglia. Journal of Physiology , v. 466, p. 9-37, 1993.
ORLOV, S. N.; HAMET, P. Intracellular monovalent ions as second messengers. The journal of membrane biology , v. 210, p. 161-172, 2006.
OVERTON, E. Studien uber die narkose. Jena Verlag Gustaf Fischer , 1901.
OWEN, O. E.; TRAPP, V. E.; SKUTCHES, C, L.; MOZZOLI, M. A.; HOELDTKE, R. D.; BOLDEN, G.; REICHARD, G. A. Acetone metabolism during diabetic ketoacidosis. Diabetes , v. 31, n. 3, p. 242-248, 1982.
RAMAN, I. M.; BEAN, B. P. Resurgent sodium current and action potential formation in dissociated cerebellar purkinje neurons. J. Neurosci. , v. 17, n. 12, p. 4517-4526, 1997.
REICHARD, G. A.; HAFF, A. C.; SKUTCHES, C. L.; PAUL, P.; HOLROYDE, C. P.; OWEN, O. E. Plasma acetone metabolism in the fasting human. J. Clin. Invest. , v, 63, n. 4, p. 619-626, 1979. RENGANATHAN, M.; CUMMINS, T. R.; HORMUZDIAR, W. N.; WAXMAN, S. G. Alpha-SMS produces the slow TTX-resistant sodium current in large cutaneous afferent DRG neurons. J. Neurophysiol. , v. 84, n. 2, p. 710-718, 2000.
RENGANATHAN, M.; DIB-HAJJ, S.; WAXMAN, S. G. Nav1.5 underlies the “third TTX-R sodium current in rat small DRG neurons. Molecular Brain Research, v. 106, p. 70-82, 2002.
61
ROY, M. L.; NARAHASHI, T. Differential proprieties of tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels in rat dorsal root ganglion neurons. The Journal of Neuroscience , v. 12, n. 6, p. 2104-2111, 1992.
RUSH, A. M.; CUMMINS, T. R.; WAXMAN, S. G. Multiple sodium channels and their roles in electrogenesis within dorsal root ganglion neurons. Journal of Physiology , v. 579, p. 1-14, 2007.
RUSH, A. M.; DIB-HAJJ, S. D.; WAXMAN, S. G. Electrophysiological propieties of two axonal sodium channels, Nav1.2 and Nav1.6, expressed in mouse spinal sensory neurons. J. Physiol. , v. 564, n. 3, p. 803-8015, 2005.
SANGAMESVARAN, L. DELGADO, S. G.; FISH, L. M.; KOCH, B. D.; JAKEMAN, L. B.; STEWART, G. R.; SZE, P.; HUNTER, J. C.; EGLEN, R. M.; HERMAN, R. C. Structure and function of a novel voltage-gated, tetrodotoxin-resistant sodium channel specific to sensory neurons. J. Biol. Chem., v. 271, n. 11, p. 5953-5956, 1996.
SCHOLZ, A.; APPEL, N.; VOGEL, W. Two types of TTX-resistant and one TTX-sensitive Na+ channel in rat dorsal root ganglion neurons and their blockade by halothane. European Journal of Neuroscience , v. 10 (suppl.), p. 2547-2556, 1998.
SCHWARTZKROIN, P. A. Mechanisms underlying the anti-epileptic efficacy of the ketogenic diet. Epilepsy Research , v. 37, p. 171-180, 1999.
SEYMOUR, K. J.; BLUML, S.; SUTHERLING, J.; SUTHERLING, W.; ROSS, B. D. Identification of cerebral acetone by 1H-MRS in patients with epilepsy controlled by ketogenic diet. MAGMA , v. 8, p. 33-42, 1999.
STÜHMER, W.; CONTI, F.; SUZUKI, H.; WANG, X.; NODA, M.; YAHAGI, N.; KUBO, H.; NUMA, S. Structural parts involved in activation and inactivation of the sodium channel. Nature , n. 339, p. 597-603, 1989.
SULWAY, M. J.; MALINS, J. M. Acetone in diabetic ketoacidosis. Lancet , v. 2, n.
7676, p. 736-740, 1970.
SWINK, T. D.; VINING, E. P.; FREEMAN, J. M. The ketogenic diet: 1997. Adv. Pediatr. , v. 44, p. 297-329, 1997.
TANII, H. Anesthetic activity of monoketones in mice: relationship to hydrophobicity and in vivo effects on Na+/K+-ATPase activity and membrane fluidity. Toxicol. Lett. , v. 85, n. 1, p 41-47, 1996.
62
VAMECQ, J.; VALLÉE, L.; LASAGE, F.; GRESSENS, P.; STABLES, J. P. Antiepileptic popular ketogenic diet: emerging twist in na ancient story. Prog. Neurobiol. , v. 75, n. 1, p. 1-28, 2005.
VIJAYARAGAVAN, K.; POWELL, A. J.; KINGHORN, J. J.; CHAHINE, M. Role of auxiliary β1-, β2-, and β3- subunits and their interaction with Nav1.8 voltage-gated sodium channel. Biochemical and Biophysical Research Communication , v. 319, p. 531-540, 2004.
VREUGDENHIL, M.; BRUEHL, C.; VOSKUYL, R. A.; KANG, J. X.; LEAF, A.; WADMAN, W. J. Polyunsaturated fatty acids modulate sodium and calcium currents in CA1 neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. , v. 93, p. 12559-12563, 1996.
WEST, J. W.; PATTON, D. E.; SCHEUER, T.; WANG, Y.; GOLDIN, A. L.; CATTERALL, W. A. A cluster of hydrophibic amino acid residues required for fast Na+-channel inactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. , v. 89, p. 10910-10914, 1992. YANG, L.; ZHAO, J.; MILUTINOVIC, P.S.; BROSNAN, R. J.; EGER, E. I.; SONNER, J. M. Anesthetic properties of the ketone bodies β-hydroxybutyric acid and acetone. Anesth. Analg. , v. 105, n. 3, p. 673-679, 2007.
YU, F. H.; CATTERALL, W. A. Overview of the voltage-gated sodium channel family. Genome Biology , v. 4, n. 3, article 207, p. 1-7, 2003. ZHOU, Z. S.; ZHAO, Z. Q. Ketamine blockage of both tetrodotoxin (TTX)-sensitive and TTX-resistant sodium channels of rat dorsal root ganglion neurons. Brain Research Bulletin , v. 52, n. 5, p. 427-433, 2000.
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