acción bactericida de la luz ultravioleta fotorreactivación
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CURSO: Laboratorio de Microbiología
DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz
GRUPO: ¨D¨
ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA
E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
ACCIÓN BACTERICIDA DE LA LUZ ULTRAVIOLETA,
FOTORREACTIVACIÓN
Microbiología General
1 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
I. INTRODUCCIÓN
Los efectos de la radiación con luz UV sobre los microorganismos pueden variar de
especie a especie y, entre cepas de la misma especie, del medio de cultivo, estado
del cultivo, densidad de microorganismos y otras características como el tipo y
composición del alimento. Los hongos y levaduras son más resistentes durante la
desinfección; sin embargo, los niveles altos de microorganismos deben tomarse en
cuenta cuando se usa UV-C para desinfectar.
La radiación absorbida por DNA puede detener el crecimiento celular y producir la
muerte celular. La luz UV-C que absorbe el DNA causa un cambio físico de
electrones que provoca la ruptura de los enlaces del DNA, retrasar la reproducción
o muerte celular. Esto significa que el efecto bactericida de la UV-C es básicamente
a nivel del ácido nucleico. Un enlace cruzado entre tiamina y citosina (Nucleótido
de bases Pirimídicas) en la misma cadena de DNA ocurre por la radiación de UV-C.
Los fotoproductos más comunes de DNA son dímeros ciclobutil pirimidina. El
efecto obtenido es que la transcripción y réplica del DNA se bloquean,
comprometiendo a las funciones celulares y eventualmente produciendo la muerte
celular. Los efectos en los enlaces cruzados del DNA son proporcionales a la
cantidad de exposición de luz UV-C.
II. OBJETIVO
Estudiar el poder letal de la luz ultravioleta midiendo la supervivencia de una
cepa bacteriana sensible.
Estudiar el fenómeno d la Fotorreactivación.
Microbiología General
2 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
III. MATERIALES
Material biológico
Cultivos puros bacterianos:Cultivos de Escherichia coli.
Material de Laboratorio
4 placas de petri estériles.
8 placas de agar nutritivo (AN).
32 tubos de 20ml de capacidad con 9ml de SSF estéril.
Un matraz de 250ml con 45ml de MgSO4 0,1M estéril.
Un matraz de 250ml con 10ml de caldo nutritivo (CN) estéril
Baño térmico con agitación
Hielo
Lámpara de luz UV (longitud de onda 240-265nm).
4 focos de luz visible de 100w.
IV. Fundamento teórico:
RADIACIONES UV
Mecanismo de acción: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV
sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante
daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los
residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo
que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo
ciclobutano.Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en
el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la
Microbiología General
3 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la
respiración.
Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con
lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram (+) y
Gram (-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no
penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos
FOTORREACTIVACIÓN
V. procedimiento:
1. Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de
microorganismos.
Encender una lámpara de luz UV durante 30 minutos. Antes del ensayo
con el fin de que se estabilice la intensidad de la emisión.
Preparar un cultivo en fase de crecimiento exponencial E. coli. Para ello
añadir 0.1ml de un cultivo incubado durante toda la noche a un matraz
con 10ml de caldo nutritivo estéril. Incubarlo a 370 C con agitación
Empieza por una enzima llamda fotorreactivante
Reconoce los dímeros
formados por la luz UV
Utiliza la luz visible
Rompe los enlaces que unía
a las dos pirimidinas
Actúa un ADNpolimeras colocandolas nuevas bases
Y finalmente una ADNligasa sella la molécula de
ADN
Microbiología General
4 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
constante (200rpm) durante 2-3 horas. De esta forma se obtendrá una
concentración celular de aproximadamente 108 UFC/ml.
Añadir al cultivo 45ml de MgSO4 0.1M.
Mantener la suspensión en hielo durante 5-10 minutos.
Dispensar 5ml de la suspensión en cada placa de Petri vacía estéril.
Rotar las placas en contra y a favor del sentido de las agujas del reloj.
Se ha de conseguir una distribución homogénea de la suspensión para
evitar el efecto de apantallamiento que las propias células pueden
crear entre sí.Radiar las muestras con luz UV durante distintos tiempos:
0, 20, 60, 120 seg.
NOTA: La lámpara UV se coloca a una altura de 50cm sobre una
superficie horizontal. La luz debe incidir verticalmente sobre las
muestras. La exposición se realizará en una habitación oscura para
evitar posible Fotorreactivación.
Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.
Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas
de agra nutritivo.
Microbiología General
5 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
Incubar a 370 C toda la noche.
Para la fotorreactivación hay que iluminar las placas irradiadas con
cuatro focos de luz visible de 100W durante 40 min a una distancia de
10cm.
Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.
Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas
de agar nutritivo.
Incubar a 37ºC toda la noche.
Diluciones Aconsejables para el Recuento de Supervivientes
Tiempo(seg) de exposición a la luz UV
Diluciones antes de la fotorreactivación
Diluciones después de la fotorreactivación
0 10-6 10-6
20 10-6 10-6
60 10-5 10-5
120 10-1 10-1
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6 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
VI. RESULTADOS:
1. Fotorreactivación:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli. Muestraa 0 segundos:
Muestra a 20 segundos:
Muestra a 60 segundos:
Muestra a 120 segundos:
Cantidad de colonias: 134
Descripción: el crecimiento microbiano es
mayor si nos expone a calor.
Cantidad de colonias: 42
Descripción: crecimiento del E. coli en menor
cantidad.
Cantidad de colonias: 43
Descripción: mayor crecimiento que a 20
segundos.
Cantidad de colonias: 165
Descripción: el crecimiento no se inhibe a
pesar que fue expuesto mayor tiempo que las
demás muestras, indicando que el E. coli tiene
un crecimiento favorable.
Microbiología General
7 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
Cantidad de colonias: 84
Descripción: colonias dispersas por todo la placa.
2. Ultravioleta:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli.
Muestra a 0 segundos:
Muestra a 20 segundos:
Muestra a 60 segundos:
Muestra a 120 segundos:
Cantidad de colonias: 123
Descripción: colonias dispersas por la placa
indicando que la radiación en UV no inhibe el
crecimiento microbiano.
Cantidad de colonias: 151
Descripción: el crecimiento no E. coli no se
inhibe a 60 segundos e incluso crece mejor q el
que no está irradiado.
Cantidad de colonias: 72
Descripción: el crecimiento es casi de la misma
proporción que cuando no se irradia.
Microbiología General
8 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
VII. DISCUSIÓN:
En condiciones apropiadas, la radiación electromagnética controla
eficazmente el crecimiento microbiano. La radiación ultravioleta es útil para
descontaminar superficies y materiales que no absorban luz, como el aire y el
agua. Las microondas, la radiación ultravioleta (UV), los rayos X son tipos de
radiación electromagnética. Sin embargo cada radiación actúa con un
mecanismo específico. La radiación UV, considerada entre 220 y 30nm de
longitud de onda, actúa como un mecanismo diferente. Las ondas UV tienen
suficiente energía para causar roturas en el ADN, produciendo la muerte del
organismo expuesto. Las cabinas de los laboratorios vienen equipadas con una
lámpara microbicida de la luz UV para la descontaminación de una superficie
después de su uso. La radiación UV no penetra las superficies sólidas, opacas,
absorbentes de luz, y su utilidad se limita a la desinfección de las superficies
expuestas. Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 692
Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de
crecimiento por encima de la cual mueren. La aplicación de calor es el
método de esterilización más utilizado. Latemperatura para la esterilización
por calor se selecciona con el fin de eliminar la mayoría de los
Microbiología General
9 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
microorganismos resistentes al calor en el material, habitualmente
endosporas bacterianas.Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 689
La luz ultravioleta no posee un gran poder de penetración lo que limita su uso
como desinfectante o germicida.Los efectos de la radiación UV son mutaciones
y alteraciones letales en los ácidos nucleídos. Los productos más importantes
de la acción de la luz UV son dímeros:
Que se formas entre dímeros. Los dímeros producidos durante la radiación
impiden la replicación y la transcripción. Estas alteraciones del DNA resultan
letales a menos de que sean reparadas por:
En las células, la radiación afecta en primer lugar a los ácidos nucleicos y las
proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las
alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido nucleico
son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la
citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de
puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y
por tanto de la bacteria.Las bacterias Gram-negativas son generalmente más
sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más
resistentes.
Existen varios métodos para la conservación de cepas interesantes de
microorganismos. Entre los más frecuentes figuran la congelaciónde muestras
de cultivos creciendo exponencialmente a los que se ha añadido un agente
Fotorreactivación
Reparación por Escisión
Mecanismo SOS
Timina – Timina
Timina – Citosina
Citosina – Citosina
Microbiología General
10 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
estabilizante (glicerol al 30%) y se mantienen a -80ºC; la liofilizacióny la
conservación en medios sólidos herméticos. La liofilización y la congelación son
los métodos de conservación más efectivos a largo plazo; pero ambos causan
una gran mortandad entre las bacterias (es decir, probablemente en torno al
80-90% de las CFU que se congelan o liofilizan mueren en el proceso). Estos
métodos son muy aplicados para conservar bacterias; sin embargo, presentan
más problemas en el caso de eucariontes ya que muchos de ellos no se
recuperan después del tratamiento.
Es de común conocimiento que las bacterias y otros microorganismos pueden
reparar su ADN tras haber sido dañados por la radiación ultravioleta (UV).
Conocida como “reactivación”, algunos microorganismos necesitan luz visible
para emprender la reparación (“fotorreactivación”), mientras que otros
pueden reparar su ADN sinluz (“reparación a oscuras”).
Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivación para
reparar el daño causado por la radiación UV cuando se exponen
inmediatamente después a la luz visible.
Las bacterias contienen complejos sistemas de enzimático de reparación del
ADN dañado por la luz UV, llamados sistemas reguladores SOS, que se activan
como consecuencia de los mismos daños en el ADN. Uno de estos es la
fotorreactivación.
Las cepas más comunes del E. coli contienen alrededor de 20 enzimas de
fotoliasa, capaces de reparar hasta cinco dímeros de timina por minuto cada
una—esto significa que, en una sola célula, pueden reparase hasta 100
dímeros por minuto. 1mJ/cm2 de UV produce, aproximadamente, 3,000-4,000
dímeros (Oguma, 2002), por lo tanto, en teoría, el daño provocado por
1mJ/cm2 de UV puede repararseen sólo 30 minutos.
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11 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
VIII. CONCLUSIÓN:
La luz ultravioleta tiene un destacado papel sobre ladesaparición bacteriana,
ya que tiene efecto bactericida en la Escherichia coli.El crecimiento depende
del tiempo de irradiación porque en algunos casos la irradiación UV no inhibe
el crecimiento, esto se observa en las muestras que estuvieron20 y 60
segundos; puede que tenga que ver que la bacteria E. coli es mesófila.
El mecanismo de fotorreactivación de la Escherichia coli es unsistema de
reparación directa de los daños producidos por la luz UV. La luz UV produce
dímeros de pirimidinas, fundamentalmente dímeros de Timinas. El enzima
Fotoliasa codificada por el gen PHR reconoce en la oscuridad los dímeros de
Timina y se une a ellos, y cuando se expone a la luz (mediante un fotón)
deshace el dímero de Timinas.
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,
Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998. Capítulo 20,
pág.: 689-691,692.
Carlos Gamazo, Ignacio López-Goñi, Ramón Díaz/”Manual Práctico de
Microbiología”/ 3a Edición- Masson S.A. Barcelona España
http://depa.pquim.unam.mx/genetica/Practica8.htm
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/23_micro.htm
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12 Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación
X. CUESTIONARIO:
1. ¿Se puede utilizar la luz UV para mutagenizar cultivos bacterianos?
Las mutaciones ¿Son siempre letales?
Si, ya que la radiación ultravioleta origina dímeros de pirimidina
(generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que son
ionizantes.
No, ya que las mutaciones pueden provocar cambios morfológicos y
fisiológicos muy grandes y en ocasiones solo puede ser detectada por
medio de técnicas moleculares. De acuerdo a los efectos que causan las
mutaciones se han clasificado en:
Morfológicas.-afectan las propiedades visibles exteriormente del
organismo, como el color, la talla, la forma.
Letales.- afectan la viabilidad de los organismos y pueden ser
dominantes, recesivas o semiletales.
Condicionales.- solo se expresan en condiciones restrictivas.
Bioquímicas.- producen deficiencias metabólicas que pueden
corregirse cambiando las condiciones del medio.
De resistencia.- confieren la capacidad de desarrollarse en presencia
de agentes patógenos o de compuestos inhibidores como los
antibióticos.