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Seminario

L’ACCREDITAMENTO: SIGNIFICATO PER I LABORATORI ED APPLICAZIONE NEI CONTROLLI DEGLI ALIMENTI

Accreditamento di una prova per un laboratorio pubblico:Accreditamento di una prova per un laboratorio pubblico:l’esperienza dell’IZSUM nella validazione della procedura per lal’esperienza dell’IZSUM nella validazione della procedura per la

ricerca delle ricerca delle biotossinebiotossine lipofilichelipofiliche

Roberta OrlettiLaboratorio Controllo Chimico e Biomonitoraggio

IZSUM Ancona

Pesaro, 20 novembre 2013

2Roberta Orletti – Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche

Sostanze tossiche prodotte da alghe unicellulari (dinoflagellati, diatomee)

Le Biotossine algali: cosa sono

Il rischio di intossicazione da biotossinealgali è principalmente legato al consumo di molluschi bivalvi filtratori (soprattutto i mitili), che possono accumulare queste sostanze a seguito del proliferare nell’acqua di particolari generi di alghe unicellulari tossiche (fitoplancton).

Fonte: http://www.daverrazzano.it


Le Biotossine algali: quante sono

• Paralytic Shellfish Poisoning (PSP)

• Amnesic Shellfish Poisoning (ASP)

• Diarrethic Shellfish Poisoning (DSP) – Tossine Lipofiliche:

• Acido okadaico e derivati (OA e DTXs)

• Yessotossine (YTXs)

• Pectenotossine (PTXs)

• Azaspiracidi (AZAs)

Fonte: IFREMER

Diffuse in tutti i paesi europei e in generale in tutti i continenti. In Adriatico si osservano quasi esclusivamente la tossine lipofiliche


Piano di Sorveglianza Regione MarchePercentuali di positività biotossine lipofiliche:

• Anno 2009 25%

• Anno 2010 13%

• Anno 2011 7%

25

13

7

0

5

10

15

20

25

30

2009 2010 2011

Anno

% p

ositi

vità

Tutti i positivi al mouse test sono

realmente tali in base al Reg. 853/2004?

Quali tossine sono presenti nei nostri campioni e in che

quantità?C’e una

spiegazione per gli andamenti

verificati?

Metodo ufficiale previsto: mouse bioassay(AESAN EU-RL-MB Lipophilictoxins vers 5 2009)


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Limite superiore

Limite inferiore

[µg

di Y

TX e

q./K

g]

Limite di legge

Campioni MBA positivi (step 1)

Campioni MBA positivi (step 2)

45%

14%

21%

9%11% Carbossi-1a-omoYTX

1a-omoYTX

YTX

45-idrossi-1a-omoYTX

45-idrossiYTX

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Carbossi-1a-omoYTX

1a-omoYTX YTX 45-idrossi-1a-omoYTX

45-idrossiYTX

YTXs totali

[µg/

Kg]

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Carbossi-1a-omoYTX

1a-omoYTX YTX 45-idrossi-1a-omoYTX

45-idrossiYTX YTXs totali

Campioni MBA positiviCampioni MBA negativi

[µg/

Kg]

Velieri F. el al. “Valutazione del metodo biologico ufficiale per la ricerca di biotossine lipofile” – Atti XXI Convegno AIVI – Signa(Fi) - 8-10 giugno 2011


Campione di mitili

MBA (150 g) LC-MS/MS

Estratto diclorometanico

Estratto idrometanolico

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

step 1

step 2

YTXs tota

li

step 1

step 2

YTXs tota

li

step 1

step 2

YTXs tota

li

step 1

step 2

YTXs tota

li

step 1

step 2

YTXs tota

li

step 1

step 2

YTXs tota

li

Limite superioreLimite inferiore

[µg/

kg]

Interferenza di YTXs nello step 1: 28-162 µg/kg ≡ 0,70-4,05 µg/topo• LD50 = 1.6-15 µg di YTX per un topo di 20 g • tempi di morte > 15a ora• sintomi neurologici ante mortem? Fattori tossici ignoti


Le problematiche evidenziate dal mouse test

I problemi etici nell’utilizzo del topo

Le raccomandazioni EFSA e i limiti proposti

L’emanazione del Reg. (UE) 15/2011


Aprile 2011: partecipazione al corso di formazione organizzato dal CRL presso l’Università di Vigo (Dott. Bacchiocchi)

Maggio - Agosto 2011: messa a punto del metodo

Settembre - Novembre 2011: validazione del metodo

25 Novembre 2011: visita ACCREDIA per l’accreditamento della prova

Febbraio 2012: il laboratorio ha ottenuto l’accreditamento per la prova (primo in Italia)

Accreditamento del metodo in LC-MS/MS(AESAN EU-RL-MB Lipophilic toxins vers 4 2011)

“L’autorità competente designa i laboratori che possono eseguire l’analisi dei campioni prelevati durante i controlli ufficiali. La autorità competenti, tuttavia, possono designare soltanto i laboratori che operano, sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee: EN ISO IEC 17025…”

Reg. (CE) 882/2004


Accreditamento del metodo in LC-MS/MS(AESAN EU-RL-MB Lipophilic toxins vers 4 2011)

Fase preliminare

1. Ricerca delle condizioni adeguate per i campioni analizzati (fasi mobili per condizioni cromatografiche basiche (I), condizioni LC per l’analisi delle tossine con colonna C18 in condizioni basiche, condizioni di frammentazione in MS/MS)

2. Il metodo ufficiale non definisce i parametri di precisione, accuratezza e incertezza. Lo studio intralaboratorio effettuato e riportato nella procedura del CRL ha lo scopo di verificare soltanto se possa risultare adeguato a sostituire il metodo precedente.

3. E’ stato quindi necessario effettuare una validazione completa del metodo, come effettuato dallo stesso CRL (Villar-Gonzalez et al. Determination of Lipophilic Toxins by LC/MS/MS: Single-Laboratory Validation - Journal of AOAC International Vol. 94, No. 3, 2011).

4. Confronto con i parametri riscontrati dal CRL.


Accreditamento del metodo in LC-MS/MS(AESAN EU-RL-MB Lipophilic toxins vers 4 2011) – 4 molecole su 12 previste

Verifica della linearità

retta acido okadaico y = 3766x - 464R2 = 0,9998

-200000

20000

400006000080000

100000

120000140000160000

0 10 20 30 40 50

Area piccoLineare (Area picco)

retta yessotossina y = 327,07x - 280,77R2 = 0,9992

-5000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0 20 40 60 80 100 120


retta PTX2 y = 5090,4x - 476,94R2 = 0,9992

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 10 20 30 40 50


retta AZA1 y = 28732x - 1411R2 = 0,9999

-200000

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 10 20 30 40 50


• 7 soluzioni del materiale di riferimento (6 per YTX), compreso lo zero, equamente distribuite sull’intero campo di applicazione. • 3 letture x concentrazione.• Costruzione delle rette di taratura (min. quadrati, senza imposizione int.=0)



Verifica della linearità e punto di concentrazione inferiore

• Calcolo “fattori di risposta” [(risposta-intercetta)/concentrazione]

• Calcolo valore medio e verifica che tutti i fattori di risposta cadessero nell’intervallo valore medio +/- 10%

Linearità confermata per AO, PTX2, AZA1 e YTX

• Calcolo di xa, o punto di concentrazione della curva più basso utilizzabile (numero di punti della retta, le medie dei valori x e y, la pendenza e l’intercetta della retta, il coefficiente di correlazione e la t di Student)

xa < x1 per AO, PTX2 e AZA1, condizione non verificata per YTX



Verifica tempi di ritenzione - LOD, LOQ

• Per identificare ogni tossina è necessario confrontare il proprio RT con quello dello standard relativo, considerando come massimo scostamento l’1% (CV% e scostamento percentuale dal valore medio dei tempi di ritenzione )

Condizione verificata per le 4 molecole

• 6 bianchi matrice: • determinazione di LOD e LOQ per ogni molecola e per gruppo di molecole (3 o 10 x SDB)• alternativamente estrapolando tale dato dal valore dell’area del picco della transizione più abbondante al livello di aggiunta inferiore effettuata per le prove di ripetibilità e accuratezza, per un S/N =10 • verifica dei LOQ calcolati con una prova su un campione bianco con aggiunta a livello di poco superiore ai LOQ riscontrati

LOQ sperimentali < LOQ definiti dal CRL



Ripetibilità

• Fortificazione (drogaggio) di bianchi-campione: 3 livelli di fortificazione a 0.5, 1 e 1.5 volte il valore del LMR per AO, PTX2 e AZA1, concentrazioni inferiori per YTX (in considerazione del livello elevato)• 6 determinazioni indipendenti per ciascun livello (18 prove complessive) x analita• Calcolato per ogni livello: valore medio (xmedio), scarto tipo (s), CV%, ripetibilità del metodo (r = t × s × 2-2)

Calcolata la funzione r = f(xmedio) per avere la ripetibilità in tutto il range di concentrazione studiato

Verificato che la ripetibilità sperimentale fosse inferiore a quella riscontrata dal CRL

14

7Ripetibilità (µg/kg) (P = 95 %)

2.82CV %

2Scarto tipo

70Media (µg/kg)

71,2158006

68,6153005

71,9158004

70,9159003

66,9150002

68,4151001

Concentrazione (µg/kg)

Area piccoDeterminazioni

80 µg/kgLivello aggiunta

MitiliMatrice

Acido okadaicoAnalita

17Ripetibilità (µg/kg) (P = 95 %)

3.80CV %

5Scarto tipo

127Media (µg/kg)

129,8285006

122,6272005

132,7290004

120,1269003

125,3278002

129,5283001

Concentrazione (µg/kg)Area piccoDeterminazioni

160 µg/kgLivello aggiunta

MitiliMatrice

Acido okadaicoAnalita


Ripetibilità (AO)

Roberta Orletti – Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche



Accuratezza e incertezza• Effettuate prove di recupero su campioni fortificati (stesse prove già eseguite per la precisione, valutando il recupero percentuale)• Calcolato il grado di esattezza come recupero percentuale medio, con relativo scarto tipo

Recuperi sperimentali paragonabili a quelli riscontrati dal CRL x AO, PTX2, AZA1, decisamente migliori per YTX

• Calcolo dell’incertezza secondo l’approccio “bottom-up” o decostruttivo o metrologico. • Calcolata l’incertezza al LOQ e ad ogni livello di aggiunta considerato per ciascuna molecola• Calcolo dell’incertezza estesa (incertezza composta x fattore di copertura k, con k uguale alla t di Student tabulata ai gradi di libertà effettivi)

Calcolata la funzione U(y) = f(xmedio) per avere l’incertezza in tutto il range di concentrazione studiato – incertezza sperimentale << incertezza del CRL


333CV

222Scarto tipo

808088Media

8081906

7978875

7983904

8177913

7979862

8481861

240 ng/g160 ng/g80 ng/g

Livello di aggiuntaRepliche


Accuratezza (AO)

17

13,0114,5713.50Incertezza estesa relativa %

25,23718,4529.402Incertezza estesa assoluta

1.9651.9951.974Fattore di copertura k al 95% (t di student)

44768173Gradi di libertà

12,8414809,2469974,763105Incertezza composta assoluta

0,0662170,0729960,068396Incertezza composta relativa

0,0137830,0137830,013783Incertezza relativa dil. materiale di riferimento

0,0605610,0605610,060561Incertezza relativa materiale di riferimento

0,0070310,0040420,003279Incertezza relativa di esattezza

0,0025100,0024750,002459Incertezza relativa di pesata

0,0011550,0011550,001155Incertezza relativa di volume

0,0000070,0000110,000020Incertezza relativa curva di taratura

0,0215350,0379590,028217Incertezza relativa di ripetibilità

4,1762284,8085381,965037Incertezza tipo di ripetibilità della media

240 ng/g160 ng/g80 ng/g

Livello di aggiuntaParametri


Incertezza (AO)


18


Coefficienti di recupero

• Verificato se il valore del coefficiente di recupero R, determinato nello studio di esattezza, fosse significativamente diverso da 1. Calcolato il rapporto:

t (sperim) = |1 - Rmedio|u(Rmedio)

• Il valore calcolato è stato confrontato con quello critico• Per AO, PTX2 e AZA1 è stato verificato che:

t (sperim) ≥ t 95%,νeff

• Per YTX:t (sperim) < t 95%,νeff

I valori di AO, PTX2 AZA1 sperimentalmente rilevati devono essere corretti per il recupero. Non è necessaria la correzione per YTX.


19

2.5712.5712.571t95%,νeff

23,30021,50612,503tsperim

240 ng/g160 ng/g80 ng/g

Livello di aggiuntaParametro

2.5712.5712.571t95%,νeff

0,2850,2132,547tsperim

480 ng/g320 ng/g80 ng/g

Livello di aggiuntaParametro


Coefficienti di recupero (AO – verde - YTX – giallo)


20


Effetto matrice

• Necessità di verificare l’effetto matrice nei propri strumenti (applicando eventualmente specifica correzione).

• Valutato il rapporto percentuale tra le aree dello standard in matrice e dello standard in solvente, alla medesima concentrazione

• Percentuali comprese da 80 e 120% sono state considerate indice di un effetto non significativo (Mol et al.)

80-120981716316750Azaspiracido-1

80-12098115579113000Pectenotossina-2

80-12011680189295Yessotossina

80-1201122361626500Acido okadaico

Valore di riferimento % per la definizione di un effetto non significativo (Mol et al. Anal. Chem.

2008, 80, 9450-9459)

Rapporto % areestandard in matrice /standard in solvente

Area relativa a 8 ng/ml di AO estrapolata dalla retta media di calibrazione in

solvente

Area media del picco della matrice bianca + AO (80

ng/g)

Materiale di riferimento


21

Verifica del metodo in LC-MS/MS (AESAN EU-RL-MB Lipophilic toxins vers 4 2011)

Circuito Europeo Quasimeme

Exercise No. 976 Round 69 Group DE10 Year 2012 Total Number of laboratories 23

AL732 (IZSUM) ha ottenuto i risultati migliori rispetto a tutti i laboratori partecipanti

Exercise No. 995 Round 71 Group DE10 Year 2012Total Number of laboratories 22

AM211 (IZSUM) ha ottenuto i secondi risultati migliori rispetto a tutti i laboratori partecipanti


22

Conclusioni

• Il metodo proposto è applicabile e adeguato per rispondere alla normativa europea sulle biotossine lipofiliche. • I risultati osservati in sede di validazione rientrano pienamente nei parametri fissati dal metodo e riscontrati dal CRL nella propria validazione intralaboratorio.• Il processo di verifica delle performance risulta limitato dalla indisponibilità di tutti gli standard certificati relativi ad ognuno dei principi attivi da analizzare.• Il metodo implementato e verificato ha consentito di conoscere quali tossine fossero presenti nei molluschi locali e le loro esatte concentrazioni.• Percentuale positività osservate nel 2012 (LC-MS/MS): 2.6%; a conferma dell’inadeguatezza del MT per la specifica situazione dell’Adriatico



Un grazie anche a:Un grazie anche a:

Simone Simone BacchiocchiBacchiocchi

Melania SiracusaMelania Siracusa

Francesco VelieriFrancesco Velieri

Roberta OrlettiResponsabile Laboratorio Controllo Chimico e BiomonitoraggioIZSUM – Sezione di AnconaTel. 071/41760Fax. 071/42758E-mail : [email protected]

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