B. ÁCIDOS ORGÁNICOS

La producción de ácidos orgánicos mediante el uso de microorganismos constituye una

fuerza motriz de gran importancia para el estudio de regulaciones metabólicas, lo cual a

su vez, ha sido clave para el desarrollo de la biotecnología en su sentido más amplio

(García et. al, 2004). Son ampliamente usados en alimentación, como acidulantes,

saborizantes o ingredientes químicos. Así también, pueden producirse por vía

microbiológica, síntesis química o extracción de productos naturales.

El uso de compuestos acidulantes en la conservación y mejora de propiedades

organolépticas en alimentos es extenso. En particular, los ácidos que contienen uno o

más carboxilos son aditivos alimentarios importantes. Estos ácidos, genéricamente

denominados “ácidos orgánicos”, son intermediarios o productos terminales de ciclos

metabólicos básicos por lo cual ocurren en una gran variedad de organismos vivientes.

Tales compuestos incluyen los ácidos cítrico, láctico, acético, málico, tartárico,

fumárico y glucónico. Su producción industrial, salvo el caso del ácido tartárico, se

realiza mayoritariamente por métodos biológicos lo que los ubica como prototipo de la

biotecnología alimentaria (García et. al, 2004).

La mayoría son obtenidos microbiológicamente procedentes del ciclo de Krebs, por lo

que, en teoría, son muchísimos los microorganismos capaces de sintetizarlos, aunque

sólo unos pocos en cantidades adecuadas para la aplicación industrial. Así también, sólo

unos pocos de estos ácidos son más rentables producidos por vía microbiológica que por

vía química.

Tabla N. Ácidos orgánicos más importantes.

Ácido orgánico Características y usos

Ácido cítrico

El más importante, ya que se obtiene únicamente por vía microbiológica.

Uso

Alimentos (acidulante y saborizante), industria farmacéutica y productos

de limpieza.

Ácido acético y

láctico

Son los segundos en importancia. Se pueden obtener tanto

microbiológica como químicamente.

Uso

Alimentos (acidulante), plásticos biodegradables, lacas, barnices,

industria farmacéutica

Ácido málico y

fumárico

Son de escasa demanda e importancia.

Ácido itacónico y

glucónico

Se prefiere la síntesis química, más sencilla y económica, ya que es más

fácil obtener de los microorganismos las enzimas que catalizan su

formación que el producto en sí.

Uso

Alimentos (regulador de la acidez), productos de limpieza (removedor de

depósitos calcáreos y óxidos), industria textil y papel.

Ácido tartárico

Se obtiene en la fermentación del vino.

Actualmente, está en desarrollo la producción a partir de Aspergillus o la

bacteria Alcaligenes.

Uso

Bebidas, antioxidante, industria farmacéutica.

Propiedades de los ácidos orgánicos en la industria de alimentos

Poder acidulante.

Capacidad amortiguadora o reguladora de pH.

Agente quelante de iones metálicos.

Emulsificante.

Efectos organolépticos.

1. Ácido cítrico: es un ácido orgánico tricarboxílico relativamente fuerte y muy

soluble en agua, con 6 átomos de carbono que está presente en la mayoría de las

frutas, sobre todo en cítricos como el limón y naranja. Su fórmula química es

C6H8O7.

Figura N. Fórmula química del ácido cítrico.

Generalidades del ácido cítrico

Es el más importante, ya que sólo se obtiene por vía microbiológica y además es

el más utilizado. Actualmente más del 99% de la producción mundial de ácido

cítrico se produce microbiológicamente. El 70% se utiliza en la industria de

alimentos y bebidas ya que el sabor de los jugos de frutas, extractos de jugos de

frutas, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por adición de

ácido cítrico. El 20% se destina a productos farmacéuticos como el citrato de

hierro y ácido cítrico que se usan como conservantes de la sangre almacenada

así como en tabletas, pomadas y preparaciones cosméticas. En la industria

química (10% restante) el ácido cítrico se utiliza como agente antiespumante,

como reblandecedor y para el tratamiento de textiles.

Su sabor agradable y elevada solubilidad hacen que tenga diversidad de usos:

Alimentación: como acidulante, aromatizante, antioxidante y

saborizante para productos dulces, como caramelos, helados, zumos.

Farmacia: Como preservante de la sangre, debido a sus propiedades

antioxidantes.

Cosmética: Como integrante de diferentes preparados.

Metalurgia: Ya que muchos metales se extraen más fácilmente como

citratos. Ácidos orgánicos y alcohol.

Detergentes: Como sustituto de los polifosfatos. Esto es importante

porque los polifosfatos son causantes de la eutrofización de las aguas

dulces. La abundancia de N y/o P favorece un altísimo desarrollo de las

algas, lo que causa una disminución enorme de oxígeno en el agua y, por

tanto, la muerte de los organismos de dichas aguas. Al producirse la

descomposición anaerobia de toda esa materia orgánica, los ríos y lagos

se acaban convirtiendo en pantanos. Por ello, se prefiere el ácido cítrico

(aunque más caro).

Química: como antiespumante y en la industria textil.

Los procesos de fermentación se llevan a cabo con cepas modificadas

genéticamente para aumentar la producción y disminución de compuestos

colaterales, como el ácido oxálico y glucónico.

Microbiología del ácido cítrico

Las especies usadas son:

Aspergillus Níger: usando como sustrato sacarosa o melazas,

hidrolizados de almidón, sueros lácteos, etc. Las condiciones de este

sustrato son:

- Limitación del fosfato.

- Ausencia de cationes metálicos, ya que éstos pueden limitar la

producción al superar los niveles traza. Esto se consigue por adición

de ferrocianatos (con lo que los cationes precipitan como complejos)

o usando resinas de intercambio iónico.

Figura M. Aspergillus Níger.

Candida lipolytica: con parafina como sustrato, aunque está poco

implantado.

Levaduras como bacterias, pueden acumular cítrico a partir de glucosa.

Su potencial es el menor tiempo de fermentación.

Bioquímica del ácido cítrico

El ácido cítrico es un intermediario en el ciclo TCA, se produce como un

producto en exceso debido a una operación defectuosa del mismo. Las enzimas

claves en la fermentación del cítrico son la aconitasa y la isocitrato

deshidrogenasa.

El catabolismo de hexosas ocurre fundamentalmente por la ruta de la glicólisis

Figura N.

Medio nutricional

a. Aspectos nutricionales

La fuente de carbono ha de tener una concentración de azúcares del 15-25%.

Para ello, se usa almidón de patata o hidrolizados de almidón (ambos

requieren hidrólisis enzimática), jarabe de caña de azúcar, melazas o sacarosa.

Minerales en las concentraciones adecuadas, sobre todo hierro, requiriendo

unas condiciones diferentes para la fase de crecimiento y la de producción. Si

no se dan las concentraciones adecuadas, la morfología del hongo no será la

óptima y la producción se verá afectada.

Los requerimientos de pH varían de la fase de crecimiento (trofofase, pH de

5) a la idiofase (de producción, pH inferior a 3).

Debido a las diferentes condiciones para idiofase y trofofase es difícil

establecer un proceso de producción en continuo.

El medio suele tratarse con resinas de intercambio iónico para asegurar

concentraciones bajas y controladas de los metales disponibles. La obtención

del ácido cítrico, que en un principio se realizaba mediante el crecimiento en

una superficie estática, ahora se lleva a cabo en fermentadores aeróbicos con

agitación. Generalmente se utilizan como materia prima las melazas en altas

concentraciones (15-18%). El ácido cítrico es un producto metabólico

primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la

principal fuente de carbono utilizada para la producción de ácido cítrico. En

la trofofase, parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de

micelio y se convierte, a través de la respiración, en CO2. En la idiofase, el

resto de glucosa se convierte en ácidos orgánicos existiendo una pérdida

mínima por respiración. Durante la idiofase y cuando el nivel de sustrato es

alto, se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la a-

cetoglutarato deshidrogenasa. La actividad citrato sintasa aumenta por un

factor de 10, mientras que las actividades de los enzimas que catabolizan el

ácido cítrico, aconitasa e isocitrato deshidrogenasa, se reducen drásticamente

en comparación con su actividad durante la trofofase. Esto da lugar a una

acumulación y excreción de ácido cítrico por el microorganismo

sobrecargado. El rendimiento teórico es de 112g de ácido cítrico anhidro por

100g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se obtienen en la

práctica debido a las pérdidas durante la trofofase. Generalmente se consigue

un 60% sobre el rendimiento teórico.

b. Aspectos fisicoquímicos

La fermentación debe controlarse entre 25-30 °C. El pH al inicio se ajusta a

3.5-4.5 y se mantiene en 2 durante la etapa productiva.

Es importante la aireación del medio. El uso del aire enriquecido en oxigeno

permite lograr una producción adecuada.

Procesos de producción

a. Procesos en superficie

Son más sencillos, pero requieren más mano de obra.

Como sustrato sólido:

- Trigo u otro cereal

- Se dispone en capas delgadas (3-5 cm) donde se colocan las esporas

- Se mantiene a pH entre 4 y 5 y 28 °C durante 90 horas.

- Se procede a la extracción del ácido cítrico mediante 5 volúmenes de

agua caliente.

Como sustrato líquido:

- Se usan sacarosa o melazas, complementadas con H2KPO4, MgSO4 y

ZnSO4.

- Se inoculan las bandejas con esporas (2-5 ·107 esporas / m2).

- Se procede a incubación a 30 oC con pH entre 4 y 5.

- Es necesario aportar suficiente oxígeno como para desplazar al CO2

producido, ya que este inhibe la producción por encima del 10% de

concentración.

- Se mantiene la etapa de crecimiento durante 30 horas, y la de

producción entre 8 y 14 días.

b. Procesos sumergidos o en profundidad

Es más complejo, pero permite una mayor mecanización.

Se opera en discontinuo o semicontinuo con alimentación fraccionada.

Se usan fermentadores pequeños (menos de 250 m3), agitados o de columna

de aire, construidos en materiales capaces de resistir pH’s ácidos sin liberar

cationes metálicos (por lo general, se construyen en acero inoxidable).

Dos factores importantes a tener en cuenta son:

• La relación Fe/Cu ha de ser más controlada que en procesos koji para que

el micelio adopte la forma adecuada.

• Los niveles adecuados de oxígeno son menores (0.2-1 vvm)

Purificación

Se efectúa en pasos:

• Se retira el micelio del hongo. Como el ácido cítrico estará atrapado en el

micelio (debido a la alta densidad de éste), se efectúa un lavado previo a la

precipitación o filtración para retirar dicho micelio.

• Adición de cationes calcio a pH 3, lo que hace que precipite oxalato cálcico.

• Extracción del ácido cítrico a pH neutro con temperaturas entre 70 y 90 oC, lo

que hace que se pierdan los componentes volátiles interferentes.

• Al adicionar ahora calcio, precipita citrato cálcico.

• El citrato se purifica mediante resinas de intercambio iónico, lo que permite

obtener el ácido cítrico.

Figura N.

2. Ácido fumárico

Este ácido tiene una producción estimada mundial superior a las 60000

toneladas anuales. Presenta una baja solubilidad en agua y es usado por como

acidulante en los alimentos, así como en la producción de resinas y materiales

plásticos. Recientemente se ha empleado como materia prima en la producción

de ácido aspártico a través de la enzima aspartasa y de ácido málico con la

enzima fumarasa. Actualmente se produce por vía química sustituyendo al

método fermentativo empleado en la década de los 60.

Debido a su baja higroscopicidad (tendencia a captar agua), se usa en bebidas

deshidratadas y revestimientos de golosinas (evita la entrada de agua a

alimentos), como colorante (fija el color de la carne), emulsificante, suavizante,

acidulante y saborizante. Paralelamente, su baja solubilidad limita otras

aplicaciones (lo que se evita por adición de compuestos que aumentan su

solubilidad).

Se obtiene a partir de hongos filamentosos los cuales acumulan ácido fumárico,

principalmente del hongo Rhizopus stolonifer usando como sustratos derivados

de soja o arroz.

Figura A. Hongo Rhizopus stolonifer.

3. Ácido málico

La producción estimada de Ácido málico es de 25 000 t/año. Prácticamente es

usado en su totalidad como agente acidulante en bebidas carbonatas. Este ácido

tiene un sabor ácido suave que se retiene en las papilas gustativas durante mayor

tiempo que el cítrico. Esto promueve un aumento en la duración del sabor.

Recientemente se ha reportado que el ácido málico presenta un efecto sinérgico

cuando se mescla con edulcorantes como aspartamo. De esa manera se reduce el

contenido final de aspartamo hasta en 10% con ahorros importaciones en costos.

El ácido málico puede producirse por fermentación con variedades de

Aspergillus y Rhizopus. Sin embargo, el método de uso actual se lleva a cabo

por trasformación enzimática de fumárico mediante la enzima fumarasa.

Figura T. Aspergillus.

4. Ácido glucónico

La producción industrial de este acido alcanza las 40 000 toneladas anuales. Es

sumamente soluble en agua y se comercializada en forma de soluciones acuosas

al 50%.

Se utiliza en la industria láctea para retardar la sedimentación en la leche. En la

forma de α- gluconolactosa se aplica como acidulante de efecto retardado en

panificación y embutidos y, en Japón, como coagulante de proteínas de soya

durante la manufactura de tofu. Sin embargo el mayor uso de ácido glucónico en

forma de sales. Gluconatos de calcio y fierro usados para tratar pacientes

anémicos y con deficiencias de calcio mediante inyecciones intravenosas o

consumo oral.

En la producción de ácido glucónico sólo participa una única enzima

microbiana, la glucosa oxidasa, que se encuentra en Aspergillus niger. Este

hongo crece en condiciones óptimas en el líquido de maceración del maíz pero

cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las células en reposo

transforman la glucosa restante en ácido glucónico. El gluconato sódico se

utiliza como agente secuestrante en muchos detergentes.

Proceso de producción

Figura L. Proceso de producción de ácido glucónico.

La oxidación de glucosa con oxígeno molecular es catalizada por la enzima

glucosa oxidas. Esta enzima, normalmente intracelular es parcialmente excretada

o mantenida extracelularmente asociada con la membrana de ciertos hongos

filamentosos, especialmente en variedades de Aspergillus y Penicillum. El

desarrollo de la fermentación glucónica se llevó a cabo en paralelo con la cítrica

basado en los estudios de Curie. Sin embargo, a diferencia del ácido cítrico, para

producir ácido glucónico se requiere un pH cercano a la neutralidad para evitar

la inactivación de glucosa oxidasa a pH bajos ya que a valores de éste neutros o

alcalinos A. níger produce este ácido casi exclusivamente. El peróxido de

hidrogeno es descompuesto por la acción de catalasa, enzima constitutiva en

dichos hongos. La gluconolactona es hidrolizada espontáneamente a glucanato.

La manufactura comercial de glucónico se lleva a cabo en medios ricos de

glucosa. El contenido de nitrógeno y fosforo debe ser relativamente bajo

mientras que los metales no son particularmente inhibitorios a las

concentraciones normalmente presentes en sustratos industriales. En

consecuencia, no es menester efectuar pretratamientos como en el caso de la

fermentación cítrica.

La particularidad de este proceso es la alta demanda de oxigeno requiriendo

altos niveles de aireación o el uso de presiones superiores a la atmosfera. La

fermentación se lleva a cabo a 30°C y el medio es neutralizado constantemente

con CaCO3 o NaOH dependiendo si el producto final es el gluconato de calcio o

de sodio.

Figura W. Aspergillus niger.

El rendimiento teórico en la producción de glucónico a partir de glucosa,

asumiendo que no hay formación de C02, es de 109 g de ácido/100 g de azúcar.

En la práctica se obtienen rendimientos superiores al 90% de este máximo. La

fermentación en escala industrial se realiza a 30-33 0C, el cultivo es agitado y se

utilizan volúmenes de aire de 1-1.5 VVM.

5.