actualización en el diagnóstico de...
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Actualización en el Diagnóstico de MalariaDiagnóstico de Malaria
Claribel Murillo S. MScNoviembre 12 de 2010
Contenido
�Generalidades Malaria �Diagnóstico de malaria
– Tipos de diagnóstico– Pruebas diagnósticas
• Gota gruesa• Gota gruesa• Métodos fluorométricos• Moleculares• Pruebas inmuno-enzimáticas • Pruebas inmuno-cromatográficas
�Control de calidad
Un viejo conocido
Generalidades
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Malaria: victimas famosas
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• “mala” “aria” = Mal aire
• “Palus” = Pantano
• Enfermedad causada por un parásito del genero Plasmodium, el cual se
transmite a través de la picadura del mosquito Anopheles.
• Agente causal identificado en 1888 por Charles Louis Alphonse Laveran.
Generalidades
•Quienes padecen malaria?
•Donde ?malaria?
•Donde ?
300 millones de casos clínicos al año
90% en niños menores de 5 años
http://www.elnuevoparquet.com/charts4fun/2010/07/18/cheryl-cole-se-recupera-de-la-
malaria/
90% en niños menores de 5 años
Incidencia estimada de malaria por 1000 habitantes, 2006
Africa 90% En América:
Brasil 40%
WHO/HTM/GMP/2008.1
Africa 90% Brasil 40%
Colombia 20%
Porcentaje estimado de casos de malaria por P. falciparum, 2006
La situación en Colombia…..
• 85% territorio colombiano cumple con las condiciones para transmisión de malaria.
• 18-24 millones de personas en riesgo.
• En el 2009: 85 mil casos aproximadamente.
Incidencia anual de malaria en Colombia (1959-2002)
600
700
800
900
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1999
2001
Year
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Departamentos por número de casos 2010
�Antioquia�Córdoba�Chocó�Valle�Guaviare�Nariño
Número de casos y proporción acumulada por municipio
Instituto Nacional de Salud. 2010
Generalidades
• Factores que contribuyen al aumento de casos
– Conflicto armado
– Desplazamiento– Migración humana– Minería– Cepas resistentes– Cambio climático
•Quien la produce, cómo y donde ?
Esporozoito
Desarrollo de Gametos
Gameto
Cigoto
OoquinetoOocisto
FertilizaciónEsporogonia
5 especies
� P. falciparum
Na
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Ciclo de vida de PlasmodiumN
atu
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Ciclo de vida de Plasmodium
Trofozoito
Esquizonte
Ciclo exoeritrocitico
Ciclo eritrocíticoMerozoito
Trofozoito
Merozoitos
Ezquizonte
Formación de
gametocitos
Gametocito
� P. falciparum�P. vivax�P. malariae�P. ovale�P. knowlesi
•Parásito de Macacos
•Ciclo de 24 horas
Extendido de un caso fatal de P. knowlesi en humano
http://www.sanger.ac.uk/about/press/2008/081008.html
Por qué es importante diagnosticarla?
– Prevenir la muerte– Manejo adecuado– Manejo adecuado– Prevenir la automedicación y generación de
resistencia– Epidemiología y estadísticas.
Cómo se diagnóstica?
Cómo se diagnóstica?
• Antecedente epidemiológico• Sintomatología• Prueba de diagnóstico positiva
Escalofrio, fiebre y sudoraciónAnemia
Dolor de cabezaMialgias
Esplenomegalia
Con que se diagnóstica ?
• Métodos Microscópicos• Gota gruesa• Métodos fluorométricos
• Métodos inmuno-cromatográficos/enzimáticos– Detección de antígenos parasitarios
• Métodos Moleculares– Detección de ADN
Microscópicos
Gota gruesa y extendido-Sangre periférica-Gota gruesa: varias capas celulares.
Detección.Detección.-Extendido: Monocapa celular.
Identificación.
Coloraciones derivadas de Romanowsky
•Field
•Giemsa
•Wright
http://analislaboratoriumkesehatan.blogspot.com/2010/03/thick-and-thin-blood-smears-for.html
irvingcrowley.com
www.udec.cl/ofem/neonat/svasc1b.htm
•Romanowsky modificada
Microscópicos
• Sensibilidad: 5-10 p/ul
• Su éxito depende de :• Coloración• Coloración• Equipo• Competencia-Habilidad del lector
Microscópicos
• QBC (Quantitative Buffy Coat )– Desarrollado por Becton & Dickenson.– Capilares con naranja de acridina– Microscopio con Luz UV.– Microscopio con Luz UV.
�Tan o más sensible que Gota Gruesa
�Menos tiempo de proceso
�Requiere equipo especial
�Dificultad para identificación de especie
�Falsos positivos por artefactos
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C.h
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Inmuno-enzimaticos
• Detectan antígenos del parásito• Uso en bancos de sangre• Permite analizar varias muestras simultáneamente
Ac. Primario
Substrato
Conjugado
Inmuno-cromatográficas ó Pruebas de diagnóstico rápido (PDR)
• Detectan antígenos del parásito– Aldolasa– Enzima lactato deshidrogenasa (pLDH)– Proteína rica en histidina II (HRP2).– Proteína rica en histidina II (HRP2).
• Sensibilidad variable. – 200p/ul
• PDR son una alternativa diagnóstica para los lugares de difícil acceso.- Uso en brotes o epidemias.
- Auto diagnóstico en viajeros.
PDR
• Más de 40 fabricantes en el mundo.• Más de 150 pruebas diferentes.• Ventajas
– Infraestructura requerida es mínima.– Infraestructura requerida es mínima.– Simples de realizar e interpretar.– Fácil de aprender y enseñar.
• Desventajas– Incapacidad para cuantificar densidad parasitaria y diferenciar entre
estadios asexuales y sexuales.– Variabilidad de resultados entre lotes– Variabilidad en el antígeno blanco
PRINCIPIO DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO (PDR)
Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000
PROCEDIMIENTO
Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000
PDR
Modificado de New Perspectives Malaria Diagnosis, 2000
Especificidad, sensibilidad, depende del antígeno b lanco
NECESIDAD DE UN SISTEMA DE CONTROL DE CALIDAD.
Reducir la posibilidad de diagnósticos errados.
Aseguramiento de la calidad de las PDR.
Generar confianza en los pacientes y los trabajadores de la salud.Generar confianza en los pacientes y los trabajadores de la salud.
Puntos Críticos: Transporte y almacenamiento
Degradación por humedad y calor.
FABRICANTEBPM
Evaluación del producto.
LAB. NACIONAL/REGIONALEvaluación de lotes.
ÁREAS REMOTAS / DISTRITOS
Tamizaje de sensibilidad
USUARIO FINALEntrenamiento y
supervisión.
REQUISITOS PARA UN ADECUADO SISTEMA NACIONAL DE ASEGURAMIENTO DE LA
CALIDAD DE PDR-MALARIA.
producto. Tamizaje de sensibilidadsupervisión.
TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO
Control y monitoreo de la temperatura
Adaptado de Bell, 2006
Moleculares
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
•Detectan blancos genéticos del parásito.•Altamente sensibles
Extracción de ADN
Principal blanco:
18s Ribosomal
Requieren equipo especial:
Termocicladores, equipo para electroforesis
Loop-Mediated Isothermal amplification (LAMP)
• Requiere extracción de ADN.• Blanco: ADN mitocondrial
Moleculares
• Blanco: ADN mitocondrial• No requiere termociclador (no cambios de temperatura
durante la reacción).• Altamente sensible.• Actualmente no es de uso convencional pero con futuro
para uso en campo.
PCR Convencional
LAMP
http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e63/F1.expansion
http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html
LAMP• Producción de pirofosfato en la reacción,
este se une a un ión metálico divalente formando una sal insoluble.
• 30-40 minutos• Turbidimetría ó
•Mariangela
• Turbidimetría ó• Fluorescencia
http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n5/full/nprot.2008.57.html
Bonizzoni, A
m.J. T
rop. Med. H
yg., 81(6), 2009, pp. 1030–1034
Conclusiones
• Enfermedad mortal sino se diagnóstica a tiempo.
• Tiene cura.• Fácil de diagnosticar.• Fácil de diagnosticar.• Prevalente y ampliamente distribuido en el
país.• Métodos de diagnóstico no complicados.• Métodos alternativos recientes sensibles y
factibles de aplicar en campo.
Conclusiones
• Estándar diagnóstico sigue siendo la microscopia.
• Entrenamiento y re-entrenamiento son necesarios.necesarios.
Referencias
•http://www.bbc.co.uk/mundo/ciencia_tecnologia/2010/02/100216_2236_tutankamon_adn_gz.shtml•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2005. 326•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2009
•WHO 2010. Basic Malaria Microscopy Part I. 2nd edition.. •Disponible en http://www.searo.who.int/LinkFiles/Malaria_malaria_microscopy_Learners_guide2010.pdf
•World Health Organization RBM, UNICEF. (2005) World Malaria Report 2009•Guía de atención de la malaria No. 19. Guías y Normas 412 - Tomo 3Final.p65. Disponible en: http://www.nacer.udea.edu.co/pdf/libros/guiamps/guias19.pdf•Pain A, Böhme u, Berry A. The genome of the simian and human malaria parasite Plasmodium knowlesi. 2008. Nature 455, 799-803.•OPS. Guía para la implementación de un sistema de gestión de calidad en el diagnóstico microscópico de malaria: Estandarización de procedimientos y herramientas sobre el control de calidad y la evaluación externa del desempeño en las redes de laboratorio. 2004. OPS/DPC/CD/M/393/06.• WHO/RBM WHO-RBM. The Use of Malaria Rapid Diagnostic Tests . Geneve-Switzerland: WHO 2003•Bell D, Wongsrichanalai C, Barnwell J. Ensuring quality and access for malaria diagnosis: how can it be achieved? Nat Rev Microbiol. 2006 Sep;4(9 Suppl):S7-20.•World Health Organization. New perspectives malaria diagnosis . Geneva: WHO; 2000.•Murray C, Gasser R, Magill J. and Miller R. Update on Rapid Diagnostic Testing for Malaria . Clinical Microbiology Reviews. Jan. 2008, p. 97–110. •Polley S, Mori Y, Watson J,Perkins M, Gonzalez I. Notomi T, Chiodini P, and Sutherland C. Mitochondrial DNA Targets Increase Sensitivity of Malaria Detection Using Loop-Mediated Isothermal Amplification. Journal of Clinical Microbiology. 2010.p. 2866–71•Tang T, Salas A, Tammam M, Martínez M, Lanza M, Arroyo E, Rubio J. First case of detection of Plasmodium knowlesi inSpain by Real Time PCR in a traveller from Southeast Asia. Malaria Journal 2010, 9:219.