adenovirus 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture...
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ADENOVIRUS1953 identificazione di un virus come causa del processo
degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane
1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio
1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato respiratorio.
Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili
più di 100 membri
ADENOVIRIDAE
Sottogruppi Tropismo cellulare Sierotipi A tratto GI 12, 18, 31 B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6 D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30,
32, 33, 36,39, 42,49, 51 E tratto respiratorio 4 F-G tratto GI 40, 41
Adenovirus umani
virus generalmente poco patogeni
infezioni lievi ed autolimitanti
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STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS
Capside (252 capsomeri)
proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il coreproteina VIII ancora gli esoni delle facce al core
proteina IIIA esoni che circondano i pentoniproteina IX esoni delle facce
Core : ds DNA - covalentemente legato alla proteina TP- complessato alla proteina VII
proteina X (proteasi)proteina V core
proteasi
70-100 nm
240 esoni : trimeri di proteina II
12 pentoni : Base (pentameri di proteina III) Fibra (trimeri di proteina IV)
70-90 nm
Il GENOMA degli ADENOVIRUS
sequenza di impacchettamento
(ds DNA: 30-36 Kb)
ITR ITR
regioni di controllo trascrizionalesiti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I
regione ORI (replicazione del genoma)
SEQUENZE ITR (100bp)
Penetrazione di Adenovirus
• entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente
• Perdita delle fibreLisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni
• A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale :
- perdita dei pentoni III e della proteina IIIa
- dissociazione della proteina VIII
- degradazione proteolitica della proteina VI da parte della proteasi presente nel virione (adenina)
- perdita della proteina IX
pH
PENETRAZIONEDEL GENOMA
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liberazione del DNA virale complessato alla proteina VII
ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS
E- geni precociL- geni tardivi
geni precocigeni tardivi 50 proteine
I GENI PRECOCI
ITR E1A/B E2A/B ITRE3 E4
GENE E1A
progressione del ciclo cellulare- legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein)
trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari
mRNA 13S proteina 289RmRNA 12S proteina 243R
induzione di apoptosi- stabilizzazione di p53
Ruolo di pRb nella regolazione della proliferazione cellulare
E1A
p14
E1A
E1A
GENE E1A
Alterano la progressione del ciclo cellulare:
trans-attivatori trascrizionali
Stimolano la replicazione del DNA virale
Bloccano la risposta ci difesa cellulare:- inibizione di STAT1- inibizione di IKK
mRNA 13S proteina 289RmRNA 12S proteina 243R
Proteine E1B
55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione di
p53
19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax
Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali.
Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.
CAR
E1A pRB
geni proliferativi
E1B55kd
p53geni pro-apoptotici
IB
NF-B
rispostainnata
E1A
E1B19kd
integrine
MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE
ESPRESSIONE GENICA
ITR E1A/B
L5
E2A/B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VA
E4
E2A - ssDBP)E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale
replicazione del DNAtrascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali
ESPRESSIONE GENICA
ITR E1A/B
L5
E2A/B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VA
E4
proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione
ESPRESSIONE GENICA
ITR E1A/B
L5
E2A/B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VA
E4
proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare
Virus-Associated (VA) RNA
VAI
1 o 2 trascritti lunghezza: 200 basicodificati dalla Polimerasi IIIdella cellula ospite VA
- mantenimento della sintesi proteica
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- inibizione delle difese anti-virali
inibizione della dimerizzazione di PKR
CICLO DI
REPLICAZIONE
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori
La sequenza Ori:sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali
(aumento dell’efficienza di replicazione)
proteina TP legata al terminale 5’ di ogni filamento
REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori
- la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP
il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso
reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core
- il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare
Replicazione del DNAReplicazione del DNA
From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press
l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats”
associazione Pol-pre-TP e ……
sintesi del filamento complementare
I geni intermedi o precoci-ritardati
gene IX = proteina IX stabilizzazione del capside virale
gene IVa2 = proteina IVa2 transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1Aincapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati
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esone
trimeri di pIX
ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI
ITR E1A/B
L5
E2A/B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VA
E4
promotore MLPL1 L2 L3 L4 L5
E1AMLTF
IVa52 kd
unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L
proteine strutturaliproteine scaffoldproteasi
E4orf6 (34KDa)
E1B
55KDa
accumulo citoplasmatico di mRNA virali
RNAbinding
NES
blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma
?
TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L
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trasporto facilitato
fattore cellulare
TRADUZIONE PREFERENZIALE
nelle fasi tardive dell’infezione blocco della sintesi proteica della cellula ospite
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eIF4F
m7G
Ad virus (shutoff proteins : L ed E proteins)
tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) che permette il ribosome shunting
L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIaL2 - polipeptide III (base dei pentoni)L3 - polipeptide II (esoni) e proteasiL4 - polipeptide 100 kDaL5- polipeptide IV (fibre)
TRADUZIONE PREFERENZIALE
Assemblaggio di adenovirus
proteine singole (no poliproteina)
ruolo critico della proteina L1(funzione scaffold ?)
citoplasma- formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4.
- formazione dei pentameri di proteina III (pentoni)- formazione dei trimeri diproteina IV (fibre)
formazione di capsidi vuoti
nucleo
disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)
E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)
RILASCIO DEL VIRUS
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Adenovirus terapeutici
TERAPIA GENICA
introduzione del gene esogeno nella cellula “malata”
- correzione del difetto genetico
- trasformazione di pro-drug
- blocco del processo tumorale
espressione della proteina
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Il DNA si degrada velocementeSistemi di veicolazione del DNA
Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione
Meccanismi non viraliliposomipolimeri cationicielettropazionemicro-iniezione
ottima protezione del DNAbuona efficienza e specificitàpossibile rischio di infezione reazioni immunitarie
buona protezione del DNAbassa efficienza, nessuna specificitàassenza di rischio e direazioni immunitarie
Meccanismi virali
infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione
ADENOVIRUS
VETTORI PER TERAPIA GENICA
1) sicurezza2) alta infettività e selettività 3) espressione sostenuta del gene terapeutico
VETTORI ADENOVIRALIinserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa
(quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb)
ITR E1A/BL5
E2B ITRE3L1 L2 L3 L4
VAE4
genoma virale
genoma virale
ITR E1A/B
transgene vettore navetta
ITRL5
E2B ITRE3L1 L2 L3 L4
VAE4
vettore adenovirale
transgene
ricombinazione
293 cell
La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule della linea cellulare HEK293)
E1A
E1BITR
L5
E2B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VA
E4transgene
nucleo
lisi
VETTORI ADENOVIRALITrials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF)
- bassa efficienza di transfezione (le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale)
-bassa efficienza di espressione genica
- potente risposta immunitaria
-un esito mortale
(danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale
somministrato)
Attualmente non sono utilizzati in trialsdi terapia genica nell’uomo
però………la sperimentazione continua
VETTORI ADENOVIRALI
VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’
genoma virale plasmidico
ITR
transgene vettore navetta
ITR E2A/B ITR
L1 L2 L3 L4
VAE4
transgene
E2A/B ITR
L1 L2 L3 L4
VA
E4
promoter
ricombinazione in cellule 293
promoter
ITR E2B ITRtransgenepromoter
taglio mediato da Cre
loxP
L5
L5
La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacitàavviene in presenza di un costrutto “helper”
ITR E2B ITR transgenepromoter
ITR E2A/B ITR
L1 L2 L3 L4
VA
E4
L5
lisi
cellulare
Vantaggi: infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione alta capacità (35 kbp)espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni)
VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’
Limitazioni:contaminazione da helper (in produzioni su larga scala)bassa resascarsa stabilità
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TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’
Distrofia muscolare (sindrome di Douchen)
Fibrosi cistica QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.
ADENOVIRUS ONCOLITICI
ADENOVIRUS Onyx - 015 (dl1520)
ITR E1A/B
L5
E2A/B ITRE3
L1 L2 L3 L4
VAE4
genoma Ad
** non esprime E1B 55K
– delezione di 827-bp nel gene E1B
e parte della regione E3 (gp19K)
ADENOVIRUS dl1520
replica solo in cellule difettive per p53p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani
e nel 70% dei tumori della testa e del collo
trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa
tumorale)