TEHNOLOGIA ADN-ULUI RECOMBINANT

1. Scurt istoric

Tehnologia a ADN-ului recombinant a fost inaugurata in anul 1973, cand a aparut si lucrarea “Constructia in vitro a plasmidelor bacteriene biologic functionale”, elaborata de catre S. Cohen, H. Boyer si altii. In aceasta lucrare este descris procedeul de legarea “in vitro” a unor fragmente de AND provenite de la doua plasmide diferite. Aceasta noua plasmida denumita “himera biologica” isi dovedeste functionalitatea dupa introducerea ei in bacteria E. coli. Progresele realizate in ingineria genetica au facut posibila dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant in directia realizarii unei compatibilitati intre specii diferite. Printre cele mai importante progrese realizate amintim:

Descoperirea , izolarea si purificarea enzimelor de restrictie, capabile sa taie molecula de AND la anumite situsuri.

Metode pentru determinarea secventei nucleotidelor in acizii nucleici si sintetizarea chimica a oligonucleotidelor.

Metode pentru izolarea unor gene si clonarea lor. Metode pentru includerea vectorilor in celula procariota si eucariota Metode de identificare rapida a celulelor transformate de catre moleculele de AND

create “in vitro”

2. Descrierea tehnologiei AND-ului recombinant

Tehnologia ADN-ului recombinat este cunoscută şi sub numele de clonarea genelor sau clonare moleculară. Ea consta in introducerea si functionarea unor gene numite pasageri (P) intr-o celula sau organism gazda numit receptor (R). Astfel, printr-o serie de proceduri experimentale este realizat transferul de informație genetică reprezentată de acidul dezoxiribonucleic – AND, de la un organism la altul.  Pentru ca gena pasager sa fie protejata de degradarea enzimatica a DN-azelor celulei receptoare, ea trebuie introdusa intr-un vehicul adecvat, numit vector (V). Tehnologia ADN-ului recombinant face posibila obtinerea unor forme de viata noi , prin introducerea unor secvente nucleotidice din ADN-ul unei rase sau specii in ADN-ul alteia. Acest procedeu nu ar putea fi realizat fara existenta enzimelor de restrictie, care taie secventele ADN in mod specific. Ele sant utilizate pentru a fragmenta ADN-ul pasagerului si pentru a taia ADN-ul circular al plasmidei (vectorul). Dupa ce ADN-ul strain (pasagerul) a fost recombinat cu ADN-ul plasmidei vectorul) , forma circulara a plasmidei poate fi refacuta cu ajutorul ADN ligazei, dupa care se poate trece la inserarea moleculei de ADN recombinat intr-o gazda adecvata (A. Griffiths si colab., 1993). Procedeul de recombinare al ADN-ului poate fi sintetizat in urmatoarele etape : (fig. 1)

Obtinerea pasagerului prin extractia ADN-ului de la un organism donator si scindarea lui cu ajutorul enzimelor de restrictie.

1

Pregatirea pasagerului si a vectorului : ADN-ul strain (P) este introdus in interiorul unei celule bacteriene gazda (V) pentru a evita degradarea lui in celula receptoare. Deschiderea vehicului in vederea inserarii pasagerului se face cu ajutorul enzimelor de restrictie, iar legarea pasagerului de ADN-ul circular al vectorului este realizata de ADN- ligaze.

Introducerea si exprimarea ADN-ului recombinant in celulele receptoare (ex. E. Coli).

Fig. 1

        

 

 

In tehnologia ADN-ului recombinant intervin mai multe elemente: vectorul , pasagerul, enzimele de restrictie, ligazele si receptorul. In continuare vom descrie succint fiecare dintre aceste elemente.

2.1. Vehicule (vectori)

Introducerea unei gene straine in (P) in genomul unei gazde poate fi facuta numai prin utilizarea unui vector (V), capabil de a transporta gena straina si de a o insera in ADN-ul celulei gazde, fara a fi degradata de enzimele de restrictie ale acesteia. Vectorii cei mai utilizati sant reprezentati de molecule mici de ADN, de forma circulara, care permit replicarea lor impreuna cu fragmentul de ADN inserat (pasagerul) intr-un numar mare de copii (aprox. 30-50 copii / celula). Ei sunt usor de recuperat din molecula hibrida.

2

Vectorii trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: Sa poata fi obtinuti in cantitati mari si sa poata fi purificati cu usurinta Sa contina markeri genetici pentru a putea face posibila izolarea celulelor transformate Sa posede un numar limitat de situsuri de restrictie astfel incat scindarea sa fie cat mai

specifica Sa contina elementele de reglaj ale unui operon procariot tipic: promotorul (P)

operatorul (O) si o parte a unei gene structurale din cadrul operonului respectiv (ex. gena reporter „lac Z”)

In practica tehnologiei ADN-ului recombinant, la procariote se utilizeaza ca vectori anumite plasmide si acizi nucleici virali cum sant plasmidele colicinogene (col. E1), colifagul lambda (λ) si virusul SV 40 .

2.1.1. Plasmidele

În calitate de vectori, plasmidele au căpătat o răspândire deosebită. Plasmidele reprezintă nişte molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom şi determină unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistenţa la antibiotice, agresivitatea. Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie să posede un număr restrâns de regiuni sensibile la acţiunea enzimelor de restricţie. În acest caz, se poate realiza ruperea şi apoi inserţia de ADN exogen în plasmid. Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S.Cohen (1973). Vectorii de clonare în celulele vegetale sunt derivaţi de la plasmide naturale (plasmidele Ti sau Ri de la Agrobacterium tumefaciens, respectiv A.rhizogenes) sau de la virusuri specifice celulelor vegetale, ce asigură funcţionarea unor anumite secvenţe de ADN după integrarea lor în genomul celulelor vegetale. Ca şi în cazul vectorilor pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt, de obicei, vectori de tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona în două gazde diferite: E.coli şi Agrobacterium sp., iar anumite porţiuni ale lor se exprimă în celulele eucariote.

Un exemplu de asemenea vector, mult utilizat în experimentele de transfer de gene în celulele vegetale, este pBI121 (fig.2)

3

Fig.2. Harta genetică a plasmidei pBI121.

Plasmida pBI121 este un derivat al plasmidei pBin19 construită de Bevan în 1984. Ea are 13 kb şi conţine o serie de elemente genetice ce îi permit menţinerea în E.coli şi în diferite tulpini de Agrobacterium (ori, gena de rezistenţă la kanamicină). De asemenea, vectorul pBI121 conţine şi secvenţe ce sunt transferate în genomul celulelor vegetale. Acestea sunt: secvenţele marginale de 25pb (derivate de la ADN-T din plasmida Ti de la A.tumefaciens) esenţiale pentru transfer, între care au fost clonate două gene marker: gena de rezistenţă la kanamicină (nptII) şi gena ce codifică sinteza β-glucuronidazei (gus). Cele două gene marker au fost clonate sub controlul unor regiuni promotor sau terminator specifice: gena nptII este controlată de promotorul NOS (de la gena pentru nopalin-sintetază)(P1) şi de terminatorul NOS, iar gena gus se află sub controlul promotorului 35S de la virusul CaMV (virusul mozaicului conopidei)(P2) şi a secvenţei terminatoare NOS. Acest tip de vector permite sinteza de proteine de fuziune prin clonarea genei de interes la nivelul MCS localizat după promotorul 35S. Interesul deosebit al cercetătorilor pentru introducerea de gene heteroloage în celulele vegetale şi pentru studiul funcţionării lor, a condus la construirea unor vectori din ce în ce mai perfecţionaţi. Unii dintre asemenea vectori permit exprimarea diferenţiată a unor gene clonate: la nivelul unor organe specifice ale plantei sau în diferite momente ale dezvoltării acesteia.

Bacteriile Agrobacterium tumerfaciens descoperite în 1907 de E.Smith şi C.Townsend, provoacă formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate). Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzează tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid în celulele vegetale. În principiu, plasmidele Ti conţin mai multe regiuni, cu funcţii distincte: regiunea ADN-T (conţinând genele de tumorigeneză), regiunea de virulenţă (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controlează transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc, primele două fiind însă cele mai importante pentru procesul de transformare a celulelor vegetale. Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală include:

introducerea segmentului de ADN-T într-un plasmid de E. coli; introducerea în plasmidul format a genei necesare şi a genei marker (gena pentru

rezistenţă la Kanamicină); introducerea plasmidului recombinat în Agrobacterium tumerfaciens; infecţia cu A.tumerfaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.3).

Pentru realizarea transferului de gene în celula vegetală este utilizată metoda culturilor de celule şi ţesuturi în vitro. Firma americană “Monsanto” comercializează deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gândacul de Colorado.

4

Fig.3. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală.

2.2. Pasageri (gene)

In tehnologia ADN-ului recombinant pasagerul reprezinta fragmentul de ADN strain care contine gena de interes.Pasagerul poate fi izolat din celule cu ajutorul enzimelor specifice sau poate fi sintetizat artificial prin metode chimice.

Oricare ar fi metoda de transfer, rata reusitei este intotdeauna foarte mica, de aceea este necesara asocierea la gena de interes si a unei gene marker (care codifica rezistenta la un antibiotic sau ierbicid), care favorizeaza selectarea celulelor in care s-a integrat transgena.

Principalele gene marker, de selectie, folosite in transformarea plantelor (dupa Schrott, 1995) :

kanamicina, neomicina geneticina (GA18) nptII (APH3´II) neomicinfosfotransferaza IIgentamicina aacC3, aacC4 gentamicin-3-N-acetiltransferazahigromicina hph, hpt (APH4) higromicin-fosfotransferazametotrexat dhfr dihidrofolatreductazaspectinomicina ADNr16S

5

aadA ARNr 16Saminoglicozida-3’-adeniltransferazastreptomicina SPT

ADNr 16SaadA streptomicinfosfotransferazaARNr 16Saminoglicozida-3’-adeniltransferazableomicina, fleomicina ble -blasticidina bsr blasticidin S deaminazasulfonamida sul dihidropteratsintazafosfinotricina bar fosfinotricinacetiltransferazaclorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetazabromoxinil bxn bromoxinilnitrilazaglifozat EPSPS 5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenazaatrazina psbA proteina QB2,2-DCPA dehalogenaza4-metil-triptofan tdc triptofandecarboxilazanitrat NR nitratreductazaS-amonoetil-L-cisteina DHPS dihidropicolinatsintetazalizina/treonina AK aspartatchinazaaminoetil-cisteina ocs octopinsintetaza

O alta gena marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductaza (DHFR), izolata tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR confera rezistenta la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la concentratii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferata la specii cum ar fi: tutunul, petunia si graul.

Genele raportoare, spre deosebire de markerii de slectie nu confera celulelor rezistenta fata de un anumit compus. Ele codifica proteine care pot fi detectate direct sau catalizeaza reactii specifice ai caror produsi pot fi detectati prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de transcriptie cis sau trans, in conditiile transformarii tranziente sau permanente, precum si monitorizarea si optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt:

• gena gus (uidA) – codifica β-glucuronidaza (GUS) si a fost izolata de la E. coli K12 (Jefferson si colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizata la plante. Exista pentru aceasta hidrolaza compusi substat pentru evidentierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice – la nivelul tesuturilor rezultand un compus de culoare albastra usor de evidentiat. La pH-ul utilizat pentru determinarea GUS nu exista activitate β-glucuronidazica detectabila in nici un tesut vegetal. Toate metodele de determinare se aplica insa, numai celulelor fixate, nonviabile.

* gena raportoare luc pentru enzima luciferaza foloseste un sistem substrat-enzima care produce bioluminescenta. Gena luc a fost izolata de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimata in plante (Ow si colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasa din tesuturi iar activitatea ei poate fi determinata in prezenta

6

luciferinei. Dar, exista si o metoda de determinare non-letala si neinvaziva direct in tesuturile si organele plantelor transformate, pentru masurarea bioluminescentei fiind necesar un luminometru.

• gena gfp pentru proteina cu fluorescenta verde (GFP) – reprezinta cea mei noua gena raportoare si totodata cea mai spectaculoasa si avantajoasa. Gena a fost izolata de la o meduza, Aequarea victoria, fiind transferata la cateva specii de plante (Chalfie si colab., 1994). GFP prezinta o serie de avantaje si anume: nu necesita un substrat, proteina se evidentiaza in tesuturi intacte in vitro si in vivo, prin excitarea in UV, proteina poate fi fuzionata

cu alte proteine permitand monitorizarea traficului proteic si a metabolismului (vezi Rakosy-Tican si

colab., 1999; 2000).

• gena cat izolata de la E. coli, codifica enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de

asemenea, mult utilizata ca gena raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretentioasa bazandu-

se pe monitorizarea acetilarii cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a

cloramfenicolului, produsii fiind separati prin cromatografie in strat subtire (TLC) si masurati prin

densitometrie sau prin scintilatie. Uneori poate exista activitate CAT si in unele tesuturi vegetale, mai

ales la Brassicaceae, ceea ce afecteaza eficienta acestui sistem.

• antocianii sunt pigmenti rosii sau purpurii care se acumuleaza in vacuole in unele tesuturi ale

plantelor. Sinteza de antociani este controlata de gene structurale si reglatoare, unele dintre ultimele

gene fiind izolate si clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare in tesuturile si organele

unor genotipuri care contin gene structurale dar nu sintetizeaza antociani. Utilizarea antocianilor ca

markeri prezinta o serie de avantaje: nu necesita un substrat, se exprima doar in celulele viabile si

metabolic active, sunt usor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de

transcriptie R si C1 de la porumb (Schrott, 1995).

• genele care confera rezistenta la streptomicina si/sau spectinomicina – au fost, de asemenea, utilizate

ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care il au, prin inactivarea cloroplastelor.

Pasagerul (gena de interes) poate fi obtinuta printr mai multe etape:

Izolarea ADN-ului genomal

Digestia ADN-ului genomal cu o enzima de restrictie

Separarea fragmentelor de restrictie prin electroforeza

2.3. Enzimele de restrictie (endonucleazele de restrictie

Enzimele de restrictie sant produse de catre plasmidele bacteriene si au capacitatea de a taia molecula de ADN la nivelul situsurilor pe care le recunoaste (situsuri de restrictie). In urma taierii rezulta fragmente cu capete monocatenare adezive 3’ sau 5’, sau capete bonte. Unele enzime de restrictie (ex.Hind II) taie simultan ambele catene ale ADN-ului in acelasi punct, rezultand fragmente cu capete „boante” (blunt ends), in timp ce altele (ex. Eco RI) taie defazat rezultand capete adezive sau cozive 3’ sau 5’ (stiky or cohesive ends). Fig.4

capete coezive capete bonte

7

Fragmentele de ADN obtinute in urma digestiei cu enzime de restrictie pot fi incluse in molecule

vectoare mici, autoreplicabile, care vor fi introduse in gazde diferite.

Clasificare Sistemele enzimatice de restricţie/modificare (sau restricţie/metilare) au fost împarţite în 3 categorii: Tipul I, Tipul II şi Tipul III. Tipurile I şi III constau în enzime care au atât funcţii de restricţie cât şi funcţii de modificare; ambele tipuri recunosc secvenţe specifice, nemetilate, de ADN dc; enzimele de tip I clivează ADN-ul într-o manieră randomizată (situs-nespecific), pe când cele de tip III taie la situsuri specifice, dar nu în cadrul secvenţei de recunoaştere, ci la o distanţa de 25-27 nucleotide de acesta (ex: EcoP1 – codificată de fagul P1). Sistemele de tip II constau în enzime separate care îndeplinesc funcţiile de metilare, respectiv, restricţie.

Denumirea enzimelor de restrictie se face cu simboluri ce marcheaza prima litera a genului, urmata

de doua litere reprezentand specia si alte simboluri.

Fig.4 Enzimele de restrictie si situsurile lor de clivaj

8

Hartile de restrictie Locurile tinta ale enzimelor de restrictie pot fi utilizate ca markeri pentru ADN. ADN-ul dintr-o sursa specifica este supus unei digestii succesive realizata de diferite enzime de restrictie. Dupa ce fragmentele au fost separate electroforetic pe gel de poliacrilamida, se poate determina „harta” situsurilor de restrictie (A. Griffiths si colab. 1993).

2.4 Alte enzime

ADN ligazele au fost descoperite in anul 1967 in celulele de E.coli neinfectate sau infectate cu bacteriofagul T4. Aceste enzime sant implicate in sinteza ADN-ului si au rolul in legarea fragmentelor de restrictie. Ele catalizeaza formarea unor legaturi fosfodiesterice intre capetele 3’-hidroxil si 5’ fosfat ale unor nucleotide adiacente din fragmentul de ADN. Prin aceasta reactie ligaza repara sparturile (nicks) dintr-o catena de ADN. ADN polimerazele au fost identificate si purificate in anul 1950 de catre A. Kornberg. Aceste enzime catalizeaza reactia de replicare a ADN-ului, reactie care are loc numai in prezenta formelor trifosfat ale nucleotidelor (deoxiadenozintrifosfatul- dATP, sau dGTP, dCTP, dTTP). Fig. 5 dATP + ADN polimeraza ADN parental + dGTP >>>>>>>>>>>>>>>> Molecule de ADN fiice (Primer) + dCTP + dTTP

Revers-transcriptazele au fost descoperite in anul 1970 de H. Temin si S. Mizutani si sant enzime care determina transcriptia inversa a informatiei genetice de la ARN la ADN. Catena de ADN sintetizata pe marita ARN-ului are la inceput o bucla care constituie un „primer” pentru sinteza celei de a doua catene de ADN. Acest tip de ADN a fost numit ADN complementar.

Terminal transferazele sant reprezentate de un grup de enzime care adauga nucleotide identice la capetele 3’ ale catenelor de ADN. Unele adauga adenina formand o coada monocatenara (AAAA) la extremitatea 3’ a moleculei de ADN, iar altele timina (TTTT) in acelasi mod. Intre aceste cozi monocatenare ale unor molecule de ADN de origini diferite se pot realiza legaturi complementare (A-T) cu ajutorul ADN-ligazelor, rezultand astfel molecule hibride de ADN.

2.5. Receptorul Receptorul are rolul de a accepta, multiplica si exprima moleculele de ADN recombinant ce contin pasagerul cu informatia dorita. Receptorul se alege in functie de tipul de vector utilizat si poate fi reprezentat de culturi bacteriene cum ar fi E.coli sau Bacillus subtilis.

9

3. Aplicaţii ale transgenezei la plante Speciile vegetale prezintă o mare diversitate genetică, iar cele sălbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obţine gene importante din punct de vedere practic. Cercetările de inginerie genetică la plante prezintă o semnificaţie teoretică deosebită, facilitând cunoaşterea modului de acţiune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltării plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Meyer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie moleculară se pot obţine informaţii utile asupra particularităţilor genomului plantelor folosite în ameliorare, a localizării unor gene de interes, a gradului de înrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff, 1994; Edwards şi Karp, 1997). În ceea ce priveşte aplicaţiile practice, până în prezent au fost obţinute o serie de rezultate semnificative, unele aplicate deja în practică aşa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze; plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători, plante transgenice rezistente la erbicide (fig. 3); plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi, plante care produc fructe rezistente la înmuiere); plante transgenice capabile să sintetizeze metaboliţi secundari în cantităţi crescute; plante transgenice producătoare de anticorpi „comestibili” etc.

Fig. 3. Comparaţie între aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la acţiunea erbicidelor şi cel al unor plante

Pe lângă aceste reuşite, cercetările efectuate în prezent vizează, pe de o parte extinderea numărului de specii de plante la care transferul de gene utile să fie eficient şi, pe de altă parte, studii asupra controlului dezvoltării plantelor şi a exprimării genelor (activarea şi silenţierea genelor) (Chua şi Sundaresan, 2000).

Aşa cum se poate vedea din cele spuse mai sus, aplicaţiile plantelor transgenice sunt extrem de diverse astfel că abordarea tuturor direcţiilor într-o singură lucrare nu este posibilă. Câteva dintre aceste aplicaţii, care fie au potenţial aplicativ spectaculos, fie nu au fost pe deplin rezolvate, fie pot aduce noutăţi în plan fundamental şi practic:

10

protecţia plantelor faţă de atacul insectelor, fitopatogenilor microbieni, virali şi a nematodelor

obtinerea de plante transgenice producătoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi obtinerea de plante transgenice folosite pentru cercetări asupra unor procese

fiziologice fundamentale (biosinteza unor hormoni, proteine, enzime etc.)

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bibliografie selectivă

1. Altman, A., 1999, Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead, EJB, 2, 2. 2. Augustin Vlaic,1997, Inginerie Genetica, Ed. Promedia Plus, p. 53-1043.Carozzi,N., WarrenW., Rice,D.A., Evola,S., Koziel,M.G., 1992, Expression of chimeric

CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco, Plant Molec.Biol., 20, p.539-548.

4. Cucu, N., Stefan, M., Mitru, M, Gavrilă, L., 1998, Modification of plant genome by genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome, în Implicaţii ştiinţifice şi bioetice în analiza şi manipularea genomului, Edit.Ars Docendi, p.161-169

5. Gatz,C., 1997, Chemical control of gene expression, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 48, p.89-108.

6. Gold, J., Harder, D., Smith, F., Aung, T, Procunier, J., 1999, Development of a molecular marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines, EJB., 2, nr.1.

7. Hedden, P., Phillips, A. L., 2000, Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.130-137.

8. Hileman, B., 2002, What’s hiding in transgenic foods? Chemical Eng. news, ian. 2002, p. 20-2

9. Ho, M. W., 2001, Horizontal gene transfer – the hidden hazards of genetic engineering, Institute of Science in Society.

10. Martinelli, L., Mandolino, G., 1994, Genetic transformation and regeneration of transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris), Theor. Appl. Geneti., 88, p.621-628

11. Riva, G. A., Cabrera, J. G., Padron, C. A., 1998, Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation, EJB, 1, nr.2.

12. Roberts RJ; Murray, Kenneth (November 1976). "Restriction endonucleases". CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (2): 123–64

13. Robinson,J., 1999, Ethics and transgenic crops, Electronic Journal of Biotechnology, 2, nr.2.

14. Sharma, H. C., Sharma, K. K., Seetharama, N., Ortiz, R., 2000, Prospects for usig transgenic resistance to insects in crop improvement, EJB, 3, nr.2.

15. Tinland, B., 1996, The integration of T-DNA into plant genomes, Trends in Plant Science, 1., nr.6.p.178-183.

16. Tourte, Y., 1998, Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes, Edit.Dunod 17. Walmsley, A. M., Arntzen, C. J., 2000, Plants for delivery of edible vaccines, Current

Opinion in Biotechnology, 11, p.121-129. 18. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific

Academic Books. 19. Weising, K., Kahl., G., 1996, Natural genetic engineering of plant cells: the molecular

biology of crown gall and hairy root disease, World J. Microbiol.Biotechnol., 12, p.327-351.

11

20. Whitelam, G. C., Cockburn,W., Owen, M. R. L., 1994, Antibody production in transgenic plants, Biochem. Society Transact., 22., p.940-943.

21. Zuo, J., Chua, N. H., 2000, Chemical inducible systems for regulated expression of plant genes, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.146-151

 

12