43

Pelacakan Gen Aerolysin dari Aeromonas hydrophilapada Ikan Mas yang Diberi Pakan Ekstrak Bawang Putih

DETECTION OF AEROLYSIN GEN FROM AEROMONAS HYDROPHILAIN COMMON CARP FED WITH GARLIC EXTRACT

Iesje Lukistyowati 1), Kurniasih2)

1) Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Riau,Kampus Bina Widya, km 12,5, Simpang Baru, Pekanbaru 28239, Telepon. 0761 - 63275

2) Bagian Patologi/Sains Veteriner Fakultas Kedokteran HewanUniversitas Gajah Mada Yogyakarta

ABSTRAK

Aeromonas hydrophila adalah bakteri oportunistik, Gram negatif, dapat menyebabkan kematianikan dalam waktu yang sangat singkat hingga mencapai 80-100 %. Salah satu faktor virulensi dari A.hydrophila yang dapat menyebabkan kematian ikan mas (Cyprinus carpio L ) adalah aerolysin. Penelitianini menggunakan primer olygonukleotida sintetis bertujuan untuk melacak gen aerolysin dari A. hydrophilapada ikan mas yang diberi pakan mengandung ekstrak bawang putih selama 30 hari kemudian diinfeksidengan A. hydrophila. Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat mendeteksi gen aerolysin dari A. hydrophila.Hasil elektrophoresis menunjukkan gen aerolysin dari A. hydrophila isolat Fakultas Kedokteran HewanUniversitas Gadjah Mada (FKH-UGM) berasal dari biakan murni yang digunakan untuk menginfeksiikan perlakuan teramplifikasi dengan bobot molekul 462 bp, sedang gen aerolysin yang terdapat padaginjal ikan perlakuan teramplifikasi dengan bobot molekul 900 bp. Hasil DNA sequencing A. hydrophilaisolat FKH UGM yang digunakan homolog dengan isolat A. hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966,complete genome dengan score 55.4 ( 71% )

Kata kunci : Aeromonas hydrophila, Cyprinus carpio L, Ekstrak bawang putih, PCR, DNA Sequencing

ABSTRACT

Aeromonas hydrophila is a gram negative and opportunistic bacteria, which could cause fish mortalityin a short time from 80%-100%. One virulent factor of A. hydrophila on common carp (Cyprinus carpio L)that could cause fish mortality is aerolysin. This research used a synthetic primers of oligonukleotide todetect aerolysin, a specific genomes of A. hydrophila on common carp (Cyprinus carpio L). The commoncarps have been feed a woof that contain garlic extract during 30 days before they challenged with A.hydrophila. Polymerase Chain Reaction (PCR) was used to detect an aerolysin gen from A. hydrophila. Theelectrophoresis result showed aerolysin gene of Aeromonas hydrophila from Veterinary Faculty of GadjahMada University (FKH-UGM) isolate was amplified with 462 bp of molecule weight. While the aerolysingen was detected in the fish kidney with 900 bp of molecule weight. Further, DNA sequence analysis of thePCR product of A. hydrophila from FKH UGM isolate showed homolog with isolate A. hydrophila subsphydrophila ATCC 7966 complete genome with score 55.4 (71%).

Keywords : Aeromonas hydrophila, Cyprinus carpio L, Garlic extract, PCR, DNA Sequencing

PENDAHULUAN

Aeromonas hydrophila termasuk Gram-negatip, berbentuk batang pendek, bersifat aerobdan fakultatif anaerob, tidak berspora, motilmempunyai satu flagel, hidup pada kisaran suhu25-300 C (Post, 1983). Serangan bakteri ini dapatmengakibatkan gejala penyakit hemorhagi

septicaemia yang mempunyai ciri lukadipermukaan tubuh, insang, ulser, abses,eksopthalmiadan perut gembung (Austin danAustin, 1993), serta gastroenteristis, diare danextra intestinal pada manusia (Porteen et al.,2007).

Bakteri ini sangat berpengaruh dalambudidaya ikan air tawar dan sering menim-

Jurnal Veteriner Maret 2012 Vol. 13 No. 1: 43-50ISSN : 1411 - 8327

44

bulkan wabah penyakit dengan tingkatkematian yang tinggi (80 100 %) dalam waktuyang singkat (1 2 minggu). Tingkat virulensidari A. hydrophila yang dapat menyebabkankematian ikan tergantung dari racun yangdihasilkan. Gen Aero dan hlyA yang bertang-gung jawab memproduksi racun aerolysin danhemolysin pada genus Aeromonas (Yousr et al.,2007). Aerolisin merupakan protein extraseluleryang diproduksi oleh beberapa strain A.hydrophila yang bisa larut, merupakan proteinhydrofilik mempunyai sifat hemolitik dansitolitik. Aerolysin mengikat reseptorglikoprotein spesifik pada permukaan seleukariot sebelum masuk ke dalam lapisan lemakdan membentuk lubang. Racun aerolysin yangmembentuk lubang melintas masuk ke dalammembran bakteri sebagai suatu preprotoksinyang mengandung peptida. Racun tersebut dapatmenyerang sel-sel epithelia dan menyebabkangastroenteristis (Yousr et al., 2007).

Primer oligonukleotida sintetik yangdigunakan dalam PCR dapat menditeksi genaerolisin pada strain A. hydrophyla dan untukmemeriksa gen-gen yang identik pada A. caviae,A. sorbia dan A. veronii. Primer-primeroligonukleotida sintetik yang digunakan dalamreaksi rantai polimerase (PCR) memiliki target209 bp dari kerangka pembacaan terbukaterbesar dari urutan gen aer (Polallard et al.,1990). Penelitian ini bertujuan untukmendeteksi keberadaan gen aerolysin dari A.hydrophila yang diinfeksikan pada ikan yangtelah diberi ekstrak bawang putih selama 30hari, kemudian setelah 14 hari pascainfeksidilakukan pengamatan, dikarenakan ikan yangdiberi perlakuan ekstrak bawang putih jumlahkoloni bakteri berkurang (Salaby et al., 2006;Lukistyowati dan Saberina, 2004).

METODE PENELITIAN

Ikan percobaan diberi pakan jenis 781-2(Central Pangan Pertiwi) jenis 781-2 dicampurdengan ekstrak etanol bawang putih.Pembuatan ekstrak etanol bawang putihdilakukan dengan cara bawang putih dikupas,dicuci bersih dan dikering anginkan. Bawangputih diblender dengan ethanol 70 % denganperbandingan 1 : 5 bahan pelarut ( 1kg bawangputih ditambah 5 liter ethanol 70 %), disaringdengan kertas saring. Filtrat hasil penyaringandicampur pada pakan pelet sesuai dengan dosisperlakuan hingga rata. Setelah filtrat terserap

oleh pelet diangin-anginkan, kemudian dioven600C selama 24 jam.

Ikan ukuran 10-15 cm dari sentrapembenihan Cangkringan Jogjakarta ditempat-kan pada aquarium 30 x 15 x 26 cm, 1 ekor/aquarium, diadaptasi diberi pakan standarsecara ad libitum selama tujuh hari. Setelahadaptasi, ikan diberi pakan mengandungberbagai konsentrasi ekstrak etanol bawangputih sesuai dengan bobot badannya sebanyak3 %. Bakteri yang dipakai menginfeksi ikanadalah SA2. A. hydrophila isolat FKH-UGM.Perlakuan yang diberikan kepada ikan-ikanpercobaan adalah :(1) Ikan kontrol positip / ikan diberi pakan

standart kemudian diinfeksi denganA.hydrophila

(2) Ikan kontrol negatip / ikan diberi pakanstandart tidak diinfeksi

(3) Ikan yang diberi pakan mengandungekstrak bawang putih 2,5 % /kg

(4) Ikan yang diberi pakan mengandungekstrak bawang putih 5 %/kg

(5) Ikan yang diberi pakan mengandungekstrak ekstrak bawang putih 10 %/kgMasing-masing perlakuan ulangannya 10

ekor. Pemberian pakan dilakukan pada pagi haridan sore hari selama 30 hari. Dilakukanpenyifonan setiap hari pada siang hari. Setelahhari ke 30 ikan diinfeksi dengan A. hydrophilasecara intramuskuler dengan bakteri 106 sel/ml,dosis 0,1 ml/ekor. Pada hari ke-14 pascainfeksiginjal ikan bagian anterior semua perlakuandiambil sebesar 25 mg guna diekstraksiDNAnya.

Ekstraksi DNA A. hydrophila isolat FKH-UGM (Ekstraksi dengan kit Qiagen-Germany) .

Isolat A. hydrophila ditumbuhkan padamedia Triptic Soya Broth (TSB) setelah umurbiakan 24 jam diambil sebanyak 10 ml dengankepadatan 108 sel/ml. Biakan tersebutdituangkan ke mikro tube sampai habis dandisentrifuse 3000 rpm selama tiga menit.Supernatannya dibuang hingga tersisa peletnya,kemudian ditambah dengan buffer ATLsebanyak 180 l, 20 l proteinase K, dandiinkubasi pada suhu 560C di water bath selama10 menit. Larutan divortex 15 detik danditambah buffer Al sebanyak 200 l, divortexkembali, ditambah 200 l etanol absolut dandivortex. Larutan tersebut kemudiandimasukkan ke spin column dan disentrifuse8000 rpm selama 1 menit. Filter dipindahkan

Lukistyowati & Kurniasih Jurnal Veteriner

45

ke spin column yang baru dan ditambah 500 lbuffer AW1 kemudian disentrifuse 8000 rpmselama 1 menit. Filter dipindahkan ke spincolumn baru ditambah 500 l buffer AW2 ,disentrifuse 14.000 rpm selama 3 menit,dipindahkan ke mikro tube baru kemudianditambah 200 l buffer AE, diinkubasi selama1 menit disuhu ruangan, disentrifuse 8000 rpmselama 1 menit. Hasil saringan disimpan padasuhu - 70 0C dan setiap waktu dapat digunakan.

Ginjal ikan perlakuan yang telah diinfeksiA. hydrophila yang diawetkan dalam etanolabsolut ditimbang sebanyak 25 mg kemudiandipotong-potong halus dan digerus dengan mortirsteril hingga lumat dalam mikrotube,ditambahkan 180 l buffer Al, ditambah 20 lproteinase K, divortex dan diinkubasi pada 56 0C di water bath selama 2 jam, selama diinkubasidilakukan vortex. Langkah selanjutnya samadengan ekstraksi bakteri A. Ahydrophila.

Amplifikasi Gen Aer (menggunakanMaster Mix Promega)

Larutan 6,5 l dH2O dan 12,5 l Green mixdalam mikrotube, kemudian campur hinggahomogen. Primer yang digunakan adalaholigonukleotida masing-masing 2 l forwardprimer ( 5-CCAAGGGGTCTGTGG-CGACA-3)dan reverse primer (5-TTTCACCGGTA-ACAGGATTG-3) dengan konsentrasi akhir 0,1M (Pollard et al., 1990) serta 2 l template DNA.Program PCR untuk amplifikasi DNA sebagaiberikut : denaturasi awal suhu 94 0C selama 2menit, kemudian dilakukan denaturasi 940Cselama 1 menit, annealing pada suhu 550Cselama 90 detik dan ekstensi pada suhu 720Cselama 2 menit, selama 30 siklus, ektensi akhir72 0 C selama 5 menit suhu akhir 40 C(Gustafson et al.,1992).

Hasil PCR dari berbagai perlakuandielektroforesis pada gel agarose 1,5 % agarose(0,75 g dilarutkan ke dalam TAE buffer 50 ml)dididihkan di microwave, setelah hangat agaroseditambah larutan EtBr sebanyak 2 l dengankonsentrasi 10 mg/ml. Agarose kemudiandituangkan ke dalam cetakan elektroforesisyang telah dipasang comb. Setelah agarosemengeras 0.8 l produk PCR dicampur dengan0,2 l loading dye dimasukkan ke sumur 2, 3, 4dan seterusnya. Sumur pertama diisi dengan0,5 l penanda molekuler (marker). Elektrofo-resis dijalankan dengan voltase 100 volt selama30 menit. Setelah itu gel diangkat diamati diatas uv transilluminator, kemudian didokumen-tasikan.

PurifikasiPurifikasi produk PCR sampel dilakukan

dengan microclean. Produk PCR sebanyak 100l ditambah microclean 100 l ( 1 : 1) kemudiandicampur hingga homogen dengan menggu-nakan pipet. Inkubasi selama 5 menit dilakukanpada suhu kamar, dan disentrifugasi dengankecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Larutansupernatan dibuang, divortek, buang superna-tannya yang tersisa hingga benar benar bersih,kemudian pellet diresuspensi dengan TEsebanyak 30 l, disimpan pada 20 0C. Purifikasidan sekuensing DNA A. hydrophila dilakukandengan automatic sequencer (Applied BiosystemsInst Model 310) di Universitas Islam NegeriYogyakarta. Kemudian dilakukan pendekatandengan program BLAST (NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Analisiskemiripan dilakukan dengan program versiMEGA 4 (1993 2008).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ikan perlakuan yang beri pakan ekstrakbawang putih selama 30 hari kemudiandiinfeksi denga A. hydrophila menunjukkangejala penyakit MAS. Gejala klinis ikanperlakuan yang terlihat antara lain luka borokyang melebar di bekas suntikan. Setelahdilakukan isolasi kembali ke media agar selektif(GSP),menunjukkan bakteri tersebut positip A.hydrophila dengan hasil uji biokimiamenunjukkan karakteristik adanya kesamaanreaksi. Tes biokimia tersebut menunjukkan ujigram (-); uji oksidase (+) ; uji katalase (+); ujimotilitas (+); uji indol (+) ; uji H2S pada mediaTSIA (+); uji Voges-proskaver (+); uji gas dariglukosa (+) dan uji Ornithin dekarbosilase (-).

A. hydrophila merupakan bakteri patogenoportunistik yang dapat menyebabkan kematiantinggi pada ikan-ikan budidaya, hal inidimungkinkan oleh sifat virulen yangdiakibatkan oleh produk ekstraseluler sepertiendotoksin, sitotoksin, hemolisin, dan protease(Yusoff dan Subangsihe, 1995). Kematian ikanuji membuktikan bahwa ikan tersebut tidakterjadi stimulasi imunologik untuk meresponmasuknya patogen

Ikan yang diberi perlakuan maupunsebagian ikan kontrol yang mempunyai sistemkekebalan yang tinggi bertahan hidup, ulserberangsur-angsur mulai membaik, dan lukabekas suntikan terlihat mengecil. Hal ini sesuai

Jurnal Veteriner Maret 2012 Vol. 13 No. 1: 43-50

46

dengan pendapat Frandson (1992) yangmenyatakan bahwa fibrinogen keluar daripembuluh dan menyebabkan timbulnyakoagulasi pada jaringan yang membantu dalammembuat barier terhadap menyebarnya unsur-unsur infeksi sehingga membangun dindinguntuk wilayah yang sedang mengalamikerusakan. Luka bekas penyuntikan mulaiterlihat menutup dan sembuh setelah 14 haripasca penyuntikan (Gambar 1 B).

Hasil PCR DNA dari isolat A. hydrophilabiakan murni dan ginjal ikan perlakuan yangdiinfeksi A. hydrophila dengan menggunakanprimer olygonukleotida menunjukkan positifterdeteksi memiliki gen aerolysin. Gen aerolysinyang terdeteksi pada biakan murni A. hydropilapita yang terbentuk menunjukkan bobotmolekul 462 bp sedangkan pada ikan yangdiberi perlakuan pakan yang mengandungekstrak bawang putih 2,5 % , 5 %, dan 10 %menunjukkan hasil positip teramplifikasi(ditandai dengan munculnya pita/band), yangmengindikasikan bahwa ginjal ikan tersebutmasih memiliki gen aerolysin ditandai denganpita tebal mengarah ke tipis menunjukkan bobotmolekul sekitar 900 bp (Gambar 2 ).

Gen aerolysin dari A. hydrophila yangberasal dari ginjal ikan yang diberi perlakuan

bawang putih dengan konsentrasi 10 % kadarracunnya berkurang diduga akibat pemberianekstrak bawang putih sehingga pada saatdilakukan deteksi dengan menggunakan PCRhasilnya sangat tipis.

Faktor yang berbahaya pada A. hydrophilaadalah racun-racun yang dihasilkan. Haltersebut telah dibuktikan oleh peneliti terdahuluyang melaporkan bahwa patogenenisitas A.hydrophila tergantung dari racun yangdihasilkan oleh bakteri tersebut, dua racunhaemolitik tersebut adalah haemolysin danaerolysin (Yousr et al., 2007 ; Yogananth dkk.,2009 ; Pollard et al., 1990). Polymerase ChainReaction (PCR) dengan menggunakan primerolyigonukleotida dapat mengidentifikasiuntaian-untaian yang memproduksi aerolysindari A. hydrophila dan mungkin memilikiaplikasi sebagai tes khusus untuk spesies karenaspesies Aeromonas hemolitik lainnya yang diteshasilnya menunjukkan negatif (Pollard et al.,1990).

Hasil PCR ginjal ikan perlakuan 1; 3; 4 dan5 terdeteksi positip terdapat adanya genaerolysin menunjukkan bobot molekul sebesar900 bp. Yousr et al., (2007) juga mendeteksi genaerolysin yang berbahaya dengan metode PCRberasal dari air tawar dan kerang di Malaysia,

Gambar 1 : Gejala klinis ikan yang diinfeksi secaraintramusculer dengan A.hydrophila A) luka bekassuntikan yang melebar akibat A.hydrophila hinggatulang vertebranya terlihat dengan jelas, B) lukabekas suntikan menutup setelah pascapenyuntikan14 hari.

Gambar 2 : Hasil uji PCR sampel DNA A..hydrophila M).DNA lader (1000 bp); SA2). DNA dariA. hydrophila murni isolat FKH-UGM); (1). DNAginjal ikan perlakuan kontrol positip ; (2). DNAginjal ikan perlakuan kontrol negatif ; (3). DNAginjal ikan perlakuan yang diberi pakan ekstrakbawang putih 2,5 % ; (4). DNA ginjal ikan perlakuanyang diberi pakan ekstrak bawang putih 5 % ; (5).DNA ikan perlakuan yang diberi pakan ekstrakbawang putih 10 %

Lukistyowati & Kurniasih Jurnal Veteriner

M SA2 1 2 3 4 5

47

Keterangan :SA2 DNA Aeromonas hydrophila isolat FKH1 DNA ikan kontrol positip (Ikan yang diberi pakan standart dan diinfeksi A.hydrophila5 DNA ikan perlakuan P3 (Ikan yang diberi pakan yang mengandung ekstrak bawang putih 10 %

kemudian diinfeksi A.hydrophila )

Gambar 3 : Hasil analisis sekuen produk PCR A. hydrophila murni isolat FKH-UGM dan ginjal ikanperlakuan yang diinfeksi A. hydrophila

Jurnal Veteriner Maret 2012 Vol. 13 No. 1: 43-50

48

setelah diisolasi dan dimurnikan dibiakkanpada media kaldu LB dengan umur biakan 18 24 jam kemudian diekstrasi DNA dan dilakukanPCR dengan menggunakan primer Aero 1, 5-ATGCTGCAGAAATGATGAATAGAATAATTACCGC-3 dan Aero 2, 5-ATGCAAGCTTGCCCCA-TAATCTCCCAGCGAT-3, positip terinfeksi A.hydrophila dengan munculnya pita untuk genaerolysin (Aer-A) dengan bobot molekuler 690bp. Deteksi aerolysin pada sampel ikan yangdiambil dari pasar lokal India yang diisolasidengan menggunakan agar SAA dan diinkubasiselama 18 24 jam pada suhu 37 0C, kemudiandiekstraksi DNA nya kemudian di PCR denganmenggunakan primer Aer 2 F : 5-AGCGGCAGAGCCCGTCTATCCA -3 dan Aer2R : 5- AGTTGGTGGCGGTGTCGTAGCG-3positip terinfeksi A. hydrophila denganmunculnya pita untuk gen aerolysin (Aer-A)dengan bobot molekuler 416 bp.

Pada penelitian ini A. hydrophila (SA2)berasal dari biakan murni yang ditumbuhkanpada media TSB umur 24 jam, gen aerolysinterdeteksi dengan bobot molekul lebih rendahyaitu (462 bp) sedang pada gen Aer A.hydrophila yang berasal dari ginjal ikanperlakuan (900 bp). Tingginya bobot molekul darihasil deteksi PCR pada DNA ginjal ikanpenelitian ini (ikan perlakuan 1, 3, 4, dan 5 )mungkin disebabkan karena pada ginjal ikanperlakuan yang diekstrak mengandung genom-genom bakteri lain selain A. hydrophila yangjuga mengandung gen aerolysin. Tercampurgenom-genom lain dalam jaringan ginjal dapatmenyebabkan primer oligonukleotida yangdigunakan selain menyandi gen aerolysin A.hydrophila juga menyandi genom-genom lainyang terdapat di ginjal ikan. Akan tetapi padaikan kontrol negatip yang tidak diinfeksi A.hydrophila gen aerolysin tidak terdeteksikarena ikan tersebut tidak diinfeksi dengan A.hydrophila, hal tersebut mengindikasikan ikanperlakuan yang diinfeksi A. hyrophila jaringanginjalnya mengandung gen aerolysin dan padaikan perlakuan 5 (perlakuan bawang putih 10%) kadar aerolysin berkurang dengan terbentukpita yang tipis.

Hasil penelitian tersebut berbeda denganyang dilakukan oleh Pollard et al.,( 1990) denganmenggunakan sampel DNA A. hydrophila murniyang diisolasi dari pasien mengidap penyakitdiare yang ditumbuhkan pada media agarMueller Hinton (Oxoid) diinkubasi 24 jam padasuhu 300C setelah dilakukan PCR denganmenggunakan primer yang sama (oligonu-

kleotida sintetis) gen aerolysin (Aer-A)teramplifikasi dengan bobot molekuler 209 bp.Penelitian ini menggunakan isolat biakan murnikoleksi laboratorium FKH- UGM (SA2) denganmenggunakan primer yang sama mengacu padapenelitian Pollard et al., (1990), teramplifikasidengan bobot molekul 462 bp.

Tingginya hasil amplifikasi mungkindisebabkan karena primer yang digunakan padapenelitian ini tidak spesifik dengan isolat A.hydrophila FKH-UGM, karena A. hydrophilabersifat serotipe dan biotipe banyak, di sampingitu jumlah enterotoksin yang potensialmerupakan salah satu penyebab bervariasinyapatogenitas, sehingga menunjukkan keraga-man yang berbeda dari masing-masing strainAeromona. Bakteri-bakteri tersebut patogenuntuk berbagai spesies hewan yang hidup padakondisi yang berbeda (dari ikan sampaimanusia) (Yousr et al., 2007).

Sekuensing gen DNA A.hydrophilaHasil sekuen produk PCR A. hydrophila

(SA2) yang digunakan (isolat FKH-UGM) biakanmurni, setelah dilakukan blast dan alignmentsmenunjukkan total skor 55,4. Dari 144nukleotida yang teridentifikasi 101 danmempunyai kesamaan (homolog) sebesar 71 %dengan A. hydrophila subsp. hydrophila ATCC7966, complete genome. Bila hasil sequen dariSA2 (biakan murni) digabung dengan hasilsekuen DNA dari ginjal ikan perlakuan (1 dan5) terdapat adanya perbedaan, sedangkan bilahasil sekuen DNA ginjal ikan perlakuan 1 dan5 digabung terdapat adanya kemiripan sebesar82,6 % (dari 454 nukleotida 79 mengalamiperbedaan). Hasil sequen DNA jaringan ginjalikan yang mengandung gen aerolysin dari A.hydrophila setelah dilakukan blast tidak dapatditemukan kemiripan dengan A. hydrophilasubsp. hydrophila ATCC7 966, complete genomehal ini mungkin karena sampel A. hydrophiladari ginjal dianalisis langsung tanpadimurnikan terlebih dahulu. Kemungkinanpada jaringan ginjal ikan tersebut sudahterdapat pengaruhpemberian bawang putih(merupakan bahan alami yang mengandungantimikroba) yang diberikan selama 30 hari,kemudian adanya uji tantang dengan A.hydrophila, dan juga adanya pengaruh sistimpertahanan tubuh yang terbentuk (tanggapkebal). Yuwono (2006) menyatakan bahwa PCRdengan menggunakan sampel DNA yangdiekstrak dari jaringan yang diawetkan hasilnyatidak seefisien hasil PCR yang menggunakan

Lukistyowati & Kurniasih Jurnal Veteriner

49

DNA yang sudah dimurnikan, akan tetapi PCR(dengan target DNA) dapat digunakan untukdeteksi gen asing dan deteksi perubahan gen.Gen asing yang dideteksi dapat berupa hasilinfeksi oleh suatu jazad misalnya bakteri,jamur, maupun virus atau gen asing yangmerupakan hasil introduksi. Teknik PCRdengan menggunakan jaringan mempunyaikelemahan, sering disebabkan oleh applifikasiDNA nonspesifik karena proses mispriming(Yuwono, 2006).

Aeromonas hydrophila isolat FKH-UGMyang digunakan belum pernah dilakukan ujimolekuler, hal ini yang menyebabkan adanyaperbedaan karena banyaknya strain Aeromonas,dan juga banyaknya kemiripan strain yangterdaftar di Gen Bank, sehingga pada saat dilakukan blast kecocokannya hanya 71 % . Padakenyataannya A. hydrophila, yang terdiri daribanyak strain dan biotipe terdapat adanyaperbedaan diskripsi dilihat dari fenotip, serologidan genotipe sehingga menyebabkan rumitnyamenentukan perumpunan status taksonomidari A. hydrophila (Austin dan Austin, 1987).

SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian dapatdisimpulkan bahwa PCR dapat mendeteksi genaerolisyn dari A. hydrophila. Gen aerolysindapat dideteksi tergantung dengan jenis primeryang digunakan, dengan menggunakan primeroligonukleotida gen aerolysin yang diekstrakdari ginjal ikan menunjukkan bobot molekulsekitar 900 bp, sedangkan gen aerolysin yangberasal dari biakan murni A. hydrophila isolatFKH- UGM teramplifikasi dengan berat molekul462 bp. Setelah dilakukan analisa Blast padaisolat A. hydrophila FKH- UGM mempunyaikesamaan (homolog) sebesar 71 % dengan A.hydrophila subsp. hydrophila ATCC7 966

SARAN

Untuk pemeriksaan molekuler dengan PCRdisarankan bakteri yang akan digunakandimurnikan terlebih dahulu agar supaya tidaktercampur dengan genom-genom yang lain danjuga primer yang digunakan sebaiknya yangspesifik (dirancang terlebih dahulu) agar dapatmengamplifikasi gen yang diharapkan. Perludilakukan penelitian lebih lanjut untukmengetahui keberadaan gen Aer dari A.hydrophila akibat pengaruh pemberian bawangputih.

UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terima kasih diberikan kepadaLPPM-UGM yang telah memberikan bantuandana melalui anggaran DIPA UGM sehinggapenelitian ini dapat berjalan dengan lancar.Penulis juga mengucapkan terima kasihKepada BPPS DIKTI yang telah memberikanbea siswa kepada penulis.

DAFTAR PUSTAKA

Austin B, Austin DA. 1993. Bacterial FishPathogens. Disease In Farmed and WildFish. Second Edition New York.

Frandson RD. 1992. Anatomi dan FisiologiTernak. Edisi ke 4, Alih Bahasa olehSigandono, B dan Praseno, K., (Judul Asli :Anatomy and Physiology of Farm Animal).Yogyakarta. Gadjah Mada University Press.Hal. 356,434 -436, 366, 507,525.

Fulder, S., Blackwood, J dan Soestrisno, E. 2000. Terapi Bawang Putih Obat Asli Alami.Inovasi. Jakarta 115 hal.

Gustafson CE, Thomas CJ, Trevor J. 1992.Detection of Aeromonas salmonicida fromfish by using Polymerase Chain ReactionAmplification of the virulance arry protein.App Environ Microbiol, 58 (12) : 3816 - 3825

Lukistyowati I, Saberina H, 2004. Pemanfaatanekstrak bawang putih Allium sativumuntuk Pengobatan Penyakit BakteriAeromonas hydrophyla pada Ikan Mas(Cyprinus carpio). Laporan Penelitian.Lembaga Penelitian Universitas Riau.

Pollard DR, Johnson WM, Lior H, Tyler SD,Rozee KR. 1990. Detection of the AerolysinGene in Aeromonas hydrophila by thePolymerase Chain Reaction. Journal ofClinical Microbiology. Nov. 2477 2481

Porteen K, Agarwal RK, Bhilegaonkar KN. 2007.Detection of Aeromonas sp from Chickenand Fish Samples by Polymerase ChainReaction. American Journal of FoodTechnology 2 (1) : 30 37

Post G. 1987. Texbook of Fish Health. NewJersey. TFH Publication Inc, Neptune. P.288 pp

Salaby AM, Khattab YA, Rahman AAM. 2006.Effects of Garlic (Allium sativum) andChloramphenicol on Growth Performance,Physiological Parameters and Survival ofNile Tilapia (Oreochromis niloticus). JVenom Anim Toxins incl Trop Dis 12 (2 ) :172 2001.

Jurnal Veteriner Maret 2012 Vol. 13 No. 1: 43-50

50

Yagananth N, Bhakyaraj R, Chanthuru A, T.Anbalaga T, Nila KM. 2009. Detection ofVirulence Gene in Aeromonas hydrophilaIsolate from Fish Samples Using PCRTechnique. Global Journal of Biotecnology& Biochemistry 4 (1) : 51 53

Yousr AH, Napis S, Rusul GRA, Son R. 2007.Detection of Aerolysin and Hemolysin Genesin Aeromonas spp. Isolated fromEnviromental and Shellfish Sources byPolymerase Chain Reaction. Asean FoodJournal 14 (2) : 115 122

Lukistyowati & Kurniasih Jurnal Veteriner

Yusoff FM, Subangsihe RP. 1995. HistopatologyAeromonas hydrophila infection in Puntiusgonionotus to different nitrit concentration.In : M. Sharif, J.R.Artur and R.P.Subangsihe (Eds). Diseases in AsianAquaculture II. Proceeding of secondSymposium on Diseases in AsianAquaculture. 25 - 29 th October 1993. AsianFisheries Society. Manila. P 275 284

Juwono T. 2006. Teori dan Aplikasi PolymeraseChain Reaction. Panduan Eksperimen PCRuntuk memecahkan masalah biologiterkini. Yogyakarta. Penerbit Andi.