aie
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SEMINÁRIO DE HABILITAÇÃO
DE TÉCNICOS EM
DIAGNÓSTICO DA AIE
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO
LABORATÓRIO NACIONAL AGROPECUÁRIO
INTRODUÇÃO
AIE é a principal enfermidade da equideocultura mundial
Rebanho mundial: 120 milhões de eqüídeos
Brasil: terceira maior população mundial
de eqüideos
(FAO, 2002)
Rebanho eqüídeo nacional: 8.382.425
(IBGE, 2003)
Anemia Infecciosa Equina
AIE
HISTÓRICO
O vírus da AIE foi o 1º vírus animal a ser descrito
FRANÇA: Lignée, 1843; Vallée e Carré, 1904
BRASIL: Primeiro diagnóstico;
extinto estado da Guanabara
animais da raça Puro Sangue Inglês (PSI)
Jóquei Clube Brasileiro
Dupont et al., 1968
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Sideroleucócitos
Inoculação de animais
Anemia Infecciosa Equina
AIE
ETIOLOGIA
AIE
( 1º Lentivírus a ser descrito)
Gp. superfície
g p 90
e n v
Proteína
p 15
Gp. transmembrana
g p 45
e n v
p 26
Duas moléculas
RNA
RT
Transcriptase
Reversa
pol
Envelopado
gp90 → adsorção
viral
p26 → + abundante
cerne viral
+ conservada
RNA
Transcriptase
reversa
Família Retroviridae
Gêneros:
Lentivírus
Spumavírus
Gammaretrovírus
Deltaretrovírus
Alfaretrovirus
Epsilonretrovírus
Anemia Infecciosa Equina
AIE
RETROVÍRUS DE IMPORTÂNCIA VETERINÁRIA
Vírus da anemia infecciosa equina (EIAV).
Vírus maedi-visna (MVV).
Vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV).
Leucose Enzoótica Bovina.
Vírus da Leucemia Felina (FeLV).
Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV).
RETROVÍRUS DE IMPORTÂNCIA HUMANA
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana.
HTLV - Vírus T- Linfotrópico.
ETIOLOGIA
AIE
( 1º Lentivírus a ser descrito)
Anemia Infecciosa Equina
AIE
REPLICAÇÃO RETROVÍRUS - AIE
Persistência viral !!!
TRANSMISSÃO
Forma natural:
picada interrompida de insetos hematófagos.
Hawkins et al., 1976; Issel e Foil, 1984
Família Tabanidae
Raio ação durante
alimentação: ~ 200m
Anemia Infecciosa Equina
AIE
TRANSMISSÃO
Iatrogênica:
fômites contaminados com sangue infectado.
Williams et al., 1981
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Instrumentos cirúrgicos
Arreios
Esporas
Seringas96 horas
TRANSMISSÃO
Transplacentária, colostro e sêmen:
pode ocorrer, mas com menor importância epidemiológica
disseminação menos eficiente
dependente da fase da doença
viremia
Kemen Jr. e Coggins, 1972; Tashjian, 1984; Clabough, 1990
Anemia Infecciosa Equina
AIE
IMUNOPATOGÊNESE
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Replicação viral em macrófagos
tissulares do fígado, baço,
linfonodos, pulmão
VIREMIA
Controle dependente de células B e T
Replicação viral abaixo do
limiar de indução da doença
RESPOSTA IMUNE ALTA E DURADORA
Alta freqüência de mutações
genéticas - TR
Alteração epitopos virais
Escape da resposta imune
neutralizante
Habilidade de sofrer rápida
variação antigênica:
persistência viral e obstáculo
ao desenvolvimento de vacinas
ALTERAÇÕES NO GENOMA
NOVAS VARIANTES ANTIGÊNICAS
Contato vírus
AIE
EPIDEMIOLOGIA
Distribuição mundial – NOTIFICAÇÃO OBRIGATÓRIA
Susceptibilidade: somente espécies da família Equidae
equinos - muares - asininos
Mais prevalente em áreas de clima quente e úmido
Anemia Infecciosa Equina
AIE
EPIDEMIOLOGIA
Animais assintomáticos são importantes fonte de infecção
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Razão para grande importância do diagnóstico laboratorial !!!!
95% dos infectados são
assintomáticos
TABELA 1
Demonstrativo
epidemiológico
da AIE no
Brasil,
1993 a 2004.
Anemia Infecciosa Equina
AIE
ANOS FOCOS ANIMAIS
EXAMINADOS POSITIVOS
POSITIVOS
(%)
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
TOTAL
1.669
1.633
1.562
1.471
1.592
1.621
1.841
1.964
2.334
2.299
3.616
3.135
24.737
238.198
145.880
178.813
186.583
137.226
131.991
156.152
235.739
200.854
220.652
340.928
310.346
2.483.362
4.055
3.799
4.145
4.322
4.476
3.689
4.037
4.446
2.243
3.892
7.513
7.865
56.482
1,70
2,60
2,32
2,32
3,26
2,79
2,59
1,89
2,11
1,76
2,20
2,53
2,27
EPIDEMIOLOGIA – Situação da AIE no Brasil
Fonte: Ministério da
Agricultura Pecuária e
Abastecimento, 2004.
~ 2%
8.382.425
Distribuição regionalizada
Mais prevalente em áreas de clima quente e úmido como
Mato Grosso e Roraima.
Pantanal: estima-se que
mais de 50% dos animais
estejam contaminados
Anemia Infecciosa Equina
AIE
EPIDEMIOLOGIA – Situação da AIE no Brasil
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Almeida, 2005
FIGURA 1
Prevalência
da AIE em
eqüídeos de
serviço, por
estrato, em
Minas Gerais.
PREVALÊNCIA X ESTRATÉGIAS DE CONTROLE
PREVALÊNCIA X CONDIÇÕES SOCIOECONÔMICA
DIAGNÓSTICO
Clínico - Deve ser considerado sempre em associação com o
diagnóstico laboratorial
Laboratorial:
IDGA – Imunodifusão em gel de ágar OFICIAL
ELISA – Ensaio Imunoenzimático
PCR – Reação em cadeia pela polimerase
Anemia Infecciosa Equina
AIE
DIAGNÓSTICO – Sinais Clínicos
TABELA 2: Formas clínicas da AIE ( Montelaro et al., 1996 )
Anemia Infecciosa Equina
AIE
AGUDA ASSINTOMÁTICACRÔNICA
DIAGNÓSTICO – Sinais Clínicos
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Em eqüídeos assintomáticos
pode ocorrer o reaparecimento
da forma crônica em casos de
estresse ou administração de
corticóides.
Baseia-se na migração
radial dupla de Ag e Ac
através do gel de ágar
Anemia Infecciosa Equina
AIE
O encontro dos reagentes, em proporções ótimas, leva à formação
de complexos Ag-Ac insolúveis que precipitam, tornando-se
visíveis sob a forma de uma linha ou banda de precipitação.
PRINCÍPIO DO IDGA
SCP
SCP
13
2
SCP
Ag
POSSÍVEIS INTERPRETAÇÕES DO IDGA
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Negativo
Positivo
Fraco Positivo
Forte Positivo
Inespecífico
PRINCÍPIO DO ELISA
As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de
Ag ou Ac marcados com enzimas e permitem a detecção
e titulação de substâncias de interesse biológico.
Anemia Infecciosa Equina
AIE
PRINCÍPIO DO ELISA
Anemia Infecciosa Equina
AIE
1
2
3
4
5
ANTÍGENO
SORO
TESTE
CONJUGADO
anti-espécie c\
enzima
SUBSTRATO
CINÉTICA DA RESPOSTA HUMORAL ÀS PROTEÍNAS E
GLICOPROTEÍNAS DO VÍRUS DA AIE
Anemia Infecciosa Equina
AIE
V1
V2
V3
gp90
gp45
p26
Tempo
Co
ncen
tração
Ac
IDGA ( p26 ) – falsos negativos em animais infectados a 14 dias ou menos
ELISA ( gp90 ) - detecção com 7 a 10 dias
PCR – fragmentos de DNA detectado de 3 a 4 dias pós infecção
PRINCÍPIO DO PCR
Técnica de amplificação de um fragmento específico
de um genoma, ou parte dele, sob condições definidas de
temperatura e utilizando-se iniciadores específicos.
(primers)
Anemia Infecciosa Equina
AIE
EXTRAÇÃO
DNA
FENOLCLOROFÓRMIO
PROTEINA K
NaOH
Etc..
Lise Celular
Digestação de Proteínas
Etc..
PBMC
Extração de
DNA
DNA total (vírus + célula)
Molde para
PCR
Coleta
Sangue
COMPONENTES DA PCRFita molde:
5’ ▬▬▬ ATGTACCATTGCGAGAAGCCTAA▬▬▬3’
3’ ▬▬▬ TACATGGTAACGCTCTTCGGATT▬▬▬5’
Iniciadores (Primers): ▬▬▬TACATGGCCTAA▬▬▬
Enzima: DNA polimerase, resistente a várias temperaturas
dNTPs: deoxinucleotídeos
Adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina (C)
Taq DNA polimerase
c a t g
c a t g
Nucleotídeos
DNA
Iniciadores
Tampão
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
EXTENSÃO
PCR
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
PRINCÍPIO DO PCR
Anemia Infecciosa Equina
AIE
Cuba de
Eletroforese
ELETROFORESE
corrente elétrica
X
peso molecular
2072 pb
1000
800
500
400
300
200
100
Figura 1- Gel de agarose 1,5 % apresentando a fragmento de 329 pb
amplificado pela reação interna da PCR. Canaleta 1- Padrão de peso
molecular 100 bp. Canaleta 2- Controle positivo. Canaleta3- Controle negativo.
Canaleta 4,5,7,9-13- Amostras negativas. Canaleta 6 e 8- Amostras positivas
329 pb
CONTROLE DA AIE
Uso de seringas e agulhas descartáveis
Limpeza dos utensílios utilizados nos animais
Hipoclorito de sódio (cloro livre a 100 ppm)
Anemia Infecciosa Equina
AIE
CONTROLE DA AIE
Isolamento dos animais positivos até o sacrifício
Uso de telas protetoras
> 200 m
Não permitir a amamentação e realizar o isolamento
de potros nascidos de éguas positivas
potro < 6 meses
isolado mín. 60 dias
02 exames - Intervalo 30-60 dias
Anemia Infecciosa Equina
AIE
CONTROLE DA AIE
Exame de todos os eqüídeos que forem realizar trânsito
Realização de exame em todas aglomerações de eqüídeos
(leilões e feiras)
Anemia Infecciosa Equina
AIE
FIM !!!