AISLAMIENTO DE CROMOSOMAS DEL

LENGUADO SENEGALÉS (SOLEA

SENEGALENSIS, KAUP 1858) M

EDIANTE

TÉCNICAS DE MICRODISECCIÓ

N LÁSER.

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Vega y colaboradores 2002

A) B)

INTRODUCCIÓN: LENGUADO SENEGALÉS

Nombre científico: Solea Senegalensis

Interés en el mercado europeo y creciente producción.

Alto valor 12-15€/kg

Desarrollo de la acuicultura

No se han implementado grandes programas de mejora genética.

Interés en investigación para desarrollarlos:

Interés en las bases genéticas del lenguado• PCR• NGS• Técnicas de citogenética tradicionales y moleculares• Microdisección láser• DOP-PCR

OBJETIVOS

Principal

Optimización de la condiciones para la microdisección láser y amplificación de los cromosomas aislados.

Objetivos parciales:

a) Obtener las mejores extensiones cromosómicas posibles en portaobjetos PET, para facilitar el aislamiento posterior de los cromosomas.

b) Lograr las mejores condiciones de corte y catapultado, para obtener el corte más fino, menos energético y efectivo ajustando las condiciones del láser y la metodología del proceso.

c) Conseguir la cantidad mínima de cromosomas y condiciones óptimas para el desarrollo de la DOP-PCR.

METODOLOGÍA DEL TRABAJO

Se mejoró la extensión de los cromosomas en las preparaciones

Se ajustó las condiciones y parámetros del láser

Se puso a punto la DOP-PCR

EXTENSIÓN PREPARACIONES CROMOSÓMICAS.

Se busca obtener la mejor extensión que permita un óptimo aislado. Preparaciones de buena calidad Buena extensión

1. Portaobjetos normales Se usaron tres protocolos distintos

2. Portaobjetos PET Se hicieron variaciones de temperatura en el protocolo anteriormente elegido

PORTAOBJETOS CONVENCIONALES

Pretratamiento Portaobjetos

Muestras

PORTAOBJETOS CONVENCIONALES

1. Homogenizado con Ácido Acético 45%

2. Los portaobjetos en una placa calefactora a 45ºC

3. Se realizó el splash

4. Fijación a 45ºC.5. Retirar ácido

acético cada 15-20

Calor

1. Los portaobjetos se someten a frío seco -20ºC.

2. Homogenizado en Carnoy.

3. Se realiza Splash4. Se dejan a 37ºC en

la placa calefactora húmeda.

5. Se gota Carnoy6. Fijación durante 1

hora a 37ºC

Zeiss

1. Los portaobjetos se someten a frío húmedo -20ºC.

2. Homogenizado en Carnoy.

3. Se realiza Splash4. Se dejan a 50ºC en

la placa calefactora húmeda.

5. Se gotea Carnoy6. Se fija durante 10

min

Jena

Tratamiento

PORTAOBJETOS CONVENCIONALES• 1 min EtOH 30% • 1 min EtOH 50% • 5 min EtOH 70% • 5 min EtOH 90% • 5 min EtOH 100% • 10 min EtOH 100%

(Temperatura ambiente)

1) Deshidratación

Una hora en la estufa a 72ºC

2) Envejecimiento

Teñir durante 15 min, con Giemsa 8% en tampón fosfato.

Lavar con agua destilada

3) Tinción Giemsa

Medida del área en píxeles de las placas metafásicas con ImageJ.

Análisis de Datos.

Post-tratamiento

RESULTADOS PORTAOBJETOS CONVENCIONALESJena4x 10x 40x

Calor

Zeiss

Jena

MATERIAL Y MÉTODOS

Pretratamiento

Tratamiento

Jen

a

50ºC

60ºC

65ºc

Post-tratamiento

Después de teñir se mantuvo 15 min a 50ºC

PORTAOBJETOS PETPost-tratamiento

Henegariu y colaboradores

RESULTADOS

50ºC 60ºC 65ºC

60ºC

AJUSTE MICRODISECTOR

Necesidad de Optimizar el corte por diversos problemas. Cromosomas de lenguado muy pequeños. Daños al realizar los cortes y dificultad de aislamiento. El láser se desenfocaba. Cortes irregulares dependiendo de la localización en la membrana.

Necesidad de ajustar parámetros y metodología mejor que a la usada anteriormente.

Parámetros

Energía

Enfoque

Ciclos

Velocidad

No corta

No corta

Desenfocado

Desenfocado

Enfoque óptimo

LáserPosición

Preparación (-) Energía (+)

Preparación

1º 2º 3º

Enfocar Aumentarenergía

RESULTADO CORTE LÁSER

Parámetro Protocolo inicial Protocolo optimizado

Energía Corte (µ J) ≈37 20 incrementando hasta 37(máx.)

Energía Catapultado (µ J) 10 10-20

Velocidad de corte µm/s 5 5

Numero de ciclos de corte 120,Aunque se realizar los necesarios hasta que

completar el corte

DOP-PCR

PCR con primers degenerados.

A partir de cromosomas microdiseccionados.

Se usaron dos protocolos con distintas polimerasas

o Termolábil (Secuenasa)

o Termoestable ( Roche)

Se mantuvo la esterilidad para evitar contaminaciones Puntas con filtro Tratamiento UV Cabina de flujo Cuidado en el manejo de reactivos

DOP-PCR

ADN molde

200pb

800pb

ADN moldePrimers DOP

• Degenerados(5′-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3′)

Unión inespecífica

Fragmentos de diferentes tamaños

Tamaños de fragmentos aleatorios

Smear

2ª PCR)

1ª PCR)

POLIMERASA SECUENASA (TERMOLÁBIL)Programa ciclos a baja temperatura.

Paso TemperaturaTiempo (min)

Observaciones

1 92ºC 5:00  

2 25ºC 2:00Adicionar 0.24 µL de Secuenasa

3 34ºC 2:00  4 90ºC 1:00  5 Ir a 2, repetir 6 veces  6 30ºC 2:20  Programa ciclos a alta temperatura.

7 94ºC 2:00Calentamiento inicial para Platinium polymerase

8 92ºC 1:00  9 56ºC 2:20  10 70ºC 2:00  11 Ir a 8, repetir 31 veces  12 70ºC 10:00  13 4ºC ∞  14 Final  

POLIMERASA ROCHE (TERMOESTABLE)

Paso Temperatura Tiempo en minutos

1 94ºC 9:002 94ºC 1:003 30ºC 2:304 72ºC 3:005 Ir de 2 a 4, repetir 9 veces6 94ºC 1:007 62ºC 1:308 72ºC 2:309 Ir de 6 a 8, repetir 30 veces10 70ºC 8:0011 4ºC ∞12 Final

RESULTADOS DOP

RESULTADOS DOP

OPTIMIZACIÓN DEL TIEMPO: DIAGRAMA DE GANTT

Limpiar portas PETEnfriar PET al congelador

Extracción (SV) larvasHomogenizado

SplashPlaca calefactora

DeshidrataciónEnvejecido

TeñirSecado

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Diseccionar cromosomas

Añadir H20

Resuspender H20

24 29 34 39 44

Resuspender en agua

Preparar material para la campana

Exposición UV en campana

Preparar PCR

DOP PCR (programa Termociclador)

Preparar Geles

Cargar Gel

Electroforesis

48 50 52 54 56 58 60 62

22%

CONCLUSIONES

1. Se consiguió optimizar el proceso completo y las condiciones de microdisección láser y amplificación mediante DOP-PCR.

2. Se mejoraron las preparaciones cromosómicas, y se confirmó que el mejor protocolo fue el de Jena. Asimismo un incremento de la temperatura de la placa calefactora en el protocolo de Jena hasta los 60ºC, en comparación a los 50ºC iniciales, favoreció la extensión de los cromosomas en los portaobjetos PET.

3. Se perfeccionó significativamente el aislamiento cromosómico por microdisección láser. El nuevo método implementado, con el que se inicia el corte con una energía de láser mínima de 20 J, para enfocar el láser y μposteriormente aumentar la energía progresivamente hasta cortar la muestra consiguió ser útil para minimizar los daños a los cromosomas.

CONCLUSIONES

4. Se constató que el uso de la polimerasa termoestable de roche era válida para la realización de la DOP-PCR. El uso de una polimerasa termoestable facilitó la DOP-PCR con respecto al uso de la polimerasa termolábil (Secuenasa). Se simplificó la preparación de reactivos, necesitando una sola mezcla de reacción, en vez de dos. Además no hay que añadir polimerasa en cada ciclo de desnaturalización en la etapa de amplificación a baja temperatura, como sucedía con la Secuenasa. Traduciéndose estos cambios en un menor trabajo de laboratorio y una mayor dificultad de contaminación de las muestras, ya que estas se manipulan menos.

5. Se obtuvo que la cantidad mínima de cromosomas microdiseccionados en Solea senegalensis que generaban productos en la DOP-PCR está cercana a los 7 cromosomas.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Permitirá aislar cromosomas y brazos cromosómicos específicos mediante microdisección láser.

Las muestras aisladas serán amplificadas por DOP-PCR, que serán de utilidad para:Secuenciación. Generar sondas para el pintado cromosómico.

Con ello se podrá continuar y completar los estudios en Solea senegalensis.

TFG FUTURO

Muchísimas gracias por su tiempo y atención.

Y especialmente al laboratorio de genética, a mi familia y amigos.