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ÁREA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLOPROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL

GRUPO

QU-304

MATERIA

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

TITULO

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

DE LA MATRIZ AMBIENTAL: _____Suelo _ ________

ASESORA

Dr. ROSA RICO MATA

DATOS DE IDENTIFICACIÓN DE LOS ANALISTASFecha de inicio del análisis: 1 de Julio del 2015Fecha de término: 9 de Julio de 2015

Nombre Cargo Salas Padilla María Guadalupe Regina Responsable

Piña Cardona Víctor Manuel Guadalupe Administrador

Ramírez Sánchez Andrés Laboratorista 1

Pedroza Díaz Noé Miguel Ángel Laboratorista 2

Rentería Aldana Jorge Laboratorista 3

GENERACIÓN: 2014-2016

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DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO1.- Breve descripción del estatus ambiental del sitio de estudio:Hace más de once años, dio inicio uno de los proyectos más emblemáticos de la Universidad Tecnológica de León (UTL). Su nombre original: “Campaña Universitaria de Protección al Ambiente (CUPA)”, ha sido heredado a través de las generaciones de alumnos que han estudiado dentro de la Universidad, ha sobrellevado los cambios organizacionales (tres rectores), ha sobrevivido al crecimiento de la infraestructura, matrícula y profesores; al tiempo y a la falta de recursos (humanos, económicos, entre otros). Ha crecido de ser un proyecto llevado solamente por los alumnos de tecnología ambiental a ser un proyecto que toda la Comunidad Universitaria empieza a conocer y a adoptar como propio

SITIO DE MUESTREO

Nombre Ubicación /coordenadas GPS

Imagen de mapa satelital

CUPA, Universidad Tecnológica de León

21.064583,-101.582469

2. Evidencia fotográfica del sitioFecha:30 de Junio del 2015Hora:10:30 a.m.

Fecha:30 de Junio del 2015Hora:10:35 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR1. Identificación

Matriz ambiental:suelo Hora de toma de muestra:10:30 a.m. Hora de siembra: 11:00 a.m.Punto de Muestreo (ubicación /coordenadas GPS): 21.064583, -101.582469

Tiempo de exposición (aplica solo para muestra de aire)

Nombre del/ los analistas que tomaron la muestra:Piña Cardona Víctor Manuel

Nombre del/ los analistas que sembró la muestra:Ramírez Sánchez Andrés

2.Parámetros Fisicoquímicos Color:Café Temperatura (oC) ambiental: 27 oC pH:5Olor:Tierra húmeda Describir condiciones climatológicas:Cielo despejado,

poca concentración de nubes pero húmedo el suelo3. Evidencia fotográfica del sitio de toma de muestra

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1. Justificación del proceso para la identificación bacterianaCada género de bacteria, de hongo, protozoo, etc., inclusive su especie, tienen diferentes reacciones cuando se les enfrentan diferentes pruebas, esto se hace a partir de un cultivo puro, en este caso un hongo. Con estas pruebas podremos decir casi con exactitud que género y que especie de hongo es.Para la identificación bacteriana en el laboratorio es importante sus características morfológicas, la reacción a la tinción de Gram, agrupación, morfología colonial, reacciones metabólicas como presencia de actividades enzimáticas o reacciones oxido-reducción.Debido a la interacciónmicrobiana se tienen una estabilidad ambiental, en este caso, trichoderma  harzianum actúa como fungicida de hongos parásitos y provee de nutrientes a otros microorganismos con una simbiosis.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Receta)

Agar dextrosa papaAgar 15 g

Dextrosa 20 g Infusión de papa 4 g

Agar Sabouraud

Glucosa 40 gPluripeptona 10 g

Agar 15 g

Clorafenicol 0.05 g

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)DescripciónEs un hongo que posee estructuras del tipo de conidias hialinas uniceluladas, ovoide en conidioforo hialino largo no verticilado, nace en centros pequeños. Tiene la capacidad de producir clamidosporas en sustratos naturales, estructuras de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo bajo condiciones adversas. Es saprofito del suelo y de la madera y el crecimiento en el suelo es muy rápido.

DescripciónLa mayoría de las colonias de Trichoderma en su inicio tienen color blanco , que se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es raro en su mayoría, y visto al microscopio es fino, los conidióforos son ramificados, parecen un árbol pequeño. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal.

Imagen Imagen

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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y receta)

Agar dextrosa papaAgar 15 g

Dextrosa 20 g Infusión de papa 4 g

Agar rosa bengalaDextrosa 10 gPeptona 5 g

Fosfato de potasio 1 g Sulfato de magnesio 0.5 g

Cloranfenicol 0.1 gRosa bengala 0.05 g

Agar bacteriológico 15 g

Morfología Colonial (Medio 1) Morfología Colonial (Medio 2)

DescripciónLas colonias se muestran rizoides, pulvinada y filamentosas color verde rodeadas de un halo color blanco.

DescripciónColonia ampliamente distribuida por el medio, filamentosa color blanco-marrón y con halos detectables parecidos a un espiral.

Imagen Imagen

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4. Procedimiento de Aislamiento(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizarMateriales y equipo:

1 parrilla de calentamiento1 agitador de vidrio2 matraces Erlenmeyer 250 mL2 vasos de precipitado 250 mL2 cajas Petri

Medios de cultivo y reactivosAgar dextrosa papaÁcido tartárico

Preparación de medios de cultivo:Se pesan 2.77 g de medio agar dextrosa papa en 70 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 mL hasta una dilución considerable. Se calienta en la parrilla y se deja hervir por un minuto. Se hace un tapón para el matraz y se esteriliza por 15 minutos a una presión de 15 psi. Después, el contenido se vierte a dos cajas Petri en cantidades de 35 mL en cada una (aproximadamente) y se agrega 1 mL al agar ya servido en las cajas. Se deja solidificar.

Para ácido tartárico:Pesar 0.98 g de ácido tartárico y disolver en 70 mL de agua desionizada. Esterilizar por 15 min a una presión de 15 psi

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, selección de la colonia y resiembra):

Siembra:La muestra se recolectó se le introduce el asa, previamente esterilizada en el mechero, al centro. La muestra en el asa se distribuyó en uno de los 2 medios en siembra por estriado, identificando la mitad del medio.se incuba a una temperatura de 37 ± 5º de 2 a 5 días.

Selección de la colonia:Después de ver crecimiento en la placa, se selecciona una colonia con las características previstas (colonias verdes con un halo blanco a su alrededor).

Resiembra:Con el asa, previamente esterilizada en mechero, se toma una fracción de la colonia identificada. En la otra caja con medio se realiza la siembra por estriado nuevamente para la aislaciónde las colonias después de la incubación. Se incuba a una temperatura de 37 ± 5º de 2 a 5 días y se observa el crecimiento después de este tiempo.

2 charolas de pesado

1 espátula

Equipo para esterilización

Agua destilada

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5. Esquema del Perfil bioquímico (metabólico ) para la identificación del microorganismo seleccionado

HONGO A IDENTIFICAR

caseína

+ -

hidrólisis de almidón

+ -

prueba de indol

+ -prueba de m

ovilidad

+ -catalasa+citrasa+-

tinción de Gram

+cápsula+-

producción de gas, CO2

+-

producción de H2

S

+-

-

-

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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)

2. MORFOLOGÍA COLONIAL OBSERVADATipo de colonia 1: Descripción

Colonia señalada en la imagen. Una colonia negruzca, filamentosa y muy uniforme en su desplazamiento en el medio.

FOTO 1

Tipo de colonia 2: Descripción La segunda era una colonia puntiforme color amarillo claro, muy separada a las demás. Plana y de desplazamiento tardado

FOTO 2

Tipo de colonia 3: Descripción La tercera era una colonia color verde claro, difuminada, filamentosa y rizoide. Este hongoes el indicado para el aislamiento.

FOTO 3

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3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)FOTO 1

Medio de cultivo Agar dextrosa papa

Colonia que se seleccionó para resiembra

FOTO 2Medio de cultivo Agar dextrosa papa

Colonia resembrada

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

Descripción La resiembra se realizó en el agar de dextrosa papa y se observó que el crecimiento fue favorable para el hongo a la temperatura de 37°C. La propagación del hongo fue acorde al estriado mostrándose colonias blancas con una leve tonalidad verde en el centro de la línea que denotaba la presencia del hongo que se buscaba.Aun no estaba en una etapa mayor, así que se volvió a incubar a la temperatura ya mencionada para que creciese un poco más.

FOTO 1

FOTO 2

FOTO 3

5. EVIDENCIA FOTOGRÁFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUÍMICO

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Nombre de la prueba

Medio de cultivo utilizado

Resultado obtenido (positivo/negativo) Evidencia fotográfica

1.-Prueba de caseína

Agar leche descremada

Negativo (-)

Fundamento de la prueba Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le da el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada por las proteasas o enzimas que degradan esta proteína, desaparecerá el color blanco alrededor del crecimiento bacteriano.

C43H64N10O12 + CASEINASA AMINOACIDOS + PEPTIDOS + CO2 + H20

2.- Hidrólisis de almidón

Agar métodos estándar y almidón

Negativo (-)

Fundamento de la pruebaEl almidón se constituye principalmente por amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amiolíticas hidrolizan almidón y sus productos. El lugol con el almidón forman un complejo color café-púrpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado

Agua peptonada Negativo (-)

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3.-prueba de indol

Fundamento de la pruebaEs una prueba realizada en microorganismos para determinar la habilidad de romper el indol del aminoácido triptófano. Es realizado por la enzima que se llama con frecuencia triptofanasa. Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo después de agregar el reactivo de kovac.Se genera el indol por una desaminación reductiva del triptófano via la molécula intermediaria ácido indolpirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Comocoenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

4.-Prueba de movilidad

Medio SIM Negativo (-)

Fundamento de la pruebaEl medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación se detectara por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada, mientras que los organismos con la capacidad de motilidad se recorrerán en el medio.La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación. Esto se debe a la presencia de flagelos que le permiten desplazarse por el medio en busca de alimento. Puede ser en medio aeróbico o anaeróbico.

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5.-prueba de catalasa

Portaobjetos y agua oxigenada

Positivo (+)

Fundamento de la pruebaLa catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y en algunos casos, los hongos. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva.

H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2

6.- Prueba de citrasa

Agar citrato de Simmons

Negativo (-)

Fundamento de la pruebaSe determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. El citrato permeasa permite el transporte de citrato al interior de las células y la enzima Citrasa convierte el citrato en acidooxalacetico y acetato, productos que son convertidos enzimáticamente en ácido pirúvico y CO2. El CO2 liberado se combina con el sodio y agua y forman carbonato de sodio que es alcalino cambiando el bromotimol de verde a azul intenso.

C6H5O7-3 + Citrasa C4H5O5 + C2H30 C3H4O3 + CO2

CO2 + H2O + Na CO3-2

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7.- tinción de GramPositivo (+)

Fundamento de la pruebaEs un tipo de tinción diferencial empleado en la microbiología para la visualización de microorganismos y su morfología. El cristal violeta (colorante catiónico) penetras en todas las células bacterianas (tanto Gram negativas como positivas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por Yodo en equilibrio con yoduro de potasio y agua destilada los cuales están presentes para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El yodo entra en las células y forman un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. El alcohol decolora el complejo, las Gram positivas no se decoloran. Ya que todo depende de su pared celular, si esta es sana será Gram positivo.

8.- prueba de cápsula

Tinta china o henna

Negativo (-)

Fundamento de la pruebaLa cápsula es una cubierta de grosor vartiable formada habitualmente por unidades de polisacáridos, proteínas o ambos. Si está bien estructurada y se encuentra bien adherida a la célula, se le denomina cápsula; si por el contrario, tiene estructura mal definida y su adhesión es débil, se le conoce como glicocálix. De acuerdo a su estructura química, puede ser flexible o rígida. La rigidez le confiere la característica de una matriz impermeable. Determina la adhesión a superficies (biopelículas), constituye una barrera de protección contra la fagocitosis y los anticuerpos e impide la desecación y la acción de otros agentes.

9.-Prueba producción de gas

Caldo lactosado Negativo (-)

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Fundamento de la pruebaEl extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono a fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gases (H2,CH4 y CO2 loscuales se evidencian al utilizar campanas Durham).

C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

10.-prueba producción de ácido sulfhídrico

Agar triple azúcar hierro (TSI)

Negativo (-)

Fundamento de la pruebaEn el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona aportan los nutrientes adecuadas para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sustrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfato de hierro, color negro.

Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.

SO4 2 + ATP + 2H+ ---- APS + Ppi

APS + 2e- + 2H+ -------> HSO3 - + AMP

HSO3 - + 6e- + 2H+ ---- HS- + H2O

ATP sulfurilasa

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IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: _________________suelo______________________

1.- Nombre científico del o los microorganismo identificado de acuerdo a los resultados del perfil bioquímico planteado ( género y especie)

Trichoderma harzianum

2. Taxonomía del o los microorganismo identificadosReino: Fungi

División: AscomycotaSubdivisión: Pezizomycotina

Clase: SordariomycetesOrden: Hypocreales

Familia: HypocreaceaeGénero: TrichodermaEspecie: T. harzianum

3. Características generalesLa mayoría de las Trichoderma no tienen un periodo sexual simplemente producen esporas asexuales. Sin embargo a unas pocas líneas de Trichoderma si se les conoce un periodo sexual pero no entre las líneas que se usan en el control biológico.Mientras que las cepas silvestres son muy adaptables y pueden ser heterocarióticas (contienen núcleos genotipicamente distintos en un mismo organismo), las cepas usadas en control biológico en agricultura son, o deben ser, homocarióticas (todos los núcleos son genéticamente similares o idénticos).

4. Ciclo(s) biogeoquímicos en el(los) que intervienen

Ciclo del Nitrógeno Ciclo del Carbono

5. La función que juegan en la transformación de la materia orgánica a través de los ciclos biogeoquímicos

Según Nalk et al, ayuda a la disminución de agentes patógenos, ayudan a la fijación de nitrógeno en plantas, estimulando el crecimiento en algunos tipos de plantas y árboles, como la vainilla, por ejemplo.Cada microorganismo cumple una función importante en los ciclos biogeoquímicos. Uno de ellos es el hongo Trichoderma harzianum, el cual está presente en suelos de cultivos, pastizales, etc. Se ha comprobado que no cumple con muchas funciones metabólicas como la degradación de caseína, producción de indol, incluso si podía vivir del citrato como única fuente de carbono.La interacción que realiza dentro de la matriz del suelo suele ser utilizada por agricultores en sus campos para la eliminación de hongos, como e Botrytis, Fusarium y Penicillium sp,que le sean dañinos al cultivo que se tenga.

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6. Conclusión parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz estudiada y la importancia de la microbiología en el área ambiental

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Como conclusión del presente proyecto ,conocimos que los microorganismos son los componentes más importantes del suelo. Constituyen su parte viva y son los responsables de la dinámica de transformación y desarrollo. La diversidad de microorganismos que se encuentran en una fracción de suelo cumplen funciones determinantes en la transformación de los componentes orgánicos e inorgánicos que se le incorporan. Esto permite comprender su importancia en la nutrición de las plantas al efectuar procesos de transformación hasta elementos que pueden ser asimilados por sus raíces. La humificación de la materia orgánica es un proceso netamente microbiológico.Tambiénal investigar y aislar elTrichoderma spp. aprendimos que son hongos los cuales están presentes en casi todos los suelos. Normalmente son los hongos con mayor presencia en ellos.Trichoderma coloniza rápidamente las raíces de las plantas Trichoderma spp. también ataca, parasita y/o se alimenta de otros hongos. Éste ha desarrollado numerosos mecanismos para atacar a otros hongos y a la vez mejorar el crecimiento de las raíces de las plantas. Sin embargo la mayoría de las cepas son más efectivas contra un hongo patógeno que otro y ser también no efectivos en un gran número de hongos.Gracias a loaprendido en el curso de microbiología ambiental pudimos realizar varias de las pruebas bioquímicas necesarias para la clasificación del hongo en cuestión, al igual que identificar su función dentro de los ciclos biogeoquímicos que, tienen una gran importancia para el correcto funcionamiento del ambiente.Adquirimos conocimientos acerca de los métodos utilizados para las pruebas usadas en este trabajo que pueden ser aplicadas para el reconocimiento o el aislamiento en cualquier microorganismo o bien, si no son los mismos métodos, se asemejan a los diferentes existentes y así facilitar el aprendizaje de nuevos métodos y abrir espacio a conocimientos más elaborados.