UNIDAD III AISLAMIENTO Y CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANAS DE IMPORTANCIA INDUSTRIALFERMENTACIONES6 HORASTEMAS:Requisitos que debe cubrir un cultivo microbiano para considerarse til en la industria de fermentacionesAislamiento de micro organismos de inters industrialProceso de tamizado; primario y secundarioObtencin de un cultivo puroMtodos de conservacin de micro organismosRequerimientos nutricionalesPruebas de Aceptacin y rechazoCultivos sincronizados Los Hongos se reproducen sexual o asexualmente

BIOTECNOLOGIA MCICROBIANA O MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Desarrolla procedimientos que permitan el aislamiento y seleccin de microorganismos de inters industrial Mtodo para detectar la actividad deseada. FERMENTACIONES

La Biotecnologa Microbiana o Microbiologa industrial, comenz con procesos de fermentacin alcohlica, tales como:fabricacin de cerveza o vino, luego prosigui CON: Antibiticosaditivos alimentarios (aminocidos), enzimas y sustancias qumicas industriales (butanol y cido ctrico

Microorganismos con potencial industrial y ambiental:

No todos los microorganismos tienen uso industrial, estos se seleccionan por su capacidad de fabricar productos especficos, transformndolos en organismos altamente especializados antes de ingresar a la industria. Biotecnologa Microbiana: En la actualidad con la tecnologa del ADN recombinante se somete al microorganismo a un proceso de ingeniera para que produzca una sustancia que normalmente no genera con alto rendimiento

De las100000 especies de mo descritas en la Naturaleza, los que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fcil o barata por otros mtodos.

Formas BacterianasLas Bacterias se reproducen por Fisin Binaria

HONGOSLos Hongos se reproducen sexual o asexualmente

Curva de crecimiento bacterianotiempoNmero de bacteriasFase LagFase logFase estacionariaFase de muerteAlgunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli) Los mo tienen una elevada tasa metablica

APLICACIN:En industria farmacutica: productos de gran valor comercial: antibiticos, hormonas, y esteroides Y : Hormonas humanas, Agentes antivirales y antitumorales, Factores de coagulacin sangunea, Activador de plasmingeno tisular, Vacunas y anticuerpos monoclonales (diagnostico y terapia). En la alimentacin el consumo de bacterias lcticas oPROBITICOS, (promotores de la vida), alimewntos fermentados etc.En agricultura, la biotecnologa microbiana, se emplea en biofertilizacin, utiliza organismos como Agrobacterium tumefacienspara modificar genticamente a las plantas. Plantas modificadas para ser resistentes a insectos tienen genes de txinas de Bacillusthuringiensis. Como Biofertilizantes (solubilizadoras de fsforo, productoras de fitohormonas) y fijadoras de nitrgeno (Herbaspirillumsp., Gluconacetiobacter sp., Azotobacter sp.) Biotecnologa microbiana, tambin se usa en medicina veter

Salud:

Bordetella pertusisClostridium tetaniCorynebacterium diptheriae

Propionebacterium sp.

Penicillium chrysogenium

Bacillus sp.Rhizopus nigricansCurvularia lunataE. coli. , Bacterias lcticas, Etc.

Alimentos:

Saccharomyces cereviciaeStreptococcus lactisLactobacillus vulgaris

Saccharomyces sp.

Acetobacter aceti

Lactobacillus sp.Streptococcus sp.Penicillium sp

Ambiental

Thiobacillus ferrooxidansAcidithiobacillus thiooxidansLeptospirillum ferrooxidans

Saccharomyces sp.

Metanognicas

Hyphomicrobium sp.Pichia pastoris.Thiobacillus thioparusDocente: Alejandra Arancibia.*

Docente: Alejandra Arancibia.

Produccin de BIOCOMBUSTIBLE la bacteriaS. degradans ha llevado a un proceso que puede hacer etanolEn BIOREMEDIACIN DE SUELOS se usa la habilidad de microbios, plantas o sus enzimas para degradar ydescontaminar distintos compuestos en suelos y tierras de naturaleza urbana e industrial.

Desechos orgnicos y Metales pesados (plomo, mercurio, cadmio)

Como agruparlos en su estudioBacterias acticas:

La actividad de las bacterias acticas se conoce desde hace siglospor la produccin de vinagre, la acetificacin de bebidas alcohlicas y el deterioro de frutos. Contaminantes de los vinos.Las acetobacterias son un cocobacilos gramnegativos, flagelos peritricos, mviles. La mayora de los gneros de esta familia soportan altas concentraciones de sacarosa, as como de sus componentes, glucosa y fructosa. Adems, muchasde ellas son capaces de crecer en presencia de cido actico Producen acidificacin cuando crecen en presencia de etanol.Algunas especies son fijadoras de Nitrgeno

Clasificacin en los aos 70 que dice que las bact. acticas pertenecen al ordenPseudomonodales, familia pseudomonodaceaeincluyendo en esta ultima dos gneros distintos al generoPseudomonasel genero GLUCONOBACTER y el ACETOBACTER que incluye a su vez tres especies importantes: Acetobacter aceti Acetobacter pasteurianusAcetobacter peroxydans Los caracteres taxomomicos mas caractersticos de cada una de ellos son los siguientes: G. Pseudomonas flagelacin polar no desarrolla a pH 4,5 No oxida el etanol a acido actico G. acetobacter flagelacin peritica desarrollo bueno a pH 4,5 oxidacin intensa etanol a ac. actico G. gluconobacter flagelacin polar desarrollo positivo a pH 4,5 oxidacin moderada etanol a ac. acetico

Bacterias del cido lctico, tambinbacterias cido lcticasycultivos lcticosSon cocos obacilos GRAM positivas, cido tolerantes, algunos en rangos depHentre 4.8 y 9.6 fermentan la lactosa con produccion de acido, anaerobias facultativas.Son organismos que no formanesporas, son inmviles,cocosobaciloscon bajo contenido deguaninay citocina, Estas son bacterias que generalmente se encuentran enplantasyproductos lcteosen descomposicinLactobacilosblgarosutilizados para la produccin casera deyogur.

Losgnerosbsicos que comprenden las BAACTERIAS LACTICAS sonLactobacillus,Leuconostoc,Pediococcus,Lactococcus, yStreptococcusas como losLactobacillalesAerococcus,Carnobacterium,Enterococcus,Oenococcus,Teragenococcus,Vagococcus, yWeisella.

Los representantes de las BAL homolcticas incluyen Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus y el grupo I Lactobacilli. A travs de la va glucoltica de Embden-Meyerhof-Parnas

Las BAL heterofermentativas utilizan la ruta de la pentosa fosfato. Las BAL obligatoriamente heterofermentativas incluyen: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y el grupo III Lactobacilli.

Grupo . thermophilic homofermentativo lactobacilliLactobacillus delbrueckiissp.bulgaricusLactobacillus acidophilusLactobacillus helveticusLactobacillus lactisGrupo . cido lctico thermophilic streptococciStreptococcus thermophilusGrupo II.- mesophilic lactococci y lactobacilliLactococcus lactisLactococcus lactis biovar diacetylactisLactococcus cremorisLeuconostoc mesenteroidesssp.cremorisLactobacillus casei, inlc.GG;Lactobacillus plantarumetc.La coleccin de "Lactina" consta de tres grupos de cepas

Estas bacterias tienen diferentes habitats, se pueden encontrar formando parte de la flora normal de las mucosas de la boca o de la vagina, y tambin se las puede encontrar en la leche

Lactobacillus bulgaricusClasificacin cientficaReino:BacteriaDivisin:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:LactobacillaceaeGnero:LactobacillusEspecie:L. delbrueckiiSubespecie:'bulgaricusNombre binomialLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (ORLA-JENSEN 1919) ROGOSA & HANSEN 1971

Lactobacilosblgarosutilizados para la produccin casera deyogur.L. acidophilusL. bulgaricusL. caseiL. delbrueckiiL. fermentumL. gasseriL. johnsoniiL. lactisL. paracaseiL. plantarumL. reuteriL. rhamnosusL. salivariusRhamnousus

Lactobacillus

Clasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:LactobacillaceaeGnero:Lactobacillus BEIJERINCK, 1901Especies

L. acetotolerans L. acidophilusL. agilis L. alimentariusL. Amylolyticus L. amylophilusL. amylovorus . animalisL. aviarius subsp. araffinosus L. aviarius subsp. aviariusL. Bifermentans L. brevisL. Buchneri L. carnisL. Casei L. catenaformeL. Cellobiosus L. collinoidesL. coryniformis subsp. Coryniformis L. coryniformis subsp. torquensL. crispatus L. curvatus subsp. curvatusL. curvatus subsp. melibiosus L. delbrueckii subsp. bulgaricusL. delbrueckii subsp. delbrueckii L. delbrueckii subsp. lactisL. Farciminis L. fermentumL. Fructivorans L. fructosusL. gallinarum L. Kefiranofaciens L. kefirgranumL. Kefiri L. kunkeeiL. Lindneri L. malefermentansL. Mali L. maltaromicusL. manihotivorans L. murinusL. oris L. panisL. Parabuchneri L. paracasei subsp. paracaseiL. paracasei subsp. Tolerans L. parakefiriL. Paraplantarum L. pentosusL. Plantarum L. pontisL. reuteri L. rhamnosusL. rogosae L. ruminisL. sakei subsp. carnosus L. sakei subsp. sakeiL. salivarius subsp. salicinius L. salivarius subsp. salivariusL. Sanfranciscensis L. gasseriL. Graminis L. hamsteriL. HelveticusL. hilgardiiL. homohiochii L. inersL. intestinalis . jenseniiL. johnsonii L. Kandleri L. sharpeaeL. Suebicus L. uliL. vaccinostercus L. vaginalisL. Vitulinus L. zeae

Identification of Lactobacilli and BifidobacteriaTable 1. Lactobacillus speciesFor further information, see reference 36.

Identification of Lactobacilli and Bifidobacteria

Leuconostoc Gram-positivasde la familiaLeuconostocaceae. tienen forma cocoide ovoide y a menudo forman cadenas. Son resistentes a la vancomicinaycatalasa-negativos (lo cual los distingue deStaphylococcus). Sonheterofermentativos, capaces de producirdextranoa partir de lasacarosa.

LeuconostocClasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:LeuconostocaceaeGnero:Leuconostoc VAN TIEGHEM1878EspeciesL. carnosum L. citreum L. durionis L. fallax L. ficulneum L. fructosum L. garlicum L. gasicomitatum L. gelidum L. inhae L. kimchii L. lactis L. mesenteroides L. oenos L. pseudoficulneum L. pseudomesenteroides

PediococcusGram-positivasde la familiaLactobacillaceae. se presentan en pares o ttradas, siendo las nicas bacterias del cido lctico con forma de coco que se dividen a lo largo de dos planos de simetra. Son bacterias homofermentativas, contaminantes de lacervezayvino. CiertosPediococcus producendiacetil, lo que proporciona un aroma amantequillaobutterscotcha algunos vinos (tales comoChardonnay) y unos pocos tipos de cerveza..

PediococcusClasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:LactobacillaceaeGnero:Pediococcus CLAUSSEN 1903EspeciesP. acidilactici P. cellicola P. claussenii P. damnosus P. dextrinicus P. ethanolidurans P. inopinatus P. parvulus P. pentosaceus P. stilesii

Lactococcuses ungnerodebacterias del cido lcticoformado por siete especies pertenecientes anteriormente al gnero Streptococcusy otras especies relacionadas.Las bacterias de este gnero son tpicamente esfricas u ovoides, de 0,5 a 1,2 m por 0,5 a 1,5 m, y se agrupan en pares o en cadenas cortas. Son no formadoras deesporasy nomviles. La especie tipo del gnero esL. lactiscon dos subespecieslactisycremoris.Lactococcusdifiere de otras bacterias cido lcticas por su tolearancia alpH,saly temperatura de crecimiento

Lactococcus Lactococcus lactisClasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:StreptococcaceaeGnero:Lactococcus SCHLEIFERET AL.1986EspeciesL. chungangensis L. fujiensis L. garvieae L. lactis L. piscium L. plantarum L. raffinolactis

ElgneroStreptococcus:cocosgrampositivos, crecen en cadenas o pares, sonoxidasa ycatalasa negativos.

Streptococcus

Clasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:StreptococcaceaeGnero:StreptococcusEspeciesS. agalactiae S. bovis S. mutans S. pneumoniae S. pyogenes S. salivarius S. sanguinis S. suis S. thermophilus S. viridans etc.

Enterococcuses ungnerodebacterias del cido lctico. Los miembros de este gnero eran clasificados comoStreptococcusGrupo Dhasta 1984 cuando los anlisis de ADN genmicos indicaron que un gnero separado era ms apropiado.SONcocoGram-positivosque se presentan en parejas (diplococos), siendo difcil distinguirlos deStreptococcus. Dos de las especies soncomensalesen el intestino humano:E. faecalisyE. faecium. El enterococo es un organismo facultativoaerobio, esto es, prefiere usaroxgeno, aunque sobrevive bien en su ausencia, exhiben gamma-hemolisis en agar sangre de cordero.

Enterococcus Enterococcus sp.Clasificacin cientficaDominio:BacteriaFilo:FirmicutesClase:BacilliOrden:LactobacillalesFamilia:EnterococcaceaeGnero:Enterococcus (EXTHIERCELIN & JOUHAUD 1903) SCHLEIFER & KILPPER-BLZ 1984EspeciesE. avium E. durans E. faecalis E. faecium

Lactobacillusacidophilus Se usa junto con el Streptococcus thermophilus en la produccin del yogur

PROBIOTICOS:Los tipos ms comunes de bacterias prebiticas son las cepas de LactobacillusyBifidobacterium, que a veces se combinan con Streptococcus thermophilus

Bifidobacteriumes ungnerodebacteriasgram-positivas,anaerbicas, no mviles, con frecuencia ramificadas. Algunas bifidobacterias se usan comoprobiticos.

Antes de1960 lasespeciesdeBifidobacteriumeran denominadas colectivamente "Lactobacillus bifidus".Las bifidobacterias es un grupo mayoritario de bacterias sacarolticas en el colon, y constituyen hastaun25%de la poblacin total en un intestino adulto, y un 95% en los recin nacidos.Son capaces de producir vitaminas del grupo B( B-1, B-2, B-6, B-12 )

B. infantis B. inopinatum B. lactis B. longum B. magnum B. merycicum B. minimum B. pseudocatenulatum B. pseudolongum B. pullorum B. ruminantium B. saeculare B. subtile B. suis B. thermacidophilum B. thermophilum

BifidobacteriumGnero:Bifidobacterium ORLA-JENSEN 1924EspeciesB. Adolescentis B. angulatum B. animalis B. asteroides B. bifidum B. boum B. breve B. catenulatum B. choerinum B. coryneforme B. cuniculi B. denticolens B. dentium B. gallicum B. gallinarum B. indicum

BifidobacteriasBifidobacterium longumBifidobacteria adolescentisBifidobacteria animalisBifidobacteria infantisBifidobacteria bifidumStreptococcus salivarisStreptococcus faeciumStreptococcus diacetylactisStreptococcus intermediusStreptococcus thermophillusSaccharomyces boulardiiMICROORGANISMOS PROBIOTICOSLactobacillus acidophilusLactobacillus casei var. ShirotaLactobacillus fermentumLactobacillus caseiLactobacillus crispatusLactobacillus reuteriLactobacillus rhamnosusLactobacillus plantarumLactobacillus bulgaricusLactobacillus cellobiosusLactobacillus curvatusLactobacillus lactis cremorisLactobacillus GG

PREBIOTICOS:Alimentos que contienen ingredientes no digeribles de la dieta que por estimular de forma selectiva el crecimiento de microorganismos o la actividad microbiana intestinal benefician la salud del consumidor fructooligosacaridos (FOS), inulinaPolmero de Fructosa en enlace ,1-2 no digerible Obtenidos de vegetales (achicoria, cebolla, etc.)

Flora intestinal estimulada: Lactobacillus, Bifidobacterium

INFECCION PORHelicobacter Pylori Patgeno Gram-negativo responsable de la gastritis, ulcera pptica y cncer gstrico. Estudios in vitro y en humanos han demostrado que los Proboticos poseen un efecto antagnico contra H. Pylori, inhibiendo su colonizacin gstrica e impidiendo el desarrollo de la patologa relacionada, inhiben la actividad de la enzima ureasa, necesaria para que el patgeno permanezca en elambientecido estomacal.

Produccin de cido Glutmico Corynebacterium glutamicum

Lafermentacin alcohlicaes unproceso fermentacinen ausencia deaire(oxgeno- O2)

Un ejemplo es elSaccharomyces cerevisiae, que se usa en la produccin devino,panycerveza. Otros miembros de este gnero son:S. bayanus, utilizado para la produccin de vino yS. boulardii, usado enmedicina. Ms recientemente, se ha demostrado que elS. boulardiies una subespecie delS. cerevisiae.

SaccharomycesClasificacin cientficaReino:FungiFilo:AscomycotaClase:HemiascomycetesOrden:SaccharomycetalesFamilia:SaccharomycetaceaeGnero:SaccharomycesEspeciesSaccharomyces bayanusSaccharomyces boullardiiSaccharomyces cerevisiaeSaccharomyces uvarum

Bebidas alcohlicas destiladasse elaboran a partir decereales fermentadosojugo de fruta fermentado. Durante elproceso de destilacin: El sabor depende del tipo y la cantidad de granos, frutas y levaduras que se utilizan. Otro factor que afecta el sabor son la fermentacin, destilacin y envejecimiento.Hay diferentestipos de bebidas alcohlicas destiladas:Whisky- Licor alcohlico destilado de grano, como el maz, el centeno o la cebada. La mayora de whiskies son una mezcla de diferentes tipos de whiskies hechos de diferentes granos y edades.Vodka- puede ser el resultado de trigo fermentado, centeno, maz o pur de papas, no es aejado, por lo tanto no tiene edad ni tiene color, olor y sabor.QUE SON LOS LICORES?Son las bebidas hidroalcohlicas dulce aromatizadas obtenidas por maceracin, infusin o destilacin de diversas sustancias vegetales naturales, con alcoholes destilados aromatizados, o por adiciones de extractos, esencias o aromas autorizados, o por la combinacin de ambos, coloreados o no, con una generosa proporcin de azcar. Teniendo un contenido alcohlico superior a los 15 llegando a superar los 50 centesimales, diferencindose de los aguardientes por mayor o menor contenido de azcares. el aguardiente, el coac y el whisky son licores

Licores- una bebida alcohlica que a menudo es dulce con una base de aguardiente, que tambin se conoce como cordial. Viene con diferentes colores y sabores, como mora, naranja, chocolate, melocotn, entre otros.Ginebra- se elabora a base de centeno y otros granos destilados aromatizados con bayas.Ron- se destila a partir de melazas de caa de azcar y luego se envejece.Brandy- destilado de vino o de zumos de frutas fermentadas que luego se aeja.Tequila es el destilado del jugo fermentado del maguey.Aquavit- licor escandinavo hecho a partir de patatas o pur de cereales y preparados con semillas de alcaravea.

Flora microbiana en el tratamiento de aguas residualesDigestin aerobiaDigestin anaerobia

1. Debe producir la sustancia de inters 2. Debe estar disponible en cultivo puro 3. Debe ser genticamente estable 4. Debe crecer en cultivos a gran escala. Debe crecer rpidamente y producir el producto deseado en un corto perodo de tiempo 5. Debe tambin crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Atributos que debe cubrir un cultivo microbiano para considerarse til en la industria de fermentaciones

6. No debe ser patgeno para el hombre o para los animales o plantas.7. Debe ser fcil de separar las clulas microbianas del medio de cultivo8.- debe ser resistente a alteraciones posibles en condiciones ambientales debido a contaminacin microbianaAtributos que debe cubrir un cultivo microbiano para considerarse til en la industria de fermentaciones

OBTENCION Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIALUna tcnica de aislamiento y seleccin efectiva debe permitir en pocos pasos, la eliminacin de los microorganismos sin valor, al mismo tiempo que la deteccin fcil de los deseados aun cuando estos se encuentren en una muy baja proporcin, en la poblacin inicial

MICROORGANISMOS QUE SE PUEDEN AISLARTermofilicosCeluloliticosMesofilicosDegradadores de hidrocarburosMicroorganismos con una alta velocidad de crecimientoProductores de antibioticosEtc.

Fuentes de obtencin de mo de inters industrial Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados.

Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin del agua y el punto de ebullicin, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire.

Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante aos hasta que el medio ambiente, ms favorable, permita el desarrollo de las clulas.

Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse as a muchas fuentes de nutricin. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos

1.- Colecciones internacionales de cultivos tipo o stock

2.- Fuentes naturales de aislamiento

3.- programas de mejoramiento de cepas

Fuentes primariasCultivos stockAmerican Type Culture Collection (ATCC)Central Bureau Voor Schimmelculture (CBS)Agricultural Research Cervice Culture Collection (NRRL)Commonwealth Mycological InstituteNational Collection of Industrial Bacteria (NCIB)Centre de Collection des Types MicrobiensNational Collection of Type Culture (NCTC)Culture Collection of Indiana Universyty

Fuentes naturales de aislamiento (fuentes secundarias) Agua negrasPosos petroleros y refinerasSuelos. (100 millones de mo por gramo de suelo) bosques, jardn etc.)Residuos vegetales en descomposicinRaces y tubrculos de vegetalesAguas dulces (lagos, Rios)Tejidos animalesResiduos de industrias alimentariasResiduos lignocelulosicosResiduos de ganadoResiduos de productos pesquerosFrutos en descomposicin Residuos de los procesos de fermentacinResiduos de plantas elaboradoras de jugos

Solo aislar aquellos microorganismos que produzcan un compuesto de beneficio econmico utilizando:

Tamizado primario Tamizado secundario

Screening (Bsqueda): Deteccin y aislamiento de microorganismos de inters industrial de entre una poblacin compleja de organismos utilizando procedimientos selectivos.

Screening Primario: Deteccin y aislamiento de microorganismos potencialmente tiles.

Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar los que tienen inters potencial de los que tienen inters real y mejorar estas cepas seleccionadas

Seleccin de MicroorganismosDeteccin y aislamiento de microorganismos de inters industrial de entre una poblacin compleja de organismos utilizando protocolos selectivos.PRIMARIOSECUNDARIO

Screening PrimarioPoblacin Mixta.Medios Selectivos. InhibidoresScreening SecundarioAnlisis de microorganismos aislados en el Screening 1. separando los de inters potencial de los de inters real y mejorar estas cepas seleccionadas. Seleccin de Microorganismos

SELECCION DE MICROORGANISMOS

Screening (Bsqueda): Deteccin y aislamiento de microorganismos de inters industrial de entre una poblacin compleja de organismos utilizando procedimientos selectivos.

Screening Primario: Deteccin y aislamiento de microorganismos potencialmente tiles.

Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar los que tienen inters potencial de los que tienen inters real y mejorar estas cepas seleccionadas.

Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una poblacin mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente tiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A este medio se le pueden aadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceramos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no creceran; o bien si queremos seleccionar hongos, aadiramos cloranfenicol, antibitico que acta frente a bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parmetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitrgeno, aireacin, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaislan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.

Muestreo y aislamiento

MuestreoTratamiento de la muestraEnriquecimientoAislamiento

Muestra de Suelo u otra:

Se toma en una bolsa estril con guantes y esptula una muestra de el suelo.

La muestra de suelo se resuspende en agua estril.

El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces.

Muestras de estas series de diluciones (100 L) se siembran sobre varios medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban.

Se aslan colonias separadas de distinta morfologa y se purifican por resiembra.

Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en medio slido listos para realizar las pruebas de seleccin.

Tcnica de siembra por difusin en placa Tcnica de vertido en placa Aislamiento directo en medio selectivo y diferencial

Parmetros a considerar: Temperatura: Hongos 20-22C;Actinomicetos 28CpH: Hongos pH cido;Bacterias pH neutro

Oxgeno: Todos los productores son aerobios

Carbono: Actinomicetos glicerol, quitina, almidn

Nitrgeno: Actinomicetos casena, arginina, asparagina; En general amonio o nitrato

Una vez crecidas las colonias que nos interesan, se utiliza un microorganismo que sea susceptible de inhibir su crecimiento por los antibiticos que queramos seleccionar: Gram +, Gram -, amplio espectro, etc. Se aslan, para ensayos posteriores, aquellas colonias que produzcan halos de inhibicin

Seleccin de microorganismos productores de vitaminas y otros factores de crecimiento Seleccin de microorganismos productores de enzimas Cmo comprobar lo que deseamos?

Cultivos puros aislados

Mejoramiento de procesosAumentar rendimientosDisminuir o eliminar co-metabolitos indeseables (ej. pigmentos, otros productos o metabolitos que se originan en la misma va, facilitar la purificacin) Estimular la utilizacin de fuentes de carbono o nitrgeno mas baratas (ej. plsticos)Alterar morfologa o funciones para obtener propiedades deseadas (ej. espuma, pellets, etc.)

Tcnicas empleadasSeleccin de microorganismos de la naturaleza empleando criterios eco-fisiolgicos (temperatura, pH, salinidad, etc.). Esta basado en tcnicas de cultivo y seleccin Seleccin directa de secuencias genticas de inters del medio ambiente (pos-genmica)MUTACION CON AGENTES MUTAGENICOS Y SELECCIN DE MUTANTESa. al azarb. sitio dirigidac. Basada en propiedades metablicas

Tcnicas empleadas4. Hibridizacin, recombinacin y seleccin de recombinantes5. Transformacin 6. Conjugacin 7. Trasduccin 8. Clonado y expresin de genes

El proceso de mejoramiento de cepas consiste en 3 ciclos interactivos de mutacin, seleccin y anlisis

MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES

Objetivos de conservar microorganismos:

1.- Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo.

2.- Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones.

3.- Mantener los cultivos sin cambios en sus caractersticas, es decir estables.

Mantenimiento bajo capa de aceite

Cubrir completamente el cultivo despus de su desarrollo en medio slido, con una capa de aceite mineral o vaselina estril.

Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente.

Desventajas:

Se sostienen que en estas condiciones los microorganismos pueden continuar reproducindose, con posibilidades de aparicin de mutantes.

Sin embargo se acepta que estas alteraciones no se observan hasta los tres aos de mantenimiento.

CONGELAMIENTOAl bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (-196C).

Existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta en la congelacion: La formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas, adems al eliminar el agua lquida por convertirse en hielo existe una concentracin de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles as como utilizar agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO 10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el proceso de congelacin de una forma rpida o gradualmente no est claro. Algunos recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta -20C para posteriormente enfriar rpidamente. Sin embargo, la descongelacin debe ser rpida.

Congelamiento:

Una baja drstica de T disminuye o anula el metabolismo.Cultivo en fase estacionaria (alta resistencia a daos).Densidad Celular Elevada.Agentes crioprotectores. (glicerol 10%, dimetilsulfxido (DMSO) 10%).Ampollas de plstico en Nitrgeno lquido.

Desventajas

Velocidades de congelamiento y descongelamiento.Como criterio general, es el enfriamiento a 1 C min-1 (ya que una rpida congelacin causa ruptura de membranas) hasta -20 C y luego un rpido descenso.

Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservacin de los microorganismos por congelacin son:

-30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la formacin de eutcticos (suspensin con distintos puntos de congelacin debido a los solutos que pueden daar a las clulas). -70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo ms utilizado en los laboratorios de microbiologa. -196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estn bien cerrados para evitar la entrada de nitrgeno lquido.

Liofilizacin:

- Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo para la conservacin de los microorganismos. -Consiste en congelar rpidamente una suspensin de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio lquido. Por lo tanto, combina la congelacion y la desecacin por sublimacin. -El sistema requiere tres componentes: mecanismo de congelacin, bomba de vaco y una trampa de agua.

Los lifilos se conservan entre 0 y 5C durante muchos aos. Para su recuperacin se resuspende el lifilo en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que estudiar, como en los casos anteriores (desecacin y congelacin), las condiciones ptimas de supervivencia de nuestro microorganismo.

Subcultivo seriadoConsiste en resembrar el microorganismo cada cierto tiempo en un medio adecuado; generalmente se utiliza agar inclinado ya que en medio slido se detectan mejor los contaminantes que en medio lquido y el hacerlo inclinado tiene por objeto el evitar la desecacin rpida del medio.

DESVENTAJAS1.- Este mtodo es vlido para cortos perodos de tiempo (semana - 15 das) por lo que deben ser resembrados con frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminacin. 2.- Adems, al mantenerlos a temperatura ambiente, pueden crecer y espontneamente cambiar sus caractersticas genticas (mutacin, prdida de plsmidos, etc.) que pueden afectar al carcter por el que fueron seleccionados.

Estos dos inconvenientes pueden subsanarse en parte en lenteciendo el metabolismo de los microorganismos al mantenerlos a 4C con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses. En microbiologa industrial hay que pensar en mantener las colecciones durante perodos de aos y no de meses, por lo tanto se utilizan otras tcnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.

DesecacinLa eliminacin del agua (deshidratacin) es un mtodo de conservacin que reduce drsticamente el metabolismo. Sin embargo, no todos los microorganismos sobreviven a estos mtodos de secado, por lo que se hace necesario aadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sdico al 10%). Una vez secos es importante mantener el producto sellado (tapn de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscpicos.

Estos mtodos de secado son particularmente tiles para conservar microorganismos productores de esporas, p.j. actinomicetos

Los soportes que se suelen utilizar son arena, suelo, slica gel previamente secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente (no utilizar autoclave y s calor seco). Sobre estos soportes se aade la suspensin de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. Tambin se pueden utilizar como soportes discos o tiras de papel, agar , discos de gelatina donde se aade la suspensin de microorganismos y posteriormente se seca al vaco evitando la congelacin, lo que se denomina L-secado (L-drying).

De los mtodos de conservacin de microorganismos proponga el mejor para cada uno:

1. Bacterias2.- Cianobacterias y cianobacterias3.- Virus 4.- Hongos filamentosos5.- Hongos levaduriformes

CONSERVACION DE DIFERENTES GRUPOS DE MICROORGANISMOS

Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no existe ningn mtodo ptimo para todos e incluso para un grupo particular de microorganismos ya que lo que funciona bien para algunos no es til para otros. No obstante, en lneas generales podemos asumir lo siguiente:

1.- Algas y cianobacterias

La mayor parte de los cultivos se han mantenido como subcultivos seriados a temperaturas entre 10 y 15C. Para crecer estos cultivos se necesita luz (fotosintticos). Algunas cianobacterias pueden conservarse bien desecadas ya que presentan formas de resistencia (akinetos). En general, las algas no aguantan bien la liofilizacin ni la desecacin. En cuanto a la congelacin los mejores resultados se obtienen con nitrgeno lquido.

2.- Bacterias

Prcticamente se han usado todos los mtodos conocidos con buenos y malos resultados, aunque en lneas generales el mejor mtodo es la liofilizacin debido a su facilidad de transporte.

3.- Virus

Se han utilizado todos los mtodos obteniendo en lneas generales baja supervivencia. Se recomienda para su conservacin durante largos perodos de tiempo el nitrgeno lquido.

4.- Hongos

La mayora de los hongos pueden conservarse por desecacin en suelo. Aunque, al igual que las bacterias, presentan una gran diversidad encontrndonos de todo.

PRUEBAS DE INDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL Morfologia microscopica Morfologia macroscopica Pruebas bioqumicas prueba de produccin del metabolito de inters PCR

PRUEBAS DE ACEPTACION O RECHAZO

Se toma un inoculo del vial o ampolleta y se hace crecer en un medio mnimo luego se hacen diluciones y se siembra, se observa la viabilidad en placa y su morfologa colonial pruebas de capacidad de produccin

Bacterias

Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido actico, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido actico. El gnero Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del gnero Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azcares originando acetona y butanol. Las bacterias del cido lctico incluyen, entre otras, las especies de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. Streptomyces su principal importancia radica en la produccin de antibiticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.

Levaduras

Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la fabricacin de pan y bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fu la primera y an hoy en da sigue siendo la ms utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.

Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico. Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son txicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.

Hongos filamentosos

Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinacin de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son tambin la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), cidos orgnicos (ctrico, lctico), antibiticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

Antibitico Organismo productorOrganismos blancoSitio o modo de accinPenicilinaPenicillium chrysogenum (H)Bacterias Gram +Sntesis de la paredCefalosporinaCephalosporium acremonium (H)Bacterias Gram + y - Sntesis de la paredBacitracinaBacillus subtilis (B)Bacterias Gram +Sntesis de la paredPolimixina BBacillus polymyxa (B)Bacterias Gram + Membrana celularAnfotericina BStreptomyces nodosus (B)HongosMembrana celularEritromicinaStreptomyces erythreus (B)Bacterias Gram +Sntesis proteicaNeomicinaStreptomyces fradiae (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaStreptomycinStreptomyces griseus (B)Bacterias Gram -Sntesis proteicaTetraciclinaStreptomyces rimosus (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaVancomicinaStreptomyces orientalis (B)Bacterias Gram +Sntesis proteicaGentamicinaMicromonospora purpurea (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaRifampicinaStreptomyces mediterranei (B)M. tuberculosisSntesis proteicaGriseofulvinaPenicillium griseofulvum (H)Hongos dermatfitosMicrotbulosTabla: Principales antibiticos obtenidos de microorganism

Antibitico Organismo productorOrganismos blancoSitio o modo de accinPenicilinaPenicillium chrysogenum (H)Bacterias Gram +Sntesis de la paredCefalosporinaCephalosporium acremonium (H)Bacterias Gram + y - Sntesis de la paredBacitracinaBacillus subtilis (B)Bacterias Gram +Sntesis de la paredPolimixina BBacillus polymyxa (B)Bacterias Gram + Membrana celularAnfotericina BStreptomyces nodosus (B)HongosMembrana celularEritromicinaStreptomyces erythreus (B)Bacterias Gram +Sntesis proteica

NeomicinaStreptomyces fradiae (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaStreptomycinStreptomyces griseus (B)Bacterias Gram -Sntesis proteicaTetraciclinaStreptomyces rimosus (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaVancomicinaStreptomyces orientalis (B)Bacterias Gram +Sntesis proteicaGentamicinaMicromonospora purpurea (B)Bacterias Gram + y -Sntesis proteicaRifampicinaStreptomyces mediterranei (B)M. tuberculosisSntesis proteicaGriseofulvinaPenicillium griseofulvum (H)Hongos dermatfitosMicrotbulos

SINCRONA DE CULTIVOSMitosis en clulas de un cultivosincronizado

SINCRONA DE CULTIVOSSe considera a un cultivo en sincrona cuando todas las clulas se encuentran en la misma fase de la curva de crecimientoTener clulas sincronizadas permite medir el parmetro deseado en todas las clulas en lugar de tener un promedio

MTODOS DE SINCRONIZACIN: Alteracin fisiolgica Ciclo de crecimiento Gradiente de sacarosa Gradiente de polietilnglicol Filtros en membrana

ALTERACIN FISIOLGICAEn el medio de cultivo se limita la cantidad de aminocidos y timina lo que afecta la sntesis de protenas y DNAEstas condiciones obligan a las clulas a disminuir algunas funciones vitalesAl regresar a las clulas a un medio de cultivo normal, casi todas reinician al mismo tiempo sus funciones normales

CICLO DE CRECIMIENTOConociendo de forma aproximada el tiempo de generacin de la clula se hacen pases sucesivos a medios de cultivo fresco

GRADIENTES4%12%De sacarosaPaquete celular en fase log5000 6000g30 40 minutosSobrenadante a emplear

El gradiente con Polietilnglicol contiene: Sacarosa Polietilnglicol (PM 8000 a 15000) PercollCon este gradiente se logran mejores resultados contando con clulas que mantienen la sincrona hasta por 5 generaciones

FILTRACIN CON MEMBRANAS (NITROCELULOSA)Se coloca en un vaso y agrega medio de cultivo, las clulas se desprenden a medida que se reproducen

En dependencia del uso que se les de al cultivo se elige el mtodo y el nmero inicial de clulasEl grado de sincrona (F) se calcula de acuerdo a la siguiente ecuacinNo = Nmero de clulas inicialesNt = Nmero de clulas despus de un ciclot = Tiempo de generacin promedioa = Tiempo en que se estabiliza el nmero de clulasSincrona perfecta:a 0Nt = 2NoF = 1Si F: 0.6 0.8 la sincrona es buena

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