Akciğer Kanserlerinin Patolojik

Değerlendirmesinde Moleküler Patolojinin Yeri

Prof. Dr. Aydanur

KargıDokuz Eylul Universitesi

Akciğer Kanserlerinin Patolojik Değerlendirmesinde Problemler ve MP’den

Beklentiler

* A.Şiddetli displazinin insitu-mikro invaziv karsinomdan ayırımı, erken tanı

* B. Prognostik değerlendirme:

1. Aynı evre ve benzer morfolojide agresif davranan

tümörleri belirleyecek biomarkerların bulunması

2. Prognozu belirlemekte kullanılmakta olan histopatolojik

sınıflandırmadan daha anlamlı sınıflandırmaların

geliştirilmesi

3. TNM...Lenf nodlarında mikrometastazların tesbiti

* C. Primer – Metastaz ayırımı

Molekuler Patoloji Neler Verebilir??

a) Prognostik olarak daha anlamlı sınıflandırma

b) Morfolojisi benzer kanserlerde prognozu belirleyen gen ve protein ürünlerinin bulunması

c) Mikrometastazların gösterilebilmesi için akciğer dokusu ve kanserlerine spesifik gen ve protein ürünlerinin bulunması

d) Akciğer kanseri patogenezini aydınlatacak, kanser gelişiminde yer alan molekuler yolaklarda rolu olan gen ve ürünlerinin bulunması

e) Tedavi ile ilişkili gen ve ürünlerinin bulunması

Karsinogenez

Proliferasyon: MI (morfoloji), PCNA, Ki-67 Onkogenler ve TSG Apoptosis: AI (morfoloji ve diğer yöntemler), Bcl-2 and BAX, Survivin, COX-2 Anjiyogenez :MVD (f-VIII,CD31, CD34), proanjiyogenik(VEGF) ve antianjiyogenik proteinler Doku invazyonu ve metastaz: Morfoloji, E-cadherin/catenin MMP-TİMMP, CD44

1) Erken tanı 2) Prognoz belirleme

Molekuler değişiklikleri göstermekte kullanılan metodlar

Spesifik mutasyonların gösterilmesi: Single strand conformational polymorphism (SSCP) Rt-PCR, PCR Genomics (cDNA microarray)

Anormal gen ürünlerinin (proteinler) gösterilmesi IHK FİSH Proteomics (microarray)

A) Erken tanı:Prekursör Lezyonlar(PL)

PL’da Molekuler Değişiklikler

Çok sayıda genetik ve epigenetik değişiklikler birikir Bir çok lokusda sırayla allel kaybı (3p, 9p, 8p, 17p-

p53 mutasyonu-) Myc and Ras up-regulasyonu, cyclin-D1

ekspresyonu, p53 immunoreaktivitesi, bcl-2 aşırı ifadesi ve DNA aneuploidy

Microsatellite alterations (MA)

* Clinics in Chest Medicine. 2002, 23(1):83-101

Resp.2005.72:313-330

Genetic dengesizlik

Tumor Supressor Gen

Protooncogene

Telomerase

Apoptosis

Angiogenesis

Balgamda AC kanserinin erken tanısı

Sitoloji:%14 sensitivite, %99 spesifisite

Nükleer imaj analizi: %45-75 sens., %90-98 spes. RT-PCR ile anormal DNA tesbiti DNA metilasyonu.. FİSH: c-myc, EGFR..%41sens, %94 spes. K-ras ve p53 mutasyonları.kansersiz hastalarda da + RNA ekstraksiyon çalışmaları..RNA çabuk yıkılır.

* Kennedy TC, Hirsch FR. Using molecular markers in sputum for the early detection of lung cancer:A review. Lung Cancer2005; 521-27.

Problemler!!

Kanser komşuluğundaki normal epitel, preneoplastik ve neoplastik epitelde de aynı genetik değişiklikler gösterilmekte

3p kaybı sigara içenlerin % 50’sinde*, MA KOAH’lı hastalarda**

Biyomarker neoplastik transformasyonu göstermede spesifik olmalı,sigara ile ilişkili değişiklikleri yansıtmamalı, kolaylıkla gösterilebilmeli ve maliyeti düşük olmalı….

** Siafakas NM et al. Microsatellite DNA instability in COPD. Chest 1999; 116:47-51

* Wistuba I et al. Molecular damage in the bronchial epithelium of current and former smokers. J Natl Cancer Inst 1997;89:1366-73

SONUÇ!!!

Prospektif çalışmalar ile invazyon-metastaz yapan ve yapmayan hastaların prekürsör lezyonlarında saptanan genetik değişiklikliklerin karşılaştırılması sonucunda anlamlı biomarker bulunabilir!!!!!

B. Prognozu belirleme :

1.Aynı evre ve morfolojideki tümörler arasında agresif davrananları belirleyecek biomarkerların bulunması

TSG inaktivasyonu – p53

P53 proteini p21, BAX, GADDA45 gbi genleri aktive ederek proliferasyonu inhibe eder, apoptozu indükler. Mutant p53 bu fonksiyonlarını kaybeder. Mutasyon proteinin yarı ömrünü uzatır ve nukleusda birikimine yol açar. Biriken p53 İHK ile gösterilir.

*43 çalışmanın meta analizi:

DNA sequence değişiklikleri: 381/1031....%37 (%25.8% -50.7)

Protein overekspresyonu :1725/3579.. %48 (%17.5% - 76.8)

Mutasyon ve protein ekspresyonu... AK: %34 ve %36

.... SHK: %52 ve% 54

DNA ve protein çalışmalarının sonucunda p53 değişiklikleri AK hastalarında kötü prognostik faktör iken SHK önemsiz bulunmuş...

• Mitsudomi T, et al. Clinic Cancer Research. 2000; 6:4055-4063.

Onkogen aktivasyonu – RAS onkogeni

RAS genleri (HRAS, KRAS, NRAS), p21 olarak adlandırılan 4 adet homolog 21 kDA proteini kodlarlar

* 43 çalışmanın meta analizi: 9 çalışma IHK: %44.6 (1548 hasta) 34 çalışma PCR:% 18.4(3779 hasta) Sağkalım sonuçları .. kötü: 9 iyi:1 önemsiz : 31 anlamsız: 2 Sonuç: KRAS AK’larda kötü prognostik faktör olabilir. Ancak

bu sonuca PCR çalışmalarında varılmıştır.

* Mascaux C, Iannino N, Martin B, et al. Br J Cancer. 2005; 92:131-139

Onkogen aktivasyonu: c-erbB family

c-erbB-1 (EGFR) c-ErbB-2 (HER2/neu) c-erB-3 /HER3 C-erB-4 /HER4

Onkogen aktivasyonu:EGFR (c-erbB-1)

*16 çalışma (2810 hasta), 13 çalışma IHK, 1PCR, 1 Northern Blot,1radiolabeled EGF IHK: %13-80 expresyon, KHDAK Tüm KHDAK’larının % 6’sı, SHK’ların % 28’i’nde gen amplifikasyonu 1 çal.: iyi prognostik faktor 3 çal.: kötü pr. faktor 12 çal.: önemsiz

11 çalışmanın (2185 hasta) verilerinin sağkalım analizi sonucunda EGFR sağkalım ilişkisi önemsiz bulunmuş.....

* Meert AP, Martin B, Delmotte P, et al. Eur Respir J. 2002; 20:975-981

Onkogen aktivasyonu:HER-2/neu (ErbB2)

* 345 evre I KHDAK ve 207 evre I-III NE AC tumorü Protein overexpression (IHK): KHDAK, 80 /345 (%23) NET, 14 / 207 (%7) Gene amplifikasyonu (FİSH): 94 immunoreaktif olgunun 7’sinde var reaktif olmayan olgularda gen amp. Yok

1) IHK için kullanılan skorlama sistemleri arasında önemli farklılık yok 2) IHK ve FİSH arasında korrelasyon yok 3) Gen ampl. / protein overexpr. klinikopatolojik parametreler ve sağ kalım ile ilişkisiz **Evre I KHDAK: 7 çalışma (1800 hasta)... 4 negatif 3 çalışma (1066 hasta)...sağ kalım için anlamsız

* Pelosi et al. Lack of prognostic implications of HER-2/neu abnormalities in 345 stage I NSCLC and 207 stage I-III neuroendocrine tumours. Int J Cancer 2005; 113:101-108.

Apoptotik İndeks

*

Bcl-2

*28 çalışma( 21KHDAK, 4KHK, 3 NET): 11 iyi, 3 kötü, 14 ilişkisiz 25 çalışma (3370hasta) KHK(4 ç.):% 71 NET(3 ç.):%55 KHDAK (21 ç.):% 35 * Hepsi IHK, genetik değişiklik olmuyor!!! * İyi prognostik faktör (paradoks??, IHK aktive-fosforile formları göstermiyor...)

* Martin B et al. British J Cancer 2003; 89;55-64*Jonathen C et al. Sem Thor. Cardovasc. Surg. 2004;16:19-27

Anjiyogenezin Karsinogenezde Rolü

Tumorün büyümesi angiogeneze bağlıdır.

Prekursor lezyonların invaziv kansere ilerlemesinde rol oynar.

Metastatik yayılımda ve metastaz alanında tümör hücrelerinin yaşaması ve çoğalmasında rol oynar.

Tümör hipoksik

ortamda 2 mm3 ten

büyük ise anjio-genez

olmadan büyüyemez.

J.Folkman

1971

Anjiogenezin Kontrolu

VEGF/VEGFR sistemiaFGF, bFGFAngiogeninAngiopoietin-1PlGF, PDGFEGF, HGF, TNF, IL-8

Thrombospondin-1Angiostatin, EndostatinAngiopoietin-2Platelet factor-4TIMP-1,-2IL-1, IL-12InterferonProtamine

+ -

Angiogenesis

Anjiogenez latent bir tümörün klinik bir tümöre dönüşmesinde bir “switch” midir?

Anjiogenez ve ilişkili proteinlerin gösterilmesi

*Biyokimyasal yöntemler*Moleküler teknikler*IHK…damarlanma (MVD)…f VIII, CD31, CD34 stereolojik yöntem!!! VEGF, bFGF

Angiogenesis(MVD)

f VIII:14 çalışma (1866 hasta), QS:52%, 6NS, 8 neg. CD34:10 çalışma (1440 hasta), QS:59% 4NS, 6 neg. CD31: 8 çalışma (1093 hasta), QS:59% 3NS, 5 neg.

T : 32 13 19 **Var olan alveoler damar çatısının kullanılımı???

* Meer AP et al. Br J Cancer 2002; 87:694-701

* Pezzella et al. Non-small cell carcinoma growth without morphological evidence of neo-angiogenesis

VEGF, bFGF

doku VEGF:15/20 çal.kötü pr. kan VEGF : 10/16 çal. kötü pr. doku bFGF: kötü,tartışmalı kan bFGF : 3/5 kötü pr.

• Delmotte P et al. VEGF and survival of patients with lung cancer: a systematic literature review and meta-analysis.Rev Mal Respir 2002;19:577-84

• Bremnes RM et al. Angiogenesis in NSCLC: The prognostic impact of neoangiogenesis and the cytokines VEGF and bFGF in tumours and blood. Lung Cancer 2006;51:143-158

Multivariate Models

D’Amico et al. Evre I AC ON: erbB-2, TSG: RB, p53, Ang.: fVIII, met: CD44 alt evre 1: 0-1, %77 alt evre 2: 2, %62 alt evre 3: 3-5, %49

D‘Amico et al. A biologic risk model for stage I lung cancer: immunohistochemical analysis of 408 patients using 10 molecular markers.J Thorac Cardiovasc Surg 1999; 117-736-43

Konu ile ilgili çalışmalarımız

* Sağol Ö, Kargı A et al. Stereologically estimated mean nuclear volume and histopathologic malignancy grading as prognostic factors of disease extent in non-small cell lung carcinoma. Pathology Research and Practise. 2000; 196: 683-689.

• Kargı A et al. Apoptosis, bcl-2 and p53 expression and their relation to tumour stage in non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Cancer Letters 1997;116: 185-189

* Kargı A et al. MUC4 expression and its relation to ErbB2 expression, apoptosis, proliferation, differentiation and tumor’s stage in NSCLCs. Accepted for publication in Pathology Research and Practise, March 2006

Konu ile ilgili çalışmalarımız

. Ulukuş Ç, Kargı A et al. Survivin,expression in non-small cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis ralated proteins, clinicopathologic prognostic factors and prognosis. Accepted for publication in Appl Immunohistochemistry Mol Morphol, 2006

. Yaren A, Öztop I, Kargı A et al., Bax, bcl-2 and c-kit expression in non-small cell lung cancer and their effects on prognosis. In press in Int J of Clinical Practise, 2006.

. Tataroğlu C, Kargı A et al. Association of macrophages, mast cells and eosinophil leukocytes with angiogenesis and tumor stage in non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Lung cancer, 2004; 43:47-54.

* Kargı A et al. CD44 expression in metastatic and non-metastatic non-small cell lung cancers. Cancer Letters 1997; 119:27-30

1. Proliferasyon ve Apoptosis

53 KHDAK...MI AK’larda evre ile ilişkili 38 KHDAK (E.I:11, E. II5, E.III:13, E.IV:9): AI ve TNM ilişkisiz 100 KHDAK : AI ve PCNA TNM ile ilişkisiz 63 KHDAK …..AI sağ kalım ilişkisiz Ki-67 sağ kalım ilişkili

* Sağol Ö, Kargı A et al. Stereologically estimated mean nuclear volume and histopathologic malignancy grading as prognostic factors of disease extent in non-small cell lung carcinoma. Pathology Research and Practise. 2000; 196: 683-689.

* Kargi et al.Apoptosis, bcl-2 and p53 expression and their relation to tumour stage in non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Cancer Letters 1997;116: 185-189

* Kargi et al. MUC4 expression and its relation to ErbB2 expression, apoptosis.., Accepted for publication in Pathology Research and Practise, March 2006.

* Ulukuş Ç, Kargı A et al. Survivin,expression in non-small cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis ralated proteins, clinicopathologic prognostic factors and prognosis. Accepted for publication in Appl Immunohistochemistry Mol Morphol, 2006

2. Apoptosis İlişkili Proteinlerbcl-2, bax and survivin(AIP)

63 KHDAK: bcl-2.. 22 (%34.9)… Sağ kalım ile ilişkisiz bax…..25 (%39.7)… Sağ kalım ile ilişkisiz survivin ……………..Sağ kalım ile ilişkisiz bcl-2/bax, surv./bax..Sağ kalım ile ilişkisiz

38 KHDAK: bcl-2 , %38, TNM ile ilişkisiz

• Ulukuş Ç, Kargı A et al. Survivin,expression in non-small cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis ralated proteins, clinicopathologic prognostic factors and prognosis. Accepted for publication in Appl Immunohistochemistry Mol Morphol, 2006

Kargi et al.Apoptosis, bcl-2 and p53 expression and their relation to tumour stage in non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Cancer Letters 1997;116: 185-189

3. TSG, p53 38 KHDAK:% 76.3 +, TNM ile ilişkisiz 63 KHDAK: %66.7 +, Sağ kalım ile ilişkisiz

* Ulukuş Ç, Kargı A et al. Survivin,expression in non-small cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis ralated proteins, clinicopathologic prognostic factors and prognosis. Accepted for publication in Appl Immunohistochemistry Mol Morphol, 2006

* Kargi et al.Apoptosis, bcl-2 and p53 expression and their relation to tumour stage in non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Cancer Letters 1997;116: 185-189

4.Onkogenler

100 KHDAK, MUC-4 ve ErbB-2 ilişkili, Her ikiside TNM ile ilişkisiz C-kit, %7/69 KHDAK, sağ kalım İY COX-2 (63 KHDAK), sağkalım ile İY HGF/c-Met (63 KHDAK), ????

Kargi et al. MUC4 expression and its relation to ErbB2 expression, apoptosis,… Accepted for publication in Pathology Research and Practise, March 2006.

Yaren A, Öztop I, Kargı A et al., Bax, bcl-2 and c-kit expression in non-small cell lung cancer and their effects on prognosis. In press in Int J of Clinical Practise, 2006.

Invazyon ve Metastaz

CD44s : CD44s ifadesi ve metastatik potansiyel arasında ters ilişki.

CD44s kaybı metastatik potansiyeli artırdığı bildirilen CDv’nin fonksiyonel eşiti?

* Kargı et al. CD44 expression in metastatic and non-metastatic non-small cell lung cancers. Cancer Letters 1997;119:27-30

SONUÇ!!! MI, Ki-67 evre ve prognoz ilişkili Apoptoz, bcl-2, bax, bcl-2/bax, survivin, survivin/bax; İlişkisiz P53; Anlamsız ErbB2, MUC4; Anlamsız C-kit, COX-2, HGF/c-met; Anlamsız Angiogenez; Anlamsız CD44s; metastaz ilişkili

B. Prognozun belirlenmesi:

2. Histolojik tiplendirme: Kullandığımız

histopatolojik sınıflandırmaya göre prognostik olarak daha anlamlı sınıflandırma??

3. TNM…lenf nodlarında mikrometastaz saptanması

Moleküler Patolojik Sınıflandırma??

Histopatolojik kriterler, patologlar arası uyum

KHK X KHDAK….95-100%

KHDAK; iyi diff.AK X SHK: 100%

az diff.AK X SHK: 50-60%??? Glandular diff.:TTF-1

Squamous diff.:p63

NE diff.:NSE,NCAM,synaptophysin,chrom…

Heterojenite

EM: Aynı hücrede farklı ayrımlaşmalar İHK, HK

Molekuler Fenotiplendirme ve Sınıflandırma

SHK: detoksifikasyon, antioksidant proteinler ve sitokeratinler ile ilişkili genler ile karekterize

AK: type II pn, Clara hücreleri, surfaktant ve küçük hava yolları ilişkili (surfactans A2 and B, mucin1, pronapsin) genler ile karekterize

BHK: Epiteliyal-mezenkimal geçiş ilişkili genler

Gen ve ürünlerinin AC karsinomları içerisinde prognostik farklılıkları saptamada değeri???

* Neoplasia. 2002;4:141-150.

Molekuler Fenotiplendirme ve Sınıflandırma

*Bhattacharjee et al. Affimetrix Genechip system, 125 AC hastası. 4 altgrup: NE, Division and proliferation, surfactant related genes, type II pnomocyte marker

**Garber et al.: cDNA array (23,200cDNAclones), 38 hasta. 3 AK altgrubu (1’inde metastatik tümör)

2 çalışmada saptanan gruplar arası farklılıklar!!

*Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:13790-5**Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:13784-9

Gene ekspresyon profili ve prognoz

Battacharje et.al.186 h.,4 AK alt tipi. Garber et al. 67 h. 3 AK alt tipi. Beer et al. 86 h. Sağ kalım-sınıflandırma, 50 gen Wigle et al. 39 h.Sağ kalım-sınıflandırma, 22 gen

Farklı grupların belirlediği sağ kalım ilişkili gen ve protein ekspresyon profilleri arasında çakışma ve farklılıklar var....

*Clinical Cancer Research. 10, 3237-3248,2004.

Prognozun belirlenmesi:3. Mikrometastazların saptanması

BT....%13 FN, %50 FP PET....%80-90 sens. and specific. Seri kesit ve IHK...pahalı ve zaman alıcı *RT-PCR..; p53 ve K-ras CK mRNA dan daha değerli.. sensitivite (%) KS1/4.... 93 lunx........ 56 muc1...... 52 CEA........ 44 PSE....... 33 CK19...... 33 Sorun: Markerların spesifisitesi ya da sensitivitesi tartışmalı... * Wallace MB et al. Accurate molecular detection of non-small cell lung

cancer metastases in mediastinal lymph nodes by endoscopic ultrasound-guided needle aspiration. Chest 2005; 127:430-437.

C) Primer- Metastaz Ayırımı

Akciğer:

TTF-1+, %75 AK, %100 KHK,

% 50 BHNEK

CK7+, CK20-:AK, CK7-, CK20+: Kolon PSA, HMB45-Melan-A, LCA…..

Sorunlar!!!! Materyal hazırlanışı, teknikler, istatistik metodlarda

standardizasyon?? En optimal analiz? Tumor ve stroma, ya da yalnız tumor

hücreleri?? Analiz de tercih edilecek olan? a)Gen ekspresyon profili: pahalı, veri analizi kompleks,

bir çok disiplinin zamanlı koordinasyonu gerekli (biostaticians, clinicians, pathologists, cell biologists…), etik sorunlar…

b)Gen ürünlerinin IHK ya da FISH ile analizi?

Sonuç

Progresyon gösterme kapasitesindeki prekürsör lezyonu saptayacak biyomarker araştırmaları sürmekte.

Akciğer kanseri gelişiminde rol alan major gen ve protein ürünlerinin prognostik önemi tartışmalı

Standardize (hasta populasyonu, materyal cinsi, teknikler) edilmiş, prospektif çalışmalara gereksinim var…