AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN PACAR KUKU (Lawsonia inermis L.) DAN BIOAUTOGRAFI TERHADAP

Bacillus subtilis DAN Shigella sonnei

NASKAH PUBLIKASI

Oleh : DYAH AYU NOVIA PRATIWI

K100090124

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

SURAKARTA 2014

2

1

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN PACAR KUKU (Lawsonia inermis L.) DAN BIOAUTOGRAFI TERHADAP Bacillus subtilis DAN

Shigella sonnei

ANTIBACTERIAL ACTIVITY ETHANOLIC EXTRACT OF PACAR KUKU LEAF (Lawsonia inermis L.) AND BIOAUTOGRAPHY AGAINST Bacillus subtilis

AND Shigella sonnei

Dyah Ayu Novia Pratiwi*, Ratna Yuliani

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. Ahmad Yani, Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102

*Email: Dyah2791@gmail.com

ABSTRAK

Ekstrak daun pacar kuku (Lawsonia inermis L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram negatif maupun Gram positif. Daun pacar kuku mengandung lawson (2-hidroksi, 1,4 naftokuinon), berbagai glikosida fenolik, flavonoid, kumarin, dan steroid (sitosterol), lemak, resin, dan henna-tanin. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pacar kuku dan mengetahui golongan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Ekstrasi daun pacar kuku dilakukan menggunakan metode maserasi dengan penyari etanol 70%. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku menggunakan metode difusi (Kirby-Bauer) dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk. Identifikasi senyawa menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak kloroform:etanol (9:1) v/v dan fase diam silika GF254. Uji bioautografi kontak dilakukan untuk mengetahui senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Hasil ekstraksi menghasilkan ekstrak kental berwarna coklat kemerahan dengan rendemen sebanyak 22,53%. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku yang dilakukan terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei menunjukkan aktivitas antibakteri yang paling besar pada konsentrasi 4000 µg/disk dengan membentuk zona radikal masing-masing 9,3±0,3 mm dan 10,8±0,3 mm. Hasil analisis KLT dan bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun pacar kuku mengandung senyawa fenol, kumarin, naftokinon, antrakinon, flavonoid, triterpenoid, dan steroid yang memiliki aktivitas antibakteri.

Kata kunci : Pacar kuku (Lawsonia inermis L.), Bacillus subtilis, Shigella sonnei, antibakteri.

ABSTRACT

Henna leaf extract (Lawsonia inermis L.) have antibacterial activity against Gram negative and Gram positive bacteria. Henna leaves contain lawsone (2-hydroxy, 1,4 napthoquinone), various phenolic glycosides, flavonoids, coumarin, and steroids (sitosterol), fats, resins, and henna-tannins. The purpose of this study was to determine the antibacterial activity of the ethanol extract of leaves of henna and class of compounds that have antibacterial activity against Bacillus subtilis and Shigella sonnei. Henna leaves macerated with ethanol 70%. Antibacterial activity of the extract was tested with diffusion method (Kirby-Bauer) by measuring the diameter of inhibition zone. Identification of compounds was carried of by thin layer chromatography with a mobile phase of chloroform: ethanol (9:1) v/v and stationary phase of silica GF254. Contact bioautografi

2

test was performed to determine compounds that have antibacterial activity. Extraction yielded reddish brown viscous extract with a yield as 22.53%. Reset of antibacterial activity test of 70% ethanol extract of leaves of henna against Bacillus subtilis and Shigella sonnei showed that the greatest antibacterial activity is extract with concentration of 4000 ug/disk with diameter zone inhibition of 9.3±0.3 mm and 10.8±0.3 mm respectively. TLC analysis and bioautografi results showed that of leaves of henna contains phenolic compounds, coumarin, napthoquinone, anthraquinone, flavonoids, triterpenoids, and steroids that have antibacterial activity.

Keywords : Henna (Lawsonia inermis L.), Bacillus subtilis, Shigella sonnei, antibacterial. PENDAHULUAN

Tanaman herbal masih merupakan pilihan utama yang digunakan dalam pengobatan di

beberapa belahan dunia (Al-Rubiay et al., 2008). Metabolit sekunder yang dihasilkan

tanaman telah diakui memiliki banyak aktivitas farmakologi seperti tanaman pacar kuku

(Lawsonia inermis L.) (Rahmoun et al., 2013). Penyakit yang sering diobati dengan

tanaman herbal salah satunya adalah infeksi yang disebabkan oleh bakteri (Borade et al.,

2011). Dua bakteri yang dapat menyebabkan penyakit antara lain Bacillus subtilis dan

Shigella sonnei.

Bacillus subtilis adalah bakteri yang mengkontaminasi makanan sehingga dapat

menyebabkan keracunan makanan (Constantin et al, 2008). Shigella sonnei merupakan

bakteri Gram negatif penyebab utama penyakit diare dan Shigellosis (Ranjbar et al., 2008).

Alcoba-florez et al. (2005) mengungkapkan bahwa 69% dari semua infeksi dan 61%

kematian yang terkait Shigella sp. terjadi pada anak usia < 5 tahun.

Ekstrak metanol, ekstrak air, dan ekstrak kloroform daun pacar kuku dapat

menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan

Pseudomonas aeruginosa (Saadabi, 2007). Ekstrak air dan ekstrak alkohol daun pacar

kuku terbukti memiliki aktivitas antibakteri dengan KHM (Kadar Hambat Minimum) 8–64

mg/mL terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococus faecalis and

Pseudomonus aeruginosa (Al-kurashy et al., 2011).

Daun pacar kuku mengandung pewarna utama lawson (2-hidroksi, 1,4 naftokuinon)

dengan konsentrasi 1,0–1,4% (Jiny et al., 2010), flavonoid, kumarin, dan steroid (Rajwar

& Khatri, 2011). Skrining fitokimia yang dilakukan Raja et al. (2013) terhadap ekstrak

daun pacar kuku menemukan kandungan senyawa glikosida, fitosterol, steroid, tannin, dan

flavonoid. Berdasarkan penelitian tersebut dilakukan pengujian ekstrak etanol daun pacar

kuku terhadap bakteri Bacillus subtilis dan Shigella sonnei, serta uji bioautografi untuk

mengetahui golongan senyawa aktif yang bertanggung jawab sebagai antibakteri.

3

METODE PENELITIAN

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas (Pyrex), alat timbang

(Ohaus), blender (Miyako), vacuum rotary evaporator (Heidolph), lampu spiritus/bunsen,

mikropipet (Socorex), autoklaf (My Life), shaker incubator (New Brunswick), oven

(Memmert), Laminar Air Flow (Astari Niagara), inkubator (Memmert), lampu UV 256 nm

dan 366 nm, mikroskop (Olympus), bejana kromatografi dan tutup bejana (Pyrex).

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Bacillus subtilis dan

Shigella sonnei yang diperoleh dari Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah

Surakarta; daun pacar kuku yang diperoleh dari Desa Tinapan, Kecamatan Todanan,

Kabupaten Blora, Jawa Tengah; disk kloramfenikol; etanol 70%; akuades; media Mueller

Hinton (MH) (Oxoid), Brain Heart Infussion (BHI) (Oxoid), Kligler Iron Agar (KIA)

(Oxoid), Lysine Iron Agar (LIA) (Oxoid), Motility Indole Ornithine (MIO) (BD),

Simmon’s sitrat (Oxoid); cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D; DMSO

(dimetilsulfooxide) 100%; blue tips, yellow tips; silika gel GF254, pereaksi deteksi KLT

(sitroborat, FeCl3, KOH 10% dalam etanol, dan Liebermann-Burchard).

3. Jalannya Penelitian

a. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi, Fakultas Keguruan dan

Ilmu Pendidikan Biologi, Universitas Muhammadiyah Surakarta dengan mempelajari

morfologi tumbuhan pacar kuku kemudian dibandingkan dengan tumbuhan yang sudah

dikenal identitasnya menggunakan kunci determinasi atau mencocokkannya dengan buku

acuan.

b. Ekstraksi

Serbuk daun pacar kuku ditimbang sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan

direndam dalam etanol 70% sebanyak 3750 mL selama 5 hari dan diaduk secara berkala.

Hasil rendaman disaring dengan corong Buchner dan kertas saring, kemudian ampasnya

diremaserasi selama 5 hari. Hasil maserasi diuapkan dengan evaporator rotary pada suhu

50°C. Ekstrak kental daun pacar kuku dihasilkan dari penguapkan di atas penangas air

pada suhu ≤ 60°C. Hasil ekstraksi ditempatkan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam

lemari pendingin pada suhu 4°C.

4

c. Identifikasi Bakteri uji

Identifikasi bakteri dilakukan dengan cara pengecatan Gram (Gram A, B, C, dan D)

dan uji biokimiawi. Bakteri Bacillus subtilis diidentifikasi dengan media KIA, LIA,

Simmon’s sitrat, dan uji katalase. Bakteri Shigella sonnei diidentifikasi dengan media KIA,

LIA, dan MIO.

d. Pembuatan Stok dan Seri Konsentrasi

Stok 40% dibuat dengan menimbang 400 mg ekstrak kental daun pacar kuku

kemudian ditambah pelarut DMSO 100% sampai 1 mL. Dari larutan stok dibuat seri

konsentrasi 20%, 10%, dan 5% menggunakan metode pengenceran.

e. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Kirby-Bauer

Bakteri diambil 200 µL dari suspensi bakteri 1,5 x 108 CFU/mL, diratakan pada media

MH dengan spreader glass steril, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Larutan stok

ekstrak etanol daun pacar kuku konsentrasi 40%, 20%, 10%, dan 10% diambil sebanyak

10µL, kemudian dimasukkan pada disk steril ukuran 6 mm sehingga setiap disk

mengandung ekstrak sebesar 4000, 2000, 1000, dan 500 µg. Disk kloramfenikol (kontrol

positif), disk ekstrak etanol daun pacar kuku, dan disk DMSO (kontrol negatif) diletakkan

pada media sambil ditekan perlahan dan diberi jarak antara satu disk dengan disk yang

lain. Kultur diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C, setelah itu diameter zona

hambat yang terbentuk diukur.

f. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Fase diam silika gel GF254 terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 105ºC–110ºC selama

1 jam. Ekstrak etanol daun pacar kuku konsentrasi 20% ditotolkan sebanyak ±7 µL pada

fase diam, kemudian dielusi dengan fase gerak kloroform : etanol (9 : 1). Plat KLT yang

sudah dielusi dideteksi pada sinar UV 254 nm dan UV 366 nm. Bercak diidentifikasi

dengan pereaksi semprot KOH 10% dalam etanol (Naftokuinon dan kumarin), FeCl3

(fenol), pereaksi semprot sitroborat (flavonoid), Liebermann-Buchard

(triterpenoid/steroid).

g. Uji Bioautografi

Lempeng plat KLT yang sudah dielusi diangin-anginkan, kemudian diletakkan dan

ditekan perlahan pada media MH yang telah diinokulasi bakteri dan dibiarkan selama 20

menit, kemudian plat KLT diangkat. Media diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam

dan diamati zona jernih yang muncul serta dihitung Rf yang dimiliki zona jernih tersebut.

5

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk menetapkan kebenaran tanaman yang

digunakan dalam penelitian. Hal ini dilakukan untuk menghindari kesalahan terhadap

tanaman yang digunakan. Hasil determinasi berdasarkan literatur yang digunakan

menunjukkan bahwa tanaman yang diidentifikasi adalah benar tanaman Lawsonia inermis

Linn (Pacar kuku).

2. Ekstraksi

Ekstraksi daun pacar kuku dilakukan dengan metode maserasi. Metode maserasi

digunakan karena menggunakan peralatan yang sederhana sehingga dapat diterapkan di

semua laboratorium, pengerjaan yang mudah, dan tidak merusak senyawa yang tidak tahan

terhadap pemanasan. Pelarut etanol 70% dapat menarik senyawa-senyawa polar yang

terkandung dalam daun pacar kuku seperti alkaloid, kuinon, terpenoid sampai senyawa

nonpolar seperti beberapa golongan flavonoid, dan triterpen (Harborne, 1996; Hidayatulla

et al., 2011). Hasil ekstraksi dari 500 gram daun pacar kuku dengan 3750 mL penyari

etanol 70% menghasilkan rendemen sebanyak 22,53%. Rendemen yang dihasilkan adalah

ekstrak kental berwarna coklat kemerahan.

3. Identifikasi Bakteri

Hasil pengecatan yang diamati dengan mikroskop perbesaran 1000 x menunjukkan

bahwa Bacillus subtilis adalah bakteri berbentuk batang, berwarna ungu, dan berpasangan

atau tunggal. Sedangkan Shigella sonnei adalah bakteri berbentuk batang pendek,

bergerombol dan susunannya tidak beraturan (Tabel 1). Hasil pengecatan Gram terhadap

Bacillus subtilis dan Shigella sonnei menunjukkan sesuai teori bahwa Bacillus subtilis

adalah bakteri Gram positif, berbentuk batang, dan memiliki susunan berpasangan atau

tunggal. Sedangkan Shigella sonnei adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang, dan

memiliki susunan yang bergerombol atau tidak beraturan (Dwipayana & Ariesyadi, 2009;

Jawetz et al., 2005; Radji, 2011).

Uji biokimia terhadap Bacillus subtilis menggunakan media KIA, MIO, Simmon’s

sitrat, dan uji katalase. Sedangkan Shigella sonnei diuji menggunakan media KIA, LIA,

dan MIO. Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri Bacillus subtilis pada media

KIA memperlihatkan bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning

yang menunjukkan Bacillus subtilis dapat memfermentasi glukosa tetapi tidak

6

memfermentasi laktosa, tidak memproduksi gas dan H2S dengan ditunjukkan tidak

terbentuknya gelembung udara dan warna hitam pada media. Tabel 1. Hasil Pengecatan Gram terhadap bakteri Shigella sonnei dan Bacillus subtilis

Bakteri Pengamatan Pustaka

(Dwipayana & Ariesyadi, 2009;

Jawetz et al., 2005; Radji, 2011).

Keterangan

Bentuk Warna Bentuk Warna

Bacillus subtilis

Batang, berpasangan/tunggal

Ungu Batang, berpasangan/tunggal

Ungu Gram positif

Shigella Sonnei

Batang, tidak beraturan

Merah

Batang, bergerombol atau tidak beraturan

Merah

Gram negatif

Hasil identifikasi menggunakan media Simmon’s sitrat menunjukkan bagian miring

berwarna biru yang menunjukkan Bacillus subtilis dapat menghidrolisis sitrat. Hasil

identifikasi menggunakan media MIO menunjukkan bahwa Bacillus subtilis termasuk

bakteri yang dapat bergerak dengan ditunjukkan adanya kekeruhan dan tidak adanya bekas

tusukan pada media. Selain itu Bacillus subtilis dapat mendekarboksilasi ornitin yang

ditunjukkan dengan warna media yang tetap berwarna ungu tetapi tidak memproduksi

indol dengan tidak terbentuknya cincin berwarna merah ketika ditetesi dengan pereaksi

Kovac. Pada uji katalase terbentuk gelembung udara setelah ditetesi larutan hidrogen

peroksida pada kultur Bacillus subtilis. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis dapat

mendetoksifikasi hidrogen peroksida.

Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri Shigella sonnei pada media KIA

menunjukkan bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning. Hal ini

menunjukkan bahwa Shigella sonnei dapat memfermentasi glukosa tetapi tidak dapat

memfermentasi laktosa. Sedangkan tidak terbentuknya gelembung udara, dan warna hitam

pada media menunjukkan bahwa Shigella sonnei tidak memproduksi gas dan H2S.

Identifikasi menggunakan media LIA menunjukkan bagian miring berwarna ungu, bagian

tegak barwarna kuning, tidak terbentuk gelembung udara, dan warna hitam pada dasar

media. Hal ini menunjukkan bahwa Shigella sonnei kurang mendekarboksilasi lisin, tidak

memproduksi gas dan H2S. Sedangkan identifikasi menggunakan media MIO

menunjukkan pertumbuhan bakteri hanya di sepanjang tusukan ketika diinokulasi, adanya

perubahan warna pada media dari ungu menjadi kuning-ungu memudar, dan tidak

terbentuk cincin berwarna merah setelah ditetesi pereaksi Kovac. Hal ini menunjukkan

bahwa Shigella sonnei termasuk bakteri yang non motil atau tidak dapat bergerak, dapat

7

mendekarboksilasi ornitin, dan tidak memproduksi indol. Hasil uji biokimia menunjukkan

bahwa bakteri yang diidentifikasi adalah benar Bacillus subtilis dan Shigella sonnei

(DIFCO & BBL, 2013; Hart & Shears, 1997; Koplan et al., 1999).

4. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku

Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pacar kuku terhadap bakteri Bacillus

subtilis dan Shigella sonnei dengan menggunakan metode difusi Kirby-Bauer. Parameter

yang diamati adalah diameter zona hambat rata-rata yang terbentuk disekitar disk,

kemudian ditentukan zona radikal dan zona irradikal. Seri konsentrasi ekstrak etanol daun

pacar kuku diresapkan ke dalam disk berukuran 6 mm sebanyak 10 µL, sehingga masing-

masing disk mengandung ekstrak berturut-turut sebesar 4000, 2000, 1000, dan 500 µg.

Kloramfenikol dipilih sebagai kontrol positif dan DMSO (Dimethyl sulfoxide) 100%

dipilih sebagai kontrol negatif. Tabel 2. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku terhadap Bakteri Bacillus subtilis

dan Shigella sonnei

Bakteri

Bahan uji dan Diameter Zona Hambat (mm)

Ekstrak etanol daun pacar kuku 500µg/disk

Ekstrak etanol daun pacar kuku

1000µg/disk

Ekstrak etanol daun pacar kuku

2000µg/disk

Ekstrak etanol daun pacar kuku

4000µg/disk

DMSO 100 % Kloramfenikol 30 µg

Bacillus subtilis

Shigella sonnei

6,0±0

6,0±0

6,0±0

6,0±0

7,8±0,3

8±0

9,3±0,3

10,8±0,3

6,0±0

6,0±0

20±0

15±0

Keterangan : diameter zona hambat sudah termasuk diameter disk (6 mm)

Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun pacar kuku memiliki

aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Hal ini dibuktikan

adanya zona hambat pada pengujian terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei.

Penghambatan terbesar ditunjukkan terhadap Shigella sonnei pada konsentrasi

4000µg/disk dengan diameter zona hambat rata-rata 10,8±0,3 mm. Pada konsentrasi yang

sama yaitu 4000µg/disk diameter zona hambat terhadap Bacillus subtilis hanya 9,3±0,3

mm. Penghambatan terkecil ditunjukkan pada konsentrasi 2000µg/disk terhadap Bacillus

subtilis dengan diameter rata-rata 7,8±0,3 mm. Uji pada konsentrasi yang sama yaitu

2000µg/disk terhadap Shigella sonnei menunjukkan diameter zona hambat 8±0 mm. Pada

konsentrasi yang lebih kecil yaitu 1000µg/disk dan 500µg/disk tidak menunjukkan

aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei (Tabel 2). Menurut Das

& Mondal (2012) ekstrak etanol daun pacar kuku bersifat bakterisida (membunuh bakteri)

terhadap bakteri yang diujikan. Hal ini sejalan dengan hasil uji antibakteri terhadap

8

Bacillus subtilis dan Shigella sonnei yang menunjukkan adanya zona radikal yaitu zona

jernih disekitar disk yang tidak ditemukan pertumbuhan bakteri.

Ekstrak etanol daun pacar kuku memiliki aktivitas yang lebih besar terhadap Shigella

sonnei jika dibandingkan dengan Bacillus subtilis. Hal ini disebabkan perbedaan

komponen dan susunan dinding sel bakteri Gram positif (Bacillus subtilis) dan Gram

negatif (Shigella sonnei). Dinding sel bakteri Gram positif memiliki struktur peptidoglikan

berlapis tunggal dan mempunyai kandungan lipid yang rendah yaitu berkisar 1–4%

(Pelczar & Chan, 1988). Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang bersifat lebih

polar sehingga akan sulit ditembus oleh senyawa antibakteri yang bersifat non polar.

Sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif memiliki susunan dinding sel yang lebih

komplek yang memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi yaitu 11–22% dan akan lebih

bersifat non polar sehingga akan lebih mudah ditembus oleh senyawa antibakteri yang

bersifat non polar (Hidayathulla et al., 2001; Jawetz et al., 2001; Pelczar & Chan, 1988).

Selain itu Bacillus subtilis dapat memproduksi kapsul asam D-glutamat yang mengelilingi

sel dan melindungi bakteri dari pengaruh lingkungan yang membahayakan, seperti

antibakteri. Sehingga Bacillus subtilis lebih tahan terhadap senyawa antibakteri (Pratiwi,

2008).

Ekstrak metanol daun pacar kuku memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bacillus

subtilis dan Pseudomonas aeruginosa dengan masing-masing diameter zona hambat 14

mm dan 16 mm konsentrasi 10mg/sumuran (Saadabi, 2007). Hasil penelitian tersebut sama

dengan hasil uji antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku terhadap Bacillus subtilis

dan Shigella sonnei jika dilihat dari kemampuan antibakteri yang lebih besar terhadap

bakteri Gram negatif daripada bakteri Gram positif. Perbedaan besarnya diameter zona

hambat uji aktivitas antibakteri dari masing-masing ekstrak daun pacar kuku salah satunya

disebabkan cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi daun pacar kuku berbeda.

Cairan penyari mempengaruhi banyak atau sedikitnya kandungan senyawa dalam ekstrak

daun pacar kuku yang memiliki aktivitas antibakteri (Kawo & Kwa, 2011). Selain itu

faktor yang mempengaruhi ukuran daya hambat pada metode difusi cakram adalah

kepekaan inokulum, waktu inkubasi, ketebalan media agar, pengaturan jarak cakram, dan

komposisi media (WHO, 2003 cit Darsana, 2012). Pada percobaan yang dilakukan Saadabi

(2007) media yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri adalah nutrient broth,

sedangkan pada uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku menggunakan

media Mueller Hinton.

9

5. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa

ekstrak etanol 70% daun pacar kuku. Fase gerak yang digunakan untuk memisahkan

senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak adalah kloroform : etanol (9 : 1) v/v dan

fase diam yang digunakan adalah silika GF254. Ekstrak daun pacar kuku yang ditotolkan

pada plat silika menggunakan konsentrasi 40% dan penotolan dilakukan menggunakan

pipa kapiler. Tabel 3. Hasil KLT ekstrak etanol 70% daun pacar kuku dengan fase gerak kloroform:etanol (9:1) v/v

dengan jarak pengembangan 5 cm

Rf

Bercak Sebelum Di semprot

Deteksi Pereaksi Semprot

Golongan senyawa Sinar UV (nm) KOH 10% dalam etanolik

FeCl3 Sitroborat LB

254 366 Vis UV 366nm

Vis UV 366nm UV 366nm

0,22 − − − − − − F.Kuning Sterol jenuh/triterpen jenuh

0,34 − − − − − − F.Kuning Sterol jenuh/ triterpen jenuh

0,48 Pem − Kuning Pem Hitam F.Ku-Hi F.Hijau Naftokinon, Fenol, Flavonoid, Steroid

0,54 Pem F.Hi-Bi Merah F.Biru −

F.Biru F.Merah Antrakinon, Triterpenoid,

Kumarin 0,64 Pem − − − − − F.Hijau Steroid

0,68 Pem F.Hi-Bu − − − F.Kuning F.Biru Flavonoid, Steroid

0,74 Pem F.Hi-Bi − F.Biru − − F.Coklat Kumarin

0,82 Pem F.Hi-Ku − − − F.Biru − − 0,88 Pem Merah

muda − − − F.Biru − −

0,96 − F.Hi-Ku − − − F.Biru − −

Keterangan Pem : Pemadaman LB : Lieberman-Burchard F: Fluoresensi Vis: Visual

Hi-Bi: Hijau kebiruan Hi-Ku: Hijau Kekuningan Ku-Cok: Kuning kecoklatan Ku-Hi: Kuning kehijauan

Senyawa naftokuinon dan senyawa kumarin dideteksi dengan pereaksi semprot KOH

10% dalam etanol. Pengamatan secara visual yang menunjukkan warna kuning, orange,

dan coklat-violet adalah senyawa derivat naftokuinon (Kotakemori & Okada, 1966).

Sedangkan pengamatan secara visual berwarna merah adalah antrakinon. Pengamatan pada

UV366nm berfluoresensi biru adalah senyawa kumarin (Wagner & Bladt, 1996). Senyawa

fenol dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl3 dan secara visual menunjukkan warna hijau,

merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat (Harborne, 1996). Senyawa flavonoid dideteksi

pereaksi semprot sitroborat. Pengamatan dilakukan setelah plat yang sudah disemprot

dipanaskan selama 5-10menit pada suhu 100°C berfluoresensi hijau-kuning pada UV366

(Alam et al., 2012). Pereaksi Liebermann-Buchard digunakan untuk mengidentifikasi

10

senyawa triterpenoid, steroid, dan sterol jenuh/triterpen jenuh. Pengamatan dilakukan

setelah plat KLT yang sudah disemprot dipanaskan selama 5–10 menit pada suhu 100°C.

Pengamatan dilakukan pada UV366 senyawa triterpenoid akan berfluoresensi merah, pink,

atau ungu. Senyawa steroid akan berfluoresensi biru atau biru-hijau. Sedangkan senyawa

sterol jenuh/ triterpen jenuh akan berfluoresensi kuning pucat (Farnsworth, 1966).

Berdasarkan uji KLT dan identifikasi dengan beberapa pereaksi semprot dapat diketahui

bahwa ekstrak etanol 70% daun pacar kuku mengandung senyawa antrakinon, naftokinon,

fenol, flavonoid, kumarin, triterpenoid, steroid, dan sterol jenuh/ triterpen jenuh.

6. Uji Bioautografi

Metode bioautografi yang digunakan dalam penelitian ini adalah bioautografi kontak

yaitu dengan cara meletakkan plat KLT yang sudah dielusi fase gerak pada media yang

sudah diinokulasi dengan bakteri uji. Senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri

ditandai dengan zona jernih yang tidak ditumbuhi bakteri. Berdasarkan hasil bioautografi

terhadap bakteri Bacillus subtilis terlihat zona jernih pada Rf 0,48; 0,54; 0,64; dan 0,96.

Sedangkan pada bakteri Shigella sonnei terlihat zona jernih pada Rf 0,54; 0,64; 0,74; dan

0,96.

Menurut hasil identifikasi senyawa menggunakan pereaksi semprot Rf 0,48

mengandung senyawa naftokinon, fenol, flavonoid, steroid. Pada Rf 0,54 teridentifikasi

adanya senyawa antrakinon, triterpenoid, kumarin. Kemudian pada Rf 0,64 teridentifikasi

senyawa steroid, pada Rf 0,74 teridentifikasi adanya senyawa kumarin. Senyawa pada Rf

0,96 yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei

adalah senyawa yang memiliki gugus karbonil, fenolik, atau gugus lain yang setidaknya

memiliki 2 ikatan rangkap terkonjugasi dan memiliki gugus kromofor yang terikat oleh

ausokrom (-OH, -O, -NH2, -OCH3) (Gandjar & Rohman, 2012; Wagner et al., 1984 cit

Iriani et al., 2011) tetapi belum teridentifikasi pada analisis KLT dengan pereaksi semprot

yang digunakan.

Mekanisme antibakteri senyawa fenol dan kumarin adalah masuk kedalam sel bakteri

dengan cara memutuskan ikatan peptidoglikan pada dinding sel dan merusak ikatan

hidrofobik dari membran sel. Sehingga terjadi perubahan permeabilitas dinding sel yang

akan menghambat pertumbuhan sel atau matinya sel (Pelczar & Chan, 1988; Pepeljnjak et

al., 2005 cit Suliantari dkk, 2008). Senyawa naftokinon dan antrakinon termasuk senyawa

fenolik sehingga mekanisme sebagai antibakteri mirip dengan mekanisme senyawa fenolik

yaitu mendenaturasi protein (Fitri, 2005 cit Kaneswari et al., 2013). Senyawa steroid

11

memiliki aktivitas antibakteri dengan mengikat membran lipid bakteri sehingga

menyebabkan kebocoran pada liposom (penyusun dinding sel bakteri) (Shihabudeen,

2010). Mekanisme antibakteri senyawa flavonoid adalah dapat berinteraksi dengan struktur

protein di dalam dinding sitoplasma bakteri yang menyebabkan rusaknya permeabilitas

dinding sel bakteri. Selain itu gugus hidroksi yang terdapat pada flavonoid menyebabkan

perubahan komponen organik dan transport nutrisi yang berefek toksik pada bakteri (Sabir,

2005). Senyawa triterpenoid memiliki aktivitas antibakteri dengan merusak membran sel

bakteri karena senyawa triterpenoid bersifat lipofilik. Sehingga dapat melisiskan membran

sel dan koagulasi sitoplasma dari sel bakteri (Cowan, 1999). Berdasarkan uji bioautografi

senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak etanol 70% daun pacar kuku

terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei adalah antrakinon, naftokinon, flavonoid,

triterpenoid, steroid, dan kumarin.

KESIMPULAN DAN SARAN

a. Kesimpulan

Ekstrak etanol 70 % daun pacar kuku memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri

Bcillus subtilis dan Shigella sonnei pada konsentrasi 2000 µg/disk dan 4000 µg/disk.

Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada ekstrak etanol 70% daun pacar kuku

adalah senyawa antrakinon, naftokinon, fenol, kumarin, triterpenoid, steroid, sterol

jenuh/triterpen jenuh, dan flavonoid.

b. Saran

Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam

daun pacar kuku dan dilakukan optimasi fase gerak yang lebih maksimal terhadap ekstrak

etanol daun pacar kuku. Selain itu perlu dilakukan identifikasi senyawa yang terkandung

dalam ekstrak etanol 70% daun pacar kuku dengan pereaksi semprot yang lebih banyak

untuk mengetahui senyawa-senyawa yang belum teridentifikasi. Perlu dilakukan penelitian

lebih lanjut dengan metode dilusi untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) dan

KBM (Kadar Bunuh Minimum) dari ekstrak daun pacar kuku.

DAFTAR PUSTAKA

Alam, G., Mufidah, Massi, N., Kurnia, R.T.F., Rahim, A. & Usmar, 2012, Skrining Komponen Kimia dan Uji Aktivitas Mukolitik Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) Terhadap Mukosa Usus Sapi secara In vitro, Majalah Farmasi dan Farmakologi, 16 (3), 123-126.

12

Alcoba-Flozen, J., Perez-Roth, E., Gonzalez-Linares, S. & Mendez-Alvarez, M., 2005, Outbreak of Shigella sonnei in Rural Hotel in Lagomera, Canary Insland, Spain, International Microbiology, 8, 133-136.

Al-Kurashy, H.M.K., Al-windy, S.A. & Al-buhadilly, A.K., 2011, Evaluation the

Antibacterial Activity of Lawsonia inermis: In vitro Study, Iraqi Journal of Science, 52 (1), 16-19.

Al-Rubiay, K.K., Jaber, N.N., Al-Mhaawe B.H. & Alrubaiy, L.K., 2008, Antimicrobial

Efficacy of Henna Extracts, Oman Medical Journal, 23 (4), 253-256. Apetroaie-Constantin, C., Mikkola, R., Andersson, M.A., Teplova, V., Suominen, I. &

Johansson, T., et al, 2009, Bacillus subtilis and B. mojavensis strains Connected to Food Poisoning Produce The Heat Stable Toxin Amylosin, Journal of Applied Microbiology, 1976-1985.

Borade, A.S., Kale, B.N. & Shete, R.V., 2011, A Phytopharmacological Review on

Lawsonia inermis (Linn.), International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 2, 536-541.

Cowan, M. M., 1999, Plants products as antimicrobial agents, Clinical Microbiology

Reviews, 12 (4), 564-582. Darsana, I.G.O., 2012, Potensi Daun Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steenis)

dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Escherichia Coli secara In Vitro, Indonesia Medicus Veterinus, 1 (3), 337 – 351.

Das, P.K. & Mondal, A.K., 2012, Studies on Traditional ‘Mehendi’ used as Herbal Colour

with Special References to its Antimicrobial Activity and Pigment Profile by TLC, International Journal of Science and Nature, 3 (4), 799-804.

DIFCO & BBL, 2013, Motility Indole Ornithine Medium,

(www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/27350.pdf diakses tanggal 20 desember 2013).

Dwipayana & Ariesyadi, H.W., 2009, Identifikasi Keberagaman Bakteri pada Lumpur

Hasil Pengolahan Limbah Cat dengan Tehnik Konvensional, Bandung, ITB.

Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal of Pharmaceutical Sciences, 55 (3), 225-269.

Gandjar, I.G. & Rohman, A., 2012, Analisis Obat secara Spektroskopi dan Kromatografi, 70-72, Yogyakarta, Pustaka Pelajar.

Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Bandung, Penerbit ITB.

Hart, T. & Shears, P., 1997, Mokrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Pratama, F.E., & Kumala, P., EGC, Jakarta.

13

Hidayathulla, S., Chandra, K. & Candrashekar, K.R., 2001, Phytochemical Evaluation and Antibacterial Activity of Pteropermum difersifolium Blume, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3 (2), 165-167.

Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E. A., 2001, Mikrobiologi Kedokteran, edisi XXII,

diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Jakarta, Penerbit Salemba Medika.

Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A., 2005, Mikrobiologi Kedoteran, diterjemahkan

oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, 233-235 & 363-364, Jakarta, Salemba Medika.

Jiny, V.K., Shilvipriya, K.S., Resmi S. & Jolly, C.I., 2010, Lawsonia Inermis (Henna): A

Natural Dye of Various Therapeutic Uses, 1 (1). Kaneswari, M.S., Mahatmi, H. & Besung, I.N.K., 2013, Perasan Daun Mengkudu

(Morinda citrifolia) Menghambat Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli secara In Vitro, Indonesia Medicus Veterinus, 2(2), 216 – 224.

Kawo, A.H. & Kwa, A.M., 2011, Phytochemical Screening and Antibacterial Activity of

The Aqueous Extracts and Fractions of Ethanolic Extracts of Lawsonia inermis leaf, International Research Journal of Microbiology, 2 (12), 510-516.

Koplan, J.P., Hughes, J.M., Cohen, M.L. & Samba, E.M., 1999, Laboratory Methods for

the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera, Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia.

Kotakemori, M. & Okada, K., 1966, Thin-Layer Chromatography of Same Substituted

Naphthoquinones, Agr. Biol. Chem., 30 (9), 935-936. Pelczar, M.J. & Chan, E.C.S., 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jakarta, Penerbit

Universitas Indonesia. Pratiwi, S.T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Jakarta, Airlangga. Radji, M., 2011, Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran,

95 & 96, Jakarta, EGC. Rahmoun, N.M., Boucherit-Atmani, Z., Benabdallah, M., Boucherit, K., Villemin, D. &

Choukchou, B.N., 2013, Antimicrobial Activities of the Henna Extract and Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives, American Journal of Medical and Biological Research, 1 (1), 16-22.

Raja, W., Ovais, M. & Dubey, A., 2013, Phytochemical Screening and Antibacterial

Activity of Lawsonia inermis Leaf Extract, International Journal of Microbiological Research, 4 (1), 33-36.

Rajwar, S. & Kantri, P., 2011, Pharmacognostic & Phitochemical Studies on Various Plant

Parts of Lawsonia inermis (Henna), Asian Journal of Pharmaceutical Sciences and Clinical Research, 1(3), 22-40.

14

Ranjbar, R., Dallal, M.M.S., Talebi, M. & Pourshafie, M.R., 2008, Increased Isolation and

Characterization of Shigella sonnei Obtained from Hospitalized Children in Tehran, Iran, Journal Health Popular Nutrition, 26 (4), 426-430.

Saadabi, M.A.A., 2007, Evaluation of Lawsonia inermis Linn. (Sudanese Henna) Leaf

Extracts as an Antimicrobial Agent, Reseacrh Journal of Biological Sciences, 2 (4), 419-423.

Sabir, A., 2005, Aktivitas Antibakteri Flavonoid Propolis Trigona sp Terhadap Bakteri

Streptococcus mutans (in vitro), Majalah Kedokteran Gigi, 38(3), 135-141. Shihabudeen, H.M.S. & Priscilla, D.H., 2010, Antimicrobial Activity and Phytochemical

Analysis of Selected Indian Folk Medicinal Plants, International Journal of Pharma Sciences and Researc, 1 (10), 430-434.

Suliantari, Jenie, B.S.L., Suhartono, M.T. & Apriantono, A., 2008, Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Sirh Hijau (Piper bittle L.) Terhadap Bakteri Patogen Pangan, Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 19 (1), 1-7.

Wagner, H. & Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas,

second edition, 197 & 275, New York, Springer.