aletl‹ anal‹z laboratuvari 7 - anasayfa · bilindi¤i gibi kromatografi tekni¤inde...

Bu üniteyi tamamlad›ktan sonraS›v› kromatografisinin temel prensiplerini ve bileflenlerini aç›klayabilecek,Farkl› s›v› kromatografi analiz sistemlerini tan›mlayabilecek,S›v› kromatografide yöntem gelifltirebilecek,S›v› kromatografisi cihazlar›n› kullanarak analiz yapabilecek bilgi ve becerileresahip olacaks›n›z.

‹çerik Haritas›

• Kromatografi• Kromatogram• Hareketli faz• Sabit faz• Al›konma• S›v› kromatografisi (LC)

• Yüksek performans s›v› kromatografisi (HPLC)

• Normal-faz kromatografi• Ters-faz kromatografi• Afinite kromatografisi

Anahtar Kavramlar

Amaçlar›m›z

NNNN

Aletli AnalizLaboratuvar›

S›v› Kromatografisive Uygulamalar›

• G‹R‹fi• SIVI KROMATOGRAF‹S‹N‹N TEMEL

PRENS‹PLER‹• SIVI KROMATOGRAF‹ S‹STEMLER‹• SIVI KROMATOGRAF‹DE YÖNTEM

GEL‹fiT‹RME• HPLC UYGULAMALARI• HPLC ANAL‹ZLER‹N‹N

DE⁄ERLEND‹R‹LMES‹

7ALETL‹ ANAL‹Z LABORATUVARI

G‹R‹fiSabit faz›n türüne bak›lmaks›z›n, hareketli faz olarak bir s›v›n›n kullan›ld›¤› tümkromatografik tekniklere s›v› kromatografisi ad› verilir. Sabit faz türlerine göre s›v›kromatografisi baz› alt dallara ayr›lm›flt›r. Bu yöntemlerin isimleri fiekil 7.1’deki fle-mada verilmifltir.

SIVI KROMATOGRAF‹S‹N‹N TEMEL PRENS‹PLER‹S›v› kromatografisinde; genellikle çok küçük tanecikleri içeren kolonlar›n kullan›-m›yla tabaka say›lar› iyilefltirilmifl ve kolona bas›nç uygulanarak ak›fl h›z› artt›r›lm›flolan yüksek performansl› s›v› kromatografisi (HPLC) cihazlar› kullan›lmaktad›r. fie-kil 7.1’de bahsi geçen kromatografi türleri bir HPLC cihaz›nda farkl› kolonlar›n kul-lan›lmas›yla elde edilebilece¤i gibi, farkl› cihaz tasar›mlar›yla da piyasada buluna-bilmektedir (özellikle iyon kromatografisi için ayr› sistemler mevcuttur, bu neden-le bu ders kapsam›nda iyon kromatografisi ayr› bir ünite olarak ele al›nm›flt›r).HPLC, sa¤lad›¤› yüksek do¤ruluk, kesinlik ve hassasl›¤› ayr›ca uçucu olmayan tür-ler için de kullan›labilmesi nedeniyle en çok tercih edilen enstrümantal kromatog-rafi türüdür.

S›v› Kromatografisi veUygulamalar›

fiekil 7.1

S›v› kromatografitürlerinins›n›fland›r›lmas›

Bilindi¤i gibi kromatografi tekni¤inde kullan›lan yöntem ne olursa olsun türler,kolonda da¤›lma sabiti (KD) de¤erlerine ba¤l› olarak ilerler ve kolonu belli bir s›-ra ile terk ederler. Modern aletli tekniklerinde, kolondan ç›kan her bir tür, uygunbir dedektörün kullan›m›yla bir sinyal olarak alg›lan›r ve zamana veya hareketli fa-z›n hacmine ba¤l› olarak bir kromatogram fleklinde gösterilir. fiekil 7.2’de, iki bi-leflenli bir numuneye ait bir kromatogram görülmektedir.

fiekil 7.2’de görülen t0 de¤eri, kolonda hiç tutulmayan bir türe ait al›konma za-man›d›r. Yani t0 için, hareketli faz›n enjeksiyon k›sm›ndan bafllay›p dedektöreulaflmas› için geçen zaman da diyebiliriz. tR1 ve tR2 ise s›ras›yla kolondan ilk ç›kanve ikinci ç›kan türlere ait al›konma zamanlar›d›r. Al›konma zaman›; analitlerin tü-rü, sabit faz›n türü, hareketli faz›n türü, ak›fl h›z› ve kolon uzunlu¤u faktörlerineba¤l› olarak de¤iflebilir.

Kolonda ilerleyen bileflenlerin göç h›zlar›yla ilgili olarak kromatografide s›kçakullan›lan bir parametre al›konma veya kapasite faktörüdür. Al›konma faktörü, k'ile gösterilir ve Eflitlik 7.1’de verildi¤i gibi bulunur:

(7.1)

Al›konma faktörünün 2’den küçük olmas› elüsyonun çok h›zl› oldu¤unun,10’dan büyük olmas› ise elüsyonun çok yavafl oldu¤unun göstergesidir. Her iki du-rumda kromatografik olarak sak›ncal›d›r. Bu nedenle ideal bir ay›rmada çözünentürlere ait k' de¤erlerinin 2 ile 10 aras›nda olmas› istenir.

Bir kolondaki türlerin göç h›zlar›n›n ba¤›l bir ifadesi olan seçicilik faktörü (α)ise afla¤›daki formüle göre hesaplan›r:

(7.2)

Bir kromatografik kolonun verimlili¤inin göstergesi elde edilen kromatogram-daki piklerin keskinli¤idir. Kolona enjeksiyon yap›lmas› ile türler kolonda ilerler-

α = t – t

t – t =

k

kR2 0

R1 0

2

1

′

′

′ =−

kt t

tR 0

0

134 Alet l i Anal iz Laboratuvar ›

Kromatogram:Kromatografik tekniklerde,bir kar›fl›mda bulunanbileflenlere karfl› dedektörcevab›n›n (sinyalinin)hareketli faz›n hacmi veyazaman›n fonksiyonu olarakçizildi¤i grafiklerdir.

fiekil 7.2

‹ki bileflenli bir numunenin HPLC analizi sonucu elde edilen kromatogram

ken kolonun sonuna do¤ru, türlere ait bantlarda geniflleme oldu¤u görülür. Bu du-ruma; boyuna difüzyon ve fazlar aras› kütle aktar›mlar› gibi baz› kinetik olaylar ne-den olmaktad›r. Kolon verimlili¤i kuramsal tabaka say›s› (N) ad› verilen bir nice-lik ile ölçülür:

(7.3)

Bu eflitliklerde yer alan w, fiekil 7.3’den de görülece¤i gibi bir pike ait taban ge-niflli¤i, tR ise ayn› pikin elde edildi¤i al›konma zaman›d›r. Kolon verimlili¤inin bafl-ka bir nicel ölçüsü ise tabaka yüksekli¤i (H) dir ve tabaka yüksekli¤i ile tabaka sa-y›s› aras›nda Eflitlik 7.4’de görüldü¤ü gibi ters orant› vard›r:

(7.4)

Bu eflitlikteki L, kolon dolgu malzemesinin uzunlu¤udur.

Bir kolonun ay›r›c›l›¤› ya da ay›rma gücü, kolonun bir numunede bulunan tür-leri birbirinden ne derece ay›rabildi¤inin nicel bir ölçüsüdür. Ayr›ma gücü (rezo-lüsyon) Rs ile gösterilir ve afla¤›da verilen eflitlikten bulunabilir:

(7.5)

Rs de¤erinin 1’den büyük olmas› iyi bir ay›r›c›l›k göstergesidir. Yüksek Rs de-¤erlerinin elde edilebilmesi için N, α ve k' de¤erlerinin de mümkün oldu¤unca bü-yük olmas› gerekir.

Bir numuneye ait elde edilen pikler için al›konma zamanlar› s›ras›yla 2,8, ve 3,5 dak., bupiklere ait taban genifllikleri ise s›ras›yla 0,6 dak. ve 1,0 dak.’d›r. Kolonda al›konmayantüre ait de¤er ise 0,9 dk. d›r. Bu verilere göre piklerin al›konma faktörleri ve seçicilik fak-törlerini hesaplayarak yorumlay›n›z.

R = t – t

(w + wsR2 R1

1 2

2x)

H = LN

N = t

wR16

2

x

1357. Ünite - S ›v › Kromatograf is i ve Uygulamalar ›

fiekil 7.3

‹ki bileflenli birnumuneye aitkromatogramdataban geniflli¤iningösterimi

S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE SIRA S ‹ZDE

AMAÇLARIMIZAMAÇLARIMIZ N NK ‹ T A P

T E L E V ‹ Z Y O N

K ‹ T A P


‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E T

1

S›v› kromatografisi ve di¤er kromatografik tekniklerle ilgili daha ayr›nt›l› bilgiyi AÖF Alet-li Analiz Ders Kitab›nda bulabilirsiniz.

Da¤›lma Kromatografisi (S›v›-S›v› Kromatografi)Da¤›lma kromatografisinde sabit faz genelde bir dolgu maddesine ba¤lanm›fl s›v›maddedir. Dolgu maddeleri genellikle silika esasl› bilefliklerdir. Silikan›n yüzeyihidroksil gruplar›n› içerecek flekilde aktive edildikten sonra istenirse yine farkl› po-lar gruplar ya da apolar gruplar ba¤lanabilir. Sabit faz›n, silika yüzeyine ba¤lanm›flgruplar›n apolar, hareketli faz›n ise polar oldu¤u kromatografi türüne ters-fazkromatografisi denmektedir. HPLC’de en çok kullan›lan s›v› kromatografi türübudur. Ancak, sabit faz›n polar, hareketli faz›n apolar oldu¤u yönteme çok dahaeski oldu¤u için normal-faz kromatografisi denmektedir.

Normal-faz kromatografide elüent olarak polariteleri nispeten düflük olan hek-zan, diklorometan ve kloroform gibi çözücüler kullan›l›r. Ters-faz kromatografideise metanol, tetrahidrofuran ve asetonitril gibi organik çözücülerin sulu çözeltilerielüent olarak kullan›l›r. Normal-faz kromatografide kullan›lan elüentin polaritesidüflük oldu¤undan, numunede bulunan bileflenlerden polaritesi az olanla dahaçok etkileflir ve kolondan önce ç›kmas›n› sa¤lar. Polar türler ise sabit fazla etkile-flece¤inden kolonu geç terk ederler. Ters-faz kromatografide ise tersi durum sözkonusudur: Apolar türler sabit fazla daha fazla etkileflerek kolonu geç terk ederler,polar türler hareketli fazla etkileflip kolonu erken terk ederler.

Normal-faz kromatografi yap›sal izomerlerin ayr›lmas›nda, nikotin gibi alkolo-idlerin, fenollerin, lipidlerin, aminlerin, pestisitlerin, metal flelatlar›n›n ve daha birçok türün ayr›lmas› ve tayininde kullan›l›r. Ters-faz kromatografi ise normal fazkromatografisine göre daha fazla kullan›m alan›na sahiptir ve en çok alkil benzenhomologlar›n›n (CnH2n+1), diuron, fenuron gibi herbisidlerin ve türevlendirilmiflaminoasitlerin ay›r›m›nda kullan›l›r.

Adsorpsiyon Kromatografisi (S›v›-Kat› Kromatografi)Bu yöntem, ayr›lacak bileflenlerin sabit kat› faz üzerinde tersinir olarak adsorblan-malar› esas›na dayan›r. Bileflenler birbirlerinden kat› yüzeye olan farkl› derecedeilgileri nedeniyle ayr›l›rlar. Adsorpsiyon denge sabiti büyük olan bileflen yüzeydedaha uzun kal›rken, küçük olan daha k›sa süre kalmakta, hiç adsorplanmayan bi-leflen ise kolonda hiç geciktirilmeden hareketli faz ile tafl›narak d›flar› ç›kmaktad›r.Yüzeye adsorplanan bileflenler ise yüzeyle etkileflmelerine ba¤l› olarak farkl› kal-ma sürelerinde kolonu terketmektedir.

Adsorpsiyon kromatografisinde sabit faz olarak adsorplama yapabilecek, ancakayr›lacak türlerle kimyasal bir tepkime vermeyecek kat›lar kullan›l›r. En çok kulla-n›lan sabit fazlar alümina ve silikajeldir. Sabit faz olarak genellikle polar kat›lar kul-lan›ld›¤›ndan, hareketli faz olarak benzen, oktan, kloroform gibi apolar veya çokaz polar s›v›lar kullan›l›r. Ayr›lacak bileflenin sabit fazla etkileflmesi dipol-dipol et-kileflimleri, van der Waals kuvvetleri veya hidrojen ba¤lar› sonucunda gerçekleflir.Adsorpsiyon kromatografisi moleküler kütlesi 5000’den küçük apolar maddelerinve izomerlerin ay›r›m›nda kullan›lmaktad›r.

‹yon-De¤iflim KromatografisiBenzer yüklü iyonlar›n tersinir flekilde yer de¤ifltirmesine iyon de¤iflimi, iyon de-¤iflimi mekanizmas›n›n rol ald›¤› kromatografik yönteme ise iyon de¤iflim kroma-tografisi denilmektedir. Bu yöntemde; hareketsiz faz› oluflturan iyon de¤ifltiriciye


Ters-farz kromatografi:Sabit faz›n apolar birmadde, hareketli faz›n isenispeten polaritesi dahayüksek bir madde oldu¤us›v›-s›v› kromatografitürüdür.

Normal-faz kromatografi:Sabit faz›n polar bir madde,hareketli faz›n ise nispetenpolaritesi düflük bir maddeoldu¤u s›v›-s›v›kromatografi türüdür.

S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



kimyasal ba¤larla ba¤l› yüklü gruplar, hareketli fazdaki benzer iyonlarla yer de¤ifl-tirirler. Bu yer de¤ifltirme istendi¤i anda geri döndürülebilmektedir. Böylece de¤ifl-tirilebilir iyon tafl›yan maddelerin (asitler, antibiyotikler, amino asitler, alkoloidlervb.) ayr›lmas› sa¤lanm›fl olmaktad›r. ‹yon kromatografisi ile ilgili daha genifl bir bil-gi ve uygulama örnekleri Ünite 9’da verilmifltir.

Jel KromatografisiJel kromatografisinde kolonlar genifl gözenekli polimer veya silika temelli reçineile doldurulmufltur. Bir numunedeki bileflenler bu jel gözeneklerinde büyüklük veflekillerine göre oyalanarak farkl› zamanlarda kolonu terk ederler ve böylece ayr›l-m›fl olurlar. Di¤er kromatografik türlerdeki gibi türlerin sabit fazla kimyasal ya dafiziksel bir etkileflimi söz konusu de¤ildir. Küçük moleküller gözeneklerde dahafazla oyalanarak kolonu geç terk ederler, büyük moleküller ise gözeneklere yete-rince giremediklerinden kolonu oyalanmadan h›zl› bir flekilde terk ederler. Bu kro-matografi yöntemi bu nedenle büyüklük d›fllama olarak da adland›r›l›r.

Jel kromatografi; jel filtrasyon ve jel geçirgenlik olmak üzere iki gruba ayr›labi-lir. Jel filtrasyonda dolgu maddesi hidrofilik, hareketli faz ise sulu çözeltilerdir vesuda çözünen maddelerin ayr›lmas›nda kullan›l›r. Jel geçirgenlik kromatografisin-de ise dolgu maddesi hidrofobik, hareketli faz ise polar olmayan çözücülerdir vesuda çözünmeyen maddelerin ayr›lmas›nda kullan›l›r.

Kromatografik ay›rmalarda etkin olan mekanizmalar› aç›klayarak, bir analizde hangisininkullan›laca¤›na nas›l karar verilir, yorumlay›n›z.

SIVI KROMATOGRAF‹ S‹STEMLER‹Laboratuvarlarda kullan›lan birçok farkl› model s›v› kromatografi sistemi mevcut-tur. Burada yüksek performansl› s›v› kromatografisinin genel yap›s› verilerek, sonzamanlarda gelifltirilmifl olan h›zl› protein s›v› kromatografi ve nano s›v› kromatog-rafi sistemlerine de k›saca de¤inilecektir.

Yüksek Performans S›v› Kromatografisi (HPLC)Bir HPLC cihaz›na ait bafll›ca bileflenler fiekil 7.4’de basit haliyle gösterilmifltir. fie-kil 7.5’de ise laboratuvarda kullan›lan bir HPLC sistemine ait resim verilmifltir.


S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



2

fiekil 7.4

Bir HPLC cihaz›n›nflematik gösterimi

Çözücü SistemiBir HPLC analizinin baflar›s› büyük oranda do¤ru çözücü sisteminin belirlenmesi-ne ba¤l›d›r. HPLC’de hareketli faz olarak kullan›lan bir çok çözücü vard›r. Bunlar-dan baz›lar› Çizelge 7.1’de verilmifltir. HPLC’de kullan›lacak çözücünün kaynamanoktas› fazla yüksek olmamal›d›r, viskozitesi düflük olmal›d›r, kullan›lan dedektör-le uyumlu olmal›d›r ve toksisitesi düflük olmal›d›r.

HPLC’de elüent olarak genellikle iki ya da daha fazla çözücüden oluflan bir ka-r›fl›m kullan›l›r. Bu kar›fl›mlarda da s›kl›kla belli oranlarda zay›f çözücü olarak suve kuvvetli çözücü olarak da tetrahidrofuran, metanol ve asetonitril gibi organikçözücüler kullan›l›r.

Baz› çok bileflenli numunelerde, analiz boyunca ayn› çözücü bileflimi kullan›l-d›¤›nda baz› elüsyon problemleri ortaya ç›kabilir. Baz› bileflenler kolondan çok ça-buk, baz›lar› ise çok geç ç›kabilir. Bu sorun, analiz boyunca elüent bilefliminin bir


ÇözücüKaynama

Noktas› (°C)Viskozite (cp) Polarite (p' ) K›r›lma ‹ndisi

Hekzan 69 0,31 0,1 1,376

Diklorometan 40 0,44 3,1 1,424

Etil asetat 77 0,43 4,4 1,372

Kloroform 61 0,57 4,1 1,446

Tetrahidrofuran 66 0,55 4,0 1,407

Asetonitril 82 0,38 5,8 1,344

Metanol 65 0,55 5,1 1,328

Su 100 1,00 10,2 1,333

fiekil 7.5

Laboratuvardakullan›lan birHPLC sistemi

Çizelge 7.1HPLC’de kullan›lanbaz› çözücüler veözellikleri

çözücü programlamas› ile de¤ifltirilmesi ile çözülebilir. S›v› kromatografide bu fle-kilde yap›lan elüsyonlara gradient elüsyon, analiz boyunca sabit bileflimli bir elü-entin kullan›lmas›yla yap›lan elüsyona ise isokrotik elüsyon denir.

Gradient elüsyon hangi durumlarda gereklidir, aç›klay›n›z.

PompalarHPLC’de ileri-geri hareket eden pistonlu yüksek bas›nç pompalar› kullan›l›r. Bu fle-kilde çal›flan üç tip pompa vard›r, bunlar; silindir yollu pompalar, fl›r›nga benzeripompalar, pnömatik pompalard›r. Bu tip pomplar ile 8000 psi bas›nca ç›k›labilir ve0,2-10 ml dak–1 ak›fl aral›¤›nda çal›fl›labilir. S›v› faz çok s›k›flt›r›labilen bir faz olma-d›¤› için ani bas›nç artmalar›nda cihaz›n herhangi bir yerinden s›v› kaça¤› sorunuolabilir. Bu sorunda genellikle cihaz ile metot olufltururken girilen bir bas›nç üst li-mit de¤eri ile çözülür. Cihaz bu bas›nc›n üstüne ç›k›lmas› durumunda otomatikolarak s›v› ak›fl›n› keser.

KolonlarHPLC’de kolon olarak çeflitli büyüklük ve çaplarda, cam veya paslanmaz çeliktenyap›lm›fl ve içinde uygun bir sabit faz bulunan malzemeler kullan›l›r. HPLC cihaz-lar›nda kullan›lan üç temel kolon tipi vard›r:

Kolon içlerinde bulunan dolgu malzemelerinin yar›çaplar› ise 3-20 µm aras›ndaolabilmektedir. Kolon dolgu malzemesini oluflturan taneciklerin yar›çap› ne kadarküçük olursa teorik tabaka yüksekli¤i o kadar az olur ve kolonun verimlili¤i de okadar fazla olur. Ancak çok küçük taneciklerin kullan›lmas› durumunda da kolon-da oluflan geri bas›nç artabilir. Bu nedenle optimum koflullar› sa¤layan dolgu mal-zemeleri seçilmelidir. Ayr›ca kolon dolgu malzemeleri, kolona doldurulmadan ön-ce, ölçekli bir elek sisteminden geçirilmeli ve belirli bir aral›ktaki tanecikler kolonadoldurulmal›d›r. Böylece kolon geçirgenli¤i artt›r›l›r ve daha düflük bas›nçlarla ça-l›fl›labilir. Yine, tanecik flekillerinin düzenli olmas› da kolon geçirgenli¤ini artt›r›r.

HPLC sistemlerinde genellikle, kullan›lan ana kolonun ön taraf›na daha k›saboyutta, fakat ana kolonla ayn› malzemeyle dolgulu, emniyet kolonu ad› verilenbir kolon ba¤lan›r. Emniyet kolonlar› ana kolonlara göre daha ucuzdur ve ana ko-lonu olabilecek yüksek deriflim ve kirliliklerden korur. Kirlendi¤inde çok daha ra-hat de¤ifltirilebilir.

DedektörlerHPLC’de kullan›lan dedektör türleri gaz kromatografisinde kullan›lanlardan dahafarkl›d›r. Infrared (IR), floresans, ultraviyole (UV), k›r›lma indisi ve elektrokimya-sal dedektörler en çok bilinen türlerdir. IR dedektörler dalga say›s› 400-700 cm–1

aral›¤›nda ölçüm yaparlar. Ancak HPLC’de kullan›lan çözücülerin bir ço¤u IR ab-sorbans›na sahip oldu¤u için pek tercih edilmemektedir.


‹sokrotik elüsyon: Analizsüresince elüent bileflimininsabit tutuldu¤u elüsyonsürecidir.

Gradient elüsyon: Analizsüresince elüent bilefliminde¤ifltirildi¤i, çözücüprogramlamas› ile yap›lanelüsyondur.

S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



3

Kolon Yar›çap› (mm) Numune miktar› (mg) Ak›fl H›z› (ml dak–1)

Mikro analitik 1-2 0,01 0,1

Standart analitik 3-5 0,1 1

Preperatif 5-20 10,0 10,0

UV dedektörler HPLC’de en çok tercih edilen dedektörlerdir. Bir civa ya da dö-teryum lambas›ndan ç›kan ›fl›malardan, istenilen dalga boyu seçilerek kolondan ç›-kan türlere gönderilir ve numunedeki bileflenlerden bu ›fl›may› absorplayanlar be-lirlenir. UV dedektörler 195-350 nm aral›¤›nda kullan›labilirler. UV dedektörler ileçok küçük deriflimlerdeki bileflenler belirlenebilir, seçicilikleri oldukça yüksektirve gradient elüsyon için elverifllidirler. Çeflitli tipte UV dedektörleri vard›r, en ucu-zu tek bir dalga boyunda çal›flan filtreli UV dedektördür. Monokromatörlü UV de-dektörleri ayn› anda 4-5 dalga boyunu tarayabilir ve çoklu-dalgaboylu dedektörolarak piyasada bulunurlar. En pahal› olan› bir fotodiyot dizisi kullanarak ayn› an-da istenildi¤i kadar dalga boyunu tarayan diyotdizinli (DAD) dedektörlerdir. Foto-diyot dizinlerindeki her bir fotodiyot baflka bir dalga boyunda ›fl›k fliddetini ölç-mektedir. Bu tip dedektörlerle üç boyutlu spektrumlar da elde edilebilir. Bir di¤ertür olan floresans dedektörlerinde yaln›zca floresans özelli¤e sahip türlerin tayiniyap›labilir. Bu nedenle seçicilikleri oldukça yüksektir. Ancak bu ayn› zamanda birdezavntajd›r, çünkü bu tip dedektörlerin kullan›m alanlar›n› s›n›rlamaktad›r. Flore-sans dedektörlerin en büyük avantajlar› yüksek hassasl›klar›d›r. UV dedektörleppm seviyesinde cevap al›n›rken, floresans dedektörle bu s›n›r ppb seviyesine ka-dar düflmektedir. K›r›lma indisi dedektörleri bir referans hücredeki saf çözücü iledi¤er hücrede bulunan numune aras›ndaki k›r›lma indisi fark›n› ölçer. K›r›lma in-disi dedektörleri UV absorbans› ya da floresans özellik göstermeyen türler için dekullan›labilir ve genellikle jel kromatografi sistemlerinde tercih edilirler. Ancak budedektörlerde hassasl›k oldukça düflüktür ve k›r›lma indisinin s›cakl›¤a ba¤›ml› ol-mas›, en ufak bir s›cakl›k de¤ifliminde ölçümlerin etkilenmesine neden olmaktad›r.Ayr›ca kullan›lan çözücüye göre ölçüm yap›ld›¤›ndan, analiz süresince çözücü bi-lefliminin de¤ifltirildi¤i gradient elüsyon bu tip dedektörlerle yap›lamamaktad›r.Elektrokimyasal dedektörler; amperometri, voltametri, kulometri ve kondüktomet-ri temelli olabilmektedir. Hassasl›klar› oldukça yüksek olan elektrokimyasal de-dektörler buna ra¤men hala optik dedektörler kadar kullan›m alan›na sahip de¤il-dirler. Tüm bu dedektörlerin yan› s›ra t›pk› GC-MS sistemlerinde oldu¤u gibi küt-le spektrometresi ile birlefltirilmifl LC-MS sistemleri de mevcuttur ancak oldukçapahal›d›rlar.

HPLC’de kullan›lacak dedektör türünü seçerken nelere dikkat etmek gerekti¤ini tart›fl›n›z.

H›zl› Protein S›v› Kromatografisi (FPLC)Bilindi¤i gibi, proteinler bütün canl› varl›klar›n en önemli ve hücrelerinde en bolbulunan organik bilefliklerdir. Bütün biyolojik olaylarda enzimatik katalizleme,mekanik hareket, koruma, tafl›ma ve depolama gibi önemli görevler üstlenmifller-dir. Proteinlerin yap›-fonksiyon iliflkisini belirleyip yaflamsal alanda kullanmak bi-rincil amaçt›r ve insan vücuduna verilecek protein çok saf olmal›d›r, aksi takdirdebir çok yan etkiye yol açabilir.

FPLC kompleks kar›fl›mlardan proteinlerin ayr›lmas›n› veya saflaflt›r›lmas›n› sa¤-layan bir kromatografi cihaz›d›r. HPLC’den farkl› olarak daha düflük bas›nçlardaçal›fl›r ve genellikle cam veya teflon bileflenlerden oluflur. Cihaz genellikle biyo-kimya ve enzimoloji alanlar›nda kullan›l›r.


S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



4

FPLC ile kullan›lan kolonlar; makromolekülleri, yük, boyut, hidrofobisite veyabiyotan›ma esaslar›na göre ay›r›rlar. Protein saflaflt›rmada kullan›lan tipik kolonlar:

• ‹yon de¤iflim kromatografisi (katyon veya anyon): Proteinleri yüzey yükle-rine göre ay›r›r.

• Jel filtrasyon ve jel geçirgenlik kromatografisi: Boyutlara dayal› ay›rma yapar.• Ters faz veya hidrofobik etkileflim: Yüzey alan›ndaki hidrofobikli¤e göre

ay›r›m yapar.• Afinite kromatografisi: Ay›rma bir ligand ile protein aras›ndaki afinite ile

sa¤lan›r. Örne¤in histidinli proteinlerin nikel kolon kullan›larak ayr›lmas›.H›zl› Protein S›v› Kromatografisi (FPLC), bir pompa, bir UV-Vis dedektör, bir

kolon, enjektör birimi ve fraksiyon toplama parçalar›ndan oluflmufltur. Sistem pro-tein, peptid vb. ay›r›mlar›n› k›sa sürede gerçeklefltirebilen bir tür h›zl› performanss›v› kromatografi sistemidir. Ayn› zamanda mikro düzeyde saflaflt›rma ve prepara-tif boyutta HPLC analizleri yapmak için uygundur.

Nano LCBir s›v› kromatografisi sisteminde kolon olarak, kapiler boyutta bir kolon kullan›l-mas› ve nano boyutta ak›fl sa¤layabilen pompalarla mobil faz ak›fl h›z›n›n µl dak–1

veya nL dak–1 olarak ayarlanmas› ile mikro-HPLC veya nano-HPLC fleklinde adlan-d›r›lan sistemler elde edilir. Nano-LC sistemleri küçük örnek hacimleriyle çal›fl›la-bilme, MALDI-TOF-MS ile yüksek uyum, yüksek hassasiyet ve çok düflük tayin s›-n›rlar› gibi bir çok önemli avantaja sahiptir. Yak›n bir gelecekte kapiler s›v› kroma-tografisinin klasik HPLC sisteminin yerini almas› beklenmektedir. Kullan›lan mobilfaz hacminin mikrolitre mertebesinde olmas›, hem analiz maliyetini düflürmektehem de analiz sonras› at›k hareketli faz›n eliminasyon problemini ortadan kald›r-maktad›r. Ayr›ca kolon çap›n›n mikro boyutta olmas›, klasik HPLC kolonlar›ndaoluflan band genifllemesi ve düflük çözünürlük problemlerini ortadan kald›rmaktave çok daha iyi bir kromatografik ay›rmaya imkan sa¤lamaktad›r.

SIVI KROMATOGRAF‹DE YÖNTEM GEL‹fiT‹RMES›v› kromatografi ile yap›lacak bir analiz için yöntem gelifltirmede en önemli ad›m-lar analitlere uygun kolon ve hareketli faz›n seçimidir. Gaz kromatografiden farkl›olarak s›v› kromatografide analitler hareketli fazla da etkileflti¤inden yöntem gelifl-tirme biraz daha zordur. S›v› kromatografide; analit, hareketli faz ve durgun fazaras›ndaki etkileflimler uygun bir flekilde dengelenmelidir. Uygun sabit faz› bula-bilmek için kullan›lan kolon türünü s›k s›k de¤ifltirmek çok pratik de¤ildir. Bu ne-denle yöntem gelifltirmede genellikle tek bir tip kolon seçilerek, farkl› hareketli fazbileflimleri denenir. Ancak bir kar›fl›mdaki tüm bileflenler bu yolla da ayr›lam›yor-sa kolonu de¤ifltirmek gerekebilir.

Daha önce belirtildi¤i gibi iyi bir ay›r›m için k', α ve N de¤erlerinin iyilefltirilme-si gerekir. Bu parametrelerden özellikle k' ve α hareketli faz›n bilefliminin de¤iflti-rilmesiyle rahatl›kla de¤ifltirilebilmektedir. Hat›rlanaca¤› üzere k' de¤erinin 2’denküçük olmas› elüsyonun çok h›zl›, 10’dan büyük olmas› ise yavafl oldu¤unun birgöstergesidir, ancak bu ideal aral›ktaki k' de¤erleri piklerin birbirinden çok iyi ay-r›ld›¤›n›n bir göstergesi de¤ildir. Dolay›s›yla α de¤erlerinin de mümkün oldu¤un-ca büyük olmas› istenir. Seçicilik de¤erine hareketli faz›n etkisini incelemeden ön-ce, al›konma faktörü ile hareketli faz bileflimi aras›ndaki iliflkiyi görmekte faydavard›r. ‹deal bir ay›rma için uygun bileflimler deneme yan›lma yoluyla bulunabile-ce¤i gibi baz› matematiksel ba¤›nt›lar yard›m› ile de bulunabilir. Bu yöntemle za-


mandan tasarruf edilmifl olunur. Al›konma faktörleri ve hareketli faz bileflimi ara-s›nda do¤rudan bir ba¤›nt› olmasa da dolayl› bir iliflki vard›r, flöyle ki; al›konmafaktörü ve çözücü polaritesi aras›nda Eflitlik 7.6’ da verilen ba¤lant›,

Ters faz için: Normal faz için: (7.6)

çözücü polaritesi ve kar›fl›mdaki hacim kesirleri aras›nda ise Eflitlik 7.7’de verilenba¤lant› vard›r. Yani al›konma faktöründen çözücü polaritesine oradan da kar›fl›m-daki bileflenlerin oran›na geçmek mümkündür. Tüm bu ba¤›nt›lar yaklafl›k de¤er-ler vermektedir.

P'AB = ϕAP'A + ϕBP' B (7.7)

Bu eflitlikte P'A ve P'B iki çözücünün polarite indisi, ϕA ve ϕB ise çözücülerin ka-r›fl›mdaki hacim kesirleridir.

Bir mayonez numunesinde bulunan koruyucu maddelerin analizi BDS-C 18 ko-lonuyla gerçeklefltirilmifltir. Hareketli faz olarak % 40 asetonitril % 60 su kullan›l-m›flt›r. Bu koflullarda al›konmayan türün elüsyonu 0,32, sonuncu bileflenin elüs-yonu ise 18 dak.’da gerçekleflmifltir. Bu koflullarda sonuncu bileflen için al›konmafaktörü nedir? Al›konma faktörünü yaklafl›k 5 yapmak için kullan›lmas› gerekenasetonitril/su oran› nedir? (P' de¤erleri asetonitril için 5,8, su için 10,2’dir)

Çözüm: Bafllang›çta elde edilen k'1 = (18 – 0,32) / 0,32 = 55,25

k'1 için P'1 = 0,4 × 5,8 + 0,6 × 10,2 = 8,44

k'2 = 5 olmas› isteniyor. Bu veriler Eflitlik 7.6’da yerine koyarak P'2 de¤eri bulu-

nabilir.

Her iki taraf›n logaritmas› al›narak çözüm ifllemi kolaylaflt›r›l›r.

P'2 = 6,36 olarak bulunur.

Bulunan bu de¤er kapasite faktörünün 5 olmas› için gereken çözücü gücüdür.Bu polariteye sahip kar›fl›m›n bileflimini bulmak için ise Eflitlik 7.7 kullan›l›r. Bura-da asetonitrilin hacim kesrine x dersek, suyun hacim kesri de 1–x olur.

6,36 = x × 5,8 + (1–x) × 10,2

x = 0,87

Elde edilen sonuca göre hareketli faz olarak % 87 asetonitril, % 13 su kar›fl›-m› kullan›ld›¤›nda kapasite faktörü yaklafl›k 5 olur ve elüsyon daha k›sa süredetamamlan›r.

– = –

1 048 44

22,

,′P

555 25

10 2 8 44 2

,( , )/ =

′−P

′

′′ ′k

kP P2

1

210 1 2 = – ( )/′

′′ ′k

kP P2

1

210 2 1 = – ( )/


Ö R N E K 7 . 1

Uygun al›konma faktörü belirlendikten sonra α de¤erinin artt›r›lmas›, hareketlifaz›n kimyasal bilefliminin de¤ifltirilmesi ile sa¤lanabilir. Bunun için genellikle sis-tematik bir yaklafl›m yapmak gerekir. Sistematik yaklafl›mda, öncelikle uygun birelüsyon için yeterli al›konma faktörü belirlenir. Daha sonra üç ya da dört farkl› çö-zücü seçilir. Bu çözücüler ters-faz için genellikle asetonitril, tetrahidrofuran ve me-tanoldür ve çözücü gücünün ayar› belirlenen k' de¤erini sa¤layacak flekilde su ila-vesiyle yap›l›r. Normal-faz kromatografide ise etil eter, metilen klorür ve kloroformgibi çözücülerin n-heksan ile ayar› yap›larak sistematik yaklafl›m gerçeklefltirilir.Belirlenen oranlarla haz›rlanan hareketli fazlar kullan›larak elde edilen kromatog-ramlardan hangisi daha iyi ise, sonraki ifllemlerde o hareketli faz kullan›l›r. Örne-¤in Lehrer ve arkadafllar› 1981 y›l›nda alt› bileflenli bir kar›fl›m› ay›rmak için böylebir sistematik yaklafl›mda bulunmufllard›r. Önce al›konma faktörü 5 olacak flekildeasetonitril-su kar›fl›m› (% 41 CH3CN % 59 H2O) haz›rlanm›fl, ancak piklerin 3dak.dan daha k›sa bir sürede ve ayr›lmadan geldi¤i bulunmufltur. Daha sonra al›-konma faktörü 10’a ç›kar›lm›fl ((% 30 CH3CN % 70 H2O) ve 7 dakikal›k ideal birelüsyon süresi elde edilmifltir. Ancak hala ayr›lmayan pikler mevcuttur. Daha son-raki aflamada al›konma faktörleri hep 10 olacak flekilde metanol-su, tetrahidrofu-ran-su ve asetonitril-tetrahirofuran-su hareketli fazlar› haz›rlanm›fl ve ayn› koflullar-da numunenin analizleri gerçeklefltirilmifltir. Piklerin en güzel asetonitril-tetrahiro-furan-su’dan oluflan hareketli faz ile ayr›ld›klar› belirlenmifltir.

Bir içecek numunesinde bulunan tatland›r›c› maddelerin analizi C18 kolon kullan›m› ilegerçeklefltirilmifltir. Hareketli faz olarak % 50 metanol % 50 su kullan›lm›flt›r. Bu koflul-larda al›konmayan türün elüsyonu 0,42, sonuncu bileflenin elüsyonu ise 18 dak.’da ger-çekleflmifltir. Bu koflullarda sonuncu bileflen için al›konma faktörü nedir? Al›konma faktö-rünü yaklafl›k 7 yapmak için kullan›lmas› gereken metanol/su oran› nedir (P' de¤erlerimetanol için 5,1, su için 10,2’dir)?

HPLC UYGULAMALARIHPLC sistemi ile yap›lan uygulamalar›na örnek olarak, kolada kafein tayini, mayo-nezde bulunabilecek baz› antioksidan ve koruyucular›n analizi ve idrarda ürik asittayini gerçeklefltirilecek ve böylece gerçek numunelerle çal›fl›l›rken gerekli olan önhaz›rl›k ifllemleri hakk›nda da bir fikir sahibi olunacakt›r.

Baz› ‹çeceklerde Kafein TayiniÇeflitli kola numunelerindeki kafein miktarlar›n›n tayini, UV dedektörlü bir HPLCsistemi ile 254 nm dalga boyunda, % 20 metanol, % 80 su’dan oluflan hareketli fa-z›n kullan›m›yla gerçeklefltirilebilir. Analiz için önce kafein standartlar›n›n haz›rlan-mas› ve tek tek HPLC’de kromatogramlar›n›n elde edilmesi gerekir. Kromatogram-lardaki kafein pikine ait alanlar cihazda bulunan program sayesinde belirlenerekbir kalibrasyon grafi¤i oluflturulur. Daha sonra numuneler ayn› koflullarda cihazaenjekte edilir. Elde edilen kromatogramda kafeine ait olan pik belirlenerek alan›bulunur. Kalibrasyon grafi¤inden bu alana karfl›l›k gelen deriflim tespit edilir.


S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



5

Deneyde kullan›lan malzeme ve kimyasallar

Standartlar›n Haz›rlanmas› ve Kalibrasyon Grafi¤inin Elde Edilmesi1. Standart çözeltiler, hareketli faz olarak kullan›lan çözelti ile haz›rlan›r. Bu

nedenle öncelikle 20:80 lik metanol-su kar›fl›m› haz›rlanmal›d›r. Hem çözü-cü hem de hareketli faz olarak kullan›lacak olan bu çözelti, 100 mL metanolüzerine 400 mL deiyonize su ilave edilmesiyle haz›rlan›r ve bir süre ultraso-nik banyoda tutularak gaz› uzaklaflt›r›l›r.

2. Stok kafein çözeltisi haz›rlamak için 12,5 mg kafein tart›larak, toplam hacmi50 mL olacak flekilde metanol-su ile çözülür. Böylece 250 ppm stok kafeinçözeltisi elde edilmifl olunur.

3. Bu stok çözeltiden 4 adet 25 mL’lik balon jojeye s›ras›yla 2,5 mL, 5,0 mL, 7,5mL ve 10,0 mL aktar›larak üzerleri yine metanol-su kar›fl›m› ile 25 mL’ye ta-mamlan›r. Haz›rlanan standart çözeltiler de HPLC sistemine enjekte edilme-den önce 5 dakika kadar ultrasonik banyoda tutulur.

4. C18 kolonu tak›l› olan HPLC sitemi aç›larak, bilgisayar program›nda dalgaboyu 254 nm’ye, ak›fl h›z› 2,0 ml dak–1’e ayarlan›r, analize geçilmeden öncekolon en az 10 dakika hareketli faz ile y›kan›r.


Malzemeler Kimyasallar

C18 kolon10 mL’lik balon joje (2 adet)25 mL’lik balon joje (4 adet)Farkl› ölçeklerde pipetlerFarkl› ölçeklerde beherler50 µL lik fl›r›nga

KafeinMetanolFarkl› markalardaki kola numuneleri

Pompa, kolon,dedektör veifllemciyigösteren pano

Hareketli fazsinyali

fiekil 7.6

Bir HPLCbilgisayarprogram›n›n vegözlenen hareketlifaz sinyaliningörüntüsü

5. Elde edilen sinyalde bir problem yoksa (fiekil 7.6), seyreltikten derifli¤e do¤-ru s›ras›yla haz›rlanan standartlar cihaza enjekte edilir. Enjeksiyon s›ras›ndacihaz›n enjeksiyon bölmesinin yükleme pozisyonunda olmas›na dikkat edil-melidir (fiekil 7.7). Bilgisayarda bulunan HPLC program›nda yap›lacak ifl-lemlerle ilgili gerekli dosyalar oluflturulduktan sonra, cihaz›n türüne göre;elle veya otomatik olarak enjeksiyonun bafllamas› sa¤lan›r. Enjeksiyonunbafllamas›yla da, standart çözeltiye ait kromatogram oluflmaya bafllar. Tümölçümler en az üç defa tekrarlanmal›d›r.

6. Deriflimi bilinen standart kafein çözeltilerinin her birine ait ortalama pik ala-n› belirlenerek, deriflimlere karfl› pik alanlar›ndan oluflan kalibrasyon grafi¤ioluflturulur.

Standart çözeltiler enjektöre çekilirken, enjektörde hava kabarc›¤› oluflturmamaya dikkatedilmelidir.

Kolada Kafein Miktar›n›n Tayini1. Analizi yap›lacak kola örneklerinden 15’er mL al›narak temiz bir behere ko-

nulur ve içerdi¤i gaz giderilinceye kadar bir kaptan di¤erine aktarma ifllemiyap›l›r. Hava kabarc›klar› yok edildikten sonra bu numunelerden 10’ar mLal›narak üzerlerine 10’ar mL 20:80 metanol-su çözeltisi ilave edilerek yar› ya-r›ya seyrelmeleri sa¤lan›r.

2. Numuneler s›ras›yla üçer defa HPLC sistemine enjekte edilir. Elde edilenkromatogramlarda, tR de¤erine bak›larak kafeine ait pik belirlenir ve alan›hesaplan›r. Üç ölçüm sonucu elde edilen ortalama pik alan› belirlenir. Ka-librasyon grafi¤inden bu alana karfl›l›k gelen deriflim hesaplan›r. Ancak he-saplanan bu deriflim de¤eri seyreltilmifl numuneye aittir. Orijinal numuneninderiflimini bulmak için seyrelme faktörünü hesaba katmak gerekir.

Bir numuneden di¤erine geçmeden önce kolon bir süre hareketli faz ile y›kanmal›d›r.

Yiyeceklerde Koruyucu Madde TayiniYiyeceklerde koruyucu madde olarak benzoik asit, sorbik asit, propionik asit, p-hidroksi benzoik asit, antioksidan olarak ise bütillenmifl hidroksianisol (BHA) vebütillenmifl hidroksitoluen (BHT), askorbil palmitat gibi maddeler kullan›l›r. Ko-ruyucu maddeler, yiyeceklerde oluflan mikrobiyal canl›lar› engellemek ve böyle-


fiekil 7.7

a b

HPLC cihaz›ndabulunan enjeksiyonbölmesia) Yükleme

pozisyonub) Enjeksiyon

pozisyonu

S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P


‹ N T E R N E T ‹ N T E R N E TS O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



likle yiyeceklerin raf ömrünü uzatmak amaçl› kullan›lmaktad›r. Bu tip bir tayineörnek olarak mayonezde benzoik asit, sorbik asit, BHA ve BHT miktar› HPLC sis-temi kullan›larak tayin edilecektir. Analitlerin ayr›m› gradient elüsyon ile gerçek-lefltirilecektir.


Standartlar›n Haz›rlanmas› ve Kalibrasyon Grafi¤inin Elde Edilmesi1. Benzoik asit, sorbik asit, BHA ve BHT içeren 250 ppm 100 mL lik stok çö-

zelti saf su kullan›larak haz›rlan›r. Haz›rlanan stok çözeltiden 100 ppm, 50ppm, 25 ppm ve 10 ppm lik standart çözeltiler haz›rlan›r.

2. Çözücü fliflelerinden birine 0,2 mL H2SO4 içeren 500 mL saf su (A), di¤erineise 500 mL asetonitril (B) koyularak, bir süre ultrasonik banyoda bekletilirve gazlar›n›n giderilmesi sa¤lan›r.

3. Hypersil BDS kolon tak›l› HPLC cihaz› aç›l›r. HPLC sistemine ba¤l› bilgisa-yar program›nda; gradient elüsyon bafllang›çta % 10 B, 3.dakikada % 60 B,4. dakikada % 80 B ve 7.dakikada tekrar %10 B olacak flekilde ayarlan›r.Ak›fl h›z› 2 mL dak–1’ya ve dalga boyu da 260 nm’ye ayarlan›r. Kolon bir sü-re hareketli faz ile y›kan›r.

4. Elde edilen sinyalde bir problem yoksa, seyreltikten derifli¤e do¤ru s›ras›y-la haz›rlanan standartlar cihaza enjekte edilir. Enjeksiyon s›ras›nda cihaz›nenjeksiyon bölmesinin yükleme pozisyonunda olmas›na dikkat edilmelidir.Bilgisayarda bulunan HPLC program›nda yap›lacak ifllemlerle ilgili gereklidosyalar oluflturulduktan sonra, cihaz›n türüne göre; elle veya otomotik ola-rak enjeksiyonun bafllamas› sa¤lan›r. Enjeksiyonun bafllamas›yla da, stan-dart çözeltiye ait kromatogram oluflmaya bafllar. Tüm ölçümler en az üç de-fa tekrarlanmal›d›r.

5. Deriflimi bilinen standart çözeltilere ait kromatogramda gelen ilk pik benzo-ik asit, ikinci pik sorbik asit, üçüncü pik BHA ve dördüncü pik ise BHT’yeaittir. Ancak bundan emin olmak için benzoik asit, sorbik asit, BHA veBHT’nin 50 ppm’lik standart çözeltileri ayr› ayr› sisteme enjekte edilebilir.Bu dört maddeyi içeren farkl› deriflimlerdeki standart çözeltilerin analizlerisonucu elde edilen pik alanlar›ndan her bir madde için kalibrasyon grafik-leri oluflturulur.



Hypersil BDS kolon100 mL’lik balon joje (1 adet)25 mL’lik balon joje (4 adet)Farkl› ölçeklerde pipetlerFarkl› ölçeklerde beherler50 µL lik fl›r›nga

Benzoik asitSorbik asitBHABHTAsetonitrilK4Fe (CN)6 × 3H2OZnSO4 × 7H2OMgSO4pH 7,4 Fosfat tamponuDeriflik Sülfirik asitMayonez numunesi

Mayonez numunesinin haz›rlanmas› ve benzoik asit, sorbik asit, BHAve BHT miktar tayini

1. Protein ve ya¤lar›n uzaklaflt›r›lmas› için mayonez örnekleri önce Carrrez te-mizlemesi ad› verilen bir iflleme tabi tutulur. Bu ifllemde 10 ml mayonez al›-n›r, üzerine 1,75 mL % 7,2 (w/w) K4Fe (CN)6 × 3H2O çözeltisi ve 1,75 mL %14,4 (w/w) ZnSO4 × 7H2O çözeltisi ilave edilir ve 15 dakika kar›flt›r›l›r. Da-ha sonra 6,5 mL % 0,1 MgSO4 içeren fosfat tamponu eklenir. Bu ifllem so-nunda kar›fl›m 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Elde edilen süzüntü 50mM H2SO4 çözeltisi ile belirli bir oranda seyreltilir, süzülerek analize haz›rhale getirilir.

2. Numuneler s›ras›yla üçer defa HPLC sistemine enjekte edilir. Elde edilenkromatogramlarda, tR de¤erlerine bak›larak tayini yap›lacak türlere ait pik-ler belirlenir ve alanlar› hesaplan›r. Üç ölçüm sonucu elde edilen ortalamapik alanlar› belirlenir. Her bir madde kendine ait kalibrasyon grafi¤inden ta-yinden edilir. Ancak hesaplanan bu deriflim de¤erleri seyreltilmifl numune-ye aittir. Orijinal numunenin deriflimini bulmak için seyrelme faktörünü he-saba katmak gerekir.

‹drarda Ürik Asit Tayini‹drarda bulunan ürik asit, ksantin, kreatinin, allopurinol ve nikotinamid gibi kim-yasallar HPLC ile ayr›larak analiz edilebilir. Ürik asitin HPLC ile tayini için literatür-de bildirilmifl bir çok yöntem mevcuttur. Bu deney, bu yöntemlerden en basit veh›zl› olan› seçilerek gerçeklefltirilecektir. Bu yönteme göre ürik asit tayini, C18 ko-lon kullan›m›yla, 290 nm’de isokrotik elüsyonla gerçeklefltirilebilir. Hareketli fazolarak ise 0,05 M amonyum fosfat tampon çözeltisi (pH: 7,4) kullanmak yeterlidir.


Standartlar›n Haz›rlanmas› ve Kalibrasyon Grafi¤inin Elde Edilmesi 1. Önce hareketli faz olarak kullan›lacak olan tampon çözelti haz›rlan›r. Bu

amaçla 3,3 g dihidrojenamonyum fosfat kat›s›ndan tart›l›r ve yaklafl›k 400mL suda çözülür. pH’› bir pH metre yard›m›yla ölçülür ve 7,4 oluncaya ka-dar seyreltik fosforik asit çözeltisi ilave edilir. Daha sonra 500 mL’ye su iletamamlan›r.

2. 50 ppm lik stok ürik asit çözeltisi, 100 mL’lik balon jojede 5 mg ürik asitinpH 7,4 tampon çözeltiyle çözülmesi ile haz›rlan›r. Bu stok çözeltiden 25ppm, 10 ppm, 5ppm ve 1ppm standart ürik asit çözeltileri hacimleri 25 mLolacak flekilde haz›rlan›r.



C18 kolon500 mL’lik balon joje (1 adet)100 mL’lik balon joje (1 adet)25 mL’lik balon joje (3 adet)Farkl› ölçeklerde pipetlerFarkl› ölçeklerde beherlerMembran filtre50 µL lik fl›r›nga

Ürik asitFosforik asitDiamonyumhidrojen fosfat0,1 M NaOH1:1 metanol:su kar›fl›m›‹drar numunesi

3. C18 kolonu tak›l› olan HPLC sitemi aç›larak dalga boyu 290 nm’ye, ak›fl h›-z› 1,0 ml dak–1’e ayarlan›r, analize geçilmeden önce kolon en az 10 dakikahareketli faz ile y›kan›r.

4. Elde edilen sinyalde bir problem yoksa, seyreltikten derifli¤e do¤ru s›ras›y-la haz›rlanan standartlar cihaza enjekte edilir. Enjeksiyon s›ras›nda cihaz›nenjeksiyon bölmesinin yükleme pozisyonunda olmas›na dikkat edilmelidir.Bilgisayarda bulunan HPLC program›nda yap›lacak ifllemlerle ilgili gereklidosyalar oluflturulduktan sonra, cihaz›n türüne göre; elle veya otomotik ola-rak enjeksiyonun bafllamas› sa¤lan›r. Enjeksiyonun bafllamas›yla da, stan-dart çözeltiye ait kromatogram oluflmaya bafllar. Tüm ölçümler en az üç de-fa tekrarlanmal›d›r.

‹drar Numunesinin Haz›rlanmas› ve Analizi1. 0,1 mL idrar numunesi bir behere koyulur ve 10 mL saf su ile seyreltilir. Bir

pH metre yard›m›yla pH’› 2,3 oluncaya kadar seyreltik fosforik asit çözeltisiilave edilir ve toplam hacmi 20 mL oluncaya kadar saf su ilave edilir. Böy-lece idrar numunesi 200 kat seyreltilmifl olunur. Numune 45 µm gözeneklibir membran filtre ile süzülerek enjeksiyona haz›r hale getirilir.

2. Haz›rlanan numune, HPLC sistemine enjekte edilir. Elde edilen kromatog-ramda, tR de¤erine bak›larak ürik asite ait pik belirlenir ve alan› hesaplan›r.‹fllem üç defa tekrar edilir ve üç ölçüm sonucu elde edilen ortalama pik ala-n› belirlenir. Kalibrasyon grafi¤inden bu alana karfl›l›k gelen deriflim hesap-lan›r. Ancak hesaplanan bu deriflim de¤eri seyreltilmifl numuneye aittir. Ori-jinal numunenin deriflimini bulmak için seyrelme faktörünü hesaba katmakgerekir. fiekil 7.8’de bir ürik asit standart›na ve idrar numunesine ait kroma-togramlar görülmektedir.

‹drar numunesi ile çal›fl›l›rken her bir tekrar öncesi, kolonu 1:1 metanol:su çözeltisi iley›kamak gereklidir.


S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



a

b

fiekil 7.8

a) 10 ppm ürik asitb) ‹drar

numunesine aitkromatogramlar,kolon: C18, dalgaboyu: 290 nm,ak›fl h›z›: 1,0 mldak–1, hareketlifaz: 0,05 Mamonyum fosfattampon çözeltisi(pH: 7,4)

HPLC ANAL‹ZLER‹N‹N DE⁄ERLEND‹R‹LMES‹Bir analitin tayini için hangi yöntem seçilirse seçilsin, elde edilen sonuçlar›n de-¤erlendirilebilmesi için yöntemle ilgili performans özelliklerini gösteren say›salölçütlerin de belirlenmesi gerekir. Bu amaçla ölçümler en az üç defa tekrarlanma-l›, standart sapmalar ve ba¤›l standart sapmalar (RSD) hesaplanarak yöntemin ke-sinli¤i bildirilmelidir. Elde edilen kalibrasyon grafi¤ine ba¤l› olarak kalibrasyonduyarl›¤›, analitik duyarl›k, gözlenebilme (teflhis) s›n›r›, tayin s›n›r› ve ça-l›flma aral›¤› belirlenmelidir. Ayr›ca seçilen yöntemin seçicili¤i de tespit edilereksonuçlarla birlikte verilmelidir. Bahsi geçen bu performans özelliklerinin nas›l bu-lunaca¤›na dair ayr›nt›l› bilgi, Aç›k Ö¤retim Fakültesi Analitik Kimya ders kitab› 2.ünitede verilmifltir.

Analitik yöntemlerin de¤erlendirilmesi ilgili daha ayr›nt›l› bilgiyi Enstrümental Analiz ‹l-keleri, Skoog, Holler, Nieman, Çeviri Editörleri: K›l›ç, Köseo¤lu ve Y›lmaz, Bilim Yay›nc›-l›k, 1998 kitab›ndan bulabilirsiniz.

HPLC ile yap›lan bir analizde afla¤›da çizelgede görülen veriler elde edilmifltir. Elde edilenbu verilerden yola ç›karak a) kalibrasyon grafi¤ini oluflturunuz, b) teflhis (gözlenebilme)s›n›r›n›, kalibrasyon duyarl›¤›n› hesaplay›n›z ve çal›flma aral›¤›n› bulunuz


Kalibrasyon Duyarl›¤›:Kalibrasyon e¤risinine¤imidir. Kesinli¤i yak›nolan iki yöntem içinde dahadik kalibrasyon e¤risi verenyöntem tercih edilir.

Analitik Duyarl›k:Kalibrasyon e¤risinine¤iminin, bir deriflimdeyap›lan ölçümün standartsapmas›na bölünmesi ilebulunur.

Gözlenebilme (Teflhis)S›n›r›: Analit sinyaliningözlenebildi¤i fakat kabuledilebilir do¤ruluk vekesinlikte analit tayins›n›rlar› içerisine girmeyenen düflük deriflimdir. Körçözeltinin standartsapmas›n›n (SS) 3,3 kat›n›n“kalibrasyon grafi¤inine¤imine (m) bölünmesi ilebulunur (3,3xSS/m).

Tayin S›n›r›: Analitin kabuledilebilir düzeyde kesin vedo¤ru olarak miktar›n›ntayin edilebilece¤i,do¤rusall›k s›n›r›n›n en altderiflimini oluflturanderiflimdir. Kör çözeltininstandart sapmas›n›n (SS)10 kat›n›n kalibrasyongrafi¤inin e¤imine (m)bölünmesi ile bulunur(10xSS/m).

Çal›flma Aral›¤›: Analitinkabul edilebilir düzeydekesin ve do¤ru olarakmiktar›n›n tayinedilebilece¤i en alt deriflimile kalibrasyon do¤rusunundo¤rusall›ktan sapmayabafllad›¤› deriflim de¤eriaras›nda bulunan ve endo¤ru çal›flma imkan›n›veren deriflim aral›¤›d›r.Analitik bir yöntemin geçerliolabilmesi için bu aral›¤›nen az 102 olmas› istenir.

S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



S O R U

D ‹ K K A T

SIRA S ‹ZDE

DÜfiÜNEL ‹M

SIRA S ‹ZDE

S O R U

DÜfiÜNEL ‹M

D ‹ K K A T




K ‹ T A P



6

Deriflim, ppm Ortalama pik alan› s

0,000 0,032 0,0091

1,00 3,165 0,032

10,0 36,72 0,26

50,0 149,54 0,72

100,0 325,15 8,5


S›v› kromatografisinin temel prensiplerini ve

bileflenlerini aç›klamak.

Kromatografinin dayand›¤› ay›rma temeli türleriniki farkl› faz aras›nda oluflturduklar› farkl› da¤›l-ma dengeleri (KD) dir. Kromatografide etkin olanmekanizmalar da¤›lma (partisyon), adsorpsiyon,iyon de¤iflim ve jel geçirgenli¤idir. Yap›lan biray›r›m›n kalitesi elde edilen kromatogramla anla-fl›l›r. Kolonun seçicili¤i ve ay›r›c›l›¤› piklerin al›-konma zamanlar› ve taban genifllikleri kullan›la-rak belirlenebilir. Kolonun verimlili¤i ise teoriktabaka say›s› ile ölçülür.

Farkl› s›v› kromatografi analiz sistemlerini ta-

n›mlamak.

HPLC cihazlar› genel olarak çözücü haznesi, gazuzaklaflt›r›c›, pompa, numune girifli, emniyet ko-lonu, ana kolon, dedektör ve kaydedici bölümle-rinden oluflur. Ancak farkl› flekillerde dizayn edil-mifl ve özel amaçlara hizmet eden HPLC türleride mevcuttur. Bunlara örnek olarak h›zl› proteins›v› kromatografi (FPLC) sistemi ve nano boyut-larda ak›fl ve çok daha küçük çapl› kolonlarla ça-l›flabilen nano LC sistemleri örnek verilebilir.

S›v› kromatografide yöntem gelifltirmek.

S›v› kromatografi ile yap›lacak bir analiz için yön-tem gelifltirmede en önemli ad›mlar analitlere uy-gun kolon ve hareketli faz›n seçimidir. Uygunsabit faz› bulabilme için s›k s›k kullan›lan kolontürünü de¤ifltirmek çok pratik de¤ildir. Bu ne-denle yöntem gelifltirmede genellikle tek bir tipkolon seçilerek, farkl› hareketli faz bileflimleridenenir. ‹yi bir ay›r›m için k', α ve N de¤erlerininiyilefltirilmesi gerekir. Bu parametrelerden özel-likle k' ve α hareketli faz›n bilefliminin de¤ifltiril-mesiyle rahatl›kla de¤ifltirilebilmektedir. ‹stenenk' de¤erini elde edebilmek için gerekli çözücüoranlar›, baz› matematiksel ifadelerin kullan›m›y-la yaklafl›k olarak belirlenebilir. Uygun al›konmafaktörü elde edildikten sonra α de¤erinin artt›r›l-mas› ise hareketli faz›n kimyasal bilefliminin de-¤ifltirilmesi ile sa¤lanabilir.

S›v› kromatografisi cihazlar›n› kullanarak ana-

liz yapmak.

Bu amaçla ö¤renciler laboratuarda HPLC cihaz›-n› kullanarak, baz› içeceklerde kafein tayini, yi-yeceklerde koruyucu madde tayini ve idrardaürik asit tayini gibi deneyleri yapacaklard›r. De-neylerin yap›l›fl›na iliflkin ayr›nt›l› bilgi için bubölümlerin dikkatlice okunmas› gerekmektedir.

Özet

1NA M A Ç

2NA M A Ç

3NA M A Ç

4NA M A Ç


1. S›v› kromatografisi ile ilgili afla¤›daki ifadelerdenhangisi yanl›flt›r?

a. Analitler, kolonda da¤›lma sabiti (KD) de¤erleri-ne ba¤l› olarak ilerler ve kolonu belli bir s›ra ileterk ederler.

b. Yap›lan bir ay›r›m›n kalitesi elde edilen kroma-togramla anlafl›l›r.

c. ‹yi bir ay›r›m için k', α ve N de¤erlerinin iyileflti-rilmesi gerekir.

d. Hareketli faz ayr›lacak bileflenlerle etkileflimegirmez, tek görevi bileflenleri kolon boyunca ta-fl›makt›r.

e. Kolon verimlili¤i kuramsal tabaka say›s› ad› ve-rilen bir nicelik ile ölçülür

2. Seçicilik faktörünün sembolü afla¤›dakilerden han-gisidir?

a. k'b. Rc. αd. ae. a'

3. Bir pike ait al›konma zaman› 12,2 dakika, taban ge-niflli¤i ise 0,9 dakika ise kuramsal tabaka say›s› kaçt›r?

a. 184b. 217c. 240d. 1018e. 2940

4. Afla¤›dakilerden hangisi HPLC analizlerinde kullan›-lacak çözücülerde olmas› istenen özelliklerden biri de-

¤ildir?

a. Kaynama noktas› fazla yüksek olmamas›b. Viskozitesi düflük olmas›c. Kullan›lan dedektörle uyumlu olmas›d. Toksisitesi düflük olmas›e. Polariteleri yüksek olmas›

5. Afla¤›dakilerden hangisi ters-faz kromatografide çö-zücü olarak kullan›lamaz?

a. Sub. Metanolc. Etilenglikold. Toluene. Asetonitril

6. 0,01 mg’l›k bir numune için afla¤›daki kolon türle-rinden hangisi tercih edilir?

a. Sub-mikro analitik kolonb. Mikro-analitik kolonc. Standart analitik kolond. Preperatif kolone. Makro kolon

7. Afla¤›dakilerden hangisi FPLC ile protein saflaflt›r-mada kullan›lan kolon türlerinden biri de¤ildir?

a. ‹yon de¤iflim b. Jel filtrasyon c. Hidrofilik etkileflimd. Ters faz e. Afinite

8. Bir pike ait al›konma faktörü ters-faz kolon ve % 40metanol % 60 su hareketli faz› kullan›ld›¤›nda 32 olarakelde ediliyorsa bu de¤eri 5’e düflürmek için metanol-suhareketli faz›nda metanol yüzdesi kaç olmal›d›r? (Pola-rite indisleri metanol için 5,1, su için 10,2’dir)

a. % 72b. % 65c. % 42d. % 38e. % 28

9. Afla¤›da verilenlerden hangisi bir analizin de¤erlen-dirilmesinde kullan›lmaz?

a. Analitik duyarl›kb. Kalibrasyon duyarl›¤›c. Cihaz duyarl›¤›d. Tayin s›n›r›e. Ba¤›l standart sapma

10. Afla¤›daki maddelerden hangisi yiyeceklerde koru-yucu madde olarak kullan›lamaz?

a. Benzoik asitb. Aspartam c. Propionik asitd. p-hidroksi benzoik asite. Sorbik asit

Kendimizi S›nayal›m


Afinite Kromatografisi Uygulamalar›

Prof. Dr. Adil DEN‹ZL‹

“Hemoperfüzyon” kan› vücut d›fl›nda dolaflt›rarak tok-

sik (zehirli) maddelerin ar›nd›r›lmas›n› sa¤layan özel

bir sistem. Zehirli maddelerin kandan uzaklaflt›r›lmas›

için kullan›l›yor. Bu yöntemde, kan›n reçine ya da aktif

karbon gibi adsorban bir maddeyle dolu bir kolondan

geçirilmesi ve bir damardan tekrar vücuda döndürül-

mesi sa¤lan›yor. Yani bir t›p merkezinde, kan› vücut d›-

fl›na al›p bir kolondan geçirmek ve bu kolonda kan› te-

mizleyip, kandaki zehirli molekülleri uzaklaflt›r›p, ar-

d›ndan da bu temiz kan› tekrar hastaya verme ifllemi

hemoperfüzyon olarak adland›r›l›yor. 100 y›ldan beri

kullan›lan bu sistemdeki ilk adsorban madde olan aktif

karbon, karbon içeri¤i olan malzemeleri yakt›ktan son-

ra elde edilen çok gözenekli bir malzeme. Birçok zehi-

ri de etkili bir flekilde tutabiliyor. Ancak aktif karbonun

seçicilik gibi bir sorunu var. Kandan uzaklaflt›rmak iste-

nilen zehiri hemoperfüzyon yöntemiyle yakal›yor yaka-

lamas›na ama, baflka yararl› maddeleri de beraberinde

al›p götürebiliyor. Bu noktada bilimsel çal›flmalar, bu

soruna çözüm getirecek “biyoafinite kromatografisi” ya

da “biyoafinite tekni¤i” ad› verilen olguyu gündeme ge-

tiriyor. 1970’lerin ortas›nda afinite kromatografisinin te-

mellerini at›yor araflt›rmac›lar. Seçici ba¤lama özelli¤ine

sahip bir maddenin (ki, bu antikor, hücre, enzim, hor-

mon, reseptör vb olabiliyor), bir destek matriksine ko-

valent ba¤la ba¤land›¤› bir ay›rma tekni¤ini gelifltiriyor-

lar. Böylece kat› deste¤e sabitlenmifl madde bir çözelti-

den ya da biyolojik ortamdan kendi hedef molekülüne

ba¤lanabiliyor. Anahtarla kilit modeli gibi. Son y›llarda

bu modele uygun biyolojik molekülleri tafl›yan poli-

merler hemoperfüzyon tekni¤inde kolon dolgu malze-

mesi olarak kullan›lmakta. Dolay›s›yla ortamdan uzak-

laflt›r›lmak istenilen madde beraberinde baflka bir fley

takmadan uzaklaflt›r›l›yor. ‹flte Adil Denizli’nin çal›flma-

lar›, üretti¤i malzemeler bu konuyla ilgili. Denizli, afini-

te sistemini kullanarak, yaln›zca kolesterolü tutan poli-

merler üretmemifl. Bu konuda laboratuvarda, hem hay-

van, hem insan kan›yla yapt›¤› deneylerde oldukça ba-

flar›l› sonuçlar elde edip, kandan kolesterolü uzaklaflt›r-

may› baflarm›fl. Denizli’nin dünyada tan›nmas›n› sa¤la-

yan çal›flmalardan bir di¤eri de “hiperbilirubinemi”, ya-ni sar›l›¤›n tedavisine sundu¤u çözüm. Sar›l›¤›n tedavi-

sinde afinite kromatografisini önermifl ve bu amaçla da

dünyada ilk kez “boya afinite kromatografisi” ni kullan-

m›fl. Boya tak›l› polimerleri kolonlara doldurup hiperbi-

lirubinemili hastan›n plazmas›n› bu kolondan geçire-

rek, bilirubin düzeyini önemli ölçüde afla¤› çekmeyi

baflarm›fl. TÜB‹TAK destekli bu çal›flmas› sar›l›k tedavi-

sine önemli bir katk› sa¤lam›fl. Denizli’nin metal iyonla-

r› konusunda yapt›¤› çal›flmalar› da oldukça önemli so-

nuçlar elde edilmesini sa¤lam›fl. Çevre kirlili¤ine ba¤l›

olarak vücudumuza giren, kadmiyum, kurflun, civa gibi

a¤›r metaller ve bu metallerin organometalik kompleks-

leri akut zehirlenmeye yol açan ve ayr›ca DNA’da bo-

zulmalar yaparak kansere neden olan maddeler. Dola-

y›s›yla özellikle kandan zehirli metal iyonlar›n›n uzak-

laflt›r›lmas› çok önemli bir olgu. Denizli çal›flmalar›yla,

akut zehirlenmelerde a¤›r metal iyonlar› henüz kanday-

ken kullan›labilecek kolon sistemlerini tasarlay›p gelifl-

tirmifl. Afinite tekniklerinin klinik uygulamalar›ndan bi-

ri de “Talasemi” ya da “Akdeniz anemisi” hastal›¤›n›n

tedavisine yönelik. Akdeniz anemisi genetik kökenleri

olan bir hastal›k. Kanda demir birikiyor ve Akdeniz ane-

misi olan hastalarda vücuttan demir at›lam›yor. Bu de-

mir birikimi özellikle karaci¤erde olup “hemokromato-

zis” ad› verilen çok ciddi bir rahats›zl›k ortaya ç›kart›-

yor. Karaci¤er pas içinde bir demir madenine dönüflü-

yor. Sonucunda ölüm getiren bu hastal›¤›n tedavisiyse,

hastaya yeni plazma verilmesi fleklinde yap›l›yor. Bu te-

davinin hem maliyeti oldukça yüksek, hem de zor ve

riskleri olan bir yöntem. Denizli ve ekibi, kandan demi-

ri uzaklaflt›rmadan hastal›¤›n tedavisine yeni bir çözüm

sunuyorlar. “Moleküler bask› teknolojisi” ile geleneksel

t›bbi teknolojiye alternatif malzeme sunarak “Moleküler

tan›ma” temelinde yeni bir çözüm öneriyorlar. “Uzak-

laflt›r›lmak istenen molekülü, polimeri haz›rlarken yap›

ya ilave ediyoruz. Bir polimer düflünün, top ya da küre

biçiminde. Bununla demir uzaklaflt›rmak istiyorsunuz;

öncelikle demiri, polimeri haz›rlarken yap›ya yerlefltiri-

yoruz, sonras›nda oradan o demir iyonunu söküyoruz.

Söktü¤ümüz zaman demiri 3 boyutlu olarak tan›yan

boflluklar olufluyor. Dolay›s›yla bu polimerler kolona

dolduruldu¤unda, kandan yaln›zca demir molekülleri

uzaklaflt›r›l›yor. Bu bir biyolojik tan›ma mekanizmas›.

Hem üç boyutlu geometrik bir tan›ma var, hem de de-

mirin kimyasal özelliklerine uygun tan›ma sözkonusu”

diyor Denizli bu çal›flmas›yla ilgili olarak. Sonuç olarak

Denizli ve ekibi, daha burada sözünü etmedi¤imiz de-

¤iflik hastal›klar›n teflhis ve tedavisine, biyoteknoloji,

çevre teknolojisi gibi pek çok konuya destek olacak

Okuma Parças›


araflt›rmalar›n sahibi. Onlar, “yükte hafif pahada a¤›r

malzemeler üretiyor ve bu malzemeleri çok de¤iflik

amaçlar için kullan›yoruz” diyorlar. Beklentileri de var:

“Ürettiklerimiz ülkemizde de de¤erlendirilsin ve bize

maddi olanaklar sunulsun. Daha pek çok baflar› ya im-

za atar›z”.

Gülgûn Akbaba

Kaynak: TÜB‹TAK Bilim ve Teknik Dergisi, Eylül 2006

Kendimizi S›nayal›m Yan›t Anahtar›1. d Yan›t›n›z yanl›fl ise, “Kromatografinin Temel

Prensipleri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.2. c Yan›t›n›z yanl›fl ise, “Kromatografinin Temel

Prensipleri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.3. e Yan›t›n›z yanl›fl ise, “Kromatografinin Temel

Prensipleri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.4. e Yan›t›n›z yanl›fl ise, “S›v› Kromatografi Sistemle-

ri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.5. d Yan›t›n›z yanl›fl ise, “S›v› Kromatografi Sistemle-

ri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.6. b Yan›t›n›z yanl›fl ise, “S›v› Kromatografi Sistemle-

ri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.7. c Yan›t›n›z yanl›fl ise, “S›v› Kromatografi Sistemle-

ri” konusunu yeniden gözden geçiriniz.8. a Yan›t›n›z yanl›fl ise, “S›v› Kromatografide Yön-

tem Gelifltirme” konusunu yeniden gözdengeçiriniz.

9. c Yan›t›n›z yanl›fl ise, “HPLC Analizlerinin De-¤erlendirilmesi” konusunu yeniden gözden ge-çiriniz.

10. b Yan›t›n›z yanl›fl ise, “HPLC Uygulamalr›” konu-sunu yeniden gözden geçiriniz.

S›ra Sizde 1

Al›konma faktörlerinin belirlenmesi için Eflitlik 8.1 kul-lan›l›r.

Eflitlik 8.2’den seçicilik katsay›s› bulunur:

Ay›r›c›l›k de¤eri ise Eflitlik 8.5 kullan›larak bulunur:

Seçicilik katsay›lar›n›n 1’den büyük olmas› kolonun se-çicili¤inin iyi oldu¤unun bir göstergesidir. ‹lk iki al›-konma faktörü 2’den büyüktür, dolay›s›yla elüsyon sü-resi de iyi diyebiliriz. Ancak ay›r›c›l›k de¤erinin 1’denküçük olmas› ay›r›c›l›¤›n düflük oldu¤unu göstermekte-dir. Hareketli fazda yap›lacak de¤iflikle hem seçicilikkatsay›s› hem de ay›r›c›l›k iyilefltirilebilir.

S›ra Sizde 2

Da¤›lma Kromatografisi (S›v›-s›v› kromatografi)’nde sa-bit faz genelde bir dolgu maddesine ba¤lanm›fl s›v› mad-dedir. Sabit faz›n polar, hareketli faz›n apolar oldu¤uyönteme normal-faz kromatografisi denmektedir. Sabitfaz›n, silika yüzeyine ba¤lanm›fl apolar gruplar, hare-ketli faz›n ise polar oldu¤u kromatografi türüne ters-fazkromatografisi denmektedir. Normal-faz kromatografiyap›sal izomerlerin ayr›lmas›nda, nikotin gibi alkoloid-lerin, fenollerin, lipidlerin, aminlerin, pestisitlerin, me-tal flelatlar›n›n ve daha bir çok türün ayr›lmas› ve tayi-ninde kullan›l›r. Ters-faz kromatografi ise normal fazkromatografisine göre daha fazla kullan›m alan›na sa-hiptir en çok alkil benzen homologlar›n›n (CnH2n+1),diuron, fenuron gibi herbisidlerin ve türevlendirilmiflaminoasitlerin ay›r›m›nda kullan›l›r.Adsorpsiyon Kromatografisi (S›v›-kat› kromatografi),ayr›lacak bileflenlerin sabit kat› faz üzerinde tersinir ola-rak adsorblanmalar› esas›na dayan›r. Bileflenler birbirle-rinden kat› yüzeye olan farkl› derecede ilgileri nedeniy-le ayr›l›rlar. Adsorpsiyon kromatografisi moleküler küt-lesi 5000’den küçük apolar maddelerin ve izomerlerinay›r›m›nda kullan›lmaktad›r.

R = t – t

(w + w =

– + s

R2 R1

1 2

2 23 5 2 80 6

x x)

, ,( , 1

1 00 88

, ), =

α12 892 11

1 37 = k

k = = 2

1

′

′,,

,

k = t – t

t =

– =

k = t –

1R 0

0

2R

′

′

2 8 0 9

0 92 11

, ,

,,

t

t =

– = 0

0

3 5 0 90 9

2 89, ,

,,

S›ra Sizde Yan›t Anahtar›


Benzer yüklü iyonlar›n tersinir flekilde yer de¤ifltirmesi-ne iyon de¤iflimi denir. ‹yon de¤iflim kromatografisindehareketsiz faz› oluflturan iyon de¤ifltiriciye kimyasalba¤larla ba¤l› yüklü gruplar, hareketli fazdaki benzeriyonlarla yer de¤ifltirirler. Böylece de¤ifltirilebilir iyontafl›yan maddelerin (asitler, antibiyotikler, amino asitler,alkoloidler vb.) ayr›lmas› sa¤lanm›fl olmaktad›r. Jel kromatografisinde kolonlar genifl gözenekli polimerveya silika temelli reçine ile doldurulmufltur. Bir numu-nedeki bileflenler bu jel gözeneklerinde büyüklük veflekillerine göre oyalanarak farkl› zamanlarda kolonuterk ederler ve böylece ayr›lm›fl olurlar. Jel kromatogra-fisinin en önemli uygulama alan› polimerlerin molekü-ler kütle aral›klar›n›n belirlenmesidir.Görüldü¤ü gibi tüm mekanizmalar›n geçerli oldu¤u vekullan›labilecekleri alanlar farkl›d›r. Analizi yap›lacaknumuneye göre ve elde bulunan mevcut cihazlara göreen uygun yöntemi seçmek analizcinin görevidir.

S›ra Sizde 3

Baz› çok bileflenli numunelerin HPLC analizlerinde, ba-z› pikler çok çabuk ve birbirine girmifl flekilde, baz› pik-ler ise çok geç elde edilebilir. Bunun nedeni numune-de bulunan türlerin polarite çeflitlili¤idir. Bu gibi du-rumlarda elüsyona, kolondan ilk ç›kan türleri birbirin-den ay›rabilecek oranda ayarlanm›fl hareketli faz bilefli-mi ile bafllan›r, elüsyon devam ederken bu oranlar de-¤ifltirilerek geç ç›kan piklerin de daha önce gelmesisa¤lan›r. Bu durum gaz kromatografisindeki s›cakl›kprogramlamas›n›n gereklili¤i ile benzerdir.

S›ra Sizde 4

Dedektör seçerken öncelikle bir dedektörün sahip ol-mas› gereken baz› temel özellikleri tafl›yor olmas›nadikkat etmek gerekir, bu özelliklerden baz›lar›; daya-n›kl› olmas›, ak›fl h›z›ndan ba¤›ms›z olmas›, bileflenlerezarar vermemesi, kullan›lmas› kolay ve güvenilirli¤iyüksek olmas›, ucuz olmas› vb.dir. Bu özellikleri tafl›-yan dedektörler aras›nda ise seçimi, tayin edilecek bile-flene göre yapmak gerekir. HPLC ile yap›lan tayinlerdeen çok UV dedektörler tercih edilir. Analit UV absor-bans özelli¤ine sahip de¤ilse k›r›lma indisi dedektörütercih edilebilir. Ancak bu dedektörün de hassasl›¤› çokyüksek de¤ildir. Bu nedenle genellikle polimerlerle il-gili çal›flmalarda kullan›l›r. Çok hassas bir analiz isteni-yorsa ve analitlerin floresans özelli¤i varsa floresans de-dektör kullan›labilir.

S›ra Sizde 5

Bafllang›çta elde edilen k'1 = (18–0,42)/0,42 = 42

k'1 için P'1 = 0,5 × 5,1 + 0,5 × 10,2 = 7,65

k'2 = 7 olmas› isteniyor. Bu veriler Eflitlik 7.6’da yerinekoyarak P'2 de¤eri bulunabilir.

Her iki taraf›n logaritmas› al›narak çözüm ifllemi kolay-laflt›r›l›r.

P'2 = 6,09 olarak bulunur.

Bulunan bu de¤er al›konma faktörünün 7 olmas› içingereken çözücü gücüdür. Bu polariteye sahip kar›fl›m›nbileflimini bulmak için ise Eflitlik 7.7 kullan›l›r. Buradametanolün hacim kesrine x dersek, suyun hacim kesride 1–x olur.

6,09 = x × 5,1 + (1 – x) × 10,2

X = 0,80

Elde edilen sonuca göre hareketli faz olarak % 80 me-tanol, % 20 su kar›fl›m› kullan›ld›¤›nda kapasite faktörüyaklafl›k 7 olur.

S›ra Sizde 6

a) Kalibrasyon grafi¤i afla¤›da verildi¤i flekilde elde edi-lir. Elde edilen do¤runun denklemi de grafik üzerin-de belirtilmifltir.

– = –

0 787 65

22,

,′P

742

10 2 7 65 2 = ( , ) /′−P


b) Kalibrasyon duyarl›¤›, do¤runun e¤imidir, yani3,208’dir.

Teflhis s›n›r› (gözlenebilme s›n›r›):

Çal›flma aral›¤› eldeki bu verilere göre 0,0283-100ppm’dir. Ancak henüz kalibrasyon do¤rusunda bir sap-ma yoktur, dolay›s›yla kesin çal›flma aral›¤›n›n belirlen-mesi için daha yüksek deriflimlerde de ölçüm yap›lma-s› gereklidir.

Bauer, H.H., Christian, G.D., O’Reilly, J.E. (1978).Instrumental Analysis, Boston: Allyn and BaconChemistry Series.

Casella, G.I., Pierri, M., Contursi, M. (2006). Journal of

Chromatography A, 1107, 198-203.Cataldi, T. R. I., Angelotti, M., ve Bufo, S. A. (1999).

Anal. Chem. 71 (21), 4919-4925.Hargis, L.G. (1988). Analytical Chemistry Principles

and Techniques, New Jersey: Prentice-Hall.Hüsgen, A.G. ve Schuster, R. (2001). HPLC for Food

Analysis, Germany: Agilent Technologies Com-pany.

Jen, J. - F., Hsiao, S. - L. ve Liu K. - H. (2002). Talanta,58, 711-717.

Lehrer, R. (1981), Amer. Lab. 13 (10), 113.Robinson, J.W., Skelly Frame, E.M., Frame II, G.M.

(2005). Undergraduate Instrumental Analysis

(6th ed.), New York: Marcell-Dekker.Sawyer, D.T., Heineman, W.R. ve Beebe, J.M. (1984).

Chemistry Experiments for Instrumental

Methods, Canada: John Wiley and Sons, Inc.Skoog, D.A., Nieman, T.A. ve Holler, F.J. (1998).

Principles of Instrumental Analysis (5th ed.).Enstrümental Analiz ‹lkeleri (Çev. Editörleri: E. K›l›ç,H. Y›lmaz ve F. Köseo¤lu). Ankara: Bilim Yay›nc›l›k.

Y›ld›z, A., Genç, Ö., Bektafl, S. (1997). Enstrümental

Analiz Yöntemleri, Ankara: Hacettepe Yay›nlar›.

Gözlenebilme sınırı = = 3,3 0,0091

3,208

3 3, SS

m

×== ppm

Tayin sınırı = =

0 0094

10 10 0 0091

3

,

,

,

SS

m

×2208

0 0283 = ppm,

Yararlan›lan Kaynaklar

aletl‹ anal‹z laboratuvari 7 - anasayfa · bilindi¤i gibi kromatografi tekni¤inde...

Documents