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Alimentos Analizadas (2005-2010) Técnica: Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7
USDA/FSIS - CAA art. 255 / 302Muestras: 117 Totales. Positivas: 37 %
Porcentajes de muestras positivas en los distintos alimentos
• Chorizo 71%• Carne molida 40%• Hamburguesa 13%• Hamburguesa 13%
Primers Secuencia de oligonucleótidos ( 5´- 3´) Tamaño del fragmento (pb)
Stx 1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG130
Stx 1 b AGCGATGCAGCTATTAATAA
Stx 2 a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT346
Stx 2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT
O157F CGGACATCCATGTGATATAGG259
O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC
Genotipos detectados en Muestras de Alimentos
Aislamiento de Salmonella spp. Por tipo de alimento y método de aislamiento utilizado.
Fabricantes de estuches comerciales• BAX (Qualicon, USA). Salmonella. Listeria. Listeria
monocytogenes y E. coli O157:H7– Reactivos en tabletas y termociclador convencional– Utiliza un gel de electroforesis– No requiere extracción de ADN.– La inclusividad y exclusividad son casi del 100%. Los falsos + y
falsos – son casi cero.• Probelia (Sanofi, France). Salmonella. Listeria.
– El sistema intenta eliminar la contaminación del producto de PCR al sustituir timina por uracilo.
• TaqMan (Perkin Elmer, USA). Salmonella. En desarrollo para: Listeria y E. coli O157.– Sistema de sondas e incorpora el marcador TaqMan que no es
fluorescente en su forma nativa pero la actividad exonucleasa de la DNA polimerasa libera un producto fluorescente, el cual es detectado y cuantificado.
– Cuantifica el microorganismo de interes.
• (ISO 8402)Es la confirmación mediante la evaluación y la provisión de evidencia objetiva, de que se cumplieron los requisitos para un uso pretendido y específico.
• Las metodologías publicadas deben ser reproducibles en cualquier laboratorio correctamente
Validación
reproducibles en cualquier laboratorio correctamente equipado.
• Ej. Validación para Salmonella.– 16 laboratorios– Secuencia blanco Gen invA– Se probaron 364 cepas– Resultados: Inclusividad: 99.6% Exclusividad: 100%– Metodología como Estandar Internacional.
Pruebas de validación.• Estudio de Viabilidad
– Detección en una gama de concentraciones• Desarrollo y estandarización del ensayo
– Debe optimizarse: • Toma, preparación, transporte de muestra y
método de extracción.• Parámetros, protocolos y reactivos.• Parámetros, protocolos y reactivos.
– Repetitividad y Reproducibilidad.– Sensibilidad (limite de detección.)
• Dilución de punto final– Especificidad analítica
• El ensayo distingue entre el agente diana y otro agente estrechamente relacionado.
• Frecuencia de validación (1 año).• Perfil térmco.
Parámetros de validación:Exactitud, Uniformidad, Heat Rate, Cool Rate, Undershoots, Overshoots. (huella dactilar).
Uniformidad
Exactitud
Overshoot
Conclusiones
– Alta sensibilidad y especificidad , bajo costo , y la versatilidad que posee.
– Son cada vez más utilizadas para el diagnostico: • “Screening ” de los serotipos más frecuentes • Resolución de cepas problemáticas (rugosas, autoaglutinantes)
– Aporta a la Vigilancia Epidemiología:• Otorga información segura y a tiempo .• Respuesta en tiempo real , ayudando a Identificar el patógeno , • Respuesta en tiempo real , ayudando a Identificar el patógeno ,
determinar el origen y la fuente , demostrando que el patógeno proviene de la fuente, describe la transmisión del patógeno.
• Relaciona casos “aparentemente” esporádicos con brotes.• Aporta al desarrollo de estrategias de intervención, reducir y controlar
la presencia y diseminación de los patógenos.
“Requieren un cierto nivel de conocimientos en herramientas básicas de biología molecular y la falta de estandarización” .
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Calidad de los resultados
• Metodos estandarizados Verificación• Metodos modificados Validación
