alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass...

10
Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening Alexander Beck 1,3 *, Martin Deeg 2 , Klaus Moeschel 1,3 , Eckhart K. Schmidt 2 , Erwin D. Schleicher 1 , Wolfgang Voelter 3 , Hans U. Ha ¨ ring 1 and Rainer Lehmann 1 1 Klinisch-chemisches Zentrallabor der Universita ¨tskliniken, Abteilung Innere Medizin IV, Universita ¨t Tu ¨ bingen, Otfried-Mu ¨ller-Strasse 10, D-72076 Tu ¨ bingen, Germany 2 Interdisziplina ¨res klinisches Forschungszentrum der Universita ¨ tskliniken, Waldho ¨rnlestr. 22, D-72072 Tu ¨bingen, Germany 3 Abteilung fu ¨r Physikalische Biochemie, Physiologisch-chemisches Institut der Universita ¨t Tu ¨bingen, Hoppe-Seyler-Str. 4, D-72076 Tu ¨ bingen, Germany Received 10 October 2001; Accepted 12 October 2001 SPONSOR REFEREE: Dr. David R. Goodlett, Institute for Systems Biology, Seattle, WA, USA A rapid on-line method for the identification of phosphorylated peptides in enzymatic protein digests by specific marker ion signals is described. In our study we investigated the use of alkaline conditions together with a previously described method for selective and sensitive detection of phosphopeptide ions combining high-performance capillary liquid chromatography LC) and electrospray ionization mass spectrometry ESI-MS). 1,2 Phosphorylation-specific marker ions m/z 79, PO 3 , and m/z 97, H 2 PO 4 ) were generated by skimmer collision-induced dissociation sCID) in the negative-ion mode. The method was evaluated and validated for mono-phosphorylated synthetic peptides using different alkaline pH values and CID offsets. Alkaline conditions pH 10.5) enhance the generation of phosphopeptide-specific fragment ions from serine- and tyrosine-phosphorylated peptides, and enable the use of m/z 79 PO 3 ) and m/z 97 H 2 PO 4 ) as phosphorylation-specific marker traces. Note that HPLC separation in trifluoroacetic acid containing solvents impairs the use of m/z 97 C 2 F 3 O fragment ion at m/z 97) as a phosphorylation-specific marker. The optimized method was applied for the detection of phosphorylated peptides in a tryptic b-casein digest. The expected mono- and tetra-phosphorylated peptides were detected and rapidly identified by mLC/ESI-sCID-MS and mLC/ESI-MS analysis. Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. The reversible phosphorylation/dephosphorylation of pro- teins represents an important mechanism by which cells regulate fundamental cellular events, such as cell growth, division and differentiation, cytoskeleton dynamics, signal transduction, gene expression, metabolism and memory. 3±5 Investigation of the complex regulatory networks and signal transduction systems in eukaryotic cells is, therefore, a major focus of current cell biology and biomedicine. Proteins are phosphorylated at specific serine or threonine residues and, less commonly, at tyrosine or other amino acid residues such as histidine. 3 Recent results indicate that dysregulated cellular phosphorylation/dephosphorylation of proteins is involved in the manifestation of different diseases, including metabolic diseases; e.g. in the insulin resistance which may lead to type 2 diabetes mellitus. 6 Therefore, identification of the phosphorylation sites is essential for understanding the relationship between altered molecular structure and dys)- function. However, the precise identification of phosphory- lation sites remains a major analytical challenge for the following reasons: i) the low abundance of the target molecules, particularly those involved in signal transduc- tion, ii) the low phosphorylation stoichiometry often <5%), iii) the amount of biological sample is often limited, and iv) multiple phosphorylation sites; e.g. the signaling molecule insulin receptor substrate 1 IRS 1), contains numerous Ser, Thr, and Tyr residues which are all potential phosphoryla- tion sites. 7 Considering these multiple problems it is evident that sensitive and selective analytical methods are required for detection and sequence determination of phosphopep- tides. 8 During the last few years, mass spectrometric methods developed for the identification of proteins and peptides have proved to be useful for the micro-characterization of post-translational modifications like phosphorylation. 9 This has led to the partial replacement of the classical techniques for phosphopeptide analysis like thin-layer chromatography and Edman degradation of 32 P-labeled phosphoproteins by mass spectrometric methods. 10 Due to their inherent selectivity, specificity and sensitivity, electrospray ionization mass spectrometry ESI-MS) in combination with liquid chromatography LC), as well as nanoelectrospray mass spectrometry NanoES-MS), have offered new analytical *Correspondence to : A. Beck, Zentrallabor/Abt. Innere Med. IV, Universita Ètskliniken Tu È bingen, Otfried-Mu È ller-Str. 10, D-72076 Tu È bingen, Germany. E-mail: [email protected] DOI:10.1002/rcm.511 Copyright # 2001 John Wiley & Sons, Ltd. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001; 15: 2324±2333

Upload: alexander-beck

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

�������� ���� �� ������ ���������� ��� �� ���������������� �������������� ����������� ��������� ���� � �� ������������� �� ������

Alexander Beck1,3*, Martin Deeg2, Klaus Moeschel1,3, Eckhart K. Schmidt2,Erwin D. Schleicher1, Wolfgang Voelter3, Hans U. Haring1 and Rainer Lehmann1

1Klinisch-chemisches Zentrallabor der Universitatskliniken, Abteilung Innere Medizin IV, Universitat Tubingen, Otfried-Muller-Strasse10, D-72076 Tubingen, Germany2Interdisziplinares klinisches Forschungszentrum der Universitatskliniken, Waldhornlestr. 22, D-72072 Tubingen, Germany3Abteilung fur Physikalische Biochemie, Physiologisch-chemisches Institut der Universitat Tubingen, Hoppe-Seyler-Str. 4, D-72076Tubingen, Germany

�������� �� ���� ����� ������� �� ���� ����

SPONSOR REFEREE: Dr. David R. Goodlett, Institute for Systems Biology, Seattle, WA, USA

� ��� ������� ����� �� ��� ������������� �� ������� ����� ������� �� ��������� � �����

������ �� �������� �� �� ��� ������� �� ��� ���� �� � ��� �� ����������� ��� �� �� ��������

��������� ������� ���� � � ������� ��� ��� ����� �� ��������� �� ��������� �������� ��

������������� ���� ��������� ������� �� ����� ������� � ���� �� ������ ���� �� ! ��

����� ��� �� ���������� ���� ����� ���� � �"#��$#!�%&' (������ ���������������� �� �� ���� ����

)*& (+,�& ����� *)& -'(+.

�! �� � ���� ��� �� ������ �������������� ����������� �� �/! �� ��������������� ���� 0�� ����� ��� ������� �� ������� �� ������������ ����� ���������

������� ���� ���� ��� �������� �- ����� �� �/ �������� �������� ��������� ��- %1�2! �������

��� ���� ����� �� ���������������������� � ������ ���� � �� �� ���� �� �� ������������� �����

�������& �� ������ ��� �� ����� )* �(+,�! ����� *) �-'(+.

�! �� ������� ���������������� �� �� � ����� 3��� ���� -(� ���� ����� �� � ���� ������� ��� ���������� �������� ����� � ��� �� ����� *)

� '4,+� � ������ ��� �� ��� *)! �� � ������� ���������������� �� �� � 0�� �������� ����� ���

������ �� ��� �������� �� ������� ����� ������� �� � � ����� �������� ������ 0�� �5����������

�� ��� ��������� ����� ������� �� � ������ �� ����� �������� �� �� �"#��� �/�$# ��

�� �"#��$# ��������� ��� ���� � '11% 6��� 7���� 8 #���& ���

��� ��� ����� ������� ���������������� ������ �� � ��

���� �� ����� �� ���� �� ��������� �� ����� �����

������ ���������� ������� ����� ���� �� ���� � ���

�������� ��� ����� ������� ����!����� �������� ������

��������� ���� �"� ������ ��������� ��� ���� �#$%&

'���������� �� �� ������" ������ � ���� !� ��� ������

��������� ������ �� ��!� ���� ����� �� �� ��� � � ��(�

����� �� �� �� ���� ������� ��� �����������# ) ����� � �

������� ����� � �������� �� ��� � � ������ ������� ���

���� �������� � � ����� � ��� ����� ���� ������� ����

�� ��������#$ ����� ����� ������� �� ��� �������

������� ������� ���������������� ������ �� � ����� ��

�������� �� �� ����������� �� ����� �� �������� ���������

�������� ��������� �#�# �� �� ������� �������� ����� ���

���� � ��� � ������� �������#* ��� ��� � ������������ ��

�� ������� ������ ���� �� �������� �� ���� ������� ��

���������� ������ ��� �� �������� � ��� � ��� +���,�

�������# -����� �� � ����� ������������ �� ������� ��

����� ���� ������ � ��(� ��������� ��������� �� ��

��������� ������. +�, �� ��� ��������� �� �� � ��

��������� �� ����� �� ���� �������� �� ������ �������

��� +��, �� ��� ������� ������ ��������� � +���� �&/,

+���, �� ����� �� ���������� ������ �� ���� ������ ��� +��,

������� ������� ������ ����� �#�# �� ��������� ��������

������� ����� ���� �� � +'�0 �, ������� ���� ��� 0�

�� ��� �� ������� ����� � � ��� ������� ������� ����

��� ����#1 2������ ��� ���� ������� � ������ � �� ������

�� �������� ��� �������� ��������� ������ � � �3�� ��

�� ������� ��� ��3����� ��� ������� �� �����������

����#4

5� ��� �� ��� ��� ��� � ���� ���� ��� �� ������

��������� �� �� ������������ �� � ����� ��� �������

���� � ���� � �� ������ �� �� ��� ����� ��� �6���� ��

���� ���������� ������������ ��!� ������� ������#7 ����

��� ��� � �� �� ��� ��������� �� �� ��������� �����3���

�� ������������� �������� ��!� �������� �� ����� ����

��� 8���� ��� ������ �� $�)�������� �������� ����� ��

���� ���� ��� �� ������#�� 5�� � ��� ���� ��

��������� ���������� ��� ��������� ���� ��� �� ����6����

���� ���� ��� � +80'�90, �� ���������� ��� ��3���

�� ����� ���� +:2, �� ���� �� �������� ��� �� ����

���� ��� � +;���80�90, ���� ���� �� ��� ���������

*������������� �. �# <��! =�� ������ ���# '��� � 9��# '> ?���� ���@�!����!�� ��@ ������ � ����9�@ ��� �0 # �� 5�1��1*��@ ������ A� ����#8�����. ���"���� #<��!B������������#��

5'.��#����� ��#&�� 2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�#

��)'5 299?;'2��';0 '; 9�00 0)82��98��F

��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

Page 2: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

� ������ �� ���� ��������� �� ������ �� ��������������

�� ��6����� � ���� ������#

0������� ������� �� ������� ����� ������� �� ������"

��"� �� ��� �� �� �� ��� �� ����������������� ���������

��� +2'5, �� �������������� ����� ����� � �� �� �����

�� ������� ��������������� �� !� ����#� 2���������� ������

��� �� � ������������� �������� ��� ������� � �������

��� �� �� 2��) ��� # '� �� ����������� ���� �� 2� ���

�) ���� ��������� ���� �� �� �� ����� �� � -�)G� +���

71, � � )$� +��� 17, ��� ����������# ��� ���� ���������

����� ������ �3�� �� �� �� �� ����� �� ��� 17 ��� 71

� ����� ���� ������� � �� �� ���� �������� ������#��

<�� � ����� ���� ��� �� ���� �� �������������

������� ���� �� �!���� 2'5� � ��%�G � �� ��������� ����

� ��� �� ���� ��������#�&%�1

;���80�90�4 ����� �� ����������� ���� � ��� �� ����

���� �����3�� �� � ��������������� ����� �� ��������

������ �� ������ �� ��� �������� �������� ����

������#�&%�1 �� ������ ��� �� 2� � ��� �& �� ���

�� �� ��!����� �� ����� ������� � ����� �������� �� ����

������ �� ��� ������� ��������������� �� !� ����������

�����#�* �1 -����� �� ����� ��� �� ���������#

H� ��� �� ����� ��� �� ������� � �� � �������� ��������

������� � ��������� ���� �� �� ����� ��� ������� �����

����������# 0������� ���� �������������� �� ����� ��

���� ��� ��� ��������� � ��� ����� �������� ��

��� �������� ������ ��"� �� �� ����� �� � �����

����6��� ��������� ��� ���� ��� �� � ���!�� ����6���

��������������# �� ��� ����� � �� ����� �� ������� ��

�������������� �� !� ���� �� ������ �� 2'5 �� ���������� ��

� ���� ����� ������ �� �� ������ ���� � ����� ������ ��

��� �� ��� �� �� � 3��� ����� ���� �����6� +�!����

�����,# 5�� � �� ���������� � ������ �!���� 2'5 +�2'5,

��� :2 ��� ������� ����� ������ ���� ���� �� �������

�� ���� � �� � ���� ������ ��� �������� ������� ��

������� ��������������� �� !� ����# ?� � ��� :2 ����

�� :2�80'��2'5�90 ������ ��� ���� ��� ��� ����

������ ���������#� � ��%�G �7%��

��!�� ����� �������� ;���80�90 ���� ��!����� ����

������ ����� � �������� ������� ��������� �� ��������

������� ����� �� ���� ����� �� �� ����� � ������ �� �

�� ������� :2�80'��2'5�90 ��� ���� ���� ������ ������

���� �� ���� ��������# ��� ��� � � ��� �� ��� �� �� ����

� ������� �� ��������� �� ��� � ������ �#�# ����

�"�� ������ ��������� �� �� ��� ����� ��������� �� ��

������� �� ������� ��������������� �� !� ���� �� �

�� ������ �����# -� � �� �������� �� �����6��

����� �� �� �������� ������� ������� �� �����������

���� �� � ���� ����� �� ����������� ���� ��!�����

:2�80'��2'5�90#

"9(":�$"30��

$��� ����-):2�� ��� ������� ����� ������ ���� +�H�, ��� �3��

���� ������� �� � ������� � �� 9� �! +5� ����

A� ����,# ��2����� ��� �� ������ � �� 0���� 2�������

2������ +0# :���� 9 ?0�, ��� ��� �� �� �� �� �����

� �� � ��������# �)2I� ���� ����� ��� ������� � ��

D� ������ <���������� 2���� ���� +:�!����� ;C

?0�,# ��2����� ��� ������� �� ��������� �� �.��� +���,

��6����� ���� ��� �� &� �9 �������� ���� �����

����� �- 4#& �� �* � � $1°2# ��� ������ ��� � ������

�� ������������ �������� �� ��������6����# ��� �������

0� �������� ����� ��� ����! � ���� +-0), � �����

������ +4�%7$ 2:;�J:�00A>08'�� �*G�#4 5�, ��� �� �

������� ����� ��*� ��� � � ����� ������ +&��%&$$

�0�8)J�FJ)A8;:� �&G$#& 5�, �� � �� ������ � ��

<����� +-������� � A� ����,#

-(� ���������� 0�!�� -):2 +H�@ �������� ��! A� ����, ��� � ����

�� �� 1&� �:���� ��� ���� �� ��� :2 ��������# )�����

���� ����� �� � �� ��� �� �� � �0I�A�� 0��� 50 � ��

��� �� � $�� �� �#�# �)�-):2 ������ +A �� -� ���� ��

I��� A� ����, ����� ��� �� ���� �������� � �

�������� ����� 4��& ��(��� +�������� '�� 2� ?0�,

�3������ ��� � &��: ������ ����# ��� ������ ���� ��

��� ��(���� � & �:���� � ���� � �&�.� � �������� ����#

0������ �� � ����� ����� � ����� � ����� � �� �/ < �

4�/ < �� G� ���# H� ��!����� ��������� ������ � +�3�����

;-$ �- ��#&, ��� ������ < +4�/ ������ ��� �� �3�����

;-$ �- ��#&, �� � ����# H� ������ ��������� ������ �

+�#�&/ �3����� �H�, ��� ������ < +4�/ ������ ��� �#�*&/

�H� �� ��� , �� � ����# H� ���� �"�� ���� &� ���� �� ��

� ��� �������� ���� ����� �� � ��������� �� & �: ������ �

��� ��(����#

$��� ����� ���� �� ��������8��� ��� �� ���� ���� � �� � ��3�� �� �� � H������� 9��

�0J 1�� �����3��� ����� ���� ���� ���� +)��� ���

2� ?0�, �3������ ��� �� 80' ��� ��# � &���� �#�# ������

������ ������� � ��� ���� �� �� �� �� ������# 0������� �� �

�� ���� ��� � ������� �� ���� �G#& !># �� ��������

�!���� 2'5 ���� ��!����� ��������� �� ������� �� ���

17 ��� 71 ������� ��������������� � ����� ���� ����

���� �2'5 ����� ��� �� �������� ������������� ����

���� ��� �2'5 ����� �� ����������� ���� � ��� ���

��3������� ����� ��� ����# ��� ����� �� � ��� �� '2:

+'�� ���� 2�� �� :�������,� ��� ��� �� ���� ������

+�2'5 ����� ���� ���� ���� ���, � � �� ����� ���

����� ��� � � �"����� ���� �� ���� �����# 9��� ���� �

�� � ��3�� �� �� ����������� �� �� ������# J$ ��� �������

��� � ���� ���� �� 1&%��& �� �#& � +����������� ����

���� ����� ������ �2'5, �������� �� � ���� ���� �� $��%

�&�� �� $ � +�������� � ����������� ���� ��� �����

������,# H� �� ����� ���� �� �������������

2:;�J:0�0A>08'� +* ������:, � �0�8)J�FJ)A8;:

+*#& ������:, ��� ������� +& �:����, ��� � -� �� � �� ����

���� �� &�/ 9�- � ����� �� �- ������ +��(���� ���

�������� �- 4#� 4#& 7#� 7#& ��#� ��#& ��#�, ��� ��

�������� �� &�/ 9�- � �- �#& +�H�, ��� �- ��#& +;-$,#

H� ��!����� ������� � �:2�80'�90 ��� �:2�80'��2'5�90

�"�� ����� � ������� �� 1�/ �3����� 9�- ��� ���� ��

����� ��3��� � � ���� �� �� & �:���� ������� ��� � �������#

0���� ��� +;�, � ���� � ��� *� ���# 2�������� ����

�� �:2�80'��2'5�90 �"�� �����. ����������� ����

�$� > �)'�2'5 ����� J$ ��� ������� ��� � ���� ����

�� 1&%��& �� �#& �# 2�������� ���� �� �:2�80'�90 �"�� ��

����. �� > �)'�2'5 ����� +���, J$ ������� ���� ���� ��

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�&

Page 3: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

Figure 1. Comparison of positive- and negative-ion mode �LC/ESI-MS experiments under acidicconditions (TFA) using 50 pmol tryptic �-casein digest each. (a) Positive-ion mode; lower trace: basepeak (BP) chromatogram; upper trace: extracted ion chromatogram (EIC) of the mono-phosphorylated peptide. (b) Negative-ion mode; lower trace: base peak (BP) chromatogram; uppertrace: EIC of the mono-phosphorylated peptide.

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

�$�* �# <��! � ���

Page 4: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

G��%�&�� �� $ � +����������� ����, ��� ��� > �)'�2'5

����� +���, J$ ������� ���� ���� �� $��%�&�� �� $ �

+����������� ����,#

/������� ��� ��H� ���������������� ��� � ����� �� �� ������

�������������� � ������ � �� �� ��������� �� ��

'�� ���� ��� ����# '� � �� � ������� �� �����������

���� �� ����������� ������ ��� ��� �������� ����

+K9 � -L�, �� � ��������� � �� ��� ������ ��� ��� ����

��� ���� �� �� ���� ��� �� �� � ���� ������� ��� ��#

��� 0D'00�)�� �� � ����� ���� �� �������� ���

)��***# � ����� ��� ���� �� ��6��� ��� ������� �� ��

� ��� ������ ��������#

Figure 2. Comparison of electrospray mass spectra from the phosphopeptide signals of the EICs shown inFig. 1. The mass spectra correspond to the tryptic phosphopeptide Phe48-Arg63 (FQpSEEQQQTEDELQDK,Mr = 2060.8 Da) from �-casein digest in (a) positive-ion mode and (b) negative-ion mode.

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�1

Page 5: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

:"#;�0# �3/ /�# ;##�+3

�� �"#��$# �������� �� � ����� �������� ��������� ���������� �� ����6���� �� �������������� �� ������

��"� �� �� � ��(� � ����� �� 80'�90������ �����������

��� �� ������# ���� ���� �� ���! �� ���������� �� ��!��� ���

� ��������� ������ ������� ������� ��� ������� �� �

���� ����� �� � �������� ���� � � �� ��������������

��� ��� ���� ���� ��� � � ������� ����� � ����

��������� � ��� � � ���� ���� ��������� �� �� ��� ���

��"� � ��� ���� � ������ ��� ��� �� ����������� ��

���� ������� �� �� �� �� ��������� �� 80'# H� �� �� �

������� ������ �� ���� ��3����� �� ����������� ��

���� ��� �� ������� ����� �� � �� � ����� ������ ����

����� �� ����6���� ������������# 0���� �� ������� �����

�� � �� �� � ������ ��� �� � �� ���� ���������� � ������

��� �� ��� � ���� ���������� ����6��#�$ H� �� �����������

�� ����������� ���� �:2�80'��2'5�90 �� �� �� ��� �

����� ���� �� �� ���������� �� ������������� ��� �� ���

��� ������ �������� ��� ����������� ���� 80' ����

������ ���� ���� ��������� �� �:2 �� ������� ��� ��

80' ��� ��#

H��� � � ����� �� ���� ���! +<), ��� �� �" ���� ���

�� ����� ��� +8'2, ������� � �� �� �������� ���

����������� ���� �:2�80'�90 �"�� ����� ����� &� ����

���� �������� ����� ���� ������ +�H�, ���������# ���

��3������ ��� ���� �� ������� ������ �� �� �� � ������

���� ������� � � �8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��

Figure 3. Effect of negative-ion mode sCID offset voltage and varying alkaline pHvalues on m/z 79 (a) and m/z 97 (b) fragment-ion intensity of the Ser-phosphorylated heat shock protein fragment peptide (81–93,CLNRQLpSSGVSEIR).

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

�$�4 �# <��! � ���

Page 6: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

+����� ����. �*%G� �������� ����� $���#$ 5�, ���

HJ�088JJJ�858:J5I +����� ����. G4%*$ ��������

����� ��*�#4 5�,# H� 8'2 ������� �� ��������������

�� ��������� ��� ������ �� �� ������ ��� ��� ��������

���� �� �� ��� ����� ���� ������������� ������ �� �

����# �� ��� �� ���� �� H��# � ��� ����� ���� � ��

������� �� �� ������������ ����� ������

+HJ�088JJJ�858:J5I ��� ��$�#& K9 � �-L�� ���

���7#1 K9��-L��,� ������ ���"������� �� � �������

��� ����� ������ ������ ��� �� �������� �� ��� �����

+��� �� �����,# ���� �� ��������� �� ����� ��� �� ����

+�$ � �&, ��� �� ����� ���3������� ������� �� ���

������# ?��� �� ������ �� ����� ����� ��������� +���

� ����� �� ��� ������ � ����� ������, �� ����6���� �� ��

� ��������� ����� ������ ��� �� ���� ����� �� ������

��� ����������� ����� �������# ��� ������������ ��

���� ������ ��� ��������� �� �� ������ ��� ������

��� ��� �������� ���� ���� ��� �� �� ��� ���� ���� �

�� �� ���!� �� �� 8'2 +H��# �,# 2���� ���� ���� ������

������� �� ������� ��� ��� ����� ������ ��� �� ��������

� � ����� �� ��� �� ���������� ����6�� �� �� �����������

���� �G �� ��� ����� ��� �� �� ���� �� �� ��

����6���� �� �� ������������ ����� ������ �� � ������"

����� ��"� � �� �� ����������� ���� �� ���� �� � ��

����������� ���� ����� �� �������������� ��� �� ��� ����

�� � ���� �� ���� +H��# �+�,, ������� � ��� � ���������

M� �������� ����N �"�� ����#�& �*

+����������� �� ��� )* �(+,�! �� ��� *)

�-'(+.�! �� �� ��� �� ������ �� �� ������ �� �-

�� � �/ ������ �����0���� �� �� ����� �� ���������������������� �� !� ����

Figure 4. (a) Effect of negative-ion mode sCID offset voltage on m/z 79 (PO3�) and m/z

97 (H2PO4�) fragment-ion intensity of the Tyr-phosphorylated pp60 c-src fragment

peptide (521–533, TSTEPQpYQPGENL) under alkaline conditions (pH 10.5). (b) Effectof negative-ion mode sCID offset voltage on m/z 79 (PO3

�) fragment-ion intensity of thepp60 c-src fragment peptide at pH 2.5 (TFA) and pH 10.5 (NH4OH).

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�7

Page 7: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

�� � ��� �� ���� ���� �� ����������� �������� ����

��!����� ��������� �& �* �� ������ �� �-���������

�� ����� �� ��� 17 +)$�, ��� ��� 71 +-�)G

�, � �����

���� �� ����������� ���� �2'5# 0������ 0� �������� ��

���� ��� ����! � ����� ������ +4�%7$, +-0), ��� ���� ��

� ����� ��������# �� �����6� �� �2'5 ����� ������ ��

��"���� ����� �� ������� ��������������� �� !� ����

-0) ������4�%7$ ��� ������� ��� �� ���� ��� �� ��� �� �

& �:���� ��� �� ������� �� �� ��� 17 ��� ��� 71 ���� ���

����� �� �� � ������� �� �� �2'5 ����� ��� �-# �� �����

�� H��# $+�, �- ������ �� ��%��#& ��� � �2'5 ����� ������ ��

�� ���� $�%*� > ��� ������ �� �� �� ����� �� �� ��� 17

����# D���� �� �- ������ ��� �� �� �- �� 7#& ���

�� ����� �� � �- �� �� ����� � ��������� ���� �� ����������

Figure 5. (a) Negative-ion mode mass spectra acquired with the hybrid-acquisition routine (100 V high potential, 10 V low potential) by the infusion of theTyr-phosphorylated pp60 c-src fragment peptide (521–533, TSTEPQpYQPGENL)under alkaline conditions (pH 10.5, NH4OH). Insert shows the intense formation ofm/z 79 (PO3

�) and m/z 97 (H2PO4�) marker ions. (b) Negative/positive-ion mode

mass spectra acquired with the hybrid-acquisition routine (100 V high potentialnegative-ion mode, 10 V low potential positive-ion mode) by the infusion of thepp60 c-src fragment peptide under acidic conditions (pH 2.5, TFA).

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

�$$� �# <��! � ���

Page 8: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

� � ��� ��"���� �� �� ����� ������ +$�%7�>, ���

�������# H� ����� �� ��� 71 ���� ��� ���� ������ � �-

��%��#& +H��# $+�,,� ������ �� ��� �� � ��� 17 ��

��������� �� � ������ � ��� +�� >, �2'5 ������ ���

��� ����� ��� ��� ������ �2'5 ������#

�� ��������� �� �� ����� �� �� �� �� !� ���� � �� �

�� �������� ����� ������ �� ��*� ��� � +&��%&$$, � ���

��� ������ ��� ���� � ��� � �� ��������� �� ��� 17 ���

��� 71 �� � ������� �� ��������� ����� � �- ��#& +H��# G+�,,#

H� ����� �� �� ��� 71 � ����� ��� ���� �� � ��� �����

������� ��� ������� ���������� � �� ���� ����� ���� �

����� ����� �������# H� ����� �� �� ��� 17 � ����� ���

��� ���!� � ���� �� ��� ����� � ����� ����� �������

������� � ������ � �� ����� ������ �� ���� ��� ># ?����

�� ���� ������ �� ����� �� �� �� ����� �� �� ��� 17

� ����� ��� ���� ������ +�- �#& �H�, ��� ��!����� +�-

��#& ;-G-, ��������� +H��# G+�,,# � ���� ����� �������

�� ������� �� ��� 17 � �- ��#& ��� ��� ����� �� � ���� ��

$%G ����� �� � ������ ��������� � �- �#&# H��� � &

������ ��� �� ���� ���� � �� �� �"�� ���� ����� ��

H��# G ���� ��!����� +�, ��� ������ +�, ��������� ������� �

�� ����� ������ �� ��� ># 9��� ���� � ������� ����

��!����� ��������� ���� �� ��� ���� �������������� ���

�� �� �������� ��� ��� �� ����� �� �� �� ������� ��

�������������� � ����� ����# -��� �- ��������� ���� � �

�� � �������� �� ����� �� ������������� ���� +����������

������� ������ ��� ��� ����, �� ��� �� 80' � �����#

��� ��� � �� � �������������� � � � ������� �����

����� � �������� ��������� �� ������� ���������������

�� !� ���������� �������#

������ �� �"�� ����� ��� �� ������� �����������

���� ������ �� �� ��!����� ��������� � ����� �������

�� ����������� �2'5��������� ���� ���� �� �� ��

� ����� ���� ��� 17 +)$�, ��� ��� 71 +-�)G

�, � ���� �����

�������# �� �� �� �������� �� �� � ������ ����� ��

�� ��� �� ��� � ����� ���� ��� �� ���� �� ���������

���� �� �� ������� �� ������� ����� ������� ��� ���

���� ������ +�H�, ��������� �� �H���� ���� 2�H$�

� ����� ��� � ��� 71 ����� � �� ��� �� �� ��� 71 �� �

������� ��������������� �� !� ���# ������� � �� �

������� ����� ������ ��� �� �������� �� �� ������

�� ������ �� �� �� ������ ����� � ������ ���� ���� ��

������ �� �� ������� �� �� �������� ������#

�����<������ �� �������������� �� ��������� ����� ����� �� �������� ������������ ����� �"#��� �/�$# �� �� �"#��$#-):2 ��� �������� ���� ��!����� ��������� ������� ���

���� ��� ����������� 80'�90# ��!����� ����������� ����

� �:2�80'�90 ���� ��� ��� ���� �2'5 ������ ��� �������

�� �� ������������ �� �������������� �� &� ���� ����

�������� ����� +H��# *,# ��� 8'2 ��� �� �'2 �� �� ��������

��� ��!����� �:2�80'�90 +�������� ���� �� G��%�&�� ���

$ � �- ��#&, � � ����� �� H��# *+�, ��� �� 8'2 ��� �� �'2 ��

����������� ��!����� :2�80'��2'5�90 �� H��# *+�,# 5� �

��� �:2�80'��2'5�90 �������� ������ � ��������� ���

������� �� � ���� ����� ������� +�$� > ������� �����, ��

�� �!���� ����� �� �� 80' ��� ��# �� ����� �� H��# *+�,

���� ��� ���� ���� �� � ������ �� �������� J$ ��� �

���� ���� �� 1�%��& ��� +�#& �,# ��� ��������������

+ ������ ���� G ��� �� ���, ����� �� ������ �� �� 8'2�

�� �� �� !� ���� ��� 17 ��� 71 +������ ��� ���� ���� ��

H��# *+�,,# ��� � ��������� �� �� ������������ �����

������ ��� � �� �� ����� �� �� ��� 17 ��� 71 ����

��� ��� �� � ��������� �� �� � ��������� �����

������ ���� ��� � �� �� ����� �� ��� 17# ?��� ��

������� ����� ������ �� ������� ��� �� �� �� � �����

���� �� ��� � ���� ������� �� �� � ��� �� ���������� ��

�� ��������������# ?��"������� �� ������� �� ��� 17

�� �� � ��������� ����� ������ ��� ���# ��� �����

����� �� �� �� ���� ����� �� ��� �� �� ��� � �� ��

������ ����� �� � ��������� �� �� ��� ������ ������

������� ��� �� �� ������ ������ ����� �������� ��

���� ����� �� ��� �� �� �� �� �� ��� � ������ ���� �

���� �� �� ���� ������ �������#

'����������� �� �� ������ �������������� ���

�������� �� ����������� �:2�80'�90 +�������� ����

G��%�&�� ��� $ � �- ��#&,# ��� �'2 �� ����� �� �� ����

��� �� H��# *+�,# 8�������� �� �� ��� ���� ���� ���� � ��

�� �� ������������� ���!� + ������ ���� G ���

�� ���, ����� � �� ������������ �� �� ��������������

�� �� ������ ��� ��� �������� ���� +����� �,# <������ ��

���� ���� ������ ������ ������� � ��������� �����

������ �� ���� ��������� �� �� �� ������� ������

+8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��� ��� �77G#�, �� � ����

���� ���� ������ �� �� ���! � �� ������ ��� �� �� ���

+��� �� �����,# 2���� �� � ������ ��������� +H��# �, ��

�������������� �� ���� � �� ���� �������� ����� �����

�� ��� � �� �� �) ������ ���� ��!����� ��������� +�'2

H��# *+�,,# � ���� �- �� ������ � ���� �� �� �������

+��������� �������� � ����, � � � ����� ��� ������

��� �� ��� � �� � ��� �������# H� ������ ������

����6���� �� �� ��� � ���� � ����� ��3��� � ��������

����� �� ����� ��������� �� �� �� ������ ������� �� ��

��� � ����� :2 �����# ��� �������������� ����� ������ ��

��� ����� �� ���� ��������� �� �� 8'2 ���� �������

Table 1. Detected phosphopeptides in alkaline �LC/ESI-sCID-MS analysis of tryptic �-casein digest

-):2 � ����� ����

+���, 9D ����� 9D ����� 92� )������ 0�3�����

G#� ��*�#� ��&7#4 � G4%*$ HJ�088JJJ�858:J5I

��#� �7*$#4 �77G#� � �1%G� 8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��

��#� $��4#* $���#$ � �*%G� �8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��

� ��� ������ � � ��� �� �� ����������� ������ �� K9 � -L�#� 9����� ��������# )������ �� �� ���� ������������� �� �� �������� ��3����� +0D'00�)�� ������� �� �� ����� )��***,#

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$$�

Page 9: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

� �� �� �:2�80'��2'5�90 +���� ��� H��# *+�,, ��� ��

�'2 �� �� �:2�80'�90 +���� ��� H��# *+�,, �"�� �����#

?��� �� ������� ��������� �� ������ ��������������

������� ������ ���!� �� �� �'2 ��� ��������� ��� �����

��� �� �����# ���� ��� ���� ������ ��� �� ������ ���!�

�� �� 8'2� �� �� �������������� +� �� ������ ��� ���

������������� ���� K9��-L�� ������ ��� ���� ����

H��# *+�,,#

��� �'2 �� �� �:2�80'�90 �"�� ���� +���� ��� H��#

*+�,, ����� �� �� ������� ������ � �� �� � ��

Figure 6. Negative-ion mode �LC/ESI-MS and �LC/ESI-sCID-MS experimentsunder alkaline conditions (pH 10.5) using 50 pmol tryptic �-casein digest. (a)Scanning a mass range of: 400–2500 m/z; EIC of the detectedtetraphosphorylated peptide (10 min retention time) is shown in the upper trace.The EIC chromatogram of the detected mono-phosphorylated peptide (4 minretention time) is shown in the middle trace, reconstructed ion chromatogram(RIC) of the �LC/ESI-MS experiment in the lower trace; (b) scanning a massrange of: 70–105 m/z; lower trace: RIC of the �LC/ESI-sCID-MS experiment forthe detection of the phosphorylation specific marker-ions m/z 79 (PO3

�,extracted, middle trace), and m/z 97 (H2PO4

�, extracted, upper trace).

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

�$$� �# <��! � ���

Page 10: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening

������� ����� ������ ��� ��� ���� �� � ������ ���

�� �� �� ������������ ����� ������# ��� � ���

��� ������� �� �� �������������� ��� ��� ������ �

������6� ������� ��� ��� � � ���������� �� ��� ��� !�

���� ������� � �� � ������ ������� �������� ���� ����

��!����� ��������� �� ����������� ����#

+3 �;#�+3#

'� �� � ���� ���� �� ���� ������ ��� �� ��!�����

��������� +�- ��#&, ������� ����������� �:2�80'��2'5�

90������ ������� �� ������� ����� ������� �� ����

� �� �� ��6����� �����# ?���� ��!����� �:2 �����������

���� �2'5 ��� ������� ��������������� �� !� ���� ���

17 ��� ��� 71 ���������� ��� �� ���� �� ���� ���������

������������� �� ������ ��� ��� ���� ������ ���������

+�H�, ���� ��� 17 ��� �� ����# ?��� ��!����� ���������

0� � ��� �� �������� ����� ������� ���� ��� ����� ����

����� ��� �� ����� ����� �� � ������ ���������# ��� ����

�- ����� ���� ����� � �������� �2'5 �� ����� �� ��

������� ��������������� �� !� ����# '� ������� ��������

��� �� �� ������� ����� ����� � ���������� ������� �� ���

�������������� � �� � ���� �������� �����#

������������������� ���� ��� ����������� ����� �� �� �� :������

�� ������������ ���! ) �� �� �� �� 0�� A��� ����

�� <�����D�@ ���� �# ��� �!����� ��������� �� 9�# A#

0��!� �� � ������� ��!���������#

:"4":"3 "#

�# -�������� 9C ����� �0 <��� 9H 2� 0�# �� ��� ������� ������# �77$� .. 1��#

�# 5��� C <� !�� D I����� 5<# ��� � ������� ������������ �77G� =. 7G#

$# 2���� )# ������ � ����� � � ����� '2. &7*#G# -��� �# ���� ����� %11. ��$#&# )����� � ;��� )# ����� ���� ����� %.. ���1#*# 9����� 0 0������ 9 I���� � 9 -�@ ��� -?# ������ ����

����� '%. &4&#1# I���� � 9 9�����! C 0���� 8 9�����! - ?�� ��� �

-�@ ��� -?# � ������ � �774� .%. 4$$#4# A����� 5� ���� ���� � D�� C5# ��� � ������� ����

������# ����� %.. $GG#7# :� ��� 9� 0� ����� A: H�� 0C :� ��� )9 ������ �� )#

!����� � ����� %. ��$#��# J��� ��� 9 C���� )# '� !����� � � "�� ���� ����� �#

!��� � ������ ����$� � C����� ) C�@ ����� - +���,# ����� �77#��# ������ � ���� C :������ D5# �� ���� ������� �777� ,..

��1#��# -��� �) A���� 58# ��� � ������� ���� ������� �77G�

=. &&7#�$# C�� 6�(���!� )� :������ D5# ����� ����� �771� >*. �7G#�G# ����� �0 -�������� 9C >� �� � 5������� �C 2� 0�#

����� ����� ����� ),. $7$#�&# 2� 0� -�������� 9C ����� �0# ����� � ����# �77*� ',*.

�4�#�*# D��� 9 ;������ A 9��� 9# ����� ����� �77*� >=. &�1#�1# ;������ A 9��� 9# ����� ����� �777� )%. �$&#�4# D��� 9 9��� 9# ����� ����� �77*� >=. �#�7# A����� 5� ����� ��� �� A��� 0 D�� C5 2� ���� A:

H����� 5 ���� ���� �# '� !������ ��� !��� � ����$� � I��� �9 I� ��!���� 5 2�����)����������� �- +���,#����� $#

��# ���� ���� � H����� 5 A��� 0 2� ���� A -����� ) ��� < 0�� ��� C =���� F A����� 5# �� !��� � ����� �774� %).&$$#

��# I�6� 9A I������6���!� < A����� 5� <��!��� 29 ;���� ���� ) ��� 0: ���� ���� �# % ���� $ ����� ')=. &��#

��# ���������. ��.�����#�"����#��������O������#�$# H�� � CD 9������� 52# ����� ����� ����� ),. $$�&#�G# 8���� ;) 2������ 2C# �� ��� ��� ���� ������# ����� %'.

��&#�&# I���� 9� >����� 99 H������� 22 0��� ��# &� � ����

������# �77�� '). ��G$#�*# D��� A 2��� �<# &� � ���� ������# �77G� '*. G��#

2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$

)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$$$