alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass...
TRANSCRIPT
![Page 1: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/1.jpg)
�������� ���� �� ������ ���������� ��� �� ���������������� �������������� ����������� ��������� ���� � �� ������������� �� ������
Alexander Beck1,3*, Martin Deeg2, Klaus Moeschel1,3, Eckhart K. Schmidt2,Erwin D. Schleicher1, Wolfgang Voelter3, Hans U. Haring1 and Rainer Lehmann1
1Klinisch-chemisches Zentrallabor der Universitatskliniken, Abteilung Innere Medizin IV, Universitat Tubingen, Otfried-Muller-Strasse10, D-72076 Tubingen, Germany2Interdisziplinares klinisches Forschungszentrum der Universitatskliniken, Waldhornlestr. 22, D-72072 Tubingen, Germany3Abteilung fur Physikalische Biochemie, Physiologisch-chemisches Institut der Universitat Tubingen, Hoppe-Seyler-Str. 4, D-72076Tubingen, Germany
�������� �� ���� ����� ������� �� ���� ����
SPONSOR REFEREE: Dr. David R. Goodlett, Institute for Systems Biology, Seattle, WA, USA
� ��� ������� ����� �� ��� ������������� �� ������� ����� ������� �� ��������� � �����
������ �� �������� �� �� ��� ������� �� ��� ���� �� � ��� �� ����������� ��� �� �� ��������
��������� ������� ���� � � ������� ��� ��� ����� �� ��������� �� ��������� �������� ��
������������� ���� ��������� ������� �� ����� ������� � ���� �� ������ ���� �� ! ��
����� ��� �� ���������� ���� ����� ���� � �"#��$#!�%&' (������ ���������������� �� �� ���� ����
)*& (+,�& ����� *)& -'(+.
�! �� � ���� ��� �� ������ �������������� ����������� �� �/! �� ��������������� ���� 0�� ����� ��� ������� �� ������� �� ������������ ����� ���������
������� ���� ���� ��� �������� �- ����� �� �/ �������� �������� ��������� ��- %1�2! �������
��� ���� ����� �� ���������������������� � ������ ���� � �� �� ���� �� �� ������������� �����
�������& �� ������ ��� �� ����� )* �(+,�! ����� *) �-'(+.
�! �� ������� ���������������� �� �� � ����� 3��� ���� -(� ���� ����� �� � ���� ������� ��� ���������� �������� ����� � ��� �� ����� *)
� '4,+� � ������ ��� �� ��� *)! �� � ������� ���������������� �� �� � 0�� �������� ����� ���
������ �� ��� �������� �� ������� ����� ������� �� � � ����� �������� ������ 0�� �5����������
�� ��� ��������� ����� ������� �� � ������ �� ����� �������� �� �� �"#��� �/�$# ��
�� �"#��$# ��������� ��� ���� � '11% 6��� 7���� 8 #���& ���
��� ��� ����� ������� ���������������� ������ �� � ��
���� �� ����� �� ���� �� ��������� �� ����� �����
������ ���������� ������� ����� ���� �� ���� � ���
�������� ��� ����� ������� ����!����� �������� ������
��������� ���� �"� ������ ��������� ��� ���� �#$%&
'���������� �� �� ������" ������ � ���� !� ��� ������
��������� ������ �� ��!� ���� ����� �� �� ��� � � ��(�
����� �� �� �� ���� ������� ��� �����������# ) ����� � �
������� ����� � �������� �� ��� � � ������ ������� ���
���� �������� � � ����� � ��� ����� ���� ������� ����
�� ��������#$ ����� ����� ������� �� ��� �������
������� ������� ���������������� ������ �� � ����� ��
�������� �� �� ����������� �� ����� �� �������� ���������
�������� ��������� �#�# �� �� ������� �������� ����� ���
���� � ��� � ������� �������#* ��� ��� � ������������ ��
�� ������� ������ ���� �� �������� �� ���� ������� ��
���������� ������ ��� �� �������� � ��� � ��� +���,�
�������# -����� �� � ����� ������������ �� ������� ��
����� ���� ������ � ��(� ��������� ��������� �� ��
��������� ������. +�, �� ��� ��������� �� �� � ��
��������� �� ����� �� ���� �������� �� ������ �������
��� +��, �� ��� ������� ������ ��������� � +���� �&/,
+���, �� ����� �� ���������� ������ �� ���� ������ ��� +��,
������� ������� ������ ����� �#�# �� ��������� ��������
������� ����� ���� �� � +'�0 �, ������� ���� ��� 0�
�� ��� �� ������� ����� � � ��� ������� ������� ����
��� ����#1 2������ ��� ���� ������� � ������ � �� ������
�� �������� ��� �������� ��������� ������ � � �3�� ��
�� ������� ��� ��3����� ��� ������� �� �����������
����#4
5� ��� �� ��� ��� ��� � ���� ���� ��� �� ������
��������� �� �� ������������ �� � ����� ��� �������
���� � ���� � �� ������ �� �� ��� ����� ��� �6���� ��
���� ���������� ������������ ��!� ������� ������#7 ����
��� ��� � �� �� ��� ��������� �� �� ��������� �����3���
�� ������������� �������� ��!� �������� �� ����� ����
��� 8���� ��� ������ �� $�)�������� �������� ����� ��
���� ���� ��� �� ������#�� 5�� � ��� ���� ��
��������� ���������� ��� ��������� ���� ��� �� ����6����
���� ���� ��� � +80'�90, �� ���������� ��� ��3���
�� ����� ���� +:2, �� ���� �� �������� ��� �� ����
���� ��� � +;���80�90, ���� ���� �� ��� ���������
*������������� �. �# <��! =�� ������ ���# '��� � 9��# '> ?���� ���@�!����!�� ��@ ������ � ����9�@ ��� �0 # �� 5�1��1*��@ ������ A� ����#8�����. ���"���� #<��!B������������#��
5'.��#����� ��#&�� 2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�#
��)'5 299?;'2��';0 '; 9�00 0)82��98��F
��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
![Page 2: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/2.jpg)
� ������ �� ���� ��������� �� ������ �� ��������������
�� ��6����� � ���� ������#
0������� ������� �� ������� ����� ������� �� ������"
��"� �� ��� �� �� �� ��� �� ����������������� ���������
��� +2'5, �� �������������� ����� ����� � �� �� �����
�� ������� ��������������� �� !� ����#� 2���������� ������
��� �� � ������������� �������� ��� ������� � �������
��� �� �� 2��) ��� # '� �� ����������� ���� �� 2� ���
�) ���� ��������� ���� �� �� �� ����� �� � -�)G� +���
71, � � )$� +��� 17, ��� ����������# ��� ���� ���������
����� ������ �3�� �� �� �� �� ����� �� ��� 17 ��� 71
� ����� ���� ������� � �� �� ���� �������� ������#��
<�� � ����� ���� ��� �� ���� �� �������������
������� ���� �� �!���� 2'5� � ��%�G � �� ��������� ����
� ��� �� ���� ��������#�&%�1
;���80�90�4 ����� �� ����������� ���� � ��� �� ����
���� �����3�� �� � ��������������� ����� �� ��������
������ �� ������ �� ��� �������� �������� ����
������#�&%�1 �� ������ ��� �� 2� � ��� �& �� ���
�� �� ��!����� �� ����� ������� � ����� �������� �� ����
������ �� ��� ������� ��������������� �� !� ����������
�����#�* �1 -����� �� ����� ��� �� ���������#
H� ��� �� ����� ��� �� ������� � �� � �������� ��������
������� � ��������� ���� �� �� ����� ��� ������� �����
����������# 0������� ���� �������������� �� ����� ��
���� ��� ��� ��������� � ��� ����� �������� ��
��� �������� ������ ��"� �� �� ����� �� � �����
����6��� ��������� ��� ���� ��� �� � ���!�� ����6���
��������������# �� ��� ����� � �� ����� �� ������� ��
�������������� �� !� ���� �� ������ �� 2'5 �� ���������� ��
� ���� ����� ������ �� �� ������ ���� � ����� ������ ��
��� �� ��� �� �� � 3��� ����� ���� �����6� +�!����
�����,# 5�� � �� ���������� � ������ �!���� 2'5 +�2'5,
��� :2 ��� ������� ����� ������ ���� ���� �� �������
�� ���� � �� � ���� ������ ��� �������� ������� ��
������� ��������������� �� !� ����# ?� � ��� :2 ����
�� :2�80'��2'5�90 ������ ��� ���� ��� ��� ����
������ ���������#� � ��%�G �7%��
��!�� ����� �������� ;���80�90 ���� ��!����� ����
������ ����� � �������� ������� ��������� �� ��������
������� ����� �� ���� ����� �� �� ����� � ������ �� �
�� ������� :2�80'��2'5�90 ��� ���� ���� ������ ������
���� �� ���� ��������# ��� ��� � � ��� �� ��� �� �� ����
� ������� �� ��������� �� ��� � ������ �#�# ����
�"�� ������ ��������� �� �� ��� ����� ��������� �� ��
������� �� ������� ��������������� �� !� ���� �� �
�� ������ �����# -� � �� �������� �� �����6��
����� �� �� �������� ������� ������� �� �����������
���� �� � ���� ����� �� ����������� ���� ��!�����
:2�80'��2'5�90#
"9(":�$"30��
$��� ����-):2�� ��� ������� ����� ������ ���� +�H�, ��� �3��
���� ������� �� � ������� � �� 9� �! +5� ����
A� ����,# ��2����� ��� �� ������ � �� 0���� 2�������
2������ +0# :���� 9 ?0�, ��� ��� �� �� �� �� �����
� �� � ��������# �)2I� ���� ����� ��� ������� � ��
D� ������ <���������� 2���� ���� +:�!����� ;C
?0�,# ��2����� ��� ������� �� ��������� �� �.��� +���,
��6����� ���� ��� �� &� �9 �������� ���� �����
����� �- 4#& �� �* � � $1°2# ��� ������ ��� � ������
�� ������������ �������� �� ��������6����# ��� �������
0� �������� ����� ��� ����! � ���� +-0), � �����
������ +4�%7$ 2:;�J:�00A>08'�� �*G�#4 5�, ��� �� �
������� ����� ��*� ��� � � ����� ������ +&��%&$$
�0�8)J�FJ)A8;:� �&G$#& 5�, �� � �� ������ � ��
<����� +-������� � A� ����,#
-(� ���������� 0�!�� -):2 +H�@ �������� ��! A� ����, ��� � ����
�� �� 1&� �:���� ��� ���� �� ��� :2 ��������# )�����
���� ����� �� � �� ��� �� �� � �0I�A�� 0��� 50 � ��
��� �� � $�� �� �#�# �)�-):2 ������ +A �� -� ���� ��
I��� A� ����, ����� ��� �� ���� �������� � �
�������� ����� 4��& ��(��� +�������� '�� 2� ?0�,
�3������ ��� � &��: ������ ����# ��� ������ ���� ��
��� ��(���� � & �:���� � ���� � �&�.� � �������� ����#
0������ �� � ����� ����� � ����� � ����� � �� �/ < �
4�/ < �� G� ���# H� ��!����� ��������� ������ � +�3�����
;-$ �- ��#&, ��� ������ < +4�/ ������ ��� �� �3�����
;-$ �- ��#&, �� � ����# H� ������ ��������� ������ �
+�#�&/ �3����� �H�, ��� ������ < +4�/ ������ ��� �#�*&/
�H� �� ��� , �� � ����# H� ���� �"�� ���� &� ���� �� ��
� ��� �������� ���� ����� �� � ��������� �� & �: ������ �
��� ��(����#
$��� ����� ���� �� ��������8��� ��� �� ���� ���� � �� � ��3�� �� �� � H������� 9��
�0J 1�� �����3��� ����� ���� ���� ���� +)��� ���
2� ?0�, �3������ ��� �� 80' ��� ��# � &���� �#�# ������
������ ������� � ��� ���� �� �� �� �� ������# 0������� �� �
�� ���� ��� � ������� �� ���� �G#& !># �� ��������
�!���� 2'5 ���� ��!����� ��������� �� ������� �� ���
17 ��� 71 ������� ��������������� � ����� ���� ����
���� �2'5 ����� ��� �� �������� ������������� ����
���� ��� �2'5 ����� �� ����������� ���� � ��� ���
��3������� ����� ��� ����# ��� ����� �� � ��� �� '2:
+'�� ���� 2�� �� :�������,� ��� ��� �� ���� ������
+�2'5 ����� ���� ���� ���� ���, � � �� ����� ���
����� ��� � � �"����� ���� �� ���� �����# 9��� ���� �
�� � ��3�� �� �� ����������� �� �� ������# J$ ��� �������
��� � ���� ���� �� 1&%��& �� �#& � +����������� ����
���� ����� ������ �2'5, �������� �� � ���� ���� �� $��%
�&�� �� $ � +�������� � ����������� ���� ��� �����
������,# H� �� ����� ���� �� �������������
2:;�J:0�0A>08'� +* ������:, � �0�8)J�FJ)A8;:
+*#& ������:, ��� ������� +& �:����, ��� � -� �� � �� ����
���� �� &�/ 9�- � ����� �� �- ������ +��(���� ���
�������� �- 4#� 4#& 7#� 7#& ��#� ��#& ��#�, ��� ��
�������� �� &�/ 9�- � �- �#& +�H�, ��� �- ��#& +;-$,#
H� ��!����� ������� � �:2�80'�90 ��� �:2�80'��2'5�90
�"�� ����� � ������� �� 1�/ �3����� 9�- ��� ���� ��
����� ��3��� � � ���� �� �� & �:���� ������� ��� � �������#
0���� ��� +;�, � ���� � ��� *� ���# 2�������� ����
�� �:2�80'��2'5�90 �"�� �����. ����������� ����
�$� > �)'�2'5 ����� J$ ��� ������� ��� � ���� ����
�� 1&%��& �� �#& �# 2�������� ���� �� �:2�80'�90 �"�� ��
����. �� > �)'�2'5 ����� +���, J$ ������� ���� ���� ��
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�&
![Page 3: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/3.jpg)
Figure 1. Comparison of positive- and negative-ion mode �LC/ESI-MS experiments under acidicconditions (TFA) using 50 pmol tryptic �-casein digest each. (a) Positive-ion mode; lower trace: basepeak (BP) chromatogram; upper trace: extracted ion chromatogram (EIC) of the mono-phosphorylated peptide. (b) Negative-ion mode; lower trace: base peak (BP) chromatogram; uppertrace: EIC of the mono-phosphorylated peptide.
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
�$�* �# <��! � ���
![Page 4: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/4.jpg)
G��%�&�� �� $ � +����������� ����, ��� ��� > �)'�2'5
����� +���, J$ ������� ���� ���� �� $��%�&�� �� $ �
+����������� ����,#
/������� ��� ��H� ���������������� ��� � ����� �� �� ������
�������������� � ������ � �� �� ��������� �� ��
'�� ���� ��� ����# '� � �� � ������� �� �����������
���� �� ����������� ������ ��� ��� �������� ����
+K9 � -L�, �� � ��������� � �� ��� ������ ��� ��� ����
��� ���� �� �� ���� ��� �� �� � ���� ������� ��� ��#
��� 0D'00�)�� �� � ����� ���� �� �������� ���
)��***# � ����� ��� ���� �� ��6��� ��� ������� �� ��
� ��� ������ ��������#
Figure 2. Comparison of electrospray mass spectra from the phosphopeptide signals of the EICs shown inFig. 1. The mass spectra correspond to the tryptic phosphopeptide Phe48-Arg63 (FQpSEEQQQTEDELQDK,Mr = 2060.8 Da) from �-casein digest in (a) positive-ion mode and (b) negative-ion mode.
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�1
![Page 5: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/5.jpg)
:"#;�0# �3/ /�# ;##�+3
�� �"#��$# �������� �� � ����� �������� ��������� ���������� �� ����6���� �� �������������� �� ������
��"� �� �� � ��(� � ����� �� 80'�90������ �����������
��� �� ������# ���� ���� �� ���! �� ���������� �� ��!��� ���
� ��������� ������ ������� ������� ��� ������� �� �
���� ����� �� � �������� ���� � � �� ��������������
��� ��� ���� ���� ��� � � ������� ����� � ����
��������� � ��� � � ���� ���� ��������� �� �� ��� ���
��"� � ��� ���� � ������ ��� ��� �� ����������� ��
���� ������� �� �� �� �� ��������� �� 80'# H� �� �� �
������� ������ �� ���� ��3����� �� ����������� ��
���� ��� �� ������� ����� �� � �� � ����� ������ ����
����� �� ����6���� ������������# 0���� �� ������� �����
�� � �� �� � ������ ��� �� � �� ���� ���������� � ������
��� �� ��� � ���� ���������� ����6��#�$ H� �� �����������
�� ����������� ���� �:2�80'��2'5�90 �� �� �� ��� �
����� ���� �� �� ���������� �� ������������� ��� �� ���
��� ������ �������� ��� ����������� ���� 80' ����
������ ���� ���� ��������� �� �:2 �� ������� ��� ��
80' ��� ��#
H��� � � ����� �� ���� ���! +<), ��� �� �" ���� ���
�� ����� ��� +8'2, ������� � �� �� �������� ���
����������� ���� �:2�80'�90 �"�� ����� ����� &� ����
���� �������� ����� ���� ������ +�H�, ���������# ���
��3������ ��� ���� �� ������� ������ �� �� �� � ������
���� ������� � � �8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��
Figure 3. Effect of negative-ion mode sCID offset voltage and varying alkaline pHvalues on m/z 79 (a) and m/z 97 (b) fragment-ion intensity of the Ser-phosphorylated heat shock protein fragment peptide (81–93,CLNRQLpSSGVSEIR).
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
�$�4 �# <��! � ���
![Page 6: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/6.jpg)
+����� ����. �*%G� �������� ����� $���#$ 5�, ���
HJ�088JJJ�858:J5I +����� ����. G4%*$ ��������
����� ��*�#4 5�,# H� 8'2 ������� �� ��������������
�� ��������� ��� ������ �� �� ������ ��� ��� ��������
���� �� �� ��� ����� ���� ������������� ������ �� �
����# �� ��� �� ���� �� H��# � ��� ����� ���� � ��
������� �� �� ������������ ����� ������
+HJ�088JJJ�858:J5I ��� ��$�#& K9 � �-L�� ���
���7#1 K9��-L��,� ������ ���"������� �� � �������
��� ����� ������ ������ ��� �� �������� �� ��� �����
+��� �� �����,# ���� �� ��������� �� ����� ��� �� ����
+�$ � �&, ��� �� ����� ���3������� ������� �� ���
������# ?��� �� ������ �� ����� ����� ��������� +���
� ����� �� ��� ������ � ����� ������, �� ����6���� �� ��
� ��������� ����� ������ ��� �� ���� ����� �� ������
��� ����������� ����� �������# ��� ������������ ��
���� ������ ��� ��������� �� �� ������ ��� ������
��� ��� �������� ���� ���� ��� �� �� ��� ���� ���� �
�� �� ���!� �� �� 8'2 +H��# �,# 2���� ���� ���� ������
������� �� ������� ��� ��� ����� ������ ��� �� ��������
� � ����� �� ��� �� ���������� ����6�� �� �� �����������
���� �G �� ��� ����� ��� �� �� ���� �� �� ��
����6���� �� �� ������������ ����� ������ �� � ������"
����� ��"� � �� �� ����������� ���� �� ���� �� � ��
����������� ���� ����� �� �������������� ��� �� ��� ����
�� � ���� �� ���� +H��# �+�,, ������� � ��� � ���������
M� �������� ����N �"�� ����#�& �*
+����������� �� ��� )* �(+,�! �� ��� *)
�-'(+.�! �� �� ��� �� ������ �� �� ������ �� �-
�� � �/ ������ �����0���� �� �� ����� �� ���������������������� �� !� ����
Figure 4. (a) Effect of negative-ion mode sCID offset voltage on m/z 79 (PO3�) and m/z
97 (H2PO4�) fragment-ion intensity of the Tyr-phosphorylated pp60 c-src fragment
peptide (521–533, TSTEPQpYQPGENL) under alkaline conditions (pH 10.5). (b) Effectof negative-ion mode sCID offset voltage on m/z 79 (PO3
�) fragment-ion intensity of thepp60 c-src fragment peptide at pH 2.5 (TFA) and pH 10.5 (NH4OH).
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$�7
![Page 7: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/7.jpg)
�� � ��� �� ���� ���� �� ����������� �������� ����
��!����� ��������� �& �* �� ������ �� �-���������
�� ����� �� ��� 17 +)$�, ��� ��� 71 +-�)G
�, � �����
���� �� ����������� ���� �2'5# 0������ 0� �������� ��
���� ��� ����! � ����� ������ +4�%7$, +-0), ��� ���� ��
� ����� ��������# �� �����6� �� �2'5 ����� ������ ��
��"���� ����� �� ������� ��������������� �� !� ����
-0) ������4�%7$ ��� ������� ��� �� ���� ��� �� ��� �� �
& �:���� ��� �� ������� �� �� ��� 17 ��� ��� 71 ���� ���
����� �� �� � ������� �� �� �2'5 ����� ��� �-# �� �����
�� H��# $+�, �- ������ �� ��%��#& ��� � �2'5 ����� ������ ��
�� ���� $�%*� > ��� ������ �� �� �� ����� �� �� ��� 17
����# D���� �� �- ������ ��� �� �� �- �� 7#& ���
�� ����� �� � �- �� �� ����� � ��������� ���� �� ����������
Figure 5. (a) Negative-ion mode mass spectra acquired with the hybrid-acquisition routine (100 V high potential, 10 V low potential) by the infusion of theTyr-phosphorylated pp60 c-src fragment peptide (521–533, TSTEPQpYQPGENL)under alkaline conditions (pH 10.5, NH4OH). Insert shows the intense formation ofm/z 79 (PO3
�) and m/z 97 (H2PO4�) marker ions. (b) Negative/positive-ion mode
mass spectra acquired with the hybrid-acquisition routine (100 V high potentialnegative-ion mode, 10 V low potential positive-ion mode) by the infusion of thepp60 c-src fragment peptide under acidic conditions (pH 2.5, TFA).
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
�$$� �# <��! � ���
![Page 8: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/8.jpg)
� � ��� ��"���� �� �� ����� ������ +$�%7�>, ���
�������# H� ����� �� ��� 71 ���� ��� ���� ������ � �-
��%��#& +H��# $+�,,� ������ �� ��� �� � ��� 17 ��
��������� �� � ������ � ��� +�� >, �2'5 ������ ���
��� ����� ��� ��� ������ �2'5 ������#
�� ��������� �� �� ����� �� �� �� �� !� ���� � �� �
�� �������� ����� ������ �� ��*� ��� � +&��%&$$, � ���
��� ������ ��� ���� � ��� � �� ��������� �� ��� 17 ���
��� 71 �� � ������� �� ��������� ����� � �- ��#& +H��# G+�,,#
H� ����� �� �� ��� 71 � ����� ��� ���� �� � ��� �����
������� ��� ������� ���������� � �� ���� ����� ���� �
����� ����� �������# H� ����� �� �� ��� 17 � ����� ���
��� ���!� � ���� �� ��� ����� � ����� ����� �������
������� � ������ � �� ����� ������ �� ���� ��� ># ?����
�� ���� ������ �� ����� �� �� �� ����� �� �� ��� 17
� ����� ��� ���� ������ +�- �#& �H�, ��� ��!����� +�-
��#& ;-G-, ��������� +H��# G+�,,# � ���� ����� �������
�� ������� �� ��� 17 � �- ��#& ��� ��� ����� �� � ���� ��
$%G ����� �� � ������ ��������� � �- �#&# H��� � &
������ ��� �� ���� ���� � �� �� �"�� ���� ����� ��
H��# G ���� ��!����� +�, ��� ������ +�, ��������� ������� �
�� ����� ������ �� ��� ># 9��� ���� � ������� ����
��!����� ��������� ���� �� ��� ���� �������������� ���
�� �� �������� ��� ��� �� ����� �� �� �� ������� ��
�������������� � ����� ����# -��� �- ��������� ���� � �
�� � �������� �� ����� �� ������������� ���� +����������
������� ������ ��� ��� ����, �� ��� �� 80' � �����#
��� ��� � �� � �������������� � � � ������� �����
����� � �������� ��������� �� ������� ���������������
�� !� ���������� �������#
������ �� �"�� ����� ��� �� ������� �����������
���� ������ �� �� ��!����� ��������� � ����� �������
�� ����������� �2'5��������� ���� ���� �� �� ��
� ����� ���� ��� 17 +)$�, ��� ��� 71 +-�)G
�, � ���� �����
�������# �� �� �� �������� �� �� � ������ ����� ��
�� ��� �� ��� � ����� ���� ��� �� ���� �� ���������
���� �� �� ������� �� ������� ����� ������� ��� ���
���� ������ +�H�, ��������� �� �H���� ���� 2�H$�
� ����� ��� � ��� 71 ����� � �� ��� �� �� ��� 71 �� �
������� ��������������� �� !� ���# ������� � �� �
������� ����� ������ ��� �� �������� �� �� ������
�� ������ �� �� �� ������ ����� � ������ ���� ���� ��
������ �� �� ������� �� �� �������� ������#
�����<������ �� �������������� �� ��������� ����� ����� �� �������� ������������ ����� �"#��� �/�$# �� �� �"#��$#-):2 ��� �������� ���� ��!����� ��������� ������� ���
���� ��� ����������� 80'�90# ��!����� ����������� ����
� �:2�80'�90 ���� ��� ��� ���� �2'5 ������ ��� �������
�� �� ������������ �� �������������� �� &� ���� ����
�������� ����� +H��# *,# ��� 8'2 ��� �� �'2 �� �� ��������
��� ��!����� �:2�80'�90 +�������� ���� �� G��%�&�� ���
$ � �- ��#&, � � ����� �� H��# *+�, ��� �� 8'2 ��� �� �'2 ��
����������� ��!����� :2�80'��2'5�90 �� H��# *+�,# 5� �
��� �:2�80'��2'5�90 �������� ������ � ��������� ���
������� �� � ���� ����� ������� +�$� > ������� �����, ��
�� �!���� ����� �� �� 80' ��� ��# �� ����� �� H��# *+�,
���� ��� ���� ���� �� � ������ �� �������� J$ ��� �
���� ���� �� 1�%��& ��� +�#& �,# ��� ��������������
+ ������ ���� G ��� �� ���, ����� �� ������ �� �� 8'2�
�� �� �� !� ���� ��� 17 ��� 71 +������ ��� ���� ���� ��
H��# *+�,,# ��� � ��������� �� �� ������������ �����
������ ��� � �� �� ����� �� �� ��� 17 ��� 71 ����
��� ��� �� � ��������� �� �� � ��������� �����
������ ���� ��� � �� �� ����� �� ��� 17# ?��� ��
������� ����� ������ �� ������� ��� �� �� �� � �����
���� �� ��� � ���� ������� �� �� � ��� �� ���������� ��
�� ��������������# ?��"������� �� ������� �� ��� 17
�� �� � ��������� ����� ������ ��� ���# ��� �����
����� �� �� �� ���� ����� �� ��� �� �� ��� � �� ��
������ ����� �� � ��������� �� �� ��� ������ ������
������� ��� �� �� ������ ������ ����� �������� ��
���� ����� �� ��� �� �� �� �� �� ��� � ������ ���� �
���� �� �� ���� ������ �������#
'����������� �� �� ������ �������������� ���
�������� �� ����������� �:2�80'�90 +�������� ����
G��%�&�� ��� $ � �- ��#&,# ��� �'2 �� ����� �� �� ����
��� �� H��# *+�,# 8�������� �� �� ��� ���� ���� ���� � ��
�� �� ������������� ���!� + ������ ���� G ���
�� ���, ����� � �� ������������ �� �� ��������������
�� �� ������ ��� ��� �������� ���� +����� �,# <������ ��
���� ���� ������ ������ ������� � ��������� �����
������ �� ���� ��������� �� �� �� ������� ������
+8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��� ��� �77G#�, �� � ����
���� ���� ������ �� �� ���! � �� ������ ��� �� �� ���
+��� �� �����,# 2���� �� � ������ ��������� +H��# �, ��
�������������� �� ���� � �� ���� �������� ����� �����
�� ��� � �� �� �) ������ ���� ��!����� ��������� +�'2
H��# *+�,,# � ���� �- �� ������ � ���� �� �� �������
+��������� �������� � ����, � � � ����� ��� ������
��� �� ��� � �� � ��� �������# H� ������ ������
����6���� �� �� ��� � ���� � ����� ��3��� � ��������
����� �� ����� ��������� �� �� �� ������ ������� �� ��
��� � ����� :2 �����# ��� �������������� ����� ������ ��
��� ����� �� ���� ��������� �� �� 8'2 ���� �������
Table 1. Detected phosphopeptides in alkaline �LC/ESI-sCID-MS analysis of tryptic �-casein digest
-):2 � ����� ����
+���, 9D ����� 9D ����� 92� )������ 0�3�����
G#� ��*�#� ��&7#4 � G4%*$ HJ�088JJJ�858:J5I
��#� �7*$#4 �77G#� � �1%G� 8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��
��#� $��4#* $���#$ � �*%G� �8:88:;>)A8'>8�0:�0�0�0880'��
� ��� ������ � � ��� �� �� ����������� ������ �� K9 � -L�#� 9����� ��������# )������ �� �� ���� ������������� �� �� �������� ��3����� +0D'00�)�� ������� �� �� ����� )��***,#
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$$�
![Page 9: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/9.jpg)
� �� �� �:2�80'��2'5�90 +���� ��� H��# *+�,, ��� ��
�'2 �� �� �:2�80'�90 +���� ��� H��# *+�,, �"�� �����#
?��� �� ������� ��������� �� ������ ��������������
������� ������ ���!� �� �� �'2 ��� ��������� ��� �����
��� �� �����# ���� ��� ���� ������ ��� �� ������ ���!�
�� �� 8'2� �� �� �������������� +� �� ������ ��� ���
������������� ���� K9��-L�� ������ ��� ���� ����
H��# *+�,,#
��� �'2 �� �� �:2�80'�90 �"�� ���� +���� ��� H��#
*+�,, ����� �� �� ������� ������ � �� �� � ��
Figure 6. Negative-ion mode �LC/ESI-MS and �LC/ESI-sCID-MS experimentsunder alkaline conditions (pH 10.5) using 50 pmol tryptic �-casein digest. (a)Scanning a mass range of: 400–2500 m/z; EIC of the detectedtetraphosphorylated peptide (10 min retention time) is shown in the upper trace.The EIC chromatogram of the detected mono-phosphorylated peptide (4 minretention time) is shown in the middle trace, reconstructed ion chromatogram(RIC) of the �LC/ESI-MS experiment in the lower trace; (b) scanning a massrange of: 70–105 m/z; lower trace: RIC of the �LC/ESI-sCID-MS experiment forthe detection of the phosphorylation specific marker-ions m/z 79 (PO3
�,extracted, middle trace), and m/z 97 (H2PO4
�, extracted, upper trace).
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
�$$� �# <��! � ���
![Page 10: Alkaline liquid chromatography/electrospray ionization skimmer collision-induced dissociation mass spectrometry for phosphopeptide screening](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022080316/575025711a28ab877eb3d9a5/html5/thumbnails/10.jpg)
������� ����� ������ ��� ��� ���� �� � ������ ���
�� �� �� ������������ ����� ������# ��� � ���
��� ������� �� �� �������������� ��� ��� ������ �
������6� ������� ��� ��� � � ���������� �� ��� ��� !�
���� ������� � �� � ������ ������� �������� ���� ����
��!����� ��������� �� ����������� ����#
+3 �;#�+3#
'� �� � ���� ���� �� ���� ������ ��� �� ��!�����
��������� +�- ��#&, ������� ����������� �:2�80'��2'5�
90������ ������� �� ������� ����� ������� �� ����
� �� �� ��6����� �����# ?���� ��!����� �:2 �����������
���� �2'5 ��� ������� ��������������� �� !� ���� ���
17 ��� ��� 71 ���������� ��� �� ���� �� ���� ���������
������������� �� ������ ��� ��� ���� ������ ���������
+�H�, ���� ��� 17 ��� �� ����# ?��� ��!����� ���������
0� � ��� �� �������� ����� ������� ���� ��� ����� ����
����� ��� �� ����� ����� �� � ������ ���������# ��� ����
�- ����� ���� ����� � �������� �2'5 �� ����� �� ��
������� ��������������� �� !� ����# '� ������� ��������
��� �� �� ������� ����� ����� � ���������� ������� �� ���
�������������� � �� � ���� �������� �����#
������������������� ���� ��� ����������� ����� �� �� �� :������
�� ������������ ���! ) �� �� �� �� 0�� A��� ����
�� <�����D�@ ���� �# ��� �!����� ��������� �� 9�# A#
0��!� �� � ������� ��!���������#
:"4":"3 "#
�# -�������� 9C ����� �0 <��� 9H 2� 0�# �� ��� ������� ������# �77$� .. 1��#
�# 5��� C <� !�� D I����� 5<# ��� � ������� ������������ �77G� =. 7G#
$# 2���� )# ������ � ����� � � ����� '2. &7*#G# -��� �# ���� ����� %11. ��$#&# )����� � ;��� )# ����� ���� ����� %.. ���1#*# 9����� 0 0������ 9 I���� � 9 -�@ ��� -?# ������ ����
����� '%. &4# I���� � 9 9�����! C 0���� 8 9�����! - ?�� ��� �
-�@ ��� -?# � ������ � �774� .%. 4$$#4# A����� 5� ���� ���� � D�� C5# ��� � ������� ����
������# ����� %.. $GG#7# :� ��� 9� 0� ����� A: H�� 0C :� ��� )9 ������ �� )#
!����� � ����� %. ��$#��# J��� ��� 9 C���� )# '� !����� � � "�� ���� ����� �#
!��� � ������ ����$� � C����� ) C�@ ����� - +���,# ����� �77#��# ������ � ���� C :������ D5# �� ���� ������� �777� ,..
��1#��# -��� �) A���� 58# ��� � ������� ���� ������� �77G�
=. &&7#�$# C�� 6�(���!� )� :������ D5# ����� ����� �771� >*. �7G#�G# ����� �0 -�������� 9C >� �� � 5������� �C 2� 0�#
����� ����� ����� ),. $7$#�&# 2� 0� -�������� 9C ����� �0# ����� � ����# �77*� ',*.
�4�#�*# D��� 9 ;������ A 9��� 9# ����� ����� �77*� >=. &�1#�1# ;������ A 9��� 9# ����� ����� �777� )%. �$&#�4# D��� 9 9��� 9# ����� ����� �77*� >=. �#�7# A����� 5� ����� ��� �� A��� 0 D�� C5 2� ���� A:
H����� 5 ���� ���� �# '� !������ ��� !��� � ����$� � I��� �9 I� ��!���� 5 2�����)����������� �- +���,#����� $#
��# ���� ���� � H����� 5 A��� 0 2� ���� A -����� ) ��� < 0�� ��� C =���� F A����� 5# �� !��� � ����� �774� %).&$$#
��# I�6� 9A I������6���!� < A����� 5� <��!��� 29 ;���� ���� ) ��� 0: ���� ���� �# % ���� $ ����� ')=. &��#
��# ���������. ��.�����#�"����#��������O������#�$# H�� � CD 9������� 52# ����� ����� ����� ),. $$�&#�G# 8���� ;) 2������ 2C# �� ��� ��� ���� ������# ����� %'.
��&#�&# I���� 9� >����� 99 H������� 22 0��� ��# &� � ����
������# �77�� '). ��G$#�*# D��� A 2��� �<# &� � ���� ������# �77G� '*. G��#
2��� ��� � ���� C��� D���� E 0��� :�# ��� � ������� ���� ������� ����� %2. �$�G%�$$$
)������������ �� ������ �� ��!����� :2�80'��2'5�90 �$$$