alvos possíveis de transformação genética: núcleo (n) plastos (p) (resistência a herbicidas do...
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Alvos possíveis de transformação genética:Núcleo (N)Plastos (P) (resistência a herbicidas do tipo triazina)Mitocôndrias (M) (cms - "cytoplasmic male sterility")
N
M
P
- Célula vegetal -
Situação que ocorre na natureza:
Bactéria com o Ti -plasmídio
Ti -plasmídio (responsável pela virulência)
Infecção de plantas feridas e transferência do DNA para as células
Planta com agrobactérias vivendo em "crown gall"
Colonização genética das plantas por infecção por Agrobacterium tumefaciens
Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormonas, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e azoto
dos quais a bactéria se alimenta
Utilização laboratorial do Agrobacterium:
Cultura in vitro do material vegetal (plântulas micropro-pagadas e germinantes)
A. rhizogenes
Agrobacterium
desarmado
Agrobacterium
Ferimento do materialvegetal (seccionamento)
Infecção dos explantes coma suspensão bacteriana
Leitura da absorvência a 600 nm
Aplicação sobre azona de ferida(24-48h)
Incubação numa solução diluída debactérias (durante alguns segundosa alguns minutos) e transferência dos explantes para meio fresco paracocultura com as bactériasCultura em meio
líquido com agitação(adição ou não deacetosseringona)
Após a cocultura:- transferência dos explantes para meio de cultura fresco (com ou sem prévia lavagem em água ou meio cultura, ou secagem sobre papel de filtro estéril)- o meio fresco deve conter antibióti- cos para eliminar o Agrobacterium
Indução de rebentos transformadosem meio de cultura selectivo (por ex. com antibióticos de selecção) e na presença dos fitorreguladoresadequados
Formação de raízes no materialinfectado. As raízes excisadas crescem e ramificam em meio de cultura sem hormonas
COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA
As estratégias mais utilizadas detransferência de DNA para plantas:
O DNA entra através
Vector não biológico: Bombardeamentocom micropartículas, de ouro ou tungsténio
(com cerca de 1 m de diâmetro)
Transferência directa:da membrana celular permeabilizada porchoques eléctricos ou agentes permeabili-zantes (como o polietilenoglicol)
Vector biológico: Agrobacterium(uma bactéria do solo com duas espécies
importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)
Plantas micropropagadas (amendoeira)utilizadas como fonte de material pararegeneração adventícia e transformação genética
Diferenciação de rebentos adventíciosa partir de folhas em meio de cultura
Plantas regeneradas de folhas transfor-madas, à esquerda uma plântula resis-tente ao antibiótico de selecção (canami-cina) e à direita uma planta sensível (nãotransformada)
Monitorização da presença de um genede referência introduzido por transfor-mação. Por incubação num substractoadequado, a enzima codificada pelo ge-ne dá origem a um produto de cor azulque permite identificar as células/plantastransformadas (à esquerda duas plantastransformadas e à direita 3 plantas controlo)
1. Estratégia global: Identificar o objectivo de
melhoramento
Identificar e isolar o(s) gene(s) deinteresse
Clonar o(s) gene(s) num vectorapropriado
Transferir o(s) gene(s) deinteresse à planta
Avaliar a integração e ocomportamento do(s) gene(s) naplanta
Avaliar o comportamento daplanta transgénica no terreno
COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE UMA PLANTA
Representação esquemáticado processo de infecção:
OHH CO3
OCH 3
COCH 3
OHH CO3
OCH 3
COCH 3
OHH CO3
OCH 3
COCH 3
A vir
A vir
A vir
vir G vir G*
F A B G C D E
T-DNA
DD
Plasmídio Ti
chv A chv B
(genes ligação ao hospedeiro)
Cromossomabacteriano
Plasmídio Ti Região de virulência
(Acetosseringona - ou outros compostos produzidos pelas células vegetais feridas)
Região excisada etransferida à planta, por informa-ção vinda da região de virulência
Receptor membranar
(Molécula que vai activar a região de virulência)
– 1/3 da produção de trigo perde-se devido a:Ervas daninhasPragasDoenças (resistência a herbicidas, pragas, doenças?...)
– As quantidades de arroz que se perdem anualmente devido a infecçõescom o vírus Tungro davam para alimentar 15.000.000 de pessoas
(introdução de resistência à virose?)
–Anualmente 2.000.000 de crianças ficam cegas por falta de pró-vit. A(melhoramento do potencial nutritivo do arroz comenriquecimento em pró-vitamina A por introdução degenes da via biossintética dos carotenos, ß-caroteno?)
EXEMPLOS DE ALGUNS PROBLEMAS ACTUAIS SOLUCIONÁVEIS POR ENGENHARIA GENÉTICA
– 900 milhões de pessoas passam fome (este número cresce
anualmente em 95 milhões)
– Os oceanos e os terrenos de cultura são explorados aos seus
limites– A quantidade de terra arável por pessoa diminui
continuamente– As perdas de culturas por pestes, doenças e ervas daninhas
atinge os 40-60%– As perdas anuais de arroz são superiores a 200 milhões de
metros cúbicos, o equivalente a alimento para 1000 milhões de pessoas
ESTRATÉGIAS E PROBLEMAS DA ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS
Identificação, isolamento e manipulaçãoin vitro dos genes
Transferência dos genes manipulados para as células vegetais
Cultura das células para obter plantas trans-génicas ou linhas de células transgénicas, man-tidas in vitro como callus, suspensões ou raízes
OBJECTIVOS DAENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS
Resistência a insectos
Resistência a herbicidas
Resistência a doenças (vírus, fungos, bactérias)Expressão de proteínas importantes do ponto de vista farmacológico (i.e.: antigéneos)
Inibição do amadurecimento de frutos
Criação de esterilidade masculina
Manipulação do metabolismo do carbono ou fósforo
Melhoramento da absorção de ferro
……