amobilisasi enzim selulase dari bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/skripsi tanpa bab...

75
AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ITBCCB148 MENGGUNAKAN BENTONIT (Skripsi) Oleh FIKA PUTRI AULIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017

Upload: others

Post on 29-Oct-2020

7 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

Page 1: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ITBCCB148MENGGUNAKAN BENTONIT

(Skripsi)

Oleh

FIKA PUTRI AULIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2017

Page 2: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

ABSTRAK

AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148MENGGUNAKAN BENTONIT

Oleh

Fika Putri Aulia

Selulase banyak digunakan dalam industri untuk mengkonversi selulosa menjadiglukosa. Agar dapat digunakan dalam proses industri, diperlukan enzim yangstabil pada pH dan suhu ekstrim. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkanstabilitas enzim selulase dari isolat bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148 melaluiproses amobilisasi enzim menggunakan bentonit. Tahapan yang dilakukan dalampenelitian ini adalah produksi, isolasi, pemurnian, amobilisasi dan karakterisasienzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi. Hasil penelitianmenunjukkan aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian sebesar 14,075 U/mg,meningkat kemurniannya 5,7 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim. Enzimselulase hasil pemurnian memilik i suhu optimum 50ºC, sedangkan enzim amobilpada suhu 60ºC. Uji stabilitas termal pada suhu 60ºC selama 100 menit untukenzim hasil pemurnian masih memiliki aktivitas sisa 7,330 %, sedangkan enzimamobil sebesar 14,681%. Data kinetika enzim hasil pemurnian diperoleh KM =1,278 mg mL-1 substrat dan Vmaks = 1,271 μmol mL-1 menit-1, t1/2 = 31,111 menit,ki = 0,022 menit-1 dan ΔGi =100,540 KJ mol-1. Pada data kinetika enzim hasilamobilisasi diperoleh KM = 0,445 mg mL-1 substrat dan Vmaks = 0,422 μmol Mlmenit-1, t1/2 = 39,833 menit, ki = 0,017 menit-1 dan ΔGi = 104,424 KJ mol-1.Berdasarkan penurunan nilai ki , peningkatan waktu paruh (t1/2) dan nilai ΔGi,diketahui bahwa amobilisasi menggunakan bentonit dapat meningkatkan stabilitasenzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148.

Kata kunci : Selulase , Bacillus subtilis ITBCCB148, Amobilisasi enzim, Bentonit

Page 3: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

ABSTRACT

THE IMMOBILIZATION OF CELLULASE FROM Bacillus SubtilisITBCCB148 BY BENTONITE

By

Fika Putri Aulia

Cellulase is widely use in industry to convert cellulose into glucose. For a certainindustrial processes, the enzyme must be set up at extreme level of both pH andtemperature. This research to increase the stability of cellulose enzyme fromBacillus Subtilis ITBCCB148 by the enzyme immobilization process usingbentonite. The steps in this research are: production, isolation, purification,immobilization and characterization of purified and immobilized enzymes. Theresearch show the specific activity of the puried enzyme of 14,075 U/mg,increased of 5,7 times than the crude extract. The purified cellulase enzyme has anoptimum temperature at 500C. Whereas the immobilized enzyme at 600C. Theresidual activity on 600C for 100 minutes for purified enzyme was 7.330%, whilethe immobilized enzyme was 14.681%. Kinetic datas of purified enzyme resultswere KM = 1.278 mg mL-1 substrate, Vmax = 1.271 µmol mL-1 minute-1,t1/2 = 31.111 minutes, Ki = 0.022 min-1 and ΔGi = 100.540 KJ mol-1. The datas ofthe immobilized enzyme were KM = 0.445 mg mL-1 substrate, Vmax = 0.442 µmolmL-1 minute-1, t1/2 = 39.833 minutes, Ki = 0.017 min-1 and ΔGi = 104.424 KJmol -1. Based on the decrease of ki, increase of half-time (t½) and the value of ΔGithe immobilization by using bentonite can improve the stability of celluloseenzyme from Bacillus Subtilis ITBCCB148.

Key words : Cellulase Enzyme, Bacillus Subtilis ITBCCB148, Enzymeimmobilization, Bentonite

Page 4: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ITBCCB148MENGGUNAKAN BENTONIT

Oleh

FIKA PUTRI AULIA

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh GelarSARJANA SAINS

Pada

Jurusan KimiaFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2017

Page 5: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148
Page 6: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148
Page 7: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Tanjung Karang, Bandar Lampung pada

tanggal, 27 November 1995, sebagai anak pertama dari tiga

bersaudara, putri dari Bapak Kartarina dan ibu Farida Rita.

Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-kanak di TK

Tunas Melati II (PTPN VII), Natar, Lampung Selatan pada tahun

2001. Sekolah Dasar di SDS Al-Kautsar Bandar Lampung pada tahun 2007. Sekolah

Menengah Pertama di SMPN 22 Bandar Lampung pada tahun 2010, dan Sekolah

Menengah Atas di SMAN 1 NATAR Lampung Selatan pada tahun 2013. Pada tahun

2013, penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila melalui jalur

SNMPTN (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri). Pada tahun 2016

Penulis telah melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 40 hari di Desa

Tanjung Anom, Kec. Terusan Nunyai, Kab. Lampung Tengah. Tepat ditahun yang

sama 2016, Penulis melakukan Praktek Kerja Lapangan di Laboratorium Biokimia

Jurusan Kimia FMIPA UNILA. Selama menjadi mahasiswa penulis pernah menjadi

asisten praktikum Kimia Dasar jurusan S1 Kehutanan periode 2015/2016 ,

KimiaDasar jurusan S1 Teknologi Hasil Pertanian 2015/2016, Kimia Dasar S1

Page 8: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

jurusan Perternakan 2016/2017, Biokimia Umum jurusan S1 Biologi dan jurusan

S1 Teknologi Hasil Pertanian periode 2017/2018. Penulis juga aktif di organisasi

Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA Unila sebagai Kader Muda

Himaki (KAMI) periode 2013/2014, anggota Bidang Sosial dan Masyarakat

HIMAKI periode 2014/2015 – 2015/2016

Page 9: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

MOTTO

“Sesungguhnya sesudah kesulitan ada kemudahan“

(Q.S Al. Insyirah;6).

Setiap aku merasa beruntung, bisa jadi itu adalah satudari ribuan doa ibuku yang dikabulkan ALLAH...

“EVERYDAY IS RACE, THE LAST BUT NOT LEAST”

“Setiap hari langkah kehidupann begitu cepat, bagaikan pembalap berebutdan melaju menjadi nomor satu, tetapi yang terakhir bukanlah yang terburuk”

Berusahalah untuk tidak menjadi manusia yang berhasil tapi

berusahalah menjadi manusia yang berguna.

(Albert Einstein)

Tetapkanlah Pikiran yang terus melangit dandengan hati yang terus membumi

(Pidi Baiq)

Page 10: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

Atas berkat rahmat ALLAH SWT sang pemilik jiwa dan ragakuyang telah menganugerahkan hidayah-Nya, dan Nabi

Muhammad SAW sebagai suri tauladanku kupersembahakankarya sederhanaku dengan penuh cinta dan perjuangan

sebagai rasa sayang dan baktiku Teruntuk :

Kedua Orang tua ku,Mamah tercinta Farida Rita dan Papah Kartarina yang telah

menjadi sumber kekuatan dan semangat bagiku

Kedua adikku,Fiki Muhamad Qoyum dan M. Bintang Faki yang selalu

penulis sayangi

Pembimbing penelitianku, Prof. Dr. Ir. Yandri AS.,M.S.Guru-guru dan Dosen-dosen yang selalu membagi ilmu dan

pengalamannya untukku,

Segenap keluarga besarku yang selalu mendo’akankeberhasilanku,

Seluruh sahabat dan teman-temanku yang senantiasamemberikan semangat dan bantuan untukku,

Serta Alamamaterku, tercinta.Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung

Page 11: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

SANWACANA

Assalamualaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahirabbil’alamin. Segala Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat

Allah SWT Yang Maha Pengasih dan Penyayang, karena atas ridho dan karunia-

Nya penulis dapan menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Amobilisasi Enzim

Selulase Dari Bacillus Subtilis ITBCCB148 Menggunakan Bentonit” dengan

baik dan lancar. Shalawat serta salam tak lupa penulis selalu haturkan kepada

Rasulullah, Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabatnya, yang

dinanti-nantikan syafa’atnya di Yaumil Akhir kelak. Amin.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana

pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Lampung. Selama menempuh pendidikan hingga penyusunan skripsi

ini penulis tidaklah lepas dari bantuan, dukungan, serta motivasi dari berbagai

pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Prof. Warsito, D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam di Universitas Lampung, yang telah memberikan bantuan

kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini.Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono,

M. T., selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila yang telah memberikan

bantuan kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini.

Page 12: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

2. Prof. Dr. Ir. Hi. Yandri A. S., M. S., selaku Dosen Pembimbing yang

senantiasa memberikan bimbingan, pendampingan, arahan, saran, serta

dukungan kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

3. Prof. Dr. Buhani, M.Si., selaku Dosen Pembahas I yang telah memberikan

masukan berupa kritik dan saran serta ilmunya demi kelancaran penelitian dan

skripsi penulis.

4. Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku Dosen Pembahas II yang telah memberikan

masukan berupa kritik dan saran serta ilmunya demi kelancaran penelitian dan

skripsi penulis.

5. Andi Setiawan, Ph.D., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah

memberikan saran, bimbingan, motivasi dan nasihat kepada penulis selama

menjalani masa perkuliahan.

6.7. Bapak dan Ibu dosen terbaik Unila khususnya Jurusan Kimia FMIPA yang

telah memberikan bekal ilmu pengetahuan, wawasan, motivasi, serta

pengalaman-pengalaman yang menginspirasi.

8. Seluruh staff karyawan Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung,

Terkhusus Pak Jhon dan Uni sebagai Laboran Biokimia serta Pak Gani dan Ibu

Ani sebagai staff Administrasi terimakasih atas segala bantuan nya selama ini

kepada penulis

9. Teristimewa Mamahku Farida Rita dan Papahku Kartarina, terima kasih atas

segala kasih sayang, nasihat, bantuan, do’a yang terbaik dalam hidupku serta

segala perjuangan sehingga penulis sampai ketahap ini.

10. Adik-adik ku tersayang Fiki Muhammad Qayum dan Muhammad Bintang

Faki terima kasih telah memberikan semangat dan motivasi nya buat Yunda

Page 13: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

11. Keluarga Besarku, Puan, Bunda, Ibu Ratu, Amah, Muda, Uncu, Tante Presi,

Kiyai Ibnu, Ka’atu Ham, adek Suci, Surya, Raffi, Tyo, Asha, Ayah Kasim,

Umik, Bunda Yani, Kanjeng Andi, Suhunan, Daying Nia, Daying Piyo, Siti

Palis, Buya Kanjeng, Ibu Pusat dan Ibu Sunan terima kasih atas segala

bantuan dan motivasi yang diberikan.

12. Sahabatku tersayang, Mia Permatasari, Riski Rahmadhani, Esti Sandra Pertiwi

dan Yunita Febrianti terima kasih selama 4 tahun ngambeknya, cerewetnya,

senengnya, sayangnya, perhatiannya, semangatnya, motivasinya, makasih bee

selalu jadi yang terbaik dari semua yang baik-baik ya.

13. Widi Tejakusuma, terimakasih atas segala bantuan, nasihat, saran motivasi

dan do’a kepada penulis.

14. Teman- Teman peergroup Biokimia Yandri Reseach Mia Permatasari, Sinta

Dewi O, Fathaniah Sejati, Maya Retna Sari, Khomsatun Khasanah, Ezra

Rhienzky, Sri Wahyuni. Mulyono Research Vyna Ayu RS, Prasetyaningtyas

Chakti, Melia Tria A, Monica Dhamayanti, Shelta Mei I, Riyan Wahyudi,

Terima kasih atas bantuan, canda, tawa, motivasi yang diberikan selama

penelitian kepada penulis.

15. Kakak-Kakak peergroup terbaikku mbk Arum., S. Farm , Putri Amalia.,M.Si.,

Ana Febrilianti W., S.Si , Aprilia Isma D., S.Si , Uswatun Khasanah., S.Si ,

Rizky Putri Yana., S.Si , Syathira Assegaf., S.Si, Fifi Ardhyanti., S.Si , Diani

Iska M, Ayu Imani, Meta Fosfi, Kak Aziez, Rizal Rabbani, Terima kasih atas

bantuan, saran, motivasi yang diberikan selama penelitian kepada penuulis

16. Adik-adik peergroup BIOKIMIA 2014, Semangat Penelitiannya.

Page 14: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

17. Temanku, keluargaku KIMIA 2013 “ CHETIR” yang menjadi rumah bagi

penulis, tempat singgah, dan berbagi dalam segala keadaan.

18. Team KKN Tanjung Anom, Kartika Agus Kusuma, Veronika Netty K, Radho

Al-Kautsar, Widi Tejakusuma, Gilbran Ibrahim, M. Luthfi Anas terima kasih

atas canda, tawa dan pengalaman yang berharga selama 40++ hari nya.

19. Sahabat-sahabat “Anak GOA“Guntur, Iben, Yogi, Rendy, Agus, dan Meiliza

yang telah membantu dan memberikan motivasi selama ini kepada penulis.

20. Sahabat SMA ku, Rizky, Ita, Tiwi, Priska, Renita, Ovi, Witri , Sahabat SMP

ku Dian, Febria, Fatimah, Terima kasih atas canda, tawa dan motivasinya

selama ini.

21. Kakak dan Adik tingkat penulis dari tahun 2010-2014.

Penulis berharap semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah

diberikan kepada penulis selama ini. Amin. Akhir kata, penulis menyadari bahwa

skripsi ini masih sangat jauh dari kata sempurna, namun penulis berharap semoga

skripsi ini dapat bermanfaat dan memiliki nilai guna khususnya rekan-rekan

mahasiswa dan pembaca pada umumnya. Amin.

Bandar Lampung, November 2017Penulis

Fika Putri Aulia

Page 15: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ........................................................................................ i

DAFTAR TABEL ................................................................................. iii

DAFTAR GAMBAR............................................................................. ivI. PENDAHULUAN ........................................................................... 1

A. Latar Belakang ........................................................................... 1

B. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4

C. Manfaat Penelitian ...................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA................................................................. 5

A. Enzim ........................................................................................ 5

B. Selulosa ..................................................................................... 14

C. Enzim Selulase .......................................................................... 15

D. Bacillus subtilis ......................................................................... 17

E. Stabilitas Enzim......................................................................... 18

F. Isolasi dan Pemurnian Enzim ................................................... 20

G. Pengujian aktivitas enzim selulase dengan metode Mandels.... 24

H. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry ....................... 24

I. Amobilisasi Enzim .................................................................... 25

J. Bentonit ..................................................................................... 30

K. Kinetika Reaksi Enzim.............................................................. 33

III. METODE PENELITIAN ............................................................. 35

A. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................... 35

Page 16: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

B. Alat dan Bahan ............................................................................ 35

C. Prosedur Penelitian...................................................................... 361. Persiapan Pendahuluan............................................................ 362. Pembuatan media inokulum dan media fermentasi................. 363. Inokulasi Bacillus Subtilis ....................................................... 374. Isolasi dan Produksi Enzim Selulase....................................... 375. Uji aktivitas Enzim Selulase dengan metode Mandels ........... 386. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry ..................... 407. Pemurnian Enzim Selulase...................................................... 408. Amobilisasi Enzim Selulase menggunakan Bentonit.............. 429. Karakterisasi Enzim Selulase .................................................. 43

10. Diagram Alir Percobaan.......................................................... 45

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 46

A. Produksi dan Isolasi enzim selulase ........................................... 46

B. Pemurnian enzim Selulase........................................................... 47

C. Penentuan pH pengikatan amobilisasi enzim selulase ................ 51

D. Karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian dan enzim ...........selulase hasil amobilisasi ........................................................... 521. Penentuan suhu optimum enzim selulase hasil pemurnian

dan enzim selulase hasil amobilisasi ...................................... 522. Penentuan stabilitas termal enzim selulase hasil pemurnian

dan enzim selulase hasil amobilisasi ...................................... 533. Penentuan KM dan Vmaks enzim selulase hasil pemurnian

dan enzim selulase hasil amobilisasi ...................................... 544. Pemakaian berulang enzim amobilisasi .................................. 565. Perubahan konstantalaju inaktivasi (ki), waktu paruh (t1/2)

dan energi akibat denaturasi (Gi) enzim selulase hasil pemurniandan enzim selulase hasil amobilisasi ..................................... 57a.Waktu paruh (t1/2) dan konstanta laju inaktivasi termal (ki) 59b.Perubahan energi akibat denaturasi .................................... 59

V. SIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 60

A. Simpulan .................................................................................... 60B. Saran ........................................................................................... 61

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

Page 17: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu ............................................... 9

2. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ............................................... 10

3. Hubungan kecepatan reaksi dengan konsentrasi enzim ....................... 11

4. Teori kunci gembok dan kecocokan enzim.......................................... 13

5. Struktur selulosa.................................................................................... 14

6. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase ............................. 16

7. Bacillus subtilis .................................................................................... 17

8. Dialisis.................................................................................................. 23

9. Teknik Pengikatan Enzim .................................................................... 27

10. Metode Ikatan Silang............................................................................ 28

11. Penjebakan teknik kisi ......................................................................... 29

12. Teknik mikrokapsul ............................................................................. 30

13. Struktur Bentonit .................................................................................. 31

14. Kurva Lineweaver-Burk ....................................................................... 34

15. Skema fraksinasi enzim dengan amonium sulfat ................................. 41

16. Diagram alir penelitian ......................................................................... 45

17. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat (0-100%) dengan aktivitas

spesifik enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148.................. 48

18. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat (0-10)% dan (10-90%)

dengan aktivitas spesifik enzim selulase dari Bacillus subtilis

ITBCCB148.......................................................................................... 49

Page 18: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

19. Aktivitas unit enzim selulase pada beberapa pH pengikatan .............. 51

20. Suhu optimum enzim selulase hasil pemurnian dan enzim selulase

hasil amobilisasi ................................................................................... 52

21. Stabilitas enzim selulase hasil pemurnian dan enzim selulase hasil

amobilisasi............................................................................................ 53

22. Grafik Lineweaver-Burk enzim selulase hasil pemurnian dan

enzim selulase hasil amobilisasi........................................................... 55

23. Pemakaian berulang enzim selulase menggunakan bentonit .............. 56

24. Grafik ln (EI/E0) enzim enzim selulase hasil pemurnian dan

enzim selulase hasil amobilisasi........................................................... 58

25. Kurva Standar Glukosa ........................................................................ 82

26. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA).................................... 83

Page 19: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Beberapa enzim yang dihasilkan mikroba dan aplikasinya ..................... 6

2. Pemurnian enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148................. 50

3. Nilai konstanta laju inaktivasi (ki), waktu paruh (t1/2), dan energi

akibat denaturasi (ΔGi) enzim selulase hasil permunian dan enzim

selulase hasil amobilisasi ........................................................................ 57

4. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat

(0-100%)dengan aktivitas spesifik enzim selulase ............................... 71

5. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat (0-10%) dan (10-90%)

dengan aktivitas spesifik enzim selulase ............................................... 71

6. Pengikatan enzim selulase pada matrik bentonit .................................... 72

7. Hubungan antrara suhu dengan aktivitas unit (U/mL) enzim selulase

hasil pemurnian dan enzim selulase hasil amobilisasi .......................... 73

8. Hubungan antrara suhu dengan aktivitas sisa (%) enzim selulase hasil

pemurnian dan enzim selulase hasil amobilisasi .................................. 73

9. Data untuk penentuan KM dan Vmaks enzim selulase hasil pemurnian

berdasarkan Lineweaver-Burk ............................................................... 74

10. Data untuk penentuan KM dan Vmaks enzim selulase hasil amobilisasi

berdasarkan Lineweaver-Burk ............................................................... 74

11. Hubungan antrara aktivitas unit (U/mL) enzim selulase hasil pemurnian

dan enzim selulase hasil amobilisasi selama inaktivasi termal 600C..... 75

12. Hubungan antrara aktivitas sisa (%) enzim selulase hasil

pemurnian dan enzim selulase hasil amobilisasi selama inaktivasi

termal 600C ............................................................................................. 76

Page 20: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

13. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase hasil

amobilisasi selama inaktivasi termal 600C ............................................ 77

14. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase hasil

pemurnian selama inaktivasi termal 600C............................................. 78

15. Hubungan antara pengulangan enzim selulase hasil amobilisasi dengan

aktivitas unit (U/mL) .............................................................................. 81

16. Absorbansi glukosa pada berbagai konsentrasi untuk menentukan kurva

standar glukosa ...................................................................................... 82

17. Absorbansi Bovine Serum Albumin pada berbagai konsentrasi untuk

menentukan kurva standar BSA ............................................................. 83

.

Page 21: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

I.PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dewasa ini peningkatan jumlah industri pangan dan non pangan dalam

penggunaan enzim semakin pesat, terutama enzim golongan hidrolase seperti

protease, amilase, lipase, kitinase, xilanase dan selulase. Seiring dengan

peningkatan penggunaan enzim tersebut berbagai penelitian tentang

perkembangan enzim telah dilakukan, karena enzim sebagai salah satu sumber

alternatif untuk menggantikan berbagai proses kimiawi baik dalam bidang industri

maupun dalam bidang bioteknologi (Falch, 1991).

Enzim selulase merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan β-1,4 glikosidik

pada molekul selulosa sehingga menghasilkan glukosa (Afsahi, 2007). Enzim

selulase dapat diperoleh dari berbagai sumber tanaman, insekta dan

mikroorganisme. Mikroorganisme penghasil selulase secara ekstraseluler tersebar

pada kapang dan bakteri (Amstrup, 1979).

Enzim ekstraseluler diperoleh dengan membiakkan mikroorganisme penghasil

enzim pada medium tertentu, kemudian diekstraksi dan dimurnikan (Balford,

1981). Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat dihasilkan oleh

beberapa mikroorganisme salah satunya yaitu Bacillus subtilis. Enzim ini

Page 22: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

2

mempunyai sifat tahan terhadap panas (Judoamidjojo dkk, 1989). Enzim yang

dihasilkan secara ekstraseluler memiliki kelebihan yaitu enzim ini dapat diperoleh

dalam keadaan murni dengan cara pemisahan dan pemurnian yang tidak begitu

rumit (Smith, 1990).

Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif yang biasanya ditemukan di dalam

tanah. Bakteri ini mempunyai kemampuan membentuk pertahanan diri yang kuat,

dengan membentuk endospora yang bersifat melindungi sehingga dapat tahan

pada kondisi lingkungan yang ekstrim (Nakano and Zuber, 1998).

Bacillus subtilis diklasifikasikan sebagai bakteri yang bersifat aerob. Bacillus

subtilis merupakan jenis kelompok bakteri yang mampu mensekresikan antibiotik

dalam jumlah besar ke luar dari sel (Sastrodinoto, 1980).

Penggunaan enzim dalam proses industri harus memenuhi syarat-syarat tertentu

yaitu enzim harus stabil pada suhu tinggi (thermostabil) dan tahan terhadap

kondisi pH yang ekstrim. Sedangkan, pada umumnya enzim hanya mampu

bekerja pada kondisi fisiologis dan tidak tahan terhadap kondisi ekstrim

(Goddatte, 1993). Beberapa kelemahan tersebut dapat diatasi dengan mengikatkan

enzim pada matriks pendukung yang tidak larut dalam air. Teknik ini dikenal

dengan amobilisasi enzim. Amobilisasi enzim adalah suatu enzim yang secara

fisik maupun kimia tidak bebas bergerak (Winarno, 1986), di mana enzim

teramobilisasi mampu mempertahankan aktivitasnya dan dapat digunakan secara

berulang maupun proses kontinyu (Jegannathan dkk, 2008).

Page 23: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

3

Bentonit adalah satu bahan alam yang dapat digunakan pada pengelolaan limbah.

Bentonit banyak dimanfaatkan dalam beberapa bidang industri, misalnya industri

sabun, zat pengisi aspal, farmasi, pengisi resin, semen dan kecantikan

(Zulkarnain, 1991). Bentonit digunakan sebagai matriks dalam proses amobilisasi

karena bentonit mempunyai luas permukaan yang sangat besar, sehingga dapat

mengikat enzim dalam jumlah besar, mempunyai kapasitas penukar ion yang

tinggi, tidak larut dalam air, memiliki daya tukar ion yang besar, mengandung

kation bivalen (Ca2+) yang dapat menstabilkan enzim, murah, tersedia cukup

berlimpah di alam termasuk Indonesia, memiliki kestabilan mekanik dan termal,

tidak mengganggu reaksi enzimatik yang dikehendaki, rigid, stabil (inert), dan

non-toksik (Sedaghat, 2009).

Pemanfaatan bentonit sebagai media pendukung amobilisasi sebelumnya telah

dilakukan terhadap enzim pektinase dari Bacillus subtilis (Rosdiana, 2013),

menghasilkan waktu optimum pektinase teradsorpsi adalah pada waktu

pengocokkan 4 jam dan aktivitas pektinase sebesar 642,7 µg/g.menit.

(Sutrisno, 2014) melaporkan bahwa waktu optimum enzim xilanase dari

Trichoderma viride yang teradsorpsi adalah waktu pengocokan 3 jam dengan

peningkatan aktivitas sebesar 10,245 unit. (Meriyanti 2014), telah berhasil

meningkatkan stabilitas enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 yang memiliki

suhu optimum enzim selulase hasil amobil pada 65oC dan enzim hasil pemunian

memiliki suhu optimum 60oC. (Wulandari, 2016) juga berhasil melakukan

amobilisasi enzim protease dari Bacillus subtilis memiliki suhu optimum 50ºC,

sedangkan enzim amobil pada suhu 55ºC.

Page 24: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

4

Pada penelitian ini menggunakan Bacillus subtilis ITBCCB148 sebagai sumber

enzim selulase. Kemudian enzim tersebut diamobil menggunakan bentonit

sebagai matriks atau bahan pendukung. Amobilisasi diharapkan dapat

meningkatkan stabilitas enzim selulase ini.

B. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Mengisolasi enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan

aktivitas dan kemurnian yang tinggi.

2. Memperoleh enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan

kestabilan yang tinggi melalui amobilisasi fisik menggunakan bentonit.

C. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah :

1. Mengetahui teknik isolasi enzim untuk meningkatkan stabilitas enzim selulase

dari Bacillus subtilis ITBCCB148.

2. Mengetahui pengaruh bentonit terhadap stabilitas enzim selulase dari

Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan teknik amobilisasi fisik .

3. Enzim selulase dengan stabilitas yang tinggi dapat digunakan dalam proses

industri.

Page 25: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

Enzim adalah protein berbentuk bulat (globular), yang terdiri atas satu rantai

polipeptida atau lebih dari satu rantai polipeptida (Wirahadikusumah, 1989).

Enzim mempunyai berat molekul yang bervariasi antara 104 - 107 Kda

(Dryer, 1993) yang dapat mempercepat reaksi 108 - 1011 kali lebih cepat

dibandingkan dengan reaksi tanpa katalis (Poedjiadi, 2006). Enzim bekerja sangat

spesifik dalam kerja katalitiknya, sehingga enzim dikatakan mempunyai sifat

sangat khas karena hanya bekerja pada substrat tertentu dan bentuk reaksi tertentu

(Girindra, 1986)

Keunggulan enzim sebagai biokatalisator antara lain memiliki spesifitas tinggi,

mempercepat reaksi kimia tanpa pembentukkan produk samping, produktivitas

tinggi dan dapat menghasilkan produk akhir yang tidak terkontaminasi sehingga

mengurangi biaya purifikasi dan efek kerusakan. Suatu enzim dapat mempercepat

laju reaksi kira-kira 108 sampai 1011 kali lebih cepat dibandingkan dengan reaksi

yang tidak dikatalisisis (Poedjiadi, 1994).

Salah satu fungsi yang paling menonjol dari protein adalah aktivitas enzim. Enzim

mempunyai fungsi khusus antara lain yaitu : (1) menurunkan energi aktivasi

Page 26: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

6

(2) mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan tetap tanpa mengubah besarnya

tetapan kesetimbangan, dan (3) mengendalikan reaksi (Page, 1997). Enzim

digunakan dalam sebagian besar sektor industri, terutama industri makanan.

Selain itu, enzim juga digunakan dalam industri deterjen, farmasi dan tekstil.

Beberapa enzim yang dihasilkan mikroba dan aplikasinya ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel l. Beberapa enzim yang dihasilkan mikroba dan aplikasinya

Enzim Sumber Aplikasi

Amilase Bacillus subtilis Tekstil, pelarutan pati,Aspergillus oryzae produksi glukosa

Penicillium roquefort

Aspergillus niger

Penicillinase Bacillus subtilis Degradasi penisilinInvertase Aspergillus oryzae Industri permen

Saccharomyces cerevisiae

Selulase Aspergillus niger Pengurang viskositas,

Tricoderma sp. membantu sistem pencernaan

Pektinase Aspergillus niger Klarifikasi wine dan jus buahPelunak, membantu sitem

Protease Clostridium sp. pencernaanSumber : Fowler, 1988.

1. Klasifikasi enzim

Klasifikasi enzim dapat dibedakan sebagai berikut :

a. Menurut Wirahadikusumah (2001), berdasarkan fungsinya enzim dapat

dibedakan menjadi enam kelas dan tiap kelas mempunyai beberapa

subkelas. Dalam tiap subkelas, nama resmi dan nomor klasifikasi dari tiap

enzim melukiskan reaksi yang dikatalisis berdasarkan IUPAC yaitu:

1. Oksidoreduktase, mengkatalisis reaksi oksidasi-reduksi. Contoh : NAD

oksido reduktase (CEIUB); Alkohol dehidrogenase (Trivial)

Page 27: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

7

2. Transferase, mengkatalisis perpindahan gugus molekul dari suatu molekul

ke molekul yang lain, seperti gugus amino, karbonil, metal, asil, glikosil

atau fosforil. Contoh : Glukosa-6-transferase (CEIUB); Glukokinase

(trivial)

3. Hidrolase, berperan dalam reaksi hidrolisis. Contoh : α-1-4-glukan 4-

glukanohidrolase (CEIUB); α-amilase (trivial)

4. Liase, mengkatalisis reaksi adisi atau pemecahan ikatan rangkap dua.

Contoh: 2-Asam oksalokarboksi-liase (CEIUB); piruvat dekarboksilase

(trivial)

5. Isomerase, mengkatalisis reaksi isomerisasi. Contoh: Alanina

rasemase (CEIUB); alanina rasemase (trivial)

6. Ligase, mengkatalisis pembentukan ikatan dengan bantuan pemecahan

ikatan dalam ATP. Contoh: Karbondioksida ligase (CEIUB); piruvat

karboksilase (trivial)

b. Menurut Lehninger (2005), klasifikasi enzim berdasarkan cara terbentuknya

dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Enzim konstitutif, yaitu enzim yang jumlahnya dipengaruhi

kadar substratnya, misalnya enzim amilase.

2. Enzim adaptif, yaitu enzim yang pembentukannya dirangsang oleh adanya

substrat, contohnya enzim β-galaktosidase yang dihasilkan oleh bakteri

E.coli yang ditumbuhkan di dalam medium yang mengandung laktosa.

Page 28: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

8

2. Sifat katalitik enzim

Menurut Page (1997) sifat-sifat katalitik dari enzim ialah sebagai berikut:

a. Enzim mampu meningkatkan laju reaksi pada kondisi biasa (fisiologik) dari

tekanan, suhu dan pH.

b. Enzim mempunyai selektifitas tinggi terhadap substrat (substansi yang

mengalami perubahan kimia setelah bercampur dengan enzim) dan jenis

reaksi yang dikatalisis.

c. Enzim memberikan peningkatan laju reaksi yang tinggi dibanding dengan

katalis biasa.

3. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah sebagai berikut:

a. Suhu

Suhu sangat mempengaruhi aktivitas enzim pada waktu mengkatalisis suatu

reaksi. Seluruh enzim memerlukan jumlah panas terutama untuk dapat aktif.

Sejalan dengan meningkatnya suhu, makin meningkat pula aktivitas enzim.

Secara umum, setiap peningkatan sebesar 10°C di atas suhu minimum, aktivitas

enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat. Aktivitas enzim meningkat pada

kecepatan ini hingga mencapai kondisi optimum. Peningkatan suhu yang melebihi

suhu optimumnya menyebabkan lemahnya ikatan di dalam enzim secara

struktural (Pratiwi, 2008). Pada suhu maksimum enzim akan terdenaturasi karena

struktur protein terbuka dan gugus non polar yang berada di dalam molekul

menjadi terbuka keluar, kelarutan protein di dalam air yang polar menjadi turun,

Page 29: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

9

sehingga aktivitas enzim juga akan turun (Lehninger, 2005). Hubungan antara

aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam Gambar 1.

Gambar 1. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Poedjiadi, 1994).

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Suhu optimal enzim antara 35ºC-

50ºC, pada suhu di atas dan di bawah optimalnya, aktivitas enzim berkurang

karena enzim secara bertahap menjadi inaktif akibat protein terdenaturasi.

b. pH

Enzim pada umumnya bersifat amfolitik, yang berarti enzim mempunyai

konstanta disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya, terutama gugus

terminal karboksil dan gugus terminal amino. Perubahan kereaktifan enzim

diperkirakan merupakan akibat dari perubahan pH lingkungan (Winarno, 1989).

Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ditunjukkan pada Gambar 2.

Page 30: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

10

Gambar 2. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Winarno, 1989).

pH optimal enzim adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat

asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi. Akan tetapi beberapa enzim

hanya beroprasi dalam keadaan asam atau alkalis. Sebagai contoh, pepsin, enzim

yang dikeluarkan ke lambung, hanya dapat berfungsi dalam kondisi asam, dengan

pH optimal 2 (Gaman dan Sherrington, 1994).

Enzim memiliki kontanta disosiasi pada gugus asam ataupun gugus basa terutama

pada residu terminal karboksil dan asam aminonya. Namun dalam suatu reaksi

kimia, pH untuk suatu enzim tidak boleh terlalu asam maupun terlalu basa karena

akan menurunkan kecepatan reaksi dengan terjadinya denaturasi. Enzim memiliki

pH optimum tertentu, pada umumnya sekitar pH 4,5 sampai 8, dan pada kisaran

pH tersebut enzim mempunyai kestabilan yang tinggi

(Williamson dan Fieser, 1992).

c. Konsentrasi enzim dan substrat

Semakin tinggi konsentrasi enzim maka kecepatan reaksi akan semakin

meningkat hingga pada batas konsentrasi tertentu dimana hasil hidrolisis akan

Page 31: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

11

konstan dengan naiknya konsentrasi enzim yang disebabkan penambahan enzim

sudah tidak efektif lagi (Reed, 1975). Hubungan antara laju reaksi enzim

dengan konsentrasi enzim ditunjukkan dalam Gambar 3.

Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan konsentrasi enzim (Page, 1997).

Pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi apabila

konsentrasi enzim tetap. Kompleks enzim substrat akan terbentuk apabila ada

kontak antara enzim dengan substrat. Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau

bagian enzim yang disebut bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian

aktif enzim ini hanya menampung sedikit substrat. Bila konsentrasi substrat

diperbesar, makin banyak substrat yang dapat berhubungan dengan enzim pada

bagian aktif tersebut. Konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal

ini menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Pada keadaan bertambah

besarnya konsentrasi substrat tidak menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi

kompleks enzim substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun tidak bertambah

besar (Wuryanti, 2004)

Page 32: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

12

d. Aktivator dan inhibitor

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator adalah

senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis.

Komponen kimia yang membentuk enzim disebut juga kofaktor. Kofaktor

tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn, Fe, Ca, Mn, Cu dan Mg atau

dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut koenzim

(Martoharsono, 1981).

Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh senyawa penghambat enzim (inhibitor).

Inhibitor dapat bersaing dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim

sehingga dapat terjadi pengurangan laju reaksi. Inhibitor biasanya menyerupai

substrat normal dengan bentuk tiga dimensinya. Karena persamaan ini, enzim

dapat berikatan dengan inhibitor (Pratiwi, 2008).

4. Teori pembentukkan enzim-substrat

Menurut (Shahib, 2005) cara kerja enzim dapat dijelaskan dengan dua teori,

yaitu teori kunci-gembok (lock and key theory) dan teori kecocokan yang

terinduksi (induced fit theory), yang ditunjukkan dalam Gambar 4.

Page 33: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

13

Gambar 4. Teori kunci-gembok dan kecocokan induksi (Shahib, 2005).

Menurut teori kunci-gembok, enzim dan substrat bergabung bersama membentuk

kompleks, seperti kunci yang masuk dalam gembok. Hal ini dikarenakan adanya

kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan sisi aktif enzim, sehingga sisi

aktif enzim cenderung kaku. Substrat dapat bereaksi dengan energi aktivasi yang

rendah di dalam kompleks enzim. Setelah bereaksi, kompleks lepas dan

melepaskan produk serta membebaskan enzim (Shahib, 2005).

Menurut teori kecocokan yang terinduksi, sisi aktif enzim merupakan bentuk

yang fleksibel. Ketika substrat memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif

termodifikasi melingkupi substrat membentuk kompleks. Ketika produk sudah

terlepas dari kompleks, enzim tidak aktif menjadi bentuk yang lepas. Sehingga,

substrat yang lain kembali bereaksi dengan enzim tersebut (Shahib, 2005).

Page 34: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

14

B. Selulosa

Selulosa merupakan senyawa organik yang paling melimpah di bumi,

diperkirakan sekitar 1011 ton selulosa dibiosintesis per tahun (Fessenden, 1992).

Selulosa merupakan polisakarida yang terdiri atas satuan-satuan glukosa yang

terikat dengan ikatan β-1,4-glikosidik. Molekul selulosa merupakan mikrofibril

dari glukosa yang terikat satu dengan lainnya membentuk rantai polimer yang

sangat panjang (Fan, 1982). Struktur selulosa dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Struktur selulosa (Sjostrom, 1995).

Selulosa dapat dihidrolisis menjadi glukosa dengan menggunakan asam atau

enzim. Hidrolisis menggunakan asam biasanya dilakukan pada temperatur tinggi.

Proses ini relatif mahal karena kebutuhan energi yang cukup tinggi. Baru pada

tahun 1980-an, mulai dikembangkan hidrolisis selulosa dengan menggunakan

enzim selulase (Gokhan, 2002). Selulosa diproduksi oleh fungi, bakteri,

tumbuhan, dan ruminansia. Produksi komersial selulase pada umumnya

menggunakan jamur atau bakteri yang telah diisolasi. Meskipun banyak

mikroorganisme yang dapat mendegradasi selulosa, hanya beberapa

mikroorganisme yang memproduksi selulase dalam jumlah yang signifikan yang

mampu menghidrolisa kristal selulosa secara invitro (Ikram, 2005).

Page 35: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

15

Mikroorganisme pendegradasi selulosa antara lain jamur (aerobik) dan bakteri

(anaerobik). Jamur adalah mikroorganisme utama yang dapat memproduksi enzim

selulase, meskipun beberapa bakteri dan actinomycetes juga dapat menghasilkan

aktivitas selulase. Berbagai jenis jamur aerobik seperti Trichoderma reesei,

Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus terreus,

Neurospora crassa dan Phanerochaet chrysosporium mampu mendegradasi

selulosa dengan memproduksi enzim selulase (Damerco, 2003).

C. Enzim Selulase

Enzim yang dapat menghidrolisis ikatan β(1,4) pada selulosa adalah selulase.

Selulase adalah enzim terinduksi yang disintesis oleh mikroorganisme selama

ditumbuhkan dalam medium selulosa (Lee, 2001). Selulase termasuk sistem

multienzim yang terdiri dari tiga komponen. Untuk menghidrolisis selulosa yang

tidak larut atau selulosa kristal diperlukan kerja sinergistik dari ketiga komponen

enzim tersebut. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase dapat dilihat

dalam Gambar 6

Page 36: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

16

Gambar 6. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase (Abdullah,2011).

Adapun ketiga komponen enzim tersebut yaitu:

1. Ekso-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor C1. Faktor ini diperlukan

untuk menghidrolisis selulosa dalam bentuk kristal.

2. Endo-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor Cx. Faktor ini diperlukan

untuk menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glukosida (selulosa amorf).

3. β-(1,4)-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa (Reese, 1976).

Aktivitas selulase disebabkan oleh enzim non hidrolitik C1, hidrolisis selulosa

yang telah diaktifkan dilakukan oleh enzim Cx. Menurut hipotesa ini, mikroba

yang tumbuh pada selulosa kristal membentuk C1, sedangkan mikroba yang hanya

dapat menguraikan selulosa yang telah dilonggarkan oleh asam fosfat atau

selulosa tersubstitusi akan kekurangan enzim C1, tetapi banyak menghasilkan

enzim Cx (Muchtadi, 1992).

selulase (Kristal)

endoselulase

Selobiosa dan selloterose

Selulase

Eksoselulase

Sellobiosa(n-glukosidase)

Glukosa

Page 37: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

17

D. Bacillus subtilis

Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif yang biasanya ditemukan di dalam

tanah. Bakteri ini mempunyai kemampuan membentuk pertahanan diri yang kuat,

dengan membentuk endospora yang bersifat melindungi sehingga dapat tahan

pada kondisi lingkungan yang ekstrim (Nakano and Zuber, 1998).

Bacillus subtilis tidak secara langsung termasuk sebagai patogen pada manusia,

bagaimanapun Bacillus subtilis dapat mengkontaminasi makanan tetapi tidak

sampai menyebabkan makanan menjadi beracun (Ryan dan Ray, 2004). Sporanya

dapat bertahan hidup pada pemanasan ekstrim yang seringkali digunakan untuk

memasak makanan dan juga mampu membuat produk pangan roti menjadi busuk

atau rusak (Gielen, 2004). Bacillus subtilis berbentuk batang lurus berukuran 1,5

x 4,5 μm, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai (Gupta, 1990).

Bacillus subtilis diklasifikasikan sebagai bakteri yang bersifat aerob. Bacillus

subtilis merupakan jenis kelompok bakteri yang mampu mensekresikan antibiotik

dalam jumlah besar ke luar dari sel (Sastrodinoto, 1980). Gambar Bacillus subtilis

ditunjukkan pada Gambar 7.

Gambar 7. Bacillus subtilis (Gupta, 1990).

Page 38: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

18

E. Stabilitas Enzim

Stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama

penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta kestabilan terhadap senyawa

yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam atau basa), oleh pengaruh

suhu kondisi-kondisi non fisiologis lainnya (Kazan, 1997). Stabilitas enzim

merupakan sifat penting yang harus dimiliki oleh enzim sebagai biokatalis.

Banyak faktor yang mempengaruhi stabilitas enzim, seperti pH, suhu, kofaktor

dan kehadiran surfaktan (Eijsink, 2005).

Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan enzim yang

mempunyai stabilitas tinggi, yaitu (1) menggunakan enzim yang memiliki

stabilitas ekstrim alami dan mengusahakan peningkatan stabilitas enzim yang

secara alami tidak atau kurang stabil (Junita, 2002), (2) Menurut Illanes (1999),

untuk meningkatkan stabilitas enzim dapat dilakukan dengan penggunaan zat

aditif, modifikasi kimia, amobilisasi dan rekayasa protein.

1. Stabilitas termal enzim

Pada suhu yang terlalu rendah kemantapan enzim tinggi, tetapi aktivitasnya

rendah. Sedangkan pada suhu yang terlalu tinggi aktivitas enzim tinggi, tetapi

kemantapannya rendah. Daerah suhu saat kemantapan dan aktivitas enzim cukup

besar disebut suhu optimum (Wirahadikusumah, 2001). Dalam industri, pada

proses reaksinya menggunakan suhu tinggi bertujuan untuk mengurangi tingkat

kontaminasi dan masalah viskositas serta meningkatkan laju reaksi. Namun, suhu

tinggi merupakan masalah utama dalam stabilitas enzim, karena enzim umumnya

Page 39: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

19

tidak stabil pada suhu tinggi. Proses inaktivasi enzim pada suhu tinggi

berlangsung dalam dua tahap, yaitu :

a. Adanya pembukaan partial (partial unfolding) struktur sekunder, tersier dan

atau kuartener molekul enzim.

b. Perubahan struktur primer enzim karena adanya kerusakan asam amino-

asam amino tertentu oleh panas (Ahern and Klibanov, 1987).

2. Stabilitas pH enzim

Perubahan aktivitas enzim akibat perubahan pH lingkungan disebabkan

terjadinya perubahan ionisasi enzim, substrat atau kompleks enzim substrat,

serta perubahan kemampuan peningkatan dan pengaruh laju reaksi. Pada

umumnya enzim menunjukkan aktivitas maksimum pada suatu kisaran pH yang

disebut pH optimum, yang umumnya antara pH 4,5-8,0 (Winarno, 1986). Enzim

tertentu mempunyai kisaran pH optimum yang sangat sempit. Di sekitar pH

optimum enzim mempunyai stabilitas yang tinggi. Dalam hal ini, enzim yang

sama sering kali pH optimumnya berbeda tergantung dari sumber enzim

tersebut.

Pada reaksi enzimatik, sebagian besar enzim akan kehilangan aktivitas

katalitiknya secara cepat dan irreversibel pada pH yang jauh dari rentang pH

optimum untuk reaksi enzimatik. Inaktivasi ini terjadi karena unfolding molekul

protein sebagai hasil dari perubahan kesetimbangan elektrostatik dan ikatan

hidrogen (Kazan, 1997).

Page 40: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

20

3. Pengaruh Kadar Air

Air memegang peranan penting pada kedua tahap di atas. Oleh karena itu, dengan

menggunakan air seperti pada kondisi mikroakueus, reaksi inaktivasi oleh panas

dapat diperlambat dan stabilitas termal enzim akan meningkat.

Stabilitas termal enzim akan jauh lebih tinggi dalam kondisi kering dibandingkan

dalam kondisi basah. Adanya air sebagai pelumas membuat konformasi suatu

molekul enzim menjadi sangat fleksibel, sehingga bila air dihilangkan molekul

enzim akan menjadi lebih kaku (Virdianingsih, 2002).

F. Isolasi dan Pemurnian Enzim

Enzim dapat diisolasi secara ekstraseluler dan intraseluler. Enzim ekstraseluler

merupakan enzim yang bekerja di luar sel, sedangkan enzim intraseluler

merupakan enzim yang bekerja di dalam sel. Ekstraksi enzim ekstraseluler lebih

mudah dibandingkan ekstraksi enzim intraseluler, karena tidak memerlukan

pemecahan sel dan enzim yang dikeluarkan dari sel mudah dipisahkan dari

pengotor lain serta tidak banyak bercampur dengan bahan-bahan sel lain

(Pelczar dan Chan, 1986 ). Pemurnian enzim adalah salah satu cara untuk

memisahkan protein enzim dari protein jenis lain dan kontaminan. Menurut

Judoamidjojo (1989), proses pengisolasian dan pemurnian enzim berlangsung

beberapa tahapan sebagai berikut:

Page 41: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

21

1. Sentrifugasi

Proses ini bertujuan untuk memisahkan enzim dari sisa-sisa dinding sel, dimana

molekul yang memiliki berat molekul tinggi dapat mengendap di dasar tabung

dengan cepat bila disentrifugasi dengan kecepatan tinggi. Kecepatan

pengendapan molekul bergantung pada beberapa faktor, yaitu berat molekul,

bentuk molekul dan viskositas larutan. Proses ini akan menimbulkan panas,

sehingga dapat mendenaturasi enzim. Untuk menghindarinya maka sentrifugasi

dilakukan pada suhu 2-4oC (sentrifugasi dingin). Sel-sel mikroba biasanya

mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 rpm selama15 menit

(Scopes, 1982; Walsh dan Headon, 1994).

2. Fraksinasi

Cara pemurnian enzim yang umum dilakukan adalah dengan proses

pengendapan bertahap atau biasa disebut sebagai fraksinasi. Fraksinasi yang

sering dilakukan adalah dengan senyawa elektrolit menggunakan garam

ammonium sulfat, natrium klorida atau natrium sulfat (Suhartono, 1992).

Menurut Wirahadikusumah (2001), meningkatnya kekuatan ion akan

menyebabkan kelarutan enzim semakin besar yang disebut dengan salting in.

Jika kandungan ion semakin tinggi akan menyebabkan kelarutan enzim

menurun dan mengendap yang disebut dengan salting out.

Ammonium sulfat sering dipakai untuk mengendapkan enzim karena

kelebihannya, yaitu: kebanyakan enzim tahan terhadap garam tersebut (tidak

terdenaturasi), memiliki kelarutan yang besar, mempunyai daya pengendapan

Page 42: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

22

yang cukup besar dan mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan enzim.

Perlakuan penambahan ammonium sulfat dilakukan dengan meningkatkan

kejenuhan dari larutan enzim, dengan pembagian fraksi : (0-20)% jenuh, (20-

40)% jenuh, (60-80)% jenuh, dan (80-100)% jenuh. Pengendapan ini dikenal

sebagai salting out (Judoamijojo,1989).

3. Dialisis

Salah satu metode yang digunakan untuk meningkatkan kemurnian enzim adalah

dialisis. Prinsip dialisis yaitu memisahkan molekul-molekul besar dari molekul-

molekul kecil dengan bantuan membran semipermeable. Dialisis berfungsi untuk

memisahkan garam-garam anorganik agar tidak mengganggu tahap pemurnian

enzim selanjutnya. Dialisis dapat dilakukan dengan menggunakan kantong

selofan, kantong ini memiliki ukuran pori-pori yang lebih kecil dari ukuran

protein sehingga protein tidak dapat keluar dari kantong selofan. Penggunaan

kantong selofan memiliki beberapa keuntungan yaitu mudah digunakan, memiliki

harga yang relatif murah dan mudah didapatkan (Kristanti, 2001).

Proses dialisis berlangsung karena adanya perbedaan konsentrasi zat terlarut di

dalam dan di luar membran. Difusi zat terlarut bergantung pada suhu dan

viskositas larutan. Meskipun suhu tinggi dapat meningkatkan laju difusi, namun

sebagian besar protein dan enzim stabil pada suhu 4-8°C sehingga dialisis harus

dilakukan di dalam ruang dingin (Pohl, 1990). Cara kerja proses dialisis

ditunjukkan pada Gambar 8.

Page 43: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

23

Gambar 8. Dialisis (Voet and Voet, 2004).

Pada proses dialisis, larutan enzim dimasukan ke dalam kantung dialisis yang

terbuat dari membran semipermeable (selofan). Jika kantung yang berisi larutan

enzim dimasukan ke dalam larutan buffer, maka molekul protein kecil yang ada di

dalam larutan protein atau enzim seperti garam anorganik akan keluar melewati

pori-pori membran, sedangkan molekul enzim yang berukuran besar tetap tertahan

dalam kantung dialisis. Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion-ion yang

ada di dalam dan di luar kantung dialisis tidak seimbang. Untuk memperkecil

pengaruh ini digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar kantung

dialisis (Lehninger, 1982). Setelah tercapai keseimbangan, larutan diluar kantung

dialisis dapat dikurangi. Proses ini dapat dilakukan secara kontinu sampai ion-ion

di dalam kantung dialisis dapat diabaikan (Boyer, 1993)

Kantong selofan

Buffer posfat

Partikel garam hasilfraksinasi

Enzim

Page 44: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

24

G. Pengujian aktivitas enzim selulase dengan metode Mandels

Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan metode Mandels (Mandels et

al.,1976), yaitu berdasarkan pembentukan glukosa dari substrat Carboxymethyl

Cellulase (CMC) oleh enzim selulase yang dideteksi dengan penambahan

pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid) ke dalam larutan uji serta proses pemanasan,

sehingga akan dihasilkan larutan berwarna kuning hingga merah pekat. Semakin

pekat warna larutan sampel dibandingkan larutan kontrol, maka semakin tinggi

aktivitasnya .

H. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry.

Kandungan protein di dalam enzim sangat berpengaruh terhadap daya katalitik

enzim tersebut. Pada umumnya dengan meningkatnya kadar protein dalam suatu

enzim, maka daya katalitiknya akan meningkat. Salah satu metode yang

digunakan untuk menentukan kadar protein adalah metode Lowry. Penentuan

kadar protein bertujuan untuk mengetahui bahwa protein enzim masih terdapat

pada setiap fraksi pemurnian (tidak hilang dalam proses pemurnian) dengan

aktivitas yang baik. Metode ini bekerja pada kondisi alkali dan ion tembaga (II)

akan membentuk kompleks dengan protein. Ketika reagen folin-ciocelteau

ditambahkan, maka reagen akan mengikat protein. Ikatan ini secara perlahan akan

mereduksi reagen folin menjadi heteromolibdenum dan mengubah warna kuning

menjadi biru.

Pada metode ini, pengujian kadar protein didasarkan pada pembentukan

kompleks Cu2+ dengan ikatan peptida yang akan tereduksi menjadi Cu+ pada

Page 45: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

25

kondisi basa. Cu+ dan rantai samping tirosin, triptofan dan sistein akan bereaksi

dengan reagen folin-ciocelteau. Reagen ini bereaksi menghasilkan produk tidak

stabil yang tereduksi secara lambat menjadi molibdenum atau tungesteen blue.

Protein akan menghasilkan intensitas warna yang berbeda tergantung pada

kandungan triptofan dan tirosinnya. Karena itu, protein yang berbeda akan

memberikan tingkat warna yang berbeda (Alexander dan Griffith, 1993).

Metode ini relatif sederhana dan dapat diandalkan serta biayanya relatif murah.

Namun, metode ini mempunyai kelemahan yaitu sensitif terhadap perubahan pH

dan konsentrasi protein yang rendah. Untuk mengatasinya adalah dengan cara

menggunakan volume sampel yang sangat kecil sehingga tidak mempengaruhi

reaksi ( Lowry et al., 1951).

I. Amobilisasi enzim

Amobilisasi enzim merupakan konsep yang cukup baru dan sangat menarik

perhatian pada industri yang menggunakan enzim. Misalnya, pada industri

makanan, enzim dimasukkan bersama dengan substrat dan reaksi dibiarkan untuk

berlangsung. Ketika perubahan yang diinginkan telah tercapai maka enzim

dinonaktifkan dengan cara pemanasan atau merubah pH dalam sistem. Jadi

penggunaan dari enzim adalah sekali pakai, dan pemurnian enzim sangat mahal.

Untuk mengatasi masalah ini maka enzim diikat pada senyawa yang tidak larut

yang disebut sebagai matrik sehingga enzim dapat mengikuti reaksi dan dapat

diambil kembali setelah selesainya reaksi. Pengikatan enzim pada matriks yang

tidak larut dalam air ini disebut sebagai amobilisasi (Johnson, 1978). Enzim

Page 46: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

26

amobil dapat didefinisikan sebagai enzim yang secara fisik ditempatkan pada

suatu ruang tertentu sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya, oleh karena

itu dapat digunakan secara berulang (Chibata, 1978).

Keunggulan penggunaan enzim amobil dalam industri menurut Payne et al

(1992) dan Wang et al (1979) antara lain:

1. Dapat digunakan berulang

2. Dapat mengurangi biaya

3. Produk tidak dipengaruhi oleh enzim

4. Memudahkan pengendalian enzim

5. Tahan kondisi ekstrim

6. Dapat digunakan untuk uji analisis

7. Meningkatkan daya guna

8. Memungkinkan proses sinambung

Amobilisasi dapat diklasifikasikan dalam tiga kategori, yaitu:

1. Metode pengikatan (carrier-binding) yang didasarkan pada pengikatan enzim

dengan carrier atau matriks yang tidak larut dalam air. Aktivitas enzim

amobil dipengaruhi oleh ukuran partikel dan luas permukaan matriks.

Pengikatan dapat dilakukan dengan cara:

a. Adsorpsi fisik adalah salah satu teknik amobilisasi enzim yang sangat

sederhana. Metode ini menjelaskan adanya interaksi fisik (adsorpsi) antara

protein enzim dengan matriks permukaan. Metode ini mudah dilakukan,

ekonomis, tidak merusak konformasi enzim, dan penurunan aktivitas enzim

cenderung rendah. Ikatan kimia yang terbentuk adalah ikatan hidrogen,

Page 47: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

27

ikatan hidrofobik dan gaya Van Der Walls yang bersifat lemah sehingga

sehingga kemungkinan untuk merubah konformasi enzim secara fisik dapat

di abaikan. Matriks yang dapat digunakan, contohnya: bentonit, silika gel,

zeolit, kitosan, dan alumina. Enzim dan matriks dapat dipisahkan kembali

melalui filtrasi maupun sentrifugasi (Suhartono, 1989).

b. Ikatan kovalen antara gugus fungsi enzim yaitu α atau β-amino; α, β, atau

γ-karboksil; sulfohidril; hidroksil; imidazol; dan fenolik dengan matriks

yang mengandung gugus reaktif seperti diazonium; asam azida; isosianat;

dan halida. Ikatan yang terbentuk cukup kuat dalam mencegah kebocoran

matriks. Namun, jika konformasi berubah maka aktivitas enzim akan

hilang. Matriks yang digunakan pun sulit diregenerasi.

c. Ikatan ionik antara gugus karboksil enzim bermuatan negatif dengan gugus

amina suatu matriks bermuatan positif pada matriks yang tidak larut dalam

air. Kelebihan dan kekurangan cara ini sama dengan cara adsorpsi fisik.

Teknik pengikatan enzim dapat di gambarkan pada Gambar 9.

Gambar 9. Teknik Pengikatan Enzim (Palmer, 1991)

Page 48: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

28

2. Metode ikatan silang (cross-linking) didasarkan atas pembentukan ikatan

kimia, seperti pada metode ikatan kovalen, tetapi tidak menggunakan matriks

yang tidak larut. Amobilisasi enzim terjadi melalui komponen bi-atau

multifungsional. Sebagai komponen pengikat dapat digunakan gluraldehida,

turunan bis-diazobenzidin, dan lain-lain. Enzim yang diamobilisasi dengan

metode ini sering bersifat gel sehingga sukar ditangani. Enzim dapat

diamobilisasi sebagai bagian dari suatu kopolimerisasi dengan anhidrida maleat

dan etilen yang sebelumnya telah direaksikan dengan etilendiamin.

Pada metode ini tidak menggunakan matriks yang tidak larut dalam air,

amobilisasi didasarkan pada pembentukan ikatan kimia antara molekul

enzimdengan menggunakan reaksi multi / fungsional.

Gambar 10 . Metode Ikatan Silang (Palmer, 1991)

Gugus fungsional yang ikut dalam reaksi ini adalah amino pada asam amino

terminal, gugus dari lisin, gugus fenolik dari tyrusin, gugus sulfidril dari sistem

serta imidazole dan histidine. Bahan atau solid support yang digunakan intuk

membentuk ikatan silang adalah heksametal endisocyanat yang akan bereaksi

dengan enzim membentuk ikatan peptida (Palmer,1991)

Page 49: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

29

3. Metode penjebakan (entrapment) yaitu penggabungan enzim ke dalam kisi-kisi

gel maupun polimer semipermeabel (mikrokapsul). Terdapat 2 teknik metode

penjebakan yaitu teknik matriks dan teknik mikrokapsul.

a. Teknik matriks

Enzim dapat terperangkap dalam gel matriks dengan membentuk gel dalam

larutan encer yang mengandung satu macam enzim. Matriks yang banyak

digunakan adalah kalsium alginat, kappa-karagenan, resin sintetis dan

poliakrilamida. Poliakrilamida terbuat dari akrilamida. Sedangkan serat yang

digunakan yaitu selulosa triasetat dan polimer-polimer lainnya.

Keuntungan menggunakan teknik ini adalah secara relatif struktur alami enzim

tidak mengalami gangguan fisik. Hal ini karena enzim tidak terikat dengan

bahan pendukung, sehingga tidak terjadi perubahan konformasi enzim atau

inaktifasi enzim. Akibatnya untuk membentuk kompleks enzim-substrat sangat

kecil kemungkinannya, karena enzim tidak berada pada permukaan bahan

pendukung.

Gambar 11. Penjebakan teknik kisi (Crueger, 1984)

Page 50: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

30

Teknik ini merugikan karena (1) terjadi kebocoran yang kontinue karena

ukuran pori-pori terlalu besar, (2) interaksi antara substrat dan enzim kurang

karena jeratan gel dan (3) kehilangan aktivitas enzim karena terbentuknya

zat-zat radikal bebas pada reaksi polimerisasi (Judoamidjojo, 1990).

b. Teknik mikrokapsul

Enzim juga dapat diperangkap dalam mikrokapsul (Gambar 10) yang terbuat

dari nilon semipermeabel butiran yang tipis atau membran

koloidon. Teknik ini merugikan karena (1) terjadi inaktif enzim selama

pembentukan mikrokapsul, (2) mikrokapsul membutuhkan konsentrasi yang

besar dan (3) enzim dapat bergabung dengan dinding membran (Crueger, 1984).

Gambar 12. Penjebakan teknik mikrokapsul (Crueger, 1984)

J. Bentonit

Bentonit adalah clay yang sebagian besar terdiri dari montmorillonit dengan

mineral- mineral seperti kwarsa, kalsit, dolomit, feldspars dan mineral lainnya.

Montmorillonit merupakan bagian dari kelompok smectit dengan komposisi kimia

Page 51: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

31

secara umum (Mg,Ca)O.Al2O3.5SiO2.nH2O. Struktur bentonit terdiri dari dua

lapisan tetrahedral dan satu lapisan oktahedral, dimana dua lapisan tetrahedral

akan saling bergabung pada ujung kisi silikat dengan hidroksil pada lapisan

oktahedral, sehingga terbentuk tiga susunan lapisan tetrahedral-oktahedral-

tetrahedral (TOT). Diantara lapisan oktahedral dan tetrahedral terdapat kation

monovalent maupun bivalent, seperti Na+, Ca2+, dan Mg2+, disebut juga interlayer

exchangeable cations (Ohtsuka, 1997). Kation-kation tersebut akan mengimbangi

muatan negatif pada permukaan bentonit. Struktur bentonit dapat dilihat pada

Gambar 13.

Gambar 13. Struktur bentonit (Ohtsuka, 1997).

Dalam keadaan kering bentonit mempunyai sifat fisik berupa partikel butiran yang

halus, kilap lilin, lunak, plastis, berwarna kuning muda hingga abu-abu, bila

diraba terasa licin, dan bila dimasukkan ke dalam air akan menyerap air. Massa

jenis bentonit 2,2 – 2,8 g/L, indeks bias 1,547 – 1,557, dan titik lebur 1330 –

1430°C. Komposisi standar bentonit, yaitu 55,40% SiO2, 20,10% Al2O3, 3,7%

Lapisan Interlayer

Page 52: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

32

Fe2O3,0,49% CaO, 2,49% MgO, 2,76% Na2O3, 0,60% K2O, 13,5 % habis terbakar

(Tekmira, 2005).

Bentonit digunakan sebagai matriks karena bentonit mempunyai luas permukaan

yang sangat besar, sehingga bentonit mempunyai kemampuan tinggi dalam

mengikat enzim dalam jumlah besar, mempunyai kapasitas penukar ion yang

tinggi, tidak larut dalam air, memiliki daya tukar ion yang besar, pH berkisar 4-7

sesuai pH optimum enzim, mengandung kation bivalen (Ca2+) yang dapat

menstabilkan enzim, murah, tersedia cukup berlimpah di alam termasuk

Indonesia, memiliki kestabilan mekanik dan termal, tidak mengganggu reaksi

enzimatik yang dikehendaki, rigid, stabil (inert), dan non-toksik

(Sedaghat dkk, 2009).

Amobilisasi enzim menggunakan bentonit dilakukan melalui metode carrier

binding secara adsorpsi fisik, dimana melibatkan pertukaran kation pada lapisan

interlayer bentonit dengan RNH3+ yang berasal dari enzim. Selain itu, terdapat

juga gaya Van der Waals sehingga interaksi yang terjadi antara bentonit dan

enzim menghasilkan ikatan yang lemah dan enzim mudah terlepas kembali

(Rosmanansari dkk, 2013). pH optimum enzim yang terikat pada matriks

bentonit pada umumnya akan mengalami pergeseran ke arah asam dikarenakan

bentonit mengandung banyak kation (polikationik) yang akan mengubah pH

lingkungan enzim pada permukaan matriks (Wulandari, 2016).

Page 53: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

33

Dalam tahun 1913 Michaelis-Menten menunjuk pada mekanisme berikut untuk

menjelaskan kekuatan reaksi-reaksi enzim.

E + S ES Hasil(x) (y) (xy)

Dimana E = enzim, ES = kompleks enzim substrat, dan S = substrat, sedangkan

[S] >> [E] dan [ES]. Transformasi persamaan Michaelis-Menten yang paling

banyak digunakan adalah “double reciprocal” Lineweaver-Burk, dengan

menggabung persamaan Michaelis-Menten.

V0 Vmaks SKM [S]

1 KM [S]V0 Vmaks [S]

1 = Kmax + 1 x 1

V0 V maks [s] Vmax

Plot dari pasangan data (1/[S]0i, 1/v0i), untuk i = 1,..., n, dengan n adalah jumlah

pasangan data, akan memberikan suatu garis lurus intercept 1/Vmaks dan -1/Km

pada Gambar 14.

Persamaan Michaelis-Menten

Persamaan Lineweaver-Burk

K. Kinetika Reaksi Enzim

Page 54: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

34

Gambar 14. Kurva Lineweaver-Burk (Suhartono, 1989).

Page 55: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan April – Agustus 2017 di Laboratorium

Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas,

kapas, kain kasa, karet gelang, alumunium foil, kertas, jarum ose, pembakar

spiritus, autoklaf model S-90N, laminar air flow CURMA model 9005-FL, neraca

analitik, shaker incubator, magnetic stirrer, sentrifuga, lemari pendingin,

mikropipet Eppendroff, waterbath, termometer, spatula dan spektrofotometer UV-

Vis Carry Win UV 32.

Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah NA (Nutrient Agar), CMC

(Carboxymethyl Cellulose), Yeast Ekstrak, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O,

MgSO4, urea,pepton, NaOH, akuades, Na(K)-Tartarat, NaH2PO4, Na2HPO4,

pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid), fenol dan Na2SO3, Na2CO3, CuSO4.5H2O

Page 56: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

36

reagen follin-ciocalteau, BovineSerum Albumin (BSA), akuades, alkohol, dan

bentonit.

Mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148

penghasil enzim selulase yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan

Teknologi Bioproses Jurusan Teknik Kimia, Institut Teknologi Bandung.

C. Prosedur Penelitian

1. Persiapan pendahuluan

Sebelum melakukan kerja, semua alat-alat gelas yang akan digunakan untuk

pembiakan bakteri disterilisasi terlebih dahulu supaya alat-alat tersebut terhindar

dari mikroba yang tidak diinginkan. Alat-alat gelas yang akan digunakan untuk

pembiakan bakteri dicuci bersih, dikeringkan, kemudian dilakukan sterilisasi

dengan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC dengan tekanan 1 atm selama

15 menit. Seluruh kegiatan dilakukan secara aseptis di dalam laminar air flow,

kecuali proses inkubasi.

2. Pembuatan media inokulum, media fermentasi

a. Media Inokulum

Media inokulum dibuat dengan komposisi sebagai berikut 0,5% CMC

(Carboxymethyl Cellulose), 0,5% Yeast Ekstrak, 0,14% (NH4)2SO4, 0,05%

KH2PO4, 0,1% CaCl2.2H2O, 0,02% MgSO4,0,3%, urea,0,4 % pepton,

dilarutkan dalam 50 mL buffer posfat pH 6 (Amalia, 2016). Selanjutnya

Page 57: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

37

larutan dipanaskan, dan disterilkan pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm, selama

15 menit dalam autoclave.

b. Pembuatan Media Fermentasi

Media inokulum dibuat dengan komposisi sebagai berikut: 0,5% CMC

(Carboxymethyl Cellulose), 0,5% Yeast Ekstrak, 0,14% (NH4)2SO4, 0,05%

KH2PO4, 0,1% CaCl2.2H2O, 0,02% MgSO4,0,3%, urea,0,4 % pepton,

dilarutkan dalam 1000 mL buffer posfat pH 6 (Amalia, 2016). Selanjutnya

larutan dipanaskan, dan disterilkan pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm, selama

15 menit dalam autoklaf.

3. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148

a. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148 pada Media Inokulum

Sebanyak 3 ose Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring

dipindahkan ke dalam 50 mL media inokulum secara aseptis lalu

dishaker menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm

pada suhu 35°C selama 24 jam.

b. Inokulasi Bacillus subtilis ITBCCB148 dari Media Inokulum keMedia Fermentasi

Sebanyak 2% media inokulum dari jumlah media fermentasi sebanyak 1000

mL dipindahkan secara aseptis ke dalam media fermentasi lalu dishaker

dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 35°C selama

waktu 72 jam (waktu optimum).

Page 58: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

38

4. Produksi dan Isolasi Enzim Seluse

a. Produksi enzim selulase

Produksi enzim selulase dilakukan pada kondisi optimum yang diperoleh

pada tahap sebelumnya.

b. Isolasi enzim selulase

Isolasi enzim selulase dilakukan menggunakan metode sentrifugasi.

Prinsip sentrifugasi yaitu pemisahan filtrat dan endapan berdasarkan

kecepatan sedimentasi. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah

suhu kamar) untuk menjaga kehilangan aktivitas enzim (Suhartono, 1989).

Setelah media fermentasi yang berisi Bacillus subtilis ITBCCB148 dishaker

menggunakan shaker incubator pada suhu 35°C, selanjutnya dipisahkan

enzim selulase dari komponen sel lainnya menggunakan sentrifuga dengan

kecepatan putaran 5000 rpm, selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh

merupakan ekstrak kasar enzim selulase yang selanjutnya diuji aktivitasnya

dengan metode Mandels dan diuji kadar proteinnya dengan metode Lowry.

5. Uji aktivitas Enzim Selulase dengan metode Mandels (Mandels et al., 1976).

a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas Enzim Selulasemetode Mandels (Mandels et al., 1976)

Ke dalam labu takar 100 mL, dimasukkan 1 g DNS (Dinitrosalisilic Acid),

selanjutnya ditambahkan 1 g NaOH lalu dikocok hingga larut, kemudian

ditambahkan 0,2 g fenol dan 0,05 g Na2S2O3 dan 0,4 gram Na(K)-tartarat,

kemudian dilarutkan dengan aquades hingga tanda batas.

Page 59: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

39

b. Uji aktivitas Enzim Selulase metode Mandels (Mandels et al., 1976)

Metode ini didasarkan pada glukosa yang terbentuk (Mandels et al., 1976).

Dengan membandingkan antara sampel [0,25 mL enzim ditambah 0,25 mL

(larutan CMC 0,5% dalam buffer posfat pH 5,0) dan kontrol (0,25 mL enzim),

yang masing-masing diinkubasi selama 60 menit dalam waterbath incubator

pada suhu 50oC. Kemudian kontrol ditambahkan dengan 0,25 mL (larutan

CMC 0,5% dalam buffer posfat pH 5,0) dan selanjutnya sampel dan kontrol

ditambahkan 1 mL pereaksi DNS dan dididihkan selama 10 menit pada

penangas air lalu didinginkan. Setelah dingin, masing-masing ditambahkan

1,5 mL akuades, kemudian serapannya diukur menggunakan spektrofotometer

UV-VIS pada λ 510 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan

mengunakan kurva standar glukosa.

6. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951).

a. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim selulase

metode Lowry

1. Pereaksi A : 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N

2. Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan

kedalam 5 mL larutan Na(K) tartarat 1%

3. Pereaksi C : 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A

4. Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades

5. Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan

kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.

Page 60: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

40

b. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Sebanyak 0,1 mL enzim selulase ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan

dengan 5 mL pereaksi C dan diaduk rata. Kemudian dibiarkan

selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5

mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada

suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades,

selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm.

Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA

(Bovine Serum Albumin).

7. Pemurnian Enzim Selulase

Setelah enzim selulase diisolasi, selanjutnya enzim tersebut dimurnikan

menggunakan metode fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat

(NH4)2SO4, dialisis dan kromatografi kolom penukar ion.

a. Fraksinasi

Ekstrak kasar enzim yang telah diperoleh selanjutnya diendapkan dengan

menggunakan ammonium sulfat (NH4)2SO4 pada berbagai derajat kejenuhan

yaitu (0-20%); (20-40%); (40-60%); (60-80%); dan (80-100%). Skema

fraksinasi dapat dilihat pada Gambar 15.

Page 61: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

41

Ekstrak kasar enzim

+ (NH4)2SO4 (0-20%)

Endapan (F1) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (20-40%)

Endapan (F2) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (40-60%)

Endapan (F3) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (60-80%)

Endapan (F4) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (80-100%)

Endapan (F5) Filtrat

Gambar 15. Skema proses fraksinasi enzim dengan ammonium sulfat

Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan

ammonium sulfat, dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi pada

kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh

dilarutkan dengan buffer fosfat 0,1 M pH 6,0 kemudian di dialisis untuk

menghilangkan sisa-sisa garam yang tersisa lalu diuji aktivitasnya dengan

metode Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry untuk

mengetahui pada fraksi-fraksi mana terdapat enzim selulase dengan aktifitas

spesifik yang tinggi.

Page 62: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

42

b. Dialisis

Endapan enzim dari tiap fraksi hasil fraksinasi kemudian dimurnikan dengan

cara dialisis melalui membran semipermeabel (kantong selofan). Endapan

tersebut dimasukkan kedalam kantong selofan dan didialisis menggunakan

buffer phosfat pH 6 0,01 M selama 24 jam pada suhu dingin (Pohl, 1990).

Selama dialisis, dilakukan pergantian bufer selama 4-6 jam agar konsentrasi

ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi.

Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong,

maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada

ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO4.

Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat

yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode

Mandels dan diukur kada proteinnya dengan metode Lowry.

8. Amobilisasi Enzim Selulase menggunakan Bentonit

a. Penetapan pH untuk proses pengikatan enzim selulase pada bentonit

Enzim selulase diikatkan pada matriks dengan variasi pH 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7

dan 7,5 dengan menggunakan buffer fosfat 0,1 M. Kemudian matriks diisi

dengan 0,5 mL enzim dan dielusi dengan buffer yang sesuai, diaduk 5-10

menit. Campuran tersebut dibiarkan hingga matriks mengendap. Selanjutnya

supernatan didekantasi dan diuji aktivitas enzim dan kadar proteinnya.

Page 63: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

43

b. Amobilisasi enzim selulase

Sebanyak 0,5 mL enzim selulase di amobil dengan bentonit pada pH optimum

pengikatan. 0,5 mL enzim selulase diikatkan pada 0,25 g bentonit. Kemudian

campuran diaduk hingga rata dan simpan dalam dalam suhu ruang selama 5-10

menit, selanjutnya enzim teramobil siap dipakai.

d. Pemakaian berulang enzim amobil

Enzim amobil yang telah dipakai (direaksikan dengan substrat), dipakai

kembali untuk direaksikan kembali dengan substrat dengan uji metode

Mandels. Pemakaian berulang ini dilakukan hingga 7 kali.

9. Karakterisasi enzim selulase

a. Penentuan suhu optimum

Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan

memvariasikan suhu yaitu 40; 45; 50; 55; 60; 65 dan 70 Selanjutnya aktivitas

enzim diukur dengan metode Mandels.

b. Penentuan KM dan Vmaks

Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks) enzim

selulase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0,25%; 0,5%;

0,75%; 1%; 1,25% dan 1,5% dalam buffer fosfat pada pH 5 dan suhu 50oC

selama 60 menit. Selanjutnya data aktivitas enzim dengan konsentrasi

substrat diplotkan ke dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan KM dan

VM (Fuwa, 1954) dan diukur aktivitas enzim dengan metode Mandels.

Page 64: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

44

c. Uji stabilitas termal enzim

Uji stabilitas termal enzim sebelum dan sesudah amobilisasi dilakukan dengan

mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama 0, 10, 20, 30, 40, 50

60, 70, 80, 90 dan 100 menit pada pH dan suhu optimumnya

(Virdianingsih, 2002).

Aktivitas enzim setelah perlakuan x 100 %Aktivitas sisa =

Aktivitas enzim awal (tanpa perlakuan)

(Virdianingsih, 2002).

10. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), danperubahan energi akibat denaturasi (∆Gi).

Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase hasil

pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan persamaan

kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan persamaan:

1n (Ei/E0)= -ki t (1)

Persamaan penentuan nilai perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi):

∆Gi=-RT 1n(ki h/kB T) (2)

Keterangan :

R = konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1)

T = suhu absolut (K)

ki = konstanta laju inaktivasi termal

h = konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det)

kB = konstanta Boltzmann (1,381 x 10-23 JK-1)

Page 65: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

45

Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian

yang ditunjukkan dalam Gambar 1.

Ekstrak kasar enzim

Enzim hasil pemurnian

Gambar 16. Diagram alir penelitian

Produksi enzim selulase

Pemurnian enzim selulase :

1.Fraksinasi dengan (NH4)2SO4

2.Dialisis

Amobilisasi Fisik

PenentuanSuhu Optimum

Penentuanstabilitas termal

Penentuan Kmdan Vm

Uji aktivitas enzim Selulase (Mandels)dan penentuan kadar protein (Lowry)

Karakterisasi

Page 66: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Aktivitas spesifik enzim selulase hasil pemurnian hingga tahap dialisis

sebesar 14,075 U/mg, meningkat 5,7 kali dengan perolehan 19,546 %

dibandingkan dengan ekstrak kasar.

2. Enzim selulase hasil pemurnian memiliki suhu optimum sebesar 500C,

dan enzim selulase hasil amobilisasi memiliki suhu optimum sebesar 600C.

3. Uji stabilitas enzim selulase hasil pemurnian pada suhu 600C selama 100

menit masih memiliki aktivitas sebesar 7,330 % sedangkan uji stabilitas

enzim selulase hasil amobilisasi pada suhu 600C selama 100 menit masih

memiliki aktivitas sebesar14,862 %.

4. Enzim selulase hasil pemurnian memiliki KM = 1,278 mg/mL substrat, dan

Vmaks = 1,271 µmol mL-1 menit-1 , t1/2 = 31,11 menit, Ki = 0,022 menit dan

ΔGi = 100,54 Kj/mol, sedangkan enzim selulase hasil amobil memiliki nilai KM

= 0,445 mg/mL, Vmaks sebesar 0,422 µmol mL-1 menit-1, t1/2 = 39,83 menit,

Ki = 0,017 menit dan ΔGi = 104,42 Kj/mol.

Page 67: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

61

5. Pemakaian berulang enzim hasil amobilisasi dapat digunakan sebanyak 5

kali. Tetapi efektifnya dapat digunakan sebanyak 3 kali dengan perolehan

enzim masih sebanyak 50,352 %.

6. Proses amobilisasi enzim selulase dari Bacillus subtilis ITBCCB 148

menggunakan bentonit dapat meningkatkan suhu dan dapat mempertahankan

stabilitas termal enzim dengan baik dibandingkan dengan enzim hasil

pemurnian.

B. Saran

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, maka disarankan untuk melakukan

pemurnian enzim selulase selanjutnya melalui teknik pemurnian selain fraksinasi

agar dapat diukur aktivitas enzim pemurniannya dan di lanjutkan ke tahap

kromatografi sehingga didapatkan tingkat kemurnian enzim yang lebih tinggi

serta penelitian lebih lanjut mengenai penggunaan matriks bentonit yang telah

diaktivasi oleh panas, asam, maupun basa.

Page 68: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah, Z. 2011. Produksi Enzim Selulase oleh Aspergillus Niger MenggunakanSubstrat Jerami Dengan Sistem Fermentasi Padat. Jurnal. Jurusan TeknikKimia Fakultas Teknik. UNDIP. Bandung.

Afsahi, B. 2007. Immobilization of Cellulase on Non-Porous Ultrafine SilicaParticles.Scientia Irania. 4:379-383.

Ahern, T.J. and A.M. Klibanov. 1987. Why do enzyme irreversibly inactive athigh temperature. Biotec 1. Microbial Genetic Engineering and EnzymeTecnology. Gustav fischer. Stuttgart. New York.

Alexander, R.R. and J.M. Griffith. 1993. Basic Biochemical Methods, 2nded.Wiley-Liss, Inc. New York.

Amalia, P.2016. Pengaruh Modifikasi Kimia Terhadap Stabilitas Enzim SelulaseDari Bakteri Lokal Bacillus Subtilis ITBCCB148 Menggunakan SitrakonatAnhidrida (Tesis). Universitas Lampung. Lampung.

Amstrup, K. 1979. Production, isolation, and economics of extracellular enzyme.Dalam L.B Wingard, E.K. Katzier and L. Goldstein (ed). Appl. Biochemand Bioeng. Vol. II. Academic Press. New York.

Balford,H.C. 1981. Modern Experimental Biochemistry. Redwood City,California 94065 : Benjamin Cumming Publishing Company.

Boyer, R.F. 1993. Modern Experimental Biochemistry. Benjamin CummingPublising Company. San Francisco, California.

Page 69: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

63

Chaplin, M.F. 1990. Enzyme Technology. Cambridge University Press. England.

Chibata, I. 1978. Immobilized Enzymes. Halsted Press Book. Tokyo.

Crueger, W. and A. Crueger. 1984. Biotechnology. A Textbook of IndrustrialMicrobiology. Broch. T. D.,editor Science Tech. Inc. Madison. USA. 178-180, 202-206.

Damerco, J. L. 2003. “Production Of Hydrolytic Enzyme By TrichodermaIsolation With Antagonistic Activity Against Crinipellis PerniciosatheCausal Agent Of Witches׳ Broom Of Cocoa,” Brazilian J. of Micro. 34, pp.33-38.

Dryer, R. L. 1993. Biokimia. Jilid 1. UGM Press. Yogyakarta. 180-181.

Eijsink, G.H., Sirgit, G. Torben, V. and Bertus van de Burg. 2005. DirectedEvolution of Enzym Stability. Biomolecular Engineering. Elsevier ScienceInc. New York. 23: 21-30.

Falch EA. 1991. Industrial Enzymes Developments in Production andApplication. Biotech. Adv. 9:43-658.

Fan, L.T., Y.H. Lee, and M.M. Gharpuray. 1982. The nature of lignocellulosicsand their pretreatment for enzymztic hydrolysis. Advances in Biochem. Eng.23: 158-187.

Fessenden, R.J. 1992. Kimia Organik Jilid II. Erlangga. Jakarta.

Fowler, M. W. 1988. “Enzyme Technology” in Biotechnology For Engineers,Biological System in Technological Processes, Edited : Scragg, A. H., JohnWiley & Sons. New York.

Fuwa, H. 1954. A New method for microdetermination of amylase activity by theuse of amylase as the substrate. J. Biochem. Tokyo.

Page 70: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

64

Gaman P.M dan K.B. Sherrington.1994.Ilmu pangan , pengantar ilmu pangan,nutrisi dan mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada Press. Yogyakarta.

Gielen, S. 2004. Biocontrol Agents of Botrytis Cinerea Tested in ClimateChambers by Making Artificial Infection on Tomato Leaf. Commun AgricAppl Biol Sci 69 : 631-9.

Girindra, A. 1986. Biokimia I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Gokhan Coral. 2002. Some Properties of Crude Carboxylmethyl Cellulase ofAspergillus niger Z10 Wild-Type Strain. Turk J. Biol. 26 (2002) 209-213.

Goddatte, D.W., C. Terri, F.L. Beth, L. Maria, R.M. Jonathan, P. Christian, B.R.Robert, S.Y. Shiow and C.R. Wilson. 1993. Srategy and Implementation ofa System for Protein Engineering. J. Biotechnol. 28 : 41-54.

Grisham and Reginald H. Garrett. 1999. Biochemistry. Saunders College Pub.Philadelphia. Pp. 426–7.

Gupta, S. 1990. Mikrobiologi Dasar. Alih bahasa oleh Dr. Julius E. S. BinarupaAksara. Jakarta.

Hartmeier, W. 1988. Immobilized Biocatalysts : An Introduction. Springer Verlag.

Weinheim.

Illanes, A. 1999. Stability of Biocatalysts. Universitas Catolica de Valparaiso.Chile.

Ikram-ul-haq. 2005. Cotton Saccharifying Activity of Cellulases Produced byCo-culture of Aspergillus niger and Trichoderma viride. Res. J. Agric &Biol. Sci. 1(3):241-245.

Jegannathan, K. R. 2008. Production of Biodiesel using Immobilized Lipase-aCritical Review, Crit. Rev. Biotechnol., 28, 253–64.

Page 71: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

65

Johnson, E.L., dan Stevenson, R. 1978. Basic Liquid Chromatography.Terjemahan Kosasih Padmawinata (1991). Dasar Kromatografi Cair. ITB.Bandung. Halaman 4-8.

Judoamidjojo, R. M. 1989. Biokonversi, Depdikbud Didjen Pendidikan Tinggi.Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB. Bogor.

Judoamidjojo dan Endang, G.S. 1990. Teknologi Fermentasi. Rajawali Press.Jakarta.

Junita. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal Enzim Protease dari Bacillusstearothermophillus Dalam Pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena.(Skripsi). Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Kazan, D. H. Ertan and A. Erarslan. 1997. Stabilization of Escherichia coliPenicillin G Acylase Agains Thermal Inactivation by Cross-linking withDextran Dialdehyde Polymers. App. Micro. Biotech. 48: 191-197.

Koelman, J. dan Roehm. 2005. Color Atlas Biochemistry. 2nd ed. PenerbitHipokrates. Jakarta.

Kristanti, N. D. 2001. Pemurnian Parsial dan Karakterisasi Lipase Ekstraselulerdari Kapang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis, Program Pascasarjana. IPB.Bogor.

Lee, S.M. 2001. Pilot scale production of cellulose using Trichoderma reesei RutC-30 in fed-batch mode. J. Micro. Biotech..11: 229-233.

Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.

Lowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr, and R. J. Randall. 1951. Proteinmeasurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193-265.

Mandels, M., A. Raymond and R. Charles. 1976. Measurement of saccharifyingcellulose. Biotech. & Bioeng. Symp. 6. John Wiley & Sons Inc.

Martoharsono, S.1981. Biokimia. UGM Press. Yogyakarta.

Page 72: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

66

Meriyanti, D. 2014. Amobilisasi Enzim Selulase Dari Aspergillus niger L-51Menggunakan Bentonit. (Skripsi). Universitas Lampung. Lampung.

Muchtadi et al., 1992 Muchtadi, D. 1989. Petunjuk Laboratorium Evaluasi NilaiGizi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat JenderalPendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. InstitutPertanian Bogor. Bogor.

Montesqrit. 1998. Ekstraksi Selulase dari Kapang Tanah dan Aplikasinya dalamMeningkatnya Kecernaan Pakan Limbah Berserat Pada Ruminansia(In Vitro). Tesis. Institut Pertanian Bogor.Bogor.

Nakano, M.M., and Zuber, P., 1998. Anaerobic growth of a "strict aerobe"(Bacillus subtilis). Annu Rev Microbiol 52: 165-90.

Ohtsuka, K. 1997. Preparation and properties of two-dimensional microporouspillared interlayered solids. J. Chem. Mater. 9 (1): 2039-2050.

Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta.

Palmer, T. 1991. Understanding Enzymes. England : Ellis Horwood.

Payne, G., V. Bringi, C. Prince, and M. Shuler. 1992. Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems. Hanser Publishers. Munich-Vienna. 177-223.Pelczar, M.J., dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI-Press.Jakarta.

Pelczar, M.J., dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI-Press.Jakarta.

Poedjiadi, A.2006. Dasar-dasar Biokimia. UI-Press. Jakarta.

Pohl, T. 1990. Concentration of protein removal of salute dalam M.P. Deutscher,Methods of Enzymology: Guide to Protein Purification. Academic Press.New York. Vol :182.

Pratiwi, S.T.2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta.

Page 73: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

67

Puslitbang, T. 2005. Bentonit Alam Terpilar Sebagai Material Katalis. DirektoratPembinaan Pengusahaan Mineral dan Batubara. Jakarta.

Reed, G. 1975. Enzymes in Food Processing. Academic Press. New York.

Reese, E.T. 1976. History of cellulase program at U.S. Army NatickDevelopment Center. Biotech. & Bioeng. Symp., 6. John Wiley & Sons Inc.

Rosdiana, A., dan Sutrisno. 2013. Amobilisasi Pektinase dari Bacillus subtilismenggunakan Matriks Pasir Laut Teraktivasi HCl. Universitas Brawijaya.Malang. Kimia Student Journal. Vol. 1. No. 2. PP 215-221.

Rosmanansari, N. S. D., A. Roosdiana, dan Sutrisno. 2013. Optimasi amobilisasipektinase dari Bacillus subtilis menggunakan bentonit. J. Kim. Student. 1(2): 243-249.

Ryan, K.J. 2004. Sherris Medical Microbiology, 4th ed., McGraw Hill. BookCompany Inc. New York.

Sastrodinoto, S. 1980. Biokimia Umum I. PT. Gramedia. Jakarta.

Sedaghat, M. E., H. Aghaei, and S. Soleimanian-Zad. 2009. Enzymeimmobilization. Part 3: Immobilization of α-amylase on Na-bentonite andmodified bentonite. J. Clay. 46 (1): 125-130.

Shahib, M.N. 2005. Biologi Molekuler Medik I. Universitas Padjajaran Press.Bandung.

Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu. UGM Press. Yogyakarta. 68-69.

Smith, AL. 1997. Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology.Oxford University Press. Oxford.

Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU. Bioteknologi ITB. Bogor.322.2nd ed. Marburg thieme.

Page 74: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

68

Suhartono, M.T. 1992. Diklat Struktur dan Biokimiawi Protein. Penelitian AntarUniversitas. IPB. Bogor.

Supeno, M. 2007. Bentonit Terpilar Alam sebagai Material Katalis/ Co-KatalisPembuatan Gas Hidrogen dan Oksigen dari Air, Disertasi. UniversitasSumatra Utara. Medan.

Sutrisno, dan Mardiana. 2014. Optimasi Amobilisasi Xilanase Dari Trichodermaviride Menggunakan Matriks Bentonit. Kimia Student Journal. UniversitasBrawijaya. Malang.

Virdianingsih, R. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal Enzim Protease dariBacillus pumilus y1 dalam Pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena.(Skripsi). Institute Pertanian Bogor. Bogor.

Voet, D. and Voet, J. G. 2004. Biochemistry 3rd Edition. Wiley John Willey &Sons, INC. 139.

Walsh, G., and D.R. Headon. 1994. Protein Biotechnology. John Willey and Sons.New York.

Wang, D.I. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and SonsInc. New York.

Williamson,K.L and L.F. Fieser. 1992. ORGANIC EXPERIMENT 7th EDITIon.DC Health ang company. United states of america.New york.

Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.Jakarta.

Wirahadikusumah, M. 2001. Biokimia : Protein, Enzim dan asam Nukleat. ITBPress. Bandung.

Wulandari A.F.2016.Amobilisasi Enzim Protease dari Bacillus subtilisITBCCB148 Menggunakan Bentonit.(Skripsi). UniversitasLampung.Lampung.

Page 75: AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus substilis ...digilib.unila.ac.id/29379/20/SKRIPSI TANPA BAB PEMBAHASAN.pdf · AMOBILISASI ENZIM SELULASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

69

Wuryanti. 2004. Isolasi dan Penentuan Aktivasi Spesifik Enzim Bromelin dariBuah Nanas (Ananas comosus L.). Artikel: JKSA, 7(3) : 83-87.

Yandri, A.S. 2004. Karakterisasi dan Modifikasi Kimia α-amilase dari BakteriIsolat Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. (Disertasi). Institut TeknologiBandung. Bandung.

Yandri, A.S., D. Herasari. dan T. Suhartati. 2007. Isolasi, Pemurnian danKarakterisasi Enzim Protease Termostabil Dari Bakteri Isolat LokalBacillus subtilis ITBCCB148. Jurnal Sains MIPA . 13(2): 100-106.

Zulkarnain, A K. 1991. Kimia Analisis Kualitatif. DepartemenPerindustrian.Yogyakarta.