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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
« Analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et des micro-vaisseaux aux différents stades
de développement des cancers bronchiques » Anne-Pascale Meert
Année académique 2006-2007
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Université Libre de Bruxelles Faculté de Médecine
Unité de Soins Intensifs Médico-chirurgicaux et Oncologie Thoracique
« Analyse et méta-analyse des niveaux d’expression d’EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et des micro-vaisseaux aux différents stades
de développement des cancers bronchiques »
Anne-Pascale Meert
Thèse déposée en vue de l’obtention du titre académique de docteur en sciences médicales
Promoteur : JP Sculier
Co-promoteur : V Ninane
Année académique 2006-2007
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Remerciements
Ce travail n’aurait jamais été possible sans l’aide précieuse d’un grand nombre de personnes
que je tiens à remercier chaleureusement :
- Le Professeur Jean-Paul Sculier qui, depuis des années, m’a donné le goût et la possibilité de
réaliser des travaux scientifiques. Sans lui, son enthousiasme, sa rigueur, sa disponibilité et
son soutien, cette thèse n’aurait jamais vu le jour
- Le Professeur Arsène Burny pour son enthousiasme chaleureux envers nos travaux et ses
précieux conseils dans la rédaction de cette thèse
- Le Professeur Vincent Ninane qui a supervisé mon travail et m’a fourni les échantillons
biospsiques
- Le Docteur Thierry Berghmans avec qui le partage du travail clinique quotidien est un réel
plaisir. Sa disponibilité constante, son amitié et sa collaboration me sont particulièrement
précieuses
- Le Docteur Céline Mascaux pour ses conseils pertinents
- Le Docteur Benoit Martin qui m’a apporté sa contribution dans la réalisation pratique de ces
travaux
- Le Professeur Bosschaerts qui m’a permis de recueillir les pièces chirurgicales
- Le Professeur Jean Klastersky qui m’a, dès mes cours de sémiologie, donné l’amour de la
médecine interne et de l’oncologie
- Le Professeur Jean-Jacques Lafitte et le Docteur Lothaire pour leur collaboration
- Le service d’anatomo-pathologie qui m’a gentillement accueillie, les Dr Verhest et Feoli et
plus particulièrement Jean-Marc Verdebout, pour ces longues soirées de révision de lames
- Marianne Paesmans pour ses compétences statistiques
- Le FNRS et le Télévie pour m’avoir accordé leur confiance et leur aide financière
- Les Amis de l’Institut Bordet pour leur soutien financier
- Les techniciennes de laboratoire (Marie, Sophie et Géraldine) pour leur aide pratique
- Les infirmières de l’ASTI, notre unité de soins intensifs, pour leur soutien quotidien dans
mon travail clinique
- Les secrétaires (Caroline et Chantal) et Nathalie Leclercq pour leur sourire et leur efficacité
- Mes meilleurs amis Sophie, Casper et Jean
- Mes parents et plus particulièrement ma maman pour sa présence constante depuis le début
de mes années d’études de médecine
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- Marraine avec qui j’aurais tellement aimé partager ces moments
- Enfin, je tiens à remercier plus particulièrement et avec tout mon amour, Laurent qui depuis
plus de 17 ans accepte sans rechigner mes horaires difficiles, mes absences, ma mauvaise
humeur et mes moments de découragement
5
But du travail Le rôle précis des facteurs biologiques dans la carcinogenèse bronchique est encore mal
compris. Le but de nos travaux est d’évaluer l’implication de certains d’entre eux dans le
pronostic du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) et de démontrer l’apparition
d’anomalies précédant le stade invasif, plus particulièrement dans le développement d’une de
ses formes, l’épithélioma épidermoïde,.
6
Résumé
Dans un premier temps, nous avons réalisé des revues systématiques de la littérature
avec méta-analyses des données de survie. Ceci nous a conduits à sélectionner 4 marqueurs de
mauvais pronostic pour la survie des CBNPC: le récepteur au facteur de croissance
épidermique (EGF-R), un autre récepteur de cette famille (c-erbB-2) ainsi que deux autres
facteurs potentiellement témoins de leur activité, Ki-67 (impliqué dans la prolifération) et le
nombre des micro-vaisseaux (témoins de la néoangiogenèse).
Dans une deuxième phase, nous avons étudié au laboratoire diverses questions sur des
tumeurs bronchiques invasives.
Premièrement, nous avons investigué le mécanisme de surexpression d’EGF-R et de c-
erbB-2 et évalué si des anomalies génétiques pouvaient prédire cette surexpression, en
recourant à des techniques d’immunohistochimie et de FISH. Ceci nous a permis d’observer
que, si la majorité des CBNPC réséqués présentent des anomalies génétiques d’EGF-R et/ou
de c-erbB-2, une amplification de ces gènes n’est présente que dans une minorité d’entre eux
et n’est pas strictement corrélée à l’expression protéique. D’autre part, la survie de ces
patients exprimant ou ayant une anomalie génique d’EGF-R et/ou c-erbB-2 est plus courte
sans atteindre le seuil de signification statistique.
Deuxièmement, nous avons recherché sur des tumeurs opérées d’éventuels liens entre
les expressions d’EGF-R, de c-erbB-2 et de Ki-67. Aucune corrélation n’a été mise en
évidence entre l’expression de ces 3 facteurs. Par contre, chez ces patients, l’expression de Ki-
67 dans la tumeur s’est avérée être un facteur de mauvais pronostic pour la survie.
Troisièmement, nous avons voulu savoir si un de ces marqueurs (EGF-R) présentait
une valeur pronostique dans un groupe plus restreint de tumeurs plus avancées, les CBNPC de
stade III. Pour mener cette recherche sur des biopsies, nous avons d’abord démontré que
l’évaluation des marqueurs biologiques (EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67) sur biopsie ne différait
pas de celle réalisée sur des tumeurs réséquées. Comme les résultats étaient équivalents, nous
avons pu étudier EGF-R sur les biopsies de CBNPC au stade III et montrer qu’EGF-R n’était
pas un facteur pronostique pour la survie dans ce groupe assez homogène de tumeurs
avancées.
Dans la dernière phase, nous avons étudié des lésions représentatives des différents
stades prénéoplasiques et néoplasiques précoces radiooccultes. Ces lésions ont été prélevées
lors d’examens endoscopiques de photodétection. EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 et le nombre des
micro-vaisseaux ont été étudiés par immunohistochimie dans ces différents stades de lésions
7
prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons observé qu’EGF-R et Ki-67 sont
statistiquement plus exprimés dans les dysplasies sévères et les carcinomes in que dans les
dysplasies légères suggérant que, au moins pour ces 2 marqueurs, les dysplasies sévères se
rapprochent plus des carcinomes in situ que des dysplasies légères. Alors que l’expression
d’EGF-R est présente dès le stade de dysplasie sévère, une augmentation du nombre des
micro-vaisseaux n’est présente qu’au stade de tumeurs micro-invasives. C-erbB-2 n’est quant
à lui pas exprimé dans ces lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces.
En conclusion, les facteurs biologiques, EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 et le nombre des
micro-vaisseaux s’avèrent des facteurs de mauvais pronostic dans le CBNPC. La
surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 dans les cancers réséqués résulte très rarement d’une
amplification génique et nous n’avons pas trouvé dans ces tumeurs de corrélation entre
l’expression des marqueurs moléculaires étudiés. Dans les tumeurs plus avancées de stade III,
EGF-R n’est pas un facteur discriminant pour le pronostic. Les anomalies de certains de ces
marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaissent précocement, dès les stades prénéoplasiques, avec
un seuil se situant entre les lésions bronchiques de bas et de haut grades. La néoangiogénèse,
évaluée par le nombre des micro-vaisseaux, s’observe à partir des cancers micro-invasifs
tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade invasif. Dans la séquence d’apparition des
anomalies génétiques conduisant au cancer invasif, l’atteinte d’EGF-R précède la
néoangiogénèse.
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Avant-propos - Pour faciliter la lecture, les tableaux et figures ont été placés à la fin du manuscrit dans
l’ordre d’apparition dans le texte.
- Afin d’alléger le texte, les références des articles inclus dans les méta-analyses n’ont pas été
reprises dans la bibliographie de la thèse mais sont disponibles dans les publications
originales, dont les tirés à part se trouvent à la fin de ce syllabus.
- Toutes les évaluations de marquages immunohistochimiques ont été réalisées en aveugle par
plusieurs investigateurs dont un anatomopathologiste. En cas de discordance, les lames ont été
revues conjointement pour obtenir un consensus.
- Toutes les abréviations sont définies par ordre alphabétique en début de texte.
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Abréviations
Adénoc = adénocarcinome ADN = acide désoxyribonucléique ARN = acide ribonucléique ARNm = acide ribonucléique messager CA IX = carbonic anhydrase IX CBNPC= cancer bronchique non à petites cellules CBPC = cancer bronchique à petites cellules CEP = centrosome CIS = carcinome in situ CMI = carcinome micro-invasif Cox-2 = cyclooxygénase 2 DL = dysplasie légère DM = dysplasie modérée DS = dysplasie sévère ELCWP = European Lung Cancer Working Party EGF = epidermal growth factor ( = facteur de croissance épidermique) EGF-R = epidermal growth factor receptor ( = récepteur à l’EGF) FHIT = fragile histidine triad FISH = fluorescence in situ hybridation FDA = Food and Drug Administration GB = globules blancs H = hyperplasie HCl = acide chlorhydrique HE = hématoxyline éosine hnRNP = heterogeneous nuclear ribonucleoprotein HR = hazard ratio IASLC = International Association for the Study of Lung cancer IC = intervalle de confiance Ig = immunoglobuline IHC = immunohistochimie IP = indice de performance ISS = international staging system kDa = kilodalton LDH = lactate déshydrogénase M = Molaire MA = méta-analyse Me = métaplasie min = minute MCM = minichromosome maintenance ml = millilitre mm = millimètre MP = micropapillomatose µg = microgramme µl = microlitre µm = micromètre N = nombre NA = non applicable
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NC = non conclusif No = normal NOR = nucleolar organizer region NMV = nombre de micro-vaisseaux NS = non significatif OMS = Organisation Mondiale de la Santé PCNA =proliferating cell nuclear antigen (antigène nucléaire de cellule proliférante) PCR = polymerase chain reaction PECAM 1 = platelet/endothelial cell adhesion molecule Ph alc = phosphatases alcalines PMN = polymorphonucléaires Pts = patients RAR = retinoic acid receptor Rb = rétinoblastome ROC = receiver operating curve SM = survie médiane TGFα = transforming growth factor α (facteur de croissance de transformation alpha) TRIS = tris(hydroxyméthyl)aminométhane TTF-1 = thyroid transforming factor 1 VEGF = vascular endothelial growth factor VPN = valeur prédictive négative VPP = valeur prédictive positive W = watt
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Table des matières 1. Introduction ………………………………………………………………….. p 14 2. Hypothèse ..................................................................................................... p 14 3. Travaux réalisés ……………………………………………………….. p 15
3.1.Tumeurs invasives ....................................................................................... p 15 3.1.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses du rôle pronostique pour la survie : guides pour la sélection des marqueurs biologiques ....................................................................... p 15
3.1.1.1. Méthodologie …………….………………………….…. p 15 3.1.1.1.1. Méthode de sélection des études ………………… p 15 3.1.1.1.2. Evaluation de la méthodologie des études sélectionnées …………………………………................................. p 16 3.1.1.1.3. Méthodes statistiques …………..………………. p 16
3.1.1.2. Résultats des méta-analyses ………………………..…. p 18 3.1.1.2.1. EGF-R ……………………………………..….……. p 18 3.1.1.2.1.1. Caractéristiques des études ……..…………... p 18 3.1.1.2.1.2. Résultats des études individuelles ………... p 19 3.1.1.2.1.3. Résultats de l’analyse qualitative …..……. p 20 3.1.1.2.1.4. Méta-analyse …………………………………….. p 20 3.1.1.2.1.5. Conclusions …………………….………………. p 22 3.1.1.2.2. c-erbB-2 ……………………………………….…….. p 22 3.1.1.2.2.1. Caractéristiques des études …………….….... p 22 3.1.1.2.2.2. Résultats des études individuelles ……….... p 22 3.1.1.2.2.3. Résultats de l’analyse qualitative ………… p 24 3.1.1.2.2.4. Méta-analyse ......................................................... p 24 3.1.1.2.2.5. Conclusions ......................................................... p 25 3.1.1.2.3. Ki-67 ....................................................................... p 26 3.1.1.2.3.1. Caractéristiques des études ............................. p 26 3.1.1.2.3.2. Résultats des études individuelles ……..…. p 26 3.1.1.2.3.3. Résultats de l’analyse qualitative ............... p 26 3.1.1.2.3.4. Méta-analyse ………………………………….… p 26 3.1.1.2.3.5. Conclusions ……………………….…………… p 29 3.1.1.2.4. Micro-vaisseaux …………………….……………… p 29 3.1.1.2.4.1. Caractéristiques des études ………………….. p 29 3.1.1.2.4.2. Résultats des études individuelles ……..…. p 29 3.1.1.2.4.3. Résultats de l’analyse qualitative .……….. p 29 3.1.1.2.4.4. Méta-analyse ……………………………………. p 31 3.1.1.2.4.5. Conclusions ……………………………………. p 32
3.1.2. Etudes de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales p 33 3.1.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2 ……………………………………………………. p 33
3.1.2.1.1. Techniques de laboratoire et évaluation du marquage p 33 3.1.2.1.1.1. Immunohistochimie ………………………….. p 33 3.1.2.1.1.2. FISH ………………………….………………….. p 34 3.1.2.1.2. Statistiques ……………………………………. p 36 3.1.2.1.3. Résultats ……………………………………….…….. p 36 3.1.2.1.3.1. EGF-R ……….....................……………………….. p 36 3.1.2.1.3.2. c-erbB-2 ....................................................................... p 38 3.1.2.1.3.3. « Co-expression » d’EGF-R et de c-erbB-2……. p 39
12
3.1.2.1.4. Conclusions ……………………………………. p 40 3.1.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 ............... p 40
3.1.2.2.1. Population étudiée ......................................................... p 40 3.1.2.2.2. Immunohistochimie …………..….…………..… p 40 3.1.2.2.3. Evaluation du marquage ……….………….……….. p 41 3.1.2.2.4 .Statistiques …………………….……………… p 41 3.1.2.2.5. Résultats ……………………………………..………. p 41 3.1.2.2.6. Conclusions ………………………………….… p 42
3.1.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées . p 42 3.1.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs ........................................... p 43
3.1.3.1.1. EGF-R …..………………………………………….. p 43 3.1.3.1.1.1. Matériel et méthode …………………………… p 43 3.1.3.1.1.2. Interprétation des résultats immunohistochimiques p 43 3.1.3.1.1.3. Statistiques ……………………………………. p 44 3.1.3.1.1.4. Résultats …………………….……………………….. p 44 3.1.3.1.1.5. Conclusions ……………………………………. p 45
3.1.3.1.2. C-erbB-2 et Ki-67 ……………………………………. p 45 3.1.3.1.2.1. Immunohistochimie …………………………… p 45 3.1.3.1.2.2. Résultats …………………………………..... p 45 3.1.3.1.2.3. Conclusions ……………………………………. p 46
3.1.3.2. EGF-R dans les stades III ……………………………………. p 46 3.1.3.2.1. Matériel et méthode ………………….………………… p 47
3.1.3.2.2. Immunohistochimie …………………………………….. p 47 3.1.3.2.3. Statistiques ………………………………..…………….. p 47 3.1.3.2.4. Résultats ....................................................................... p 47 3.1.3.2.5. Conclusions ……………………………….…………….. p 48
3.2. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces . p 51 3.2.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………..… p 51
3.2.1.1. Population étudiée …………………………..…………………. p 51 3.2.1.2. Préparations des échantillons et immunohistochimie ……..…. p 51 3.2.1.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques ……..…. p 52 3.2.1.4. Statistiques ……………………………………………………….. p 52 3.2.1.5. Résultats ……………………………………………………….. p 54 3.2.1.6. Conclusions ……………………………………………………….. p 57
3.2.2. C-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………….. p 58
3.2.2.1. Population étudiée, immunohistochimie ………………….. p 58 3.2.2.2. Résultats ……………………………………………………….. p 58 3.2.2.3. Conclusions ……………………………………………………….. p 59
3.2.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………………….. p 58
3.2.3.1. Population étudiée …………………………..…………………. p 58 3.2.3.2. Immunohistochimie ……………………………..………………. p 59 3.2.3.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques ……..…. p 59 3.2.3.4. Statistiques ……………………………………………………….. p 59 3.2.3.5. Résultats ……………………………………..…………………. p 61 3.2.3.6. Conclusions ……………………………………………………….. p 63
3.2.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces …………………………… p 64
13
3.2.4.1. Population étudiée ……………………………………………… p 64 3.2.4.2. Immunohistochimie ……………………………………………… p 64 3.2.4.3. Interprétation de l’immunohistochimie …………………. p 65 3.2.4.4. Statistiques ………………………………………………………. p 65 3.2.4.5. Résultats ………………………………………………………. p 65 3.2.4.6. Conclusions ………………………………………………………. p 68
4. Synthèse, limitations des études et discussion ………… p 68 4.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses ……....... p 69 4.2. Etude de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales ………… p 70 4.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2 p 70
4.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 …………………. p 73 4.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées ……... p 74
4.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs ……………………………………. p 74 4.3.2. EGF-R dans les stades III ……………………………………………… p 76
4.4. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……… p 77 4.4.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 77 4.4.2. c-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 79 4.4.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………………….………. p 79 4.4.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces ……………………………………. p 83 4.4.5. Autres anomalies des lésions bronchiques prénéoplasiques décrites dans la littérature ………………………….………………………….… p 84
5. Conclusions ……………..………………………………………………….. p 88
6. Perspectives ………………………………………………………..……….. p 88
7. Bibliographie ………………………………………………………………… p 90
14
1. Introduction Le cancer bronchique est une des tumeurs les plus fréquentes et les plus mortelles: en
Europe, il a atteint, en 2004, plus de 380 000 personnes et causé plus de 340 000 morts (1).
Les cancers bronchiques non à petites cellules (épithélioma épidermoïde et adénocarcinome)
sont les types histologiques les plus fréquents. Malgré les progrès réalisés, seuls les patients se
présentant avec un stade précoce de cancer bronchique pourront survivre à long terme: le taux
de guérison à 5 ans pouvant atteindre plus de 70 % dans les stades IA (2) et près de 95 % dans
les cancers radio-occultes (3). Malheureusement, la majorité des patients se présentent à un
stade avancé de la maladie lors du diagnostic. Le traitement consiste alors en chimio- et/ou
radiothérapie (4) dont l’efficacité reste limitée et beaucoup décèderont dans l’année du
diagnostic. Ce taux de mortalité important pourrait être réduit par l’arrêt du tabagisme, par la
détection plus précoce des cancers bronchiques et par de nouveaux traitements tels que les
thérapies biologiques ciblées. Une meilleure connaissance de la carcinogenèse bronchique et
de ses bases moléculaires est indispensable à la réalisation de ces objectifs.
Le développement d’un cancer bronchique résulte de l’accumulation d’altérations
génétiques et moléculaires séquentielles et/ou additives incluant des proto-oncogènes, des
gènes suppresseurs de tumeurs, des facteurs de prolifération et des protéines impliquées dans
les mécanismes d’angiogenèse et d’apoptose. Ces anomalies ont été détectées à des stades
précoces de l’évolution néoplasique. Elles peuvent déjà être présentes dans les lésions
bronchiques prénéoplasiques ou néoplasiques précoces des épithélioma épidermoïdes
(hyperplasie, métaplasie, dysplasie légère, modérée ou sévère et carcinome in situ) et des
adénocarcinomes (hyperplasie adénomateuse atypique), voire même dans l’épithélium
(phénotypiquement normal) de fumeurs avant même que n’apparaissent les anomalies
morphologiques (5).
Le rôle précis des facteurs biologiques impliqués dans le cancer bronchique est encore
mal compris aussi bien en termes de carcinogenèse qu’en termes de pronostic. Nos travaux
s’inscrivent dans l’évaluation de l’implication de certains d’entre eux dans leur
développement et dans le pronostic des cancers bronchiques non à petites cellules.
2. Hypothèse Le rôle pronostique des facteurs biologiques impliqués dans le cancer bronchique n’a
jusqu’à présent été étudié que dans les cancers bronchiques invasifs dans de petits groupes de
patients. Nous avons postulé que leur rôle pourrait être plus précoce (dès les stades
15
prénéoplasiques) dans la carcinogenèse bronchique. Pour étudier ce problème, nous avons,
dans un premier temps, réalisé des revues systématiques de la littérature sur plusieurs facteurs
biologiques et essayé de confirmer leur utilité potentielle en tant que facteur pronostique pour
la survie des patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules. Dans un second
temps, nous avons voulu étudier le rôle de certains d’entre eux dans l’évolution du cancer
bronchique et, plus particulièrement, dans le développement d’une de ses formes,
l’épithélioma épidermoïde, afin de démontrer que certaines de ces anomalies biologiques
apparaissaient à des stades précédant le cancer invasif et que leur rôle dans la carcinogenèse
bronchique serait donc précoce.
3. Travaux réalisés 3.1. Tumeurs invasives
3.1.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses du rôle
pronostique pour la survie: guides pour la sélection des marqueurs biologiques
Afin de guider notre choix pour l’étude ultérieure de certains marqueurs biologiques et
d’évaluer leur rôle pronostique pour la survie chez les patients atteints de CBNPC, nous avons
dans un premier temps réalisé une revue de la littérature. La réalisation préalable de méta-
analyses de la littérature nous a permis d’opter pour une série de marqueurs à étudier en
démontrant leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands
nombres de cas. En effet, les lésions bronchiques prénéoplasiques que nous projetions
d’étudier sont de tout petits prélèvements. Leur faible nombre et leur taille très réduite les
rendent particulièrement précieux et nous imposent d’être économes dans leur utilisation.
3.1.1.1. Méthodologie
3.1.1.1.1. Méthode de sélection des études
Pour être éligibles pour une revue systématique, les études devaient concerner
uniquement le cancer bronchique primitif, évaluer l’association entre l’expression du
marqueur et la survie des patients, analyser l’ADN/ARNm ou la protéine dans la tumeur
primitive et/ou dans le sérum, et enfin être publiée dans la littérature anglophone ou
francophone, langue accessible à tous les lecteurs. Les articles ont été identifiés par une
recherche dans la base de données MEDLINE, complétée par la bibliographie personnelle des
auteurs et les références mentionnées dans les articles sélectionnés. Lorsqu’un auteur
rapportait une même cohorte de patients dans plusieurs publications, seule la plus récente ou
la plus complète était incluse dans l’analyse afin d’éviter le recoupement entre les cohortes.
16
3.1.1.1.2. Evaluation de la méthodologie des études sélectionnées
Afin d'analyser la qualité méthodologique et de garantir une interprétation correcte des
résultats, les articles ont été lus par plusieurs investigateurs et notés selon une échelle
d'évaluation de l’ELCWP spécialement adaptée aux facteurs pronostiques biologiques du
cancer du poumon (cf annexe). Le score global, sur 40 points, évalue 4 aspects
méthodologiques, notés chacun sur 10 points: le modèle scientifique, la description des
techniques utilisées pour révéler l’expression du marqueur, la "généralisabilité" (possibilité
d’extrapolation des résultats à une population non sélectionnée) et l’analyse des résultats de
l’étude. Plus le score global, exprimé en %, est élevé, meilleure est supposée la qualité
méthodologique de l’étude. Les études éligibles pour la revue sont appelées "éligibles" et
celles retenues pour la méta-analyse sont dites "évaluables". Seules les études rapportant les
résultats de la survie en fonction du marqueur investigué ont été considérées pour la méta-
analyse.
3.1.1.1.3. Méthodes statistiques
Le résultat d’une étude est considéré comme significatif si la probabilité de signification
associée au test statistique comparant les distributions de survie entre les groupes exprimant
ou n’exprimant pas le marqueur est < 0,05. L’étude est considérée « négative » lorsque
l’expression du marqueur est de mauvais pronostic pour la survie et « positive » dans le cas
contraire. Les études restantes sont considérées comme « non significatives ».
La corrélation entre les scores de méthodologie (ou deux autres variables continues) est
calculée par un coefficient de corrélation de Spearman. Des tests non paramétriques sont
utilisés pour comparer la distribution du score de méthodologie en fonction de la valeur d’une
variable discrète (test U de Mann-Whitney pour une variable binaire et test de Kruskall-Wallis
pour une variable comprenant plus de deux catégories).
Pour l’agrégation quantitative des résultats de survie, l'estimation de l'effet de
l'expression du marqueur est mesurée par le rapport des risques instantanés (Hazard ratio).
Celui-ci, de même que sa variance, peut être rapporté dans les résultats d’une étude donnée. Si
tel n’est pas le cas, il doit être calculé à partir des paramètres de l’analyse univariée (nombre
d'événements et statistique du logrank ou sa probabilité de signification, intervalle de
confiance à 95 % du HR). Si ces paramètres ne sont pas disponibles, le calcul approximatif de
l’estimation du HR se fait grâce au nombre total d’événements et à la statistique du logrank,
ou grâce à la valeur de p. Enfin, si les seuls résultats sont sous la forme d’une représentation
graphique des distributions de survie, la reconstruction de l’estimation du HR et de sa
variance se fait par extraction des taux de survie à des temps spécifiques, en considérant que
17
le taux de patients perdus de vue est constant durant tout le suivi (6). La méthode publiée par
Peto (7) est appliquée pour combiner les estimations des HR individuels en un HR global.
Cette méthode consiste en un modèle à effets fixes supposant l'homogénéité des HR
individuels. Afin de tester cette homogénéité, un test de chi carré d'hétérogénéité est réalisé.
Si l'hypothèse d'homogénéité est rejetée, nous utilisons un modèle à effets aléatoires. Par
convention, un HR >1 correspond à une réduction de la survie dans le groupe exprimant le
marqueur.
Annexe : Echelle de qualité évaluant les revues systématiques de facteurs biologiques 2 points 1 point 0 point A. Modèle scientifique Définition de l’objectif Primaire Secondaire Non défini Considérations statistiques Clairement définies
(évaluation du nombre de patients à inclure…)
Evaluation du nombre de patients à inclure selon le nombre de variables étudiées
Non définies
Modèle scientifique Prospectif Rétrospectif Non défini Définition de la survie Complète Incomplète Non mentionnée ou
inadéquate Méthodes statistiques Clairement définies Incomplètes Non définies B. Description des techniques
Tests biologiques Double aveugle Simple aveugle Non mentionné ou pas en aveugle
Nature du facteur dosé Clairement mentionnée Douteuse ou incomplète Non mentionnée Conservation des échantillons Tissu frais ou fixation et
conservation définie Douteuse ou incomplète Non mentionnée ou
inadéquate Description de la procédure de test
Clairement définie Incomplète Non mentionnée ou inadéquate
Contrôles négatifs et positifs Clairement mentionnés Incomplets Non mentionnés ou inadéquats
Contrôle de reproductibilité Clairement défini Douteux ou incomplet Non mentionné ou inadéquat
Niveau de positivité du test Validé Arbitraire Non mentionné C. Généralisabilité Critères de sélection des patients
Complets Partiels Non mentionnés
Caractéristiques des patients Complètes Partielles Non mentionnées Bilan initial Défini et complet Partiel Non mentionné Caractéristiques du traitement
Complètes Partielles Non mentionnées
Source des échantillons Clairement définie Extrapolable Non mentionnée Nombre de prélèvements non évaluables avec causes
Complet et adéquat Partiel ou inadéquat Non mentionné
D. Analyse des résultats Caractéristiques du suivi Clairement définies Partielles ou inadéquates Non mentionnées Survie selon le marqueur biologique
Clairement définie Partielle ou inadéquate Non mentionnée
Analyse univariée Avec HR et IC Sans HR et IC Non mentionnée Analyse multivariée Avec HR et IC Sans HR et IC Non mentionnée
18
3.1.1.2. Résultats des méta-analyses
3.1.1.2.1. EGF-R
EGF-R (ou c-erbB-1, le récepteur du facteur de croissance épidermique), une
glycoprotéine transmembranaire de 170 kDa, résulte de la transcription de l’oncogène HER-
1/erbB-1. Son domaine extracellulaire est le site de liaison de nombreux polypeptides : facteur
de croissance épidermique (epidermal growth factor ou EGF), facteur de croissance de
transformation alpha (transforming growth factor α ou TGFα), amphiréguline, bêtacelluline,
protéine de liaison à l’héparine (heparin binding protein), épiréguline et facteur de croissance
du virus de la vaccine (vaccinian virus growth factor). La liaison d’un de ces ligands au
domaine extracellulaire d’EGF-R entraîne une homo- ou une hétérodimérisation d’EGF-R
avec erbB-2, erbB-3 ou erbB-4 et une autophosphorylation, premier événement d’une cascade
de signalisations impliquée dans le contrôle de la division cellulaire, de la motilité cellulaire,
de l’adhésion, de l’invasion et de l’angiogenèse. Dans les cancers bronchiques non à petites
cellules, la surexpression d’EGF-R est rapportée dans 24 à 89 % des carcinomes épidermoïdes
et dans 23 à 46 % des adénocarcinomes. L’amplification et l’existence de mutations d’EGF-R
est décrite dans un faible pourcentage de CBNPC. De plus, les premières études cliniques
suggérant qu’EGF-R pouvait être une cible potentielle pour une thérapeutique ciblée sont
apparues au début des années 2000. Tout ceci nous a conduits à étudier le rôle de ce facteur
dans les CBNPC.
3.1.1.2.1.1. Caractéristiques des études
Vingt et une études, publiées entre 1989 et 2001, ont été répertoriées ; 5 d’entre elles ont
été exclues car elles étudiaient les mêmes cohortes de patients que d’autres études déjà
incluses (tableau 1). Deux mille huit cent dix patients étaient inclus dans ces travaux.
Quatorze publications concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules tous sous-
types histologiques confondus, une uniquement des adénocarcinomes et une uniquement des
carcinomes épidermoïdes. Les patients traités par chirurgie pour une maladie loco-régionale
représentaient la majorité des cas. L’immunohistochimie était la technique la plus
fréquemment utilisée pour mettre EGF-R en évidence mais différents anticorps ont été
utilisés: un anticorps monoclonal de souris (Triton, Alameda, CA, USA), le clone EGFR 113
(de Novocastra, Newcastle, Royaume Uni), un anticorps EGF-R 1 (Amersham,
Buckinghamshire, Royaume Uni), un anticorps EGF-R Ab-4 (Dianova, Hambourg,
Allemagne), un anticorps de souris (Transformation Research, Framingham, USA), un
anticorps monoclonal 014H4819 (Sigma, St Louis, USA) ou des anticorps personnels.
19
Tableau 1: Caractéristiques des études de la littérature ayant évalué le rôle de
l’expression d’EGF-R pour la survie des patients atteints de cancer bronchique: seize
études, publiées entre 1989 et 2001, et incluant 2810 patients ont été répertoriées . Quatorze
études concernaient des CBNPC de tous sous-types histologiques, une uniquement des
adénocarcinomes et une uniquement des carcinomes épidermoïdes. Les patients traités par
chirurgie pour une maladie loco-régionale représentaient la majorité des cas. L’IHC était la
technique la plus fréquemment utilisée pour mettre EGF-R en évidence.
Auteur Année Histologie Stade N pts
Technique Estimation de l’HR Résultat
Brabender 2001 CBNPC I - IIIA 83 PCR HR + IC 95% NS Cox 2000 CBNPC I - IIIA 169 IHC logrank + n
évènements NS
D'Amico 2000 CBNPC I 408 IHC logrank + n évènements
NS
Dazzi 1989 CBNPC I - ? 152 IHC Pas de données NS
Fontanini 1998 CBNPC I - IIIA 195 IHC logrank + n événements
NS
Fu 1999 CBNPC I - IIIB 158 IHC Pas de données NS Giatromanola
ki 1996 CBNPC I - II 107 IHC Pas de données NS
Greatens 1998 CBNPC I - IV 101 IHC Pas de données NS Koukourakis 1997 CBNPC I - II 107 IHC Pas de données NS
Ohsaki 2000 CBNPC I - IV 290 IHC Courbes de survie négatif Pastorino 1997 CBNPC I 505 IHC HR + IC 95% NS Pfeiffer 1998 CBNPC I - IV 180 IHC Courbes de survie NS Rush 1997 CBNPC I - IIIA 96 Northern +
IHC Courbes de survie positif
Tateishi 1994 Adéno- carcinomes
I - IV 119 IHC Courbes de survie NS
Veale 1993 CBNPC I - III 19 Compétition
ligand HR + IC 95% négatif
Volm 1998 Carcinomes épidermoïdes
I - III 121 IHC Courbes de survie négatif
3.1.1.2.1.2. Résultats des études individuelles
Trois études étaient “négatives”, une était “positive” et 12 “non significatives”.
Selon le seuil utilisé par les auteurs, EGF-R était surexprimé dans la tumeur chez 51 % des
patients évaluables, chez 46 % dans l’étude sur les adénocarcinomes et chez 82 % dans
l’étude sur les carcinomes épidermoïdes. Une surexpression d’EGF-R était retrouvée
20
respectivement dans 50 %, 54 % et 49 % des patients présentant une maladie au stade I, I à III
ou I à IV.
3.1.1.2.1.3. Résultats de l’analyse qualitative
Le score de qualité global des études variait de 25,8 % à 70,7 % avec une médiane de
56,3 % (tableau 2). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études
évaluables ou non pour la méta-analyse en termes de score de qualité (p = 0,19). De même,
aucune différence statistiquement significative n’était mise en évidence entre les quatre
études significatives et les douze non significatives (p = 0,44).
Tableau 2 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression d’EGF-R pour
la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse: nous
n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative entre les études évaluables ou
non pour la méta-analyse. De même, aucune différence statistiquement significative n’a pu être
mise en évidence entre les études significatives et les non-significatives.
Etudes (nombre) Modèle
scientifique(/10)
Méthode de laboratoire
(/10)
Générali- sabilité
(/10)
Analyse des
résultats (/10)
Score global (%)
Toutes (16) 4,00 6,43 6,67 5,00 56,34 Evaluables pour la MA (11) 4,00 7,14 6,67 5,00 61,70 Non évaluables pour la MA (5) 4,00 5,00 5,00 3,75 48,84 P = 0,28 0,11 0,61 0,14 0,19 Significatives (4) 5,00 6,43 5,42 5,00 54,70 Non significatives (12) 4,00 6,43 6,67 5,62 56,34 P = 0,36 0,85 0,27 0,95 0,90 Etudes significatives dans la MA (4) 5,00 6,42 5,41 5,00 54,70 Etudes non significatives dans la MA (7) 4,00 7,14 6,67 7,50 61,70 P = 0,57 0,70 0,13 0,57 0,44
3.1.1.2.1.4. Méta-analyse
Sur les 16 études éligibles pour la revue systématique, 5 n’ont pu être agrégées dans la
méta-analyse par manque de données pour calculer l’HR. Dès lors, la méta-analyse a été
limitée à 11 études et 2185 patients. Le test d’hétérogénéité était significatif (p = 0,02). Nous
avons donc calculé le HR combiné par une méthode à effet aléatoire et obtenu une valeur qui
n’était pas statistiquement significative: 1,14 (IC 95% : 0,94-1,39) (Figure 1). Afin de
diminuer l’hétérogénéité des études, les 8 études utilisant l’immunohistochimie (IHC) ont été
considérées, les résultats de la méta-analyse atteignaient ainsi juste la significativité: HR =
1,13 (IC 95% : 1,00-1,28) (Figure 2) en faveur des tumeurs ne surexprimant pas EGF-R.
21
Figure 1 : Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression
d’EGF-R pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat ne montre pas de
différence significative en termes de survie pour les patients dont la tumeur surexprime ou
non EGF-R. En effet, le HR est égal à 1,14 (0,93-1,39).
Un HR <1 implique un bénéfice de survie pour le groupe de patients dont la tumeur exprime
EGF-R. La taille du rectangle est proportionnelle au nombre de patients inclus dans l’étude.
Le centre du losange correspond au HR combiné de la méta-analyse et ses extrémités à
l’intervalle de confiance à 95 %.
Figure 2 : Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression
d’EGF-R pour la survie des patients atteints de CBNPC par IHC : le résultat atteint juste
la signification statistique en faveur des tumeurs ne surexprimant pas EGF-R avec un HR égal
à 1,13 (1,00-1,28)
22
3.1.1.2.1.5. Conclusions
Cette étude suggère que les patients dont la tumeur ne surexprime pas EGF-R en
immunohistochimie pourraient avoir une survie légèrement meilleure. Cet effet n’est pas
retrouvé quand toutes les techniques de détection sont regroupées (8).
3.1.1.2.2. c-erbB-2
Nous avons ensuite voulu étudier c-erbB-2 qui est une protéine de type récepteur
tyrosine kinase appartenant à la même famille qu’EGF-R. Le gène dominant HER-2/neu est
localisé chez l’homme sur le bras long (q21) du chromosome 17. Ce gène code pour une
protéine de 185 kDa (p185 neu ou c-erbB-2) similaire à EGF-R. Cette glycoprotéine
transmembranaire de 1255 acides aminés est composée de 3 domaines: un extra-cellulaire, un
transmembranaire et un intracellulaire avec activité tyrosine kinase. Lorsqu’un ligand de type
EGF (il n’existe pas de ligand spécifique connu pour c-erbB-2) se lie à un récepteur de la
famille d’EGF-R (c-erbB-1, 3 ou 4), il y a hétérodimérisation de ce récepteur avec c-erbB-2.
C-erbB-2 est nécessaire à la régulation de la croissance cellulaire normale et à la
différenciation. L’amplification d’HER-2 peut mener à une surexpression de ce récepteur et à
une formation de plus d’hétérodimères et être impliquée dans le développement de nombreux
cancers dont le cancer bronchique. La protéine c-erbB-2, p185, est exprimée dans 20 à 30 %
des cancers bronchiques non à petites cellules et plus particulièrement dans les
adénocarcinomes.
3.1.1.2.2.1. Caractéristiques des études
Trente-neuf études étaient éligibles pour cette revue systématique. Neuf articles ont été
exclus car comportant des cohortes de patients identiques. Notre revue a inclus 4582 patients.
Les caractéristiques principales des publications éligibles sont rapportées dans la tableau 3.
Vingt-quatre d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types histologiques
confondus, cinq des adénocarcinomes uniquement et une des cancers bronchiques à petites
cellules. La plupart des observations concernaient des patients présentant une maladie
locorégionale (stades I à IIIB). De même, la plupart des études utilisaient
l’immunohistochimie pour mettre c-erbB-2 en évidence.
3.1.1.2.2.2. Résultats des études individuelles
Douze études concernant les CBNPC étaient “négatives”, une était “positive” et seize
“non significatives”. Selon le seuil utilisé par les auteurs, c-erbB-2 était surexprimé dans 31 %
des CBNPC et dans 30 % des adénocarcinomes. Une surexpression de c-erbB-2 était retrouvée
respectivement dans 32 % des patients avec une maladie locorégionale et dans 36% des
maladies avancées.
23
Tableau 3 : Caractéristiques des 30 études de la littérature ayant évalué le rôle de
l’expression de c-erbB-2 pour la survie des patients atteints de cancer bronchique: 30
études différentes, incluant 4582 patients étaient éligibles pour cette revue systématique.
Vingt-quatre d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types, cinq des
adénocarcinomes uniquement et une des cancers bronchiques à petites cellules. La plupart des
études concernaient des patients présentant une maladie locorégionale. De même, une grande
majorité des études utilisaient l’IHC pour mettre c-erbB-2 en évidence.
Auteur Année Histologie Stade N pts
Technique Estimation HR
Résultat
2001 CBNPC III-IV 84 ELISA (+ IHC)
Logrank + n événements
Négatif
Brabender 2001 CBNPC I-IIIA 83 PCR Courbes de survie Négatif Cantero 2000 CBNPC I-IIIA 102 ELISA HR + IC Négatif
Carbognani 2002 CBNPC I-IIIA 78 IHC Pas de données NS D’Amico 1999 CBNPC I 408 IHC Logrank + n
événements Négatif
Fu 1999 CBNPC I-IIIB 158 IHC Pas de données NS Giatromanolaki 1996 CBNPC I-II 107 IHC Courbes de survie NS
Graziano 1998 CBNPC IIIA 47 IHC Pas de données NS Greatens 1998 CBNPC I-IV 101 IHC Pas de données Positif
Han 2002 CBNPC I 85 IHC Courbes de survie Négatif Harpole 1996 CBNPC I 275 IHC Logrank + n
événements Négatif
Hirsch 2002 CBNPC I-IIIA 187 IHC (+FISH)
Courbes de survie NS
Hsieh 1998 Adénoc I 42 IHC Logrank + n événements
Négatif
Kern 1990 CBNPC I-IV 44 IHC HR + IC Négatif Kim 1998 CBNPC I-IV 238 IHC HR + IC NS
Kwiatkowski 1998 CBNPC I 243 IHC Logrank + n événements
NS
Liao 2001 CBNPC I-IIIA 127 IHC Logrank + n événements
NS
MacKinnon 1997 Adénoc ? 162 IHC Pas de données NS Moldvay 2000 CBNPC I-IV 227 IHC Logrank + n
événements NS
Nemunaitis 1998 Adénoc I-IV 103 IHC Pas de données NS Pastorino 1997 CBNPC I 483 IHC HR + IC NS Pfeiffer 1996 CBNPC I-IV 186 IHC Courbes de survie NS
Potti 2002 CBPC Etendu 193 IHC Courbes de survie Négatif Schneider 2000 CBNPC I-IIIA 103 IHC Pas de données Négatif Selvaggi 2002 CBNPC I-III 130 IHC HR + IC Négatif
Shou 2001 CBNPC I-III 111 IHC Courbes de survie NS Tateishi 1994 Adénoc I-IV 119 IHC Courbes de survie Négatif Visscher 1997 Adénoc I-IV 31 IHC Pas de données NS
Volm 1993 CBNPC I-III 241 IHC Pas de données NS Yu 1997 CBNPC I-IIIA 116 IHC Courbes de survie Négatif
24
3.1.1.2.2.3. Résultats de l’analyse qualitative
Le score de qualité global variait de 37,4 % à 82,6 % avec une médiane de 57,6 %
(tableau 4). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études
évaluables ou non pour la méta-analyse mais une différence statistiquement significative a été
mise en évidence entre les études significatives et les études non significatives (p = 0,03),
principalement en terme d’analyse des résultats.
Tableau 4 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression de c-erbB-2
pour la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse :il
n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études évaluables ou non pour
la méta-analyse en termes de score de qualité mais une différence statistiquement significative
a été mise en évidence entre les études significatives et les études non significatives,
principalement en terme d’analyse des résultats.
Etudes (nombre) Modèle
scientifique(/10)
Méthode de laboratoire
(/10)
Générali- sabilité
(/10)
Analyse des
résultats (/10)
Score global (%)
Toutes (30) 5,00 6,42 6,66 5,62 57,58 Evaluables pour la MA (21) 5,00 6,42 6,66 6,25 61,07 Non évaluables pour la MA (9) 5,00 6,42 7,50 3,75 54,34 P = 0,15 0,94 0,83 0,02 0,09 Significatives (14) 5,00 6,42 6,66 6,87 61,19 Non significatives (16) 4,50 6,07 6,66 5,00 52,64 P = 0,30 0,26 0,27 0,03 0,03 Etudes significatives dans la MA (12) 5,00 6,42 6,66 7,50 61,19 Etudes non significatives dans la MA (9) 5,00 6,42 6,66 6,25 53,18 P = 0,91 0,47 0,59 0,14 0,22
3.1.1.2.2.4. Méta-analyse
Douze des quatorze études significatives et neuf des seize non significatives ont été
incluses dans la méta-analyse. Lorsque l’on considérait uniquement les vingt études
concernant les CBNPC, le test d’hétérogénéité était significatif (p = 0,001). Nous avons donc
calculé le HR global en utilisant la méthode à effets aléatoires et obtenu une valeur
statistiquement significative: HR = 1,55 (IC 95% : 1,29-1,86) (Figure 3). Lorsque nous
considérions uniquement les études utilisant l’immunohistochimie, l’hétérogénéité était
toujours présente (p < 0,001) et le résultat statistiquement significatif: HR 1,46 (95% IC: 1,19-
1,78).
25
Figure 3 : Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression
de c-erbB-2 pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat montre que les
patients dont la tumeur surexprime c-erbB-2 ont une survie statistiquement plus courte que
ceux dont la tumeur ne surexprime pas cette protéine (HR = 1,55 avec un IC 95 % : 1,29-
1,86).
3.1.1.2.2.5. Conclusions
Cette étude suggère que les patients dont la tumeur ne surexprime pas c-erbB-2 ont une
meilleure survie (9).
26
3.1.1.2.3. Ki-67
EGF-R étant impliqué dans la prolifération tumorale, nous avons voulu étudier cet
aspect dans la cancer bronchique et voir si un marqueur de la prolifération était un facteur
pronostique. En routine pour évaluer l'activité proliférative, les anticorps dirigés contre Ki-67
sont utilisés. Ki-67 est une protéine nucléaire et nucléolaire exprimée spécifiquement au cours
de tout le cycle cellulaire des cellules proliférantes à l'exception de la phase G0 où son
expression est absente. La fonction exacte de cette protéine est inconnue mais il semble qu'elle
soit un facteur important pour la progression dans le cycle de division cellulaire.
3.1.1.2.3.1. Caractéristiques des études
Quarante-deux études publiées entre 1991 et 2002, ont été répertoriées ; cinq d’entre
elles ont été exclues car elles incluaient les mêmes cohortes de patients que d’autres études
déjà incluses. Les caractéristiques de ces études sont répertoriées au tableau 5. Vingt-neuf
concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules de tous sous-types histologiques
confondus, 5 tous les types de cancers bronchiques, une uniquement des cancers bronchiques à
petites cellules et deux uniquement des tumeurs carcinoïdes. Les patients traités par chirurgie
pour un CBNPC loco-régional représentaient la majorité des cas. L’immunohistochimie était
la seule technique utilisée pour mettre Ki-67 en évidence mais les anticorps utilisés variaient
selon les études : clone MIB-1 dans 68 % des cas et clone de chez DAKO dans 16 %.
3.1.1.2.3.2. Résultats des études individuelles
Quinze études étaient “négatives” et 22 “non significatives”. Selon le seuil utilisé par les
auteurs, Ki-67 était exprimé dans 49 % des tumeurs.
3.1.1.2.3.3. Résultats de l’analyse qualitative
Le score de qualité global variait de 21,2 % à 84,1 % avec une médiane de 50,6 %
(tableau 6). Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les études
significatives et les études non significatives (p = 0,42) mais bien entre les études évaluables
ou non pour la méta-analyse (p = 0,002) en termes de score de qualité.
3.1.1.2.3.4. Méta-analyse
Pour les CBNPC (16 études, 1863 patients), l’agrégation des résultats (figure 4) a mis
en évidence que les patients dont la tumeur exprime Ki-67 avaient un moins bon pronostic
(HR : 1,55 ; IC 95% 1,34-1,78). Il n’y avait pas d’hétérogénéité entre le études (p=0,12). Ceci
a été aussi montré pour les adénocarcinomes (HR : 2,45 ; IC 95% 1,66-3,64), les carcinomes
épidermoïdes (HR : 2,47 ; IC 95% 1,32-4,57), les stades I (HR : 1,56 ; IC 95% : 1,26-1,93) et
les stades I-III (HR : 1,79 ; IC 95% 1,40-2,28)
27
Tableau 5 : Caractéristiques des 37 études de la littérature ayant évalué le rôle de
l’expression de Ki-67 pour la survie des patients atteints de cancer bronchique : vingt-neuf
concernaient des cancers bronchiques non à petites cellules de tous sous-groupes histologiques,
une uniquement des cancers bronchiques à petites cellules et deux uniquement des tumeurs
carcinoïdes. Les patients traités par chirurgie pour un CBNPC loco-régional représentaient la
majorité des cas. L’immunohistochimie était la seule technique utilisée pour mettre Ki-67 en
évidence.
Auteur Année Histologie Stade N pts Estimation HR Résultat Bellotti 1997 CBNPC I à II 67 Pas de données NS Bohm 1996 carcinoïde I à IV 59 Pas de données négatif Cagini 2000 CBNPC I - II 99 Logrank + n événements NS Carbognani 2002 CBNPC I à IIIA 78 Logrank + n événements NS Carvalho 2000 adénoc I à IV 45 Pas de données NS Costes 1995 carcinoïde I - ? 47 Logrank + n événements négatif D'Amico 1999 CBNPC I 408 Logrank + n événements NS Dazzi 1999 CBNPC I à IIIB 76 Pas de données NS Demarchi 2000 adénoc I à IIIB 64 Données individuelles négatif Dingemans 1999 CBPC Tous 93 Logrank + n événements négatif Dingemans 2001 CBNPC III à IV 38 Logrank + n événements NS Ferreira 2001 CBNPC I à IIIA 144 Pas de données NS Fontanini 1996 CBNPC I à IIIA 70 Courbes de survie NS Giaccone 1995 CBNPC I à IV 33 Pas de données NS Giatromanolaki 1996 CBNPC I à II 107 Pas de données NS Harpole 1995 CBNPC I 271 Courbes de survie négatif Hayashi 2001 adénoc I à IV 98 Pas de données négatif Hommura 2000 CBNPC I - II 109 Courbes de survie négatif Ishida 1997 adénoc I à IIIA 114 Courbes de survie négatif Kawai 1994 Tous I à III 165 Pas de données NS Komaki 1998 CBNPC N1 137 Pas de données NS Mehdi 1998 CBNPC I à II 203 Courbes de survie NS Minami 2002 adénoc I 47 Logrank + n événements négatif Nguyen 2000 CBNPC I à IV 49 Courbes de survie NS Pelosi 2001 CBNPC I 222 Pas de données négatif Pence 1993 CBNPC I à IV 61 Courbes de survie négatif Puglisi 2001 CBNPC I à IIIB 74 Courbes de survie NS Pujol 1996 Tous I à IV 133 Courbes de survie NS Ramnah 2001 CBNPC I à IV 221 HR NS Rigau 2002 CBNPC I à IV 86 Pas de données NS Santinelli 1999 Tous I à II 42 Pas de données NS Shiba 2000 CBNPC I à III 156 Logrank + n événements négatif Shiba 2001 Tous I à IIIB 57 Courbes de survie négatif Soomro 1998 CBNPC I à IV 105 Courbes de survie négatif Tsoli 2001 CBNPC I à III 69 Données individuelles NS Tungekar 1991 Tous IA et IIA 187 Courbes de survie négatif Van de Vaart 2000 CBNPC I à II A 27 HR NS
28
Tableau 6 : Score de qualité des études ayant évalué le rôle de l’expression de Ki-67 pour
la survie des patients atteints de cancer bronchique éligibles pour la méta-analyse : il n’y
avait pas de différence statistiquement significative entre les études significatives et les études
non significatives mais bien entre les études évaluables ou non pour la méta-analyse en terme
de score de qualité.
Etudes (nombre) Modèle scientifique
(/10)
Méthode de laboratoire
(/10)
Générali- sabilté (/10)
Analyse des résultats
(/10)
Score global (%)
Toutes les études (37) 4,0 5 6,7 6,2 50,6 Evaluables pour la MA (20) 5,0 5,7 6,7 7,5 60,7 Non évaluables pour la MA (17) 3,0 4,3 5,8 5,0 45,8 P = 0,009 0,009 0,57 0,004 0,002 Significatives (15) 4,0 5,0 6,7 6,2 52,5 Non significatives (22) 3,5 5,0 6,2 5,0 49,2 P = 0,30 0,82 0,44 0,47 0,42
Figure 4: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle de l’expression de
Ki-67 pour la survie des patients atteints de CBNPC : le résultat montre que les patients
dont la tumeur surexprime Ki-67 ont une survie statistiquement plus courte (HR = 1,55 avec
un IC 95 % :1,34-1,78).
29
3.1.1.2.3.5. Conclusions
Ki-67 est un facteur de mauvais pronostic pour la survie des patients atteints d’un
CBNPC (10).
3.1.1.2.4. Le nombre des micro-vaisseaux
L’angiogenèse tumorale est un processus multifactoriel complexe impliquant des
facteurs de croissance dont EGF-R et des enzymes de la matrice extra-cellulaire. La néo-
angiogenèse est fondamentale pour la croissance et la progression tumorale. Trois anticorps
peuvent être utilisés pour mettre les vaisseaux tumoraux en évidence par immunohistochimie:
le facteur VIII ou facteur de von Willebrand impliqué dans l’adhérence et l’agrégation
plaquettaire; le CD31 ou PECAM 1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule) associé à
l’adhésion dans l’inflammation, la cicatrisation et la migration cellulaire; le CD34 impliqué
dans l’adhérence leucocytaire et la migration de cellules endothéliales durant l’angiogenèse.
3.1.1.2.4.1. Caractéristiques des études
Le nombre des micro-vaisseaux a été évalué sur des pièces chirurgicales par
immunohistochimie à l’aide du facteur VIII dans 14 études (tableau 7), du CD34 dans 10
(tableau 8) et du CD31 dans 8 (tableau 9). Respectivement 1866, 1440 et 1093 patients atteints
d’un CBNPC ont été inclus. Certains patients ont été évalués par 2 techniques différentes.
3.1.1.2.4.2. Résultats des études individuelles
Lorsque le facteur VIII est étudié, huit études étaient “négatives”, cinq non significatives
et une ne permettait pas de tirer de conclusion. Sept étaient évaluables pour la méta-analyse.
En ce qui concerne CD34, six études étaient “négatives” et quatre non significatives. Neuf
étaient évaluables pour la méta-analyse. En terme de CD31, cinq études étaient “négatives” et
trois non significatives. Sept étaient évaluables pour la méta-analyse.
3.1.1.2.4.3. Résultats de l’analyse qualitative
La médiane des scores de qualité était respectivement de 52,4, 59,3 et 59,5 % pour les
études évaluant les micro-vaisseaux par le facteur VIII, le CD34 et CD31, sans différence
statistiquement significative entre les études évaluables ou pas pour la méta-analyse ni entre
les études significatives ou non.
30
Tableau 7: Caractéristiques des 14 études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre
des micro-vaisseaux par le facteur VIII pour la survie des patients atteints de cancer
bronchique: 12 d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types et 2 des
adénocarcinomes uniquement. Mille huit cent soixante-six patients sont inclus.
Auteur Année Histologie Stade N Estimation de l’HR
Résultat Anticorps
Aikawa 1999 CBNPC I-IIIB 97 Pas de données Négatif TaKaRa Mo AbChandrachud 1997 CBNPC I-IIIA 88 Logrank NS Dako A0082 D’Amico 1999 CBNPC I 408 Logrank Négatif Biogenex Mo
Ab Duarte 1998 CBNPC I 96 Courbes de
survie Négatif Ventana Mo Ab
Fontanini 1995 CBNPC I-IIIB 248 Courbes de survie
Négatif Dako
Giatromanolaki 1997 CBNPC I-II 134 Pas de données Négatif Dako Mo F8/86 Imoto 1998 CBNPC I-IIIB 91 HR + IC NS Dako Po A0082Macchiarini 1994 CBNPC I-III 28 Pas de données Négatif Dako Mo Ab Mattern 1995 CBNPC I-III 204 Courbes de
survie NS Dako
Ohta 1999 CBNPC I 104 Pas de données Négatif Dako Po Ab Sheng 2000 CBNPC I-IV 98 Pas de données NC Santa Cruz Takanami 1997 Adénoc I-IV 120 Courbes de
survie Négatif Nichirei Mo Ab
Yamazaki 1994 Adénoc I-IV 42 Pas de données NS Dako Po Ab Yano 2000 CBNPC I-IV 108 Pas de données NS Dako Mo Ab
Tableau 8: Caractéristiques des 10 études de la littérature ayant évalué le rôle du
nombre des micro-vaisseaux par le CD34 pour la survie des patients atteints de cancer
bronchique: 8 d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types et 2 des
adénocarcinomes uniquement avec au total 1440 patients inclus.
Auteur Année Histologie Stade N Estimation de l’HR
Résultat Anticorps
Cagini 2000 CBNPC I-IIB 99 Logrank NS Clone QB END 10 Cox 2001 CBNPC I-IIIA 167 HR + IC Négatif Clone QB END 10 Dazzi 1999 CBNPC I-IIIB 76 Logrank NS Clone QB END 10 Fontanini 1997 CBNPC I-III 407 Logrank Négatif Clone QB END 10 Liao 2001 CBNPC I-III 115 Pas de données NS Pas de données Matsuyama 1998 CBNPC I-IIIB 101 Logrank Négatif Clone QB END 10 Offersen 2001 CBNPC I-III 143 Courbes de
survie NS Clone QB END 10
Shibusa 1998 Adénoc I 44 Courbes de survie
Négatif Clone QB END 10
Takanami 2000 Adénoc I-IIIA 180 Courbes de survie
Négatif Novocastra Mo Ab
Yano 2000 CBNPC I-IV 108 Logrank Négatif Clone QB END 10
31
Tableau 9: Caractéristiques des 8 études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre
des micro-vaisseaux par le CD31 pour la survie des patients atteints de cancer
bronchique: 7 d’entre elles concernaient des CBNPC de tous sous-types et 1 des
adénocarcinomes uniquement avec au total 1093 patients inclus. Toutes les études
concernaient des patients présentant une maladie locorégionale.
Auteur Année Histologie Stade N Estimation de l’HR
Résultat Anticorps
Apolinario 1997 CBNPC I-IIIA 104 Courbes de survie
Négatif Clone JC70
Duarte 1998 CBNPC I 96 Courbes de survie
NS Dako Mo Ab
Han 2001 CBNPC I 85 Courbes de survie
Négatif Ventana
Hasegawa 2001 CBNPC I-III 53 Pas de données NS Clone JC70 Kawagushi 1997 Adénoc I 42 Courbes de
survie Négatif Clone JC70
O’Byrne 2000 CBNPC IIIA 183 Courbes de survie
Négatif Clone JC70
Ohta 1996 CBNPC I 15 Logrank Négatif Dako Mo AbPastorino 1997 CBNPC I 515 HR + IC NS Clone JC70
3.1.1.2.4.4. Méta-analyse
L’agrégation des résultats de survie a permis de montrer qu’un nombre élevé de micro-
vaisseaux dans les CBNPC était un facteur de mauvais pronostic quel que soit le facteur
utilisé: facteur VIII (HR:1,81 ; IC 95%:1,16 – 2,84) (figure 5), CD34 (HR:1,99 ; IC 95%:1,53
– 2,58) (figure 6) ou CD31 (HR:1,80 ; IC 95% 1,10 – 2,96) (figure 7).
Figure 5: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des
micro-vaisseaux, évalués par le facteur VIII, pour la survie des patients atteints de
CBNPC: le résultat montre que les patients dont la tumeur présente un nombre important de
micro-vaisseaux ont une survie statistiquement plus courte que les autres patients (HR = 1,81
avec un IC 95 % :1,16-2,84).
32
Figure 6: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des
micro-vaisseaux, évalués par CD34, pour la survie des patients atteints de CBNPC: le
résultat montre que les patients dont la tumeur présente un nombre important de micro-
vaisseaux ont une survie statistiquement plus courte que les autres patients (HR = 1,99 ; IC 95
%:1,53 – 2,58)
Figure 7: Méta-analyse des études de la littérature ayant évalué le rôle du nombre des micro-
vaisseaux, évalués par CD31, pour la survie des patients atteints de CBNPC: le résultat montre
que les patients dont la tumeur présente un nombre important de micro-vaisseaux ont une survie
statistiquement plus courte que les autres patients (HR =1,80; IC 95 %:1,10 – 2,96)
3.1.1.2.4.5. Conclusion
La néoangiogenèse tumorale est un facteur pronostique péjoratif pour la survie des
patients atteints de CBNPC (11).
33
3.1.2. Etudes de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales
Dans une deuxième phase, afin de mieux appréhender l’implication de ces facteurs
dans la carcinogenèse et le pronostic des patients atteints de CBNPC, nous avons étudié au
laboratoire diverses questions sur des tumeurs bronchiques invasives.
3.1.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2
Le but de cette étude était d’investiguer le mécanisme de surexpression protéique
d’EGF-R et de c-erbB-2 et d’évaluer si des anomalies géniques pouvaient prédire cette
surexpression en recourant à des techniques d’IHC et de FISH sur les mêmes pièces
tumorales.
3.1.2.1.1. Techniques de laboratoire et évaluation du marquage
Tous les tissus ont été fixés en routine et mis en paraffine. De chaque bloc, des sections
de 5 µm ont été coupées et déposées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel-Gläser,
Braunschwein, Germany).
3.1.2.1.1.1. Immunohistochimie
Tous les réactifs ont été utilisés sans purification préalable. Le méthanol, l’acide
citrique, le citrate de sodium, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) et l’acide
hydrochlorhydrique proviennent de chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Les lames ont été
déparaffinées dans du xylène et les tissus réhydratés dans des solutions aqueuses comprenant
des concentrations croissantes d’éthanol. L’immunohistochimie a été réalisée selon la
méthode standard du complexe avidine-biotine-peroxydase.
Immunohistochimie EGF-R
La peroxydase endogène a été inactivée par incubation des lames dans du peroxyde
d’hydrogène 0,3 % dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Les lames
ont été rincées 2 fois dans un tampon TRIS-HCl 0,005 M, NaCl 0,9 %, pH 7,6 pendant 10
minutes. Un démasquage de l’antigène a été réalisé par triple passage (3 fois 5 minutes) au
four à micro-ondes à 650 W en tampon citrate 0,01 M à pH 7. Les lames ont ensuite été
refroidies pendant 25 minutes à température ambiante. L’anticorps monoclonal de souris anti-
EGF-R dirigé contre le domaine extracellulaire d’EGF-R (Ig G2a; NCL–EGF-R; clone EGF-
R.113) de chez Novocastra (Newcastle Upon Tyne, Royaume Uni) (dilution 1/20, titration
finale 5 µg/ml) a été déposé et incubé pendant 60 minutes à 37° C. Toutes les étapes suivantes
ont été réalisées de façon automatique à 37° C dans le système NexES (Ventana Medical
Systems, Tucson, AZ, USA). Le complexe entre EGF-R et l’anticorps a été fixé avec du
glutaraldéhyde en NaCl 0,9 %. L’anticorps secondaire a été incubé pendant 8 minutes. Les
coupes ont ensuite été colorées par de la diaminobenzidine (DAB) (kit de détection Ventana
34
Medical Systems, Tucson AZ, USA) et contre-colorées avec de l’hématoxyline. Le marquage
obtenu est membranaire.
Des contrôles négatifs ont été obtenus en omettant l’anticorps primaire et en
substituant des Ig G2a normales de souris à l’anticorps primaire. Le contrôle positif externe
était un adénocarcinome bronchique positif pour EGF-R et du placenta.
Le niveau de positivité a été exprimé en pourcentages de cellules marquées (0-100 %)
et les lames ont été considérées comme positives si ≥ 1 % des cellules étaient marquées.
Immunohistochimie c-erbB-2
Un démasquage de l’antigène a été réalisé par 5 passages de 5 minutes au four à
micro-ondes à 650 W en tampon citrate 0,01 M à pH 6. Les lames ont ensuite été refroidies
pendant 25 minutes à température ambiante et rincées 2 fois dans du TRIS-HCl 0,005 M NaCl
0,9 % pH 7,6 pendant 10 minutes. Toutes les étapes suivantes ont été réalisées de façon
automatique à 37° C dans le système NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA).
La peroxydase endogène a été inactivée par incubation dans du peroxyde d’hydrogène 0,3 %
dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. L’anticorps anti-c-erbB-2
monoclonal de souris (clone CB11) de chez Novocastra (Newcastle Upon Tyne, Royaume
Uni) (dilution 1/30, titration finale 0,9 µg/ml) a été déposé et incubé pendant 30 minutes. Le
complexe entre c-erbB-2 et l’anticorps a été fixé avec du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %.
L’anticorps secondaire a été incubé pendant 8 minutes. Les coupes ont ensuite été colorées
par de la diaminobenzidine (DAB) (kit de détection Ventana Medical Systems, Tucson AZ,
USA) et contre-colorées avec de l’hématoxyline. Le marquage obtenu est membranaire.
Des contrôles négatifs ont été réalisés par omission de l’anticorps primaire et par
substitution des Ig G1 normales de souris à l’anticorps primaire. Le contrôle positif externe
était un cancer du sein positif pour c-erbB-2.
Pour c-erbB-2, la classification utilisée dans le cancer du sein et acceptée par la FDA a
été utilisée. Les lames ont été considérées comme faiblement positives (2+) si plus de 10 % des
cellules tumorales avaient un marquage complet faible à modéré de la membrane et fortement
positives (3+) si le marquage complet était fort dans plus de 10% des cellules. Tous les autres
marquages ont été interprétés comme négatifs (0 - 1+).
3.1.2.1.1.2. FISH
Le nombre de copies du gène HER-2/Neu a été déterminé en utilisant le kit de sondes
PathVysion (Vysis, IL, USA). Pour Her-2/Neu, le kit contient une sonde marquée par un
fluorophore à spectre orange marquant le locus du gène HER-2/Neu et une sonde marquée par
un fluorophore à spectre vert marquant la région du centromère du chromosome 17 (CEP 17).
35
Pour EGF-R, le kit contient une sonde marquée par un fluorophore à spectre orange marquant
le locus du gène EGF-R (7p12) et une sonde marquée par un fluorophore à spectre vert
marquant la région du centromère du chromosome 7 (CEP 7).
Après séchage une nuit à 55°C, les lames ont été déparaffinées dans le toluol pendant
10 min puis les tissus réhydratés dans l’éthanol 100 % pendant 5 min à température ambiante
et enfin les lames séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. La zone d’intérêt a été
délimitée par comparaison avec les lames marquées à l’hématoxyline éosine. Les lames ont
été immergées dans l’HCl 0,2N pendant 20 min, rincées dans l’eau pendant 2 min, immergées
dans du 2xSSC (saline sodium citrate = NaCl 3M+ citrate de sodium 0,3M) pH 7 pendant 2
min à température ambiante puis séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. Elles ont
ensuite été plongées dans la solution de pré-traitement à 80°C pendant 30 min, rincées dans
l’eau pendant 2 min, dans du 2xSSC pH 7 pendant 2 minutes à température ambiante et
séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes. Les lames ont ensuite été immergées pour
15 min dans une solution de protéase à 37°C ; elles ont ensuite été rincées dans du 2xSSC pH
7 pendant 1 min à température ambiante puis séchées à 45°-50°C pendant quelques secondes.
La digestion des échantillons a été vérifiée en ajoutant 15 µl de DAPI (4, 6-diamidino-2-
phenylindole) dans du phénylènediamine dihydrochloride et du glycérol sur les lames. Après
vérification de la digestion, les lames ont été rincées dans du 2xSSC 10 min. Si la digestion
était insuffisante, les lames étaient réimmergées quelques minutes dans la solution de protéase
et la digestion était à nouveau contrôlée. Lorsque celle-ci était satisfaisante, les lames étaient
rincées dans un tampon neutre de formaline à température ambiante pendant 10 min, puis
dans le 2xSSC pH 7 2 fois 5 min et enfin séchées quelques secondes à 45°-50°C. Après ce
prétraitement, la dénaturation de l’ADN a été réalisée par immersion pendant 5 min dans une
solution dénaturante (28 ml formamide + 8 ml H2O + 4 ml 20xSSC pH 5,3) pH 7-8
préchauffée à 73°C. Ensuite les lames ont été immergées dans de l’éthanol 70% 1 min, dans
de l’éthanol 85% 1 min, dans de l’éthanol 100 % 1 min et séchées à 45°-50°C sur la plaque
chauffante pendant 2 à 5 min. Dix µl de la solution de sondes ont été appliqués sur la zone
d’intérêt des lames et un couvre-lame de 22 x 22 mm a été placé puis collé sur celles-ci. Elles
ont ensuite été placées pendant une nuit dans une chambre noire humidifiée à 37°. Le tampon
de post-hybridation (50 ml 20xSSC + 150 µl NP-40 0,3 %) a été préchauffé à 73°C et un autre
récipient de tampon à température ambiante a été préparé. La colle et le couvre-lame ont été
enlevés et les lames ont été plongées dans le tampon de post-hybridation à température
ambiante pendant 5 min puis dans celui à 73°C pendant 5 min. Elles ont ensuite été séchées
36
en position verticale dans le noir à température ambiante. Une application de 10 µl de DAPI
et d’un nouveau couvre-lame a finalement été réalisée. Les lames ont été stockées dans le noir
à – 20 °C jusqu’à la lecture. L’analyse de la fluorescence a été réalisée sur un microscope à
fluorescence Olympus BX51.
Le nombre total de signaux de HER-2/Neu (ou EGF-R) et du CEP17 (ou CEP7) a été
compté en utilisant les filtres correspondants dans 60 noyaux de cellules tumorales. Un
rapport HER-2 (ou EGF-R) /CEP17 (ou CEP7) ≥ 2 a été défini comme une amplification de
Her-2/Neu (ou EGF-R). Une disomie bien équilibrée (statut normal) a été définie comme un
rapport proche de 1 avec un nombre de HER-2/Neu (ou EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre
1,5 et 2,5 chacun. Une trisomie équilibrée a été définie comme un nombre de HER-2/Neu (ou
EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre 2,5 et 3,5 chacun. Une quadrisomie équilibrée a été
définie comme un nombre de HER-2/Neu (ou EGF-R) et de CEP17 (ou CEP7) entre 3,5 et 4,5
chacun. Tous les autres cas étaient considérés comme aneuploïdes. Les amplifications, les
trisomies, les quadrisomies et les autres aneuploïdies ont été regroupées sous le terme de
"anomalies géniques".
3.1.2.1.2. Statistiques
L’analyse a été réalisée en considérant que le FISH était le test de référence pour
l’amplification et les autres anomalies génétiques. La valeur prédictive positive de l’IHC pour
l’amplification génique (ou les autres anomalies géniques) et la valeur prédictive négative ont
été calculées. Des tests de Fisher bilatéraux ont été utilisés pour vérifier s’il y avait une
association entre d’une part l’expression de c-erbB-2 ou d’EGF-R et d’autre part l’histologie,
le stade, le degré de différenciation ou les anomalies géniques. La survie a été calculée à partir
de la date de l’intervention chirurgicale selon la méthode de Kaplan-Meier. Des tests du
logrank ont été utilisés pour comparer les distributions de survie entre les groupes.
3.1.2.1.3. Résultats
3.1.2.1.3.1. EGF-R
Cent treize pièces chirurgicales de patients opérés entre novembre 1992 et juillet 2000
d’un cancer bronchique non à petites cellules ont été évaluées par IHC, 77 (pour lesquelles du
tissu était encore disponible) l’ont également été par FISH.
Par IHC, 40 % des tumeurs étaient positives pour EGF-R : respectivement 56 % des
carcinomes épidermoïdes et 22 % des adénocarcinomes (p=0,0005). Il n’y avait pas de
différence statistiquement significative en terme d’expression d’EGF-R selon le stade de la
maladie (respectivement 37 %, 39 % et 19 % de positivité dans les stades I, II et III).
37
En FISH, 74 % des tumeurs présentaient une disomie, 9 % une trisomie, 3 % une
quadrisomie et un autre type d’aneuploïdie dans 14% des cas. Aucune amplification n’a été
observée.
Dans le groupe de tumeurs étudiées par les 2 techniques (n = 77), 40 % étaient négatives
par IHC et avaient un statut génique normal, 21 % étaient positives par IHC et présentaient des
anomalies géniques et les résultats étaient discordants pour 39 % des tumeurs (p=0,009)
(tableau 10). Les valeurs prédictives positives et négatives de l’IHC pour la présence d’une
anomalie génique étaient respectivement de 38 et 88 %.
Tableau 10: Etude de l’expression génique et protéique d’EGF-R dans les CBNPC opérés:
sur une série de 77 tumeurs, 40 % étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal
en FISH, 21 % étaient positives en IHC et présentaient des anomalies géniques et les résultats
étaient discordants pour 39 % des tumeurs. Les valeurs prédictives positives et négatives de
l’IHC pour les anomalies géniques étaient respectivement de 38 et 88 %.
N tumeurs IHC positives
(n = 42)
IHC négatives
(n = 35)
Anomalies géniques en FISH
(n = 20)
21 % 5 %
Amplifications en FISH
(n = 0)
0 0
FISH normal
(n= 57)
34 % 40 %
Au moment de l’analyse, 52 % des patients étaient décédés: respectivement 41 % des
patients de stade I, 61 % des stades II et 78 % des stades III ; la survie médiane était
respectivement de 207/ 97/ 75 mois pour les stades I/ II/ III (p=0,05).
Les médianes de survie étaient respectivement de 25 et 45 mois pour les patients avec et
sans surexpression protéique d’EGF-R dans la tumeur. Les patients avec des anomalies
géniques tumorales d’EGF-R avaient également une médiane de survie plus courte (31 mois)
que ceux qui n’en avaient pas (43 mois). La survie médiane était de 17 mois pour les patients
38
présentant dans leur tumeur une surexpression protéique et une anomalie génique et de 45 mois
pour les patients qui ne surexprimaient pas EGF-R et ne présentaient pas d’anomalies géniques.
Toutes ces différences n’atteignaient pas le seuil de la signification statistique.
3.1.2.1.3.2. c-erbB-2
Par IHC (n=106), 36/46/20/4 tumeurs étaient respectivement 0/1+/2+/3+ pour c-erbB-2.
Un statut c-erbB-2 positif (2+ et 3+) était donc retrouvé chez 22 % des patients [17 % des
carcinomes épidermoïdes et 31 % des adénocarcinomes (sans différence statistiquement
significative)] mais seulement 4 % des cas présentaient une surexpression à 3+. Il n’y avait pas
de différence en terme d’expression de c-erbB-2 selon le stade (respectivement 22 %, 23 % et
20 % dans les stades I, II et III).
Une amplification était observée dans 6 % des tumeurs des 102 patients évaluables par
FISH. Quarante-quatre % des tumeurs présentaient une disomie, 12 % une trisomie et 2 % une
quadrisomie. D’autres types d’aneuploïdie étaient observés dans 36 % des tumeurs.
Trois % des tumeurs étaient positives par IHC et présentaient une amplification
génique, 72% étaient négatives par IHC et n’avaient pas d’amplification génique et les résultats
étaient discordants dans les autres cas (p = 0,13). Les valeurs prédictives positive et négative de
l’IHC pour l’amplification génique étaient respectivement de 14 et 96 %. Quand toutes les
anomalies génétiques étaient considérées, 19 % des tumeurs étaient positives par IHC et avaient
des anomalies géniques, 38 % étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal et
43 % des résultats discordaient (p = 0,05) (tableau 11). Les valeurs prédictives positive et
négative de l’IHC pour les anomalies génétiques étaient respectivement de 72 et 53 %.
La survie médiane était respectivement de 17 et 40 mois pour les patients avec ou sans
surexpression protéique tumorale de c-erbB-2. Les patients présentant une amplification de c-
erbB-2 dans leur tumeur avaient une médiane de survie plus courte (18 mois) par rapport à ceux
qui n’en avaient pas (38 mois). La survie médiane était de 16 mois pour les patients avec la
surexpression de c-erbB-2 et les anomalies géniques et 28 mois pour les patients sans
surexpression de c-erbB-2 et un statut génique normal. Toutes ces différences n’atteignaient
pas le seuil de signification statistique.
39
Tableau 11: Etude de l’expression génique et protéique de c-erbB-2 dans les CBNPC
opérés: 19 % des tumeurs étaient positives par IHC et avaient des anomalies géniques, 38 %
étaient négatives par IHC et avaient un statut génique normal, les autres résultats discordaient.
Les valeurs prédictives positives et négatives de l’IHC pour les anomalies génétiques étaient
respectivement de 72 et 53 %.
N tumeurs IHC positives
(n = 22)
IHC négatives
(n = 74)
Anomalies géniques en FISH
(n = 51)
16 % 34 %
Amplification en FISH
(n = 6)
3 % 3 %
FISH normal
(n = 45)
6 % 38 %
3.1.2.1.3.3 . « Co-expression » d’EGF-R et de c-erbB-2
Pour 106 patients, l’IHC a été réalisée pour EGF-R et pour c-erbB-2. Quarante-sept %
des tumeurs n’exprimaient aucune des protéines, 11 % exprimaient les 2, 30 % exprimaient
uniquement EGF-R et 11 % uniquement c-erbB-2 (p = 0,35).
Pour 69 patients, le FISH a été réalisé pour c-erbB-2 et EGF-R . Le nombre de gènes
était normal pour EGF-R et c-erbB-2 dans 38 % des tumeurs, anormal pour les 2 marqueurs
dans 19 %, anormal pour EGFR seulement dans 7 % et anormal pour c-erbB-2 seulement dans
36 % des cas (p = 0,07) (tableau 12).
La survie médiane était respectivement de 44, 40 et 17 mois pour les patients qui
surexprimaient 0, 1 ou 2 protéines (p = 0,59) et de 50, 41 et 40 mois pour ceux qui présentaient
0, 1 ou 2 anomalies géniques (p = 0,40) dans leur tumeur .
40
Tableau 12 : Etude par FISH de la co-expression d’EGF-R et de c-erbB-2: pour 69
patients, le FISH a été réalisé pour c-erbB-2 et EGF-R. Le nombre de gènes était normal pour
EGF-R et c-erbB-2 dans 38 % des tumeurs, anormal pour les 2 marqueurs dans 19 %, anormal
pour EGFR seulement dans 7 % et anormal pour c-erbB-2 seulement dans 36 % des cas.
Résultats FISH EGF-R normal (n = 51) EGF-R anormal (n = 18)
c-erbB-2 normal (n = 31) 38 % 7%
c-erbB-2 anormal (n = 38) 36 % 19 %
3.1.2.1.4. Conclusions
Si la majorité des CBNPC réséqués présentent des « anomalies géniques » au sens
large du terme d’EGF-R et/ou de c-erbB-2, une amplification de ces gènes n’est présente que
dans une minorité d’entre eux et n’est pas parfaitement corrélée à l’expression protéique. La
survie des patients dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-erbB-2 ou manifeste une
anomalie de ces gènes est plus courte sans différence statistiquement significative avec les
patients dont la tumeur ne présente pas ces anomalies (12).
3.1.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67
EGF-R et c-erbB-2 jouent un rôle dans la progression des CBNPC. Cependant, les
relations entre EGF-R et c-erbB-2 et d’autres facteurs impliqués dans cette progression
tumorale ne sont pas bien compris. L’objectif de ce travail est de corréler l’expression de ces
marqueurs avec la prolifération tumorale.
3.1.2.2.1. Population étudiée.
Des 129 patients consécutifs ayant été traités chirurgicalement pour un cancer
bronchique de novembre 1992 à juillet 2000, 104 étaient éligibles pour cette étude car il restait
assez de matériel pour réaliser les trois immunomarquages. Après résection chirurgicale, les
tissus étaient fixés dans du tampon formaline 10 % puis enrobés en paraffine.
3.1.2.2.2. Immunohistochimie
Pour Ki-67, les lames ont été déparaffinées dans du xylène et les tissus réhydratés dans
des solutions aqueuses comprenant des concentrations croissantes d’éthanol. L’antigène a été
démasqué en le chauffant dans du tampon citrate 0,01 M pH 6 3 x 5 min au four à micro-ondes
à 600 W. Les lames sont ensuite restées pendant 25 min à l’air ambiant avant d’être rincées
deux fois dans du tampon TRIS-HCl 0,005 M pH 7,6 en NaCl 0,9 % pendant 10 min. Toutes
les étapes suivantes ont été réalisées automatiquement à 37 °C dans le système NexES
(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA). La peroxydase endogène a ensuite été inhibée
41
par incubation dans du peroxyde d’hydrogène 0,3 % pendant 4 min à température ambiante.
Les anticorps murins monoclonaux anti-Ki-67 donnant un marquage nucléaire (clone MIB-1 de
Neomarkers, Union City, USA ; dilution 1/50, titration finale 1,9 µg/ml) ont ensuite été
déposés et les lames ont été incubées pendant 30 min. Le complexe entre Ki-67 et l’anticorps a
été fixé avec du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %. L’anticorps secondaire a incubé pendant 8 min.
Pour EGF-R et c-erbB-2, le protocole de marquage décrit plus haut a été appliqué (voir
3.1.2.1.1.1.).
Les contrôles négatifs ont été réalisés en omettant l’anticorps primaire et par
substitution de celui-ci avec une Ig normale de souris. Les contrôles positifs externes étaient
du tissu de cancer bronchique positif pour EGF-R, du tissu de cancer du sein positif pour Ki-
67 et c-erbB-2.
3.1.2.2.3. Evaluation du marquage.
Le taux de positivité a été exprimé en pourcentage de cellules présentant un marquage
membranaire (pour EGF-R) ou nucléaire (pour Ki-67) et les lames ont été considérées comme
positives pour le marqueur quand ≥ 1 % des cellules étaient marquées.
Pour c-erbB-2, la classification appliquée dans le cancer du sein et décrite plus haut a
été adoptée (voir 3.1.2.1.1.1.).
3.1.2.2.4. Statistiques.
L’analyse statistique a été réalisée grâce à des tests de Mc Nemar pour comparer les
taux de positivité entre deux variables binaires. Les distributions des variables biologiques ont
été comparées selon l’histologie par les tests de Mann-Whitney. La survie a été mesurée à partir
de la date de la chirurgie et les distributions de survie estimées selon la méthode de Kaplan-
Meier. Les comparaisons des survies ont été réalisées par un test du logrank bilatéral.
3.1.2.2.5. Résultats.
Quatre-vingt-six hommes et dix-huit femmes ayant bénéficié d’une résection
chirurgicale de CBNPC ont été inclus. Selon la classification de l’OMS de 1998, 49 patients
présentaient un adénocarcinome, 47 un carcinome épidermoïde et 8 un autre type
histologique. La majorité des patients présentaient une maladie limitée: 62 stades I, 26 stades
II, 15 stades III et 1 stade IV.
Le taux de marquage d’EGF-R variait entre 0 et 100% (médiane 0%) et était plus élevé
dans les carcinomes épidermoïdes (7% de médiane, variant de 0 à 100%) que dans les
adénocarcinomes (0% de médiane, variant de 0 à 100%) (p< 0,001). Quarante-deux % des
tumeurs étaient positives pour EGF-R.
42
Vingt-deux % des tumeurs étaient positives pour c-erbB-2 avec une différence
statistiquement significative entre les adénocarcinomes (30%) et les carcinomes épidermoïdes
(15%) (p=0,05).
L’expression de Ki-67 variait entre 0 et 92% (médiane 20 %) et était plus élevée dans
les carcinomes épidermoïdes (33,3%) que dans les adénocarcinomes (8,3 %) (p < 0,001) ; au
total, 97 % des tumeurs étaient positives pour Ki-67.
En considérant les variables comme continues, nous n’avons pas pu mettre en évidence
de corrélation entre EGF-R et Ki-67 (r = 0,0026; p = 0,97). En dichotomisant les variables
(positif versus négatif), nous avons observé que la surexpression d’EGF-R diffère en fonction
de la positivité de Ki-67 (p < 0,001), ainsi qu’en fonction du statut c-erbB-2 (p < 0,001) et que
celle de c-erbB-2 diffère en fonction de celle de Ki-67 (p < 0,001) (tableau 13).
Tableau 13 : Etude de l’expression d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 dans les CBNPC opérés
N cas Ki-67 positif Ki-67 négatif c-erbB-2 positif c-erbB-2 négatif
EGF-R positif 41 3 12 32
EGF-R négatif 60 0 11 49
Ki-67 positif - - 22 79
Ki-67 négatif - - 1 2
Le suivi médian était de quarante-huit mois. Soixante-deux patients étaient décédés au
moment de l’analyse. La survie médiane était de 53 mois sans différence significative selon le
statut EGF-R et c-erbB-2: 49 mois pour les tumeurs EGF-R positives et 55 pour les négatives
(p = 0,42), 18 mois pour les tumeurs c-erbB-2 positives et 55 pour les négatives (p = 0,76).
Cependant, une différence significative a été mise en évidence selon l’expression de Ki-67: 54
mois pour les tumeurs Ki-67 positives et 95 pour les négatives (p < 0,005).
3.1.2.2.6. Conclusions
Aucune corrélation n’a été mise en évidence entre l’expression d’EGF-R et c-erbB-2
et la prolifération tumorale évaluée par Ki-67 (13). L’expression de Ki-67 est associée à une
mauvaise survie dans les CBNPC.
3.1.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées
Dans la plupart des études publiées, les paramètres biologiques sont évalués par
immunohistochimie sur des tissus fixés au formol et conservés en paraffine obtenus lors de la
43
résection chirurgicale de la tumeur primitive. Avant de pouvoir étudier ces marqueurs sur des
biopsies provenant de tumeurs plus avancées pour lesquelles une pièce opératoire est souvent
absente, nous avons d’abord exploré si, chez des patients opérés, l’expression de marqueurs
sur des petites biopsies obtenues avant la chirurgie par des techniques non chirurgicales (par
bronchoscopie) est corrélée à celle observée sur les pièces chirurgicales de patients. Dans un
deuxième temps nous avons étudié l’expression d’EGF-R dans un groupe plus homogène de
CBNPC : les stades III.
3.1.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs
Le but de notre étude est de rechercher si l’expression de marqueurs biologiques
évaluée par immunohistochimie sur les biopsies bronchiques est corrélée à celle observée sur
du matériel chirurgical.
3.1.3.1.1. EGF-R
Comme première étude, nous avons évalué l’expression d’EGF-R sur les biopsies et sur
les tumeurs réséquées correspondantes.
3.1.3.1.1.1. Matériel et méthode
Nous avons recherché les patients opérés d’un CBNPC chez lesquels une biopsie
préopératoire donnant le diagnostic de CBNPC était disponible. La même cohorte de 129
patients opérés décrite plus haut a été étudiée. Soixante-huit de ces cas ont eu un diagnostic
anatomopathologique préopératoire de cancer bronchique dans notre institution. Parmi ces
patients, le diagnostic préopératoire avait été réalisé sur des prélèvements cytologiques dans
16 cas et 3 patients avaient reçu de la chimiothérapie néoadjuvante; ces 19 cas ont été exclus
de l’analyse. De plus, pour 22 patients, le tissu (biopsique et/ou chirurgical) n'était plus
disponible en quantité suffisante pour réaliser un immunomarquage. Dès lors, 27 patients
étaient évaluables en terme de biopsie obtenue par bronchoscopie et de prélèvement
chirurgical. Tous les prélèvements ont été fixés dans du formol 10 % et conservés dans la
paraffine.
3.1.3.1.1.2. Interprétation des résultats immunohistochimiques
Le même protocole de marquage que celui décrit au point 3.1.2.1.1.1. a été appliqué.
Le pourcentage de cellules positives tumorales a été évalué de façon semi-quantitative à
grossissement 200 sur l'ensemble de la lame: seul le marquage membranaire a été pris en
compte. Pour les pièces opératoires, un seul bloc a été évalué. Les lames ont été considérées
positives si plus de 1% des cellules étaient marquées sans tenir compte de l'intensité du
marquage. D'autre part, pour évaluer un autre seuil et comme validé pour les récepteurs
44
hormonaux dans les tumeurs mammaires, un score EGF-R combinant un score de proportion
plus un score d'intensité a été calculé. Le score de proportion comporte 5 groupes: 0 = pas de
cellules marquées; 1 = <1/100 cellules marquées; 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées; 3 = 1/10
à 1/3 cellules marquées; 4 = 1/3 à 2/3 cellules marquées et 5 > 2/3 cellules marquées. Le score
d'intensité du marquage a été divisé en 4 catégories (0 = pas de marquage; 1 = marquage faible;
2 = marquage modéré et 3 = marquage intense). Les prélèvements ont été considérés comme
positifs si le score global atteignait minimum 4 afin de considérer un minimum de 10 % de
cellules marquées avec une intensité minimale de 1.
3.1.3.1.1.3. Statistiques
La corrélation entre l’expression d’EGF-R sur les biopsies et les pièces chirurgicales a
été mesurée par le coefficient de Spearman. Des tests de Wilcoxon ont été utilisés pour
comparer le marquage d’EGF-R sur les biopsies et les pièces chirurgicales. Des tests de Mann
Whitney ont été utilisés pour comparer la distribution d’EGF-R en fonction de l’histologie.
Pour évaluer la concordance entre les biopsies et les tumeurs, nous avons également réalisé des
évaluations sur des variables binaires par des tests de Mc Nemar et par le calcul de coefficients
d’agrément kappa en considérant uniquement la positivité des résultats sur les biopsies et les
tumeurs. Une probabilité de signification bilatérale p inférieure à 0,05 a été considérée comme
significative. Nous avons également recherché si un seuil autre que 1 % ou 10 % de cellules
positives pour les biopsies pouvait être plus adéquat pour conclure à la positivité (plus de 1 %
ou 10 % des cellules marquées) de la tumeur en utilisant une courbe ROC.
3.1.3.1.1.4. Résultats
La population de patients étudiés consiste en 22 hommes et 5 femmes d’âge médian de
60 ans. Les types histologiques sont : 15 carcinomes épidermoïdes, 11 adénocarcinomes et 1
tumeur à grandes cellules de type neuroendocrine. Dix-sept patients présentent un stade I, 6 un
stade II et 4 un stade III. Le pourcentage moyen de cellules néoplasiques positives pour EGF-R
est de 11 % sur les pièces chirurgicales et de 28 % dans les biopsies (p = 0,02).
En utilisant le seuil de 1 % de cellules marquées pour EGF-R, 55% des biopsies sont
considérées comme positives. Avec ce même seuil, 48% des tumeurs réséquées sont
considérées comme positives pour l’expression d’EGF-R. Si l’on considère que les résultats
trouvés sur la tumeur opérée sont les plus corrects, lorsque l’on compare les résultats de
marquage immunohistochimique d’EGF-R obtenus sur des biopsies avec ceux obtenus sur les
tumeurs réséquées, on retrouve 4 % de faux négatifs et 11 % de faux positifs sur les biopsies
avec 85 % de résultats concordants entre les biopsies et les tumeurs réséquées (tableau 14). Le
taux de positivité n’est pas statistiquement différent entre les biopsies et les pièces chirurgicales
45
(p = 0,63). La valeur prédictive positive des biopsies est de 80 % et la valeur prédictive
négative de 92 %. Une corrélation significative (coefficient de Spearman r = 0,67; p = 0,0001)
est observée entre les biopsies et les tumeurs réséquées.
En utilisant le seuil de 4 pour le score EGF-R, 45 % des biopsies et 33 % des tumeurs
sont considérées comme positives pour EGF-R. On retrouve ainsi 67 % de résultats
concordants entre les biopsies et les tumeurs réséquées, 22 % de faux positifs et 11 % de faux
négatifs sur les biopsies (si l’on considère que les résultats trouvés sur la tumeur opérée sont les
plus corrects). Le taux de positivité n'est pas statistiquement différent entre les biopsies et les
pièces chirurgicales (p = 0,36). La valeur prédictive positive des biopsies est de 60 % et la
valeur prédictive négative de 80 %. Une corrélation significative (coefficient de Spearman r =
0,60; p = 0,0008) est observée entre les biopsies et les tumeurs réséquées pour l’expression
d’EGF-R.
En utilisant une courbe ROC, l’aire sous la courbe est estimée à 0,88 (significativement
différente de 0,5: p < 0,001; intervalle de confiance à 95 %: 0,74-1,00). Le seuil optimal est 0,
ce qui signifie que quand une biopsie est positive, on peut conclure que la tumeur est positive
avec une sensibilité de 92 % et une spécificité de 79 %.
3.1.3.1.1.5. Conclusions
Cette étude démontre que les biopsies peuvent donner des informations suffisantes sur
le statut d’EGF-R dans le cancer bronchique. En utilisant un seuil de 1 % de cellules marquées,
nous avons observé 85 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les pièces
chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et négatifs
et de bonnes valeurs prédictives positive et négative (14).
3.1.3.1.2. C-erbB-2 et Ki-67
Afin de voir si les résultats obtenus pour EGF-R étaient généralisables, nous avons
décidé d’explorer les autres marqueurs que nous étudions: Ki-67 et c-erbB-2.
3.1.3.1.2.1. Immunohistochimie
Pour c-erbB-2 et Ki-67, les techniques de marquage décrites plus haut ont été
appliquées (voir 3.1.2.1.1.1. et 3.1.2.2.2.).
3.1.3.1.2.2. Résultats
Vingt-huit et vingt-six paires biopsies/tumeurs étaient respectivement évaluables pour
Ki-67 et c-erbB-2.
Le pourcentage moyen de cellules positives (> 1 % des cellules marquées) pour Ki-67
était de 32 % dans les tumeurs réséquées et 14 % dans les biopsies. Nous avons observé 82 %
46
de résultats concordants entre les biopsies et les tumeurs, 14 % de faux négatifs et 4 % de faux
positifs sur les biopsies. La valeur prédictive positive des biopsies était de 96 %.
Huit % des biopsies et 19 % des tumeurs réséquées étaient considérées comme
positives pour c-erbB-2 (tumeurs 2 ou 3+). Nous avons observé 15 % de faux négatifs et 4 %
de faux positifs sur les biopsies avec 81 % de résultats concordants. La valeur prédictive
négative de la biopsie était de 83 % (tableau 14).
Tableau 14: Etude de l’expression d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 sur les biopsies
bronchiques et sur les tumeurs bronchiques réséquées correspondantes : nous avons
observé plus de 80 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les pièces
chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et
négatifs et de bonnes valeurs prédictives positive et négative. Ces données démontrent que
l’évaluation de ces marqueurs peut être réalisée sur de petites biopsies bronchiques.
EGF-R c-erbB-2 Ki-67 Résultats concordants 85% 81% 82% Faux négatifs 4% 15% 14% Faux positifs 11% 4% 4% Valeur prédictive positive 80% NA 96% Valeur prédictive négative 92% 83% NA
3.1.3.1.2.3. Conclusions
Comme pour EGF-R, nous avons donc observé une concordance satisfaisante entre les
biopsies et les tumeurs réséquées pour les immunomarquages de c-erbB-2 et Ki-67 (15).
3.1.3.2. EGF-R dans les stades III
Afin d’évaluer l’impact de l’expression d’EGF-R dans un groupe plus homogène de
CBNPC à un stade avancé, nous avons étudié sa valeur pronostique dans les CBNPC de stade
III. La classification internationale de 1997 sépare les patients de stade III en stade IIIA et
IIIB. Ce groupe de patients est hétérogène et inclut des patients dont la tumeur est résécable
chirurgicalement et des patients avec des tumeurs irrésécables qui bénéficient de chimio-
et/ou de radiothérapie. Précédemment (16;17), nous avons observé que la répartition des
stades III en stades ΙΙΙβ (T3-4N3M0) et ΙΙΙα (les autres stades III) discrimine mieux les
patients en terme de survie que la classification standard. Dès lors, cette classification IIIαβ a
été utilisée également dans cette étude.
47
3.1.3.2.1 Matériel et méthodes
Nous avons recherché les biopsies de tous les patients présentant un CBNPC au stade III
non préalablement traités.
3.1.3.2.2. Immunohistochimie
L’immunohistochimie a été réalisée comme décrit plus haut (voir 3.1.2.1.1.1.).
3.1.3.2.3. Statistiques
La survie a été mesurée depuis la date du diagnostic. L’analyse univariée pour la
comparaison de survie a été réalisée selon un test du logrank. Toutes les variables avec une
probabilité de signification inférieure ou égale à 0,2 en analyse univariée ont été incluses dans
un modèle de Cox pour l’analyse multivariée. La comparaison des caractéristiques des patients
selon le statut EGF-R a été réalisée par un test de chi-carré en cas de variable binaire ou selon
un test de Mann-Whitney. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement
significative.
3.1.3.2.4. Résultats
De janvier 1987 à juillet 2002, 298 patients consécutifs avec un CBNPC de stade III ont
été traités dans notre département d’oncologie thoracique. Chez 175 d’entre eux, les biopsies
avaient été réalisées dans une autre institution et étaient indisponibles pour un marquage par
immunohistochimie. Dans 17 cas, il n’y avait plus de tissu tumoral dans le bloc. Sept autres
patients ont été exclus parce qu’ils n’ont pas été traités ou parce qu’ils avaient reçu un
traitement dans une autre institution. Nonante-neuf patients étaient donc évaluables. La
majorité des patients ont été traités par chimiothérapie seule (n = 40) ou avec une association (n
= 42) incluant de la chimiothérapie et de la radiothérapie (n = 36) ou de la chirurgie avec ou
sans radiothérapie (n = 6). Les autres patients ont reçu de la radiothérapie exclusive (n = 15) ou
de la chirurgie seule (n = 2). Une chimiothérapie à base de cisplatine ou de carboplatine a été
administrée chez 71 et 5 patients, respectivement. Le taux de réponse à la thérapie d’induction
a été de 39,4 %.
Respectivement, septante-six et vingt-trois tumeurs étaient négatives ou positives pour
EGF-R. Au total, le taux de positivité était de 23,2 %. Il était de 39,6 % pour les carcinomes
épidermoïdes et de 7,8 % pour les autres histologies (p = 0,0002). L’expression d’EGF-R en
fonction des caractéristiques des patients est décrite dans la tableau 15. Excepté pour
l’histologie, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les tumeurs EGF-R
positives ou négatives.
La durée médiane de suivi était de 78,4 mois. Au moment de l’analyse, 10 patients
étaient toujours en vie, 83 décédés et 6 perdus de vue. Les survies à 1, 2, 3 et 4 ans étaient
48
respectivement de 51,6 %, 19,8 %, 9,1 % et 2,4 %. Les résultats d’analyse univariée pour la
survie sont rapportés tableau 16. Un bon indice de performance, un traitement chirurgical, un
taux d’hémoglobine et de sodium normal et le stade T étaient associés statistiquement à une
meilleure survie. En plus de ces 5 variables, celles ayant une probabilité de signification
inférieure ou égale à 0,2 en analyse univariée (la perte de poids, le taux de neutrophiles et de
plaquettes, le taux de LDH sérique et la créatininémie) ont été incluses dans un modèle de Cox
multivarié. Quatre-vingt-trois observations étaient complètes. Trois variables étaient
indépendamment associées à la survie en analyse multivariée : un bon indice de performance (p
= 0,006), la résection chirurgicale (p = 0,007) et le taux de créatinine (p = 0,02).
La même analyse a été réalisée dans les tumeurs positives et négatives pour EGF-R,
séparément. Pour les tumeurs EGF-R positives (n = 23), seule la résection chirurgicale était
associée avec un avantage en termes de survie en analyse univariée (p = 0,01). Dans les
tumeurs négatives pour EGF-R (n = 76), un bon indice de performance (p = 0,004), la résection
chirurgicale (p = 0,0002), une créatininémie basse (p = 0,04), une natrémie normale (p = 0,02)
et un stade T1-T2 (p = 0,01) étaient associés à une meilleure survie en analyse univariée.
Toutes les variables avec une probabilité de signification inférieure ou égale à 0,2 en analyse
univariée ont été entrées dans un modèle de Cox. En analyse multivariée, la résection
chirurgicale (p = 0,02) et l’indice de performance (p = 0,03) étaient associés significativement à
la survie.
3.1.3.2.5. Conclusions
EGF-R n’est pas un facteur pronostique significatif pour la survie dans le sous-groupe
des patients atteints d’un CBNPC au stade III (18).
49
Tableau 15: Etude de l’expression d’EGF-R chez les patients présentant un CBNPC au
stade III : 23,2 % des tumeurs surexpriment EGF-R. Les caractéristiques des patients en
fonction du statut d’EGF-R sont similaires excepté pour l’histologie (39,6% de positivité pour
les carcinomes épidermoïdes et 7,8% pour les autres histologies).
EGF-R + EGF-R - p
Tous 23 76
IIIA/IIIB 9/14 31/45 0,89
IIIα/IIIβ 19/3 61/12 0,75
IP
80-100
60-70
<60
15
6
1
39
27
6
0,30
Age
≤ 60 ans
> 60 ans
7
16
25
51
0,83
Sexe
Hommes
Femmes
18
5
57
19
0,75
Histologie
Epidermoïdes
Non- épidermoïdes
19
4
29
47
0,0002
Perte de poids
≤ 5%
> 5%
15
6
51
18
0,82
50
Tableau 16 : Etude de la survie chez les patients présentant un CBNPC au stade III :
l’analyse univariée pour la survie des 99 patients a montré qu’un bon IP, un traitement
chirurgical, un taux d’hémoglobine normal, une natrémie normale et le stade T étaient associés
statistiquement à une meilleure survie alors que le statut EGF-R ne modifiait pas le pronostic.
SM (jours) N patients N décès p EGF-R négatifs EGF-R positifs
371 411
76 23
65 18
0,26
IIIA IIIB
408 332
40 59
35 48
0,36
III α
III β
413 140
80 15
67 13
0,25
T1-T2 T3-T4
448 263
41 54
32 48
0,05
N0-2 N3
413 215
68 30
59 23
0,41
IP 80-100 < 80
500 220
54 40
43 36
0,001
Age ≤ 60 ans > 60 ans
424 375
32 67
28 55
0,57
Hommes Femmes
400 310
75 24
62 21
0,37
Perte de poids ≤ 5% > 5%
416 219
66 24
55 21
0,13
Epidermoïdes Non-épidermoïdes
420 332
48 51
41 42
0,46
Chirurgie : Oui Non
1085 365
8 91
4 79
0,00002
PMN ≤ 7500/mm³ > 7500/mm³
403 332
67 32
55 28
0,15
Plaquettes ≤ 44.104/mm³ > 44.104/mm³
401 199
78 21
64 19
0,07
Hémoglobine 12-18 g/dl < 12 g/dl
401 216
71 28
59 24
0,03
LDH ≤ 200 mUI/ml > 200 mUI/ml
419 311
67 31
53 29
0,07
Créatininémie ≤ 0,9 mg/dl > 0,9 mg/dl
412 288
70 29
55 28
0,07
Calcémie 8,5-10,3 mg/dl <8,5 ou > 10,3 mg/dl
383 370
89 9
73 9
0,31
Natrémie 135-146 mEq/l < 135 ou > 146 mEq/l
404 147
83 16
68 15
0,01
Bilirubine ≤ 0,5 mg/dl > 0,5 mg/dl
381 383
64 35
55 28
0,59
51
3.2. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
La fumée de tabac induit des anomalies génétiques au sein de la muqueuse
bronchique. Celles-ci sont diffusément réparties dans les voies respiratoires et sont
responsables d’apparition de tumeurs successives (19). Le système endoscopique LIFE (Light
Induced Fluorescence Endoscopy), basé sur l’autofluorescence des muqueuses bronchiques,
permet la mise en évidence de lésions prénéoplasiques et néoplasiques précoces à différents
stades : hyperplasie, métaplasie, dysplasie (légère, modérée et sévère), carcinome in situ et
cancer micro-invasif avec une sensibilité nettement meilleure que celle de la bronchoscopie
ordinaire en lumière blanche (20). Nos patients bénéficient donc de cet examen dans le bilan
préopératoire et le suivi du cancer bronchique (et ORL) opéré ainsi que pour le dépistage de
cancer bronchique. Pour être inclus pour le LIFE, les patients doivent avoir fumé au minimum
30 paquets de cigarettes-années et/ou avoir une histoire de cancer bronchique ou de la tête et
du cou. La bronchoscopie en fluorescence a été réalisée sous anesthésie locale et toutes les
zones anormales en fluorescence et en lumière blanche ont été biopsiées. Cette technique nous
a permis de constituer une banque de biopsies représentatives des différents stades
prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons ensuite réalisé les études décrites ci
dessous.
3.2.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
3.2.1.1 Population étudiée
Cent vingt-quatre patients ayant bénéficié d'une bronchoscopie en fluorescence entre
février 1996 et octobre 2001 (98 hommes et 26 femmes, de 63 ans d'âge médian) ont été
inclus dans l’étude. Plusieurs biopsies ont été réalisées chez chaque patient; seule la lésion
avec le grade histologique le plus avancé a été prise en compte de sorte que chaque patient n'a
été inclus qu'une seule fois dans l'étude.
3.2.1.2. Préparation des échantillons et immunohistochimie
Toutes les biopsies ont été fixées en routine dans un formol 10 % tamponné,
immédiatement après la bronchoscopie (pendant minimum 3 et maximum 10 heures) et ont
été enrobées dans la paraffine. Pour chaque bloc, des sections de 5 µm ont été coupées à partir
des blocs de paraffine et déposées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel-Gläser,
Braunschwein, Allemagne). Toutes les lésions marquées à l'hématoxyline éosine ont été
classifiées selon la classification histologique OMS/IASLC des lésions bronchiques pré-
invasives.
52
Le protocole d’immunohistochimie décrit précédemment et utilisé pour les tumeurs
invasives a été appliqué (voir 3.1.2.1.1.1.).
3.2.1.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques
Les lésions bronchiques ont été évaluées par un score de proportion et un score
d'intensité. Le score de proportion a été défini comme suit: 0 = pas de marquage ou marquage
de la couche basale uniquement; 1+ = marquage des cellules basales et suprabasales (maximum
dans le tiers inférieur de l'épaisseur de l'épithélium); 2+ = marquage des cellules dans les deux-
tiers inférieurs de l'épaisseur de l'épithélium; 3+ = marquage des cellules dans toute l'épaisseur
de l'épithélium (figure 8). L'intensité du marquage a été évaluée comme suit: 0 = pas de
marquage, 1 = intensité comparable à celle de l'épithélium bronchique normal, 2 = intensité
plus forte que l'épithélium bronchique normal, 3 = intensité aussi forte que le contrôle positif de
cancer bronchique. Un score EGF-R global a ensuite été calculé: il correspond à la somme du
score de proportion et du score d'intensité.
3.2.1.4. Statistiques
Nous avons regroupé les lésions bronchiques en 5 catégories selon l'histologie: groupe
1 = épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =
dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs microinvasives.
En terme de score de proportion, nous avons comparé deux catégories: les lésions 0 et 1+
versus 2+ et 3+. En terme d'intensité, nous avons dichotomisé les lésions en 2 groupes:
intensités 0 et 1 versus intensités 2 et 3. En ce qui concerne le score global EGF-R, nous
avons dichotomisé les lésions entre celles ayant un score < 5 et celles avec un score ≥ 5 afin
d'avoir au minimum une proportion de marquage de 2/3 de l'épaisseur de l'épithélium avec
une intensité de grade 3 ou un marquage des 3/3 de l'épithélium avec une intensité de grade 2.
Les comparaisons d’expression d’EGF-R entre les différents groupes ont été réalisées par des
tests de chi-carré ou des tests exacts de Fisher quand il y avait trop peu de cas par catégorie.
53
Figure 8: Exemple d'immunomarquage EGF-R des lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces A B
C D
E
A. Hyperplasie des cellules basales: EGF-R est présent dans la couche basale de l'épithélium mais pas dans les couches plus superficielles
B. Transition de l'hyperplasie des cellules basales au carcinome in situ: dans l'hyperplasie, EGF-R est présent dans la couche basale de l'épithélium mais pas dans les couches plus superficielles; dans le carcinome in situ, EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium
C. Dysplasie sévère: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium D. Carcinome in situ: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium E. Tumeur micro-invasive: EGF-R est présent dans toutes les couches de l'épithélium
54
3.2.1.5. Résultats
Sur les 124 patients éligibles, nous disposions de matériel biopsique en quantité
suffisante pour réaliser le marquage immunohistochimique d'EGF-R chez 94 patients (74
hommes et 20 femmes). L'âge médian des patients était de 63 ans. Vingt-huit patients étaient
fumeurs, quarante-neuf ex-fumeurs, deux non-fumeurs et, pour quinze d'entre eux, les
habitudes tabagiques n’étaient pas connues. La bronchoscopie de photodétection a été réalisée
dans le cadre d'un dépistage de cancer bronchique pour 20 patients ; chez 14 patients lors d’un
bilan pré-opératoire de cancer bronchique (10 patients) ou cervicofacial (4 patients) ; dans le
suivi d'un cancer bronchique guéri chez 40 patients ou dans le suivi d'un CIS chez 14 patients
et dans 6 cas pour des raisons diverses. Les prélèvements suivants ont été étudiés: 13
épithéliums bronchiques normaux, 19 hyperplasies, 16 métaplasies, 10 dysplasies légères, 1
dysplasie modérée, 10 dysplasies sévères, 14 CIS et 11 tumeurs microinvasives.
L'immunomarquage pour EGF-R était observé dans la couche cellulaire basale de
l'épithélium bronchique normal. Il était visible dans la couche basale mais pas dans les
couches plus superficielles de l'épithélium hyperplasique. Sept des seize métaplasies
présentaient un marquage positif pour EGF-R étendu plus haut que la couche basale mais
seulement deux cas (12 %) avaient un marquage des 3 tiers de l'épithélium. Toutes les
dysplasies légères et modérées présentaient un marquage semblable à l'épithélium normal. Six
des dix dysplasies sévères (60 %) avaient un marquage positif de toute l'épaisseur de
l'épithélium. L'épaisseur de tout l'épithélium de la majorité des CIS (86 %) et des tumeurs
microinvasives (82 %) était positive pour EGF-R (tableau 17). Cette différence de répartition
du marquage entre les stades de lésions bronchiques est statistiquement significative (chi carré
p < 0,001). Lorsque les données sont analysées en fonction des groupes définis dans la partie
statistique, il n'y a pas de différence de positivité entre les groupes histologiques 1 et 2 (p =
0,58) ni entre les groupes 4 et 5 (p = 1) mais il y a une différence statistiquement significative
entre les groupes 2 et 4 (p = 0,01).
Un grade d'intensité de marquage 2 ou 3 a été obtenu dans 1 (6 %) métaplasie, dans
aucune des dysplasies légères ou modérées, dans 6 (60 %) dysplasies sévères, dans 6 (43 %)
CIS et dans 6 (55 %) tumeurs microinvasives (test chi carré p < 0,001) (tableau 18). Il n'y a
pas de différence significative d'intensité entre les groupes histologiques 1 et 2 (p = 1) ni entre
les groupes 4 et 5 (p = 0,71) mais il y a une différence statistiquement significative entre les
groupes 2 et 4 (p = 0,006).
55
Tableau 17: Localisation de la positivité du marquage EGF-R dans les lésions
bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: l'immunomarquage pour EGF-R
est observé dans la couche cellulaire basale de l'épithélium bronchique normal. Il est visible
dans la couche basale mais pas dans les couches plus superficielles de l'épithélium
hyperplasique. Sept des seize métaplasies présentent un marquage positif pour EGF-R étendu
plus haut que la couche basale et deux cas ont un marquage des 3/3 de l'épithélium. Toutes les
dysplasies légères et modérées présentent un marquage semblable à l'épithélium normal. Six
des 10 dysplasies sévères ont un marquage positif de toute l'épaisseur de l'épithélium.
L'épaisseur de tout l'épithélium de la majorité des CIS et des tumeurs microinvasives est
positive pour EGF-R.
Types de lésions
Groupe Nombre de
cas
0 1+ 2+ 3+
Normaux 1 13 13 0 0 0
Hyperplasies 1 19
19 0 0 0
Métaplasies 1 16 9 1 4 2
Dysplasies légères 2 10 10 0 0 0
Dysplasies modérées 3 1 1 0 0 0
Dysplasies sévères 4 10 3 1 0 6
CIS 5 14 2 0 0 12
Tumeurs micro-
invasives
5 11 2 0 0 9
0= pas de marquage ou marquage de la couche basale uniquement
1+ = marquage des cellules de la couche basale et de la région suprabasale (maximum le 1/3
inférieur de l’épithélium
2+ = marquage de cellules jusqu’à 2/3 de l’épaisseur de l’épithélium
3+ = marquage de cellules dans les 3/3 de l’épaisseur de l’épithélium
Les lésions bronchiques ont été catégorisées en 5 groupes selon l'histologie: groupe 1 =
épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =
dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.
56
Tableau 18: Intensité du marquage EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques
et néoplasiques précoces: un grade d'intensité de marquage 2 ou 3 a été observé dans 6 %
des métaplasies, dans aucune des dysplasies légères ou modérées, dans 60 % des dysplasies
sévères, dans 43 % des CIS et dans 55 % des tumeurs micro-invasives
Types de lésions
Groupe Nombre de
cas
0 1 2 3
Normaux 1 13 0 13 0 0
Hyperplasies 1 19 4 15 0 0
Métaplasies 1 16 0 15 0 1
Dysplasies légères 2 10 0 10 0 0
Dysplasies modérées 3 1 0 1 0 0
Dysplasies sévères 4 10 1 3 4 2
CIS 5 14 2 6 6 0
Tumeurs micro-
invasives
5 11 2 3 2 4
0 = pas de marquage
1 = intensité de marquage comme l’épithélium bronchique normal
2 = marquage plus fort que l’épithélium bronchique normal
3 = marquage aussi fort que le contrôle positif de tumeur bronchique
Les lésions bronchiques ont été catégorisées en 5 groupes selon l'histologie: groupe 1 =
épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 =
dysplasie modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.
57
Tableau 19: Score EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques
précoces: un score EGF-R global supérieur ou égal à 5 a été obtenu dans 16 % des
métaplasies, dans aucune des dysplasies légères ni dans la dysplasie modérée, dans 60 % des
dysplasies sévères, dans 43 % des CIS et dans 55 % des tumeurs microinvasives
Types de lésions
Groupe Nombre
de cas 0 1 2 3 4 5 6
Normaux 1 13 0 13 0 0 0 0 0
Hyperplasies 1 19 4 15 0 0 0 0 0
Métaplasies 1 16 0 9 1 4 1 0 1
Dysplasies légères 2 10 0 10 0 0 0 0 0
Dysplasies modérées 3 1 0 1 0 0 0 0 0
Dysplasies sévères 4 10 1 2 1 0 0 4 2
CIS 5 14 2 0 0 0 6 6 0
Tumeurs micro-
invasives
5 11 2 0 0 0 3 2 4
Le score EGF-R a été obtenu en faisant la somme du score de positivité et du score d’intensité.
Les lésions bronchiques ont été catégorisées en 5 groupes selon l'histologie: groupe 1 =
épithelium normal, hyperplasie et métaplasie; groupe 2 = dysplasie légère; groupe 3 = dysplasie
modérée; groupe 4 = dysplasie sévère et groupe 5 = CIS et tumeurs micro-invasives.
Un score EGF-R global supérieur ou égal à 5 a été obtenu dans 1 (6 %) métaplasie,
dans aucune des dysplasies légères ni dans la dysplasie modérée, dans 6 (60 %) dysplasies
sévères, dans 6 (43 %) CIS et dans 6 (55 %) tumeurs microinvasives (p < 0,001) (tableau 19)
avec les mêmes résultats statistiques que pour l'intensité entre les différents groupes
histologiques.
3.2.1.6. Conclusions
EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les dysplasies sévères et les carcinomes
in situ que dans les lésions de grade moins élevé (21).
58
3.2.2. C-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques
précoces
3.2.2.1. Population étudiée, immunohistochimie
Les critères d’éligibilité et la population de départ pour cette étude étaient similaires à
l’étude précédente sur EGF-R (voir 3.2.1.1.). De même, le protocole de marquage et la
classification histologique utilisée étaient semblables à ceux décrits précédemment (voir
3.1.2.1.1.1.).
3.2.2.2. Résultats
Septante-quatre biopsies provenant de 56 hommes et 18 femmes ont permis
l’évaluation de c-erbB-2. L’âge médian était de 63 ans. Vingt patients étaient fumeurs, 38 ex-
fumeurs, 2 non-fumeurs et, pour 14 d’entre eux les habitudes tabagiques n’étaient pas
connues. La bronchoscopie avait été réalisée chez 15 patients lors d’un dépistage du cancer
bronchique, chez 14 durant le bilan préopératoire d’une tumeur bronchique (10 patients) ou
ORL (4 patients), chez 33 dans le suivi d’un cancer bronchique en rémission ou guéri, chez 8
pour le suivi d’un CIS et chez 4 pour d’autres raisons. Neuf épithéliums bronchiques
normaux, 16 hyperplasies, 12 métaplasies, 12 dysplasies légères, 8 dysplasies sévères, 11 CIS
et 6 tumeurs microinvasives étaient évaluables.
Aucune de ces 74 lésions ne montrait de marquage pour c-erbB-2 (le contrôle positif
montrant bien un marquage 3+).
3.2.2.3. Conclusions
Dans notre étude, c-erbB-2 n’est pas exprimé dans les lésions bronchiques
prénéoplasiques et néoplasiques épidermoïdes précoces (22).
3.2.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
3.2.3.1. Population étudiée
Les critères d’éligibilité pour cette étude étaient similaires à ceux d’EGF-R (voir
3.2.1.1) mais nous avons uniquement étudié 55 biopsies (provenant de 55 patients différents)
gradées à partir du stade de dysplasie et obtenues par bronchoscopie en autofluorescence entre
mars 1996 et novembre 2000.
59
3.2.3.2. Immunohistochimie
L’immunohistochimie a été réalisée selon la méthode décrite précédement pour les
biopsies et les tumeurs réséquées (voir 3.1.2.2.2.).
3.2.3.3. Interprétation des résultats immunohistochimiques
Plusieurs biopsies présentaient différents grades de dysplasies. Pour chaque cas,
l'évaluation immunohistochimique a été réalisée sur la partie de la coupe correspondant à
l'altération histologique la plus grave. Nous avons exclu les régions où la section était coupée
tangentiellement (ce qui peut résulter en la présence de noyaux positifs dans une couche
apparemment superficielle de l'épithélium). Les lymphocytes intraépithéliaux positifs pour
Ki-67 associés à un infiltrat inflammatoire ont été différenciés des cellules épithéliales à plus
fort grossissement.
Le niveau de positivité a d'abord été exprimé en pourcentage de cellules anormales
marquées (23-25). De plus, nous avons appliqué des méthodes déjà utilisées pour classifier
l'activité proliférative observée sur des lésions précancéreuses du col utérin (26) ou du sein
(27) et de lésions cancéreuses. La première évalue la présence d’amas positifs pour Ki-67. Un
"amas" (cluster) étant défini comme un groupe d'au moins 2 cellules contiguës présentant un
noyau fortement marqué pour Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium pathologique. Par
la deuxième, pour chaque lésion, un score Ki-67 global a été calculé en faisant la somme d'un
score de proportion et d'un score d'intensité. Le score de proportion varie de 0 à 5 selon le
pourcentage de cellules positives pour Ki-67: 0 = pas de cellules marquées; 1 = <1/100
cellules marquées; 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées; 3 = 1/10 à 1/3 cellules marquées; 4 =
1/3 à 2/3 cellules marquées et 5 > 2/3 cellules marquées. Le score d'intensité varie de 0 à 3:
0 = pas de marquage; 1 = marquage faible; 2 = marquage modéré et 3 = marquage intense. Un
score Ki-67 global ≥ à 4 a été considéré comme positif. Un exemple de marquage est présenté
figure 9.
3.2.3.4. Statistiques
Des tests de Mann-Whitney et de Kruskall-Wallis ont été utilisés pour comparer la
distribution du pourcentage de cellules positives pour Ki-67 selon les groupes histologiques.
Les comparaisons entre les groupes histologiques et la présence d’amas Ki-67 ont été
réalisées par des tests de chi-carré et des tests de Fisher bilatéraux. Le niveau de signification
choisi était de p ≤ 0,05.
60
Figure 9: Exemple d'immunomarquage Ki-67 des lésions bronchiques prénéoplasiques
et néoplasiques précoces
A, C, E, G: marquage hématoxyline-éosine.
B, D, F, H: l'immunomarquage Ki-67 correspondant
A et B: dysplasie légère
C et D: dysplasie modérée
E et F: dysplasie sévère
G et H: carcinome in situ: noter la désorganisation marquée de la muqueuse bronchique très mince.
Une activité mitotique superficielle est présente.
Des groupes de noyaux de cellules positives pour Ki-67 (flèches) sont observés sur les figures
F et H mais pas sur les figures B et D.
A
H
F
D
G
E
C
B
61
3.2.3.5. Résultats
Sur les cinquante-cinq patients inclus, 45 étaient des hommes et 10 des femmes. L'âge
médian était de 62 ans. Vingt-cinq patients étaient fumeurs actifs, 25 ex-fumeurs et 2 non-
fumeurs. Pour 3 patients, les habitudes tabagiques n'étaient pas connues. La bronchoscopie en
fluorescence était réalisée chez 14 patients pour le dépistage d'un cancer bronchique, chez 10
dans le bilan préopératoire d'un carcinome bronchique (7 patients) ou cervicofacial (3
patients), 15 patients ont bénéficié de biopsies pour le suivi d'un cancer bronchique traité, 7
dans le suivi d'un CIS et 9 pour diverses raisons. Dix-sept DL, 9 DM, 11 DS et 15 CIS ont été
diagnostiqués; pour 3 lésions, aucun consensus sur le grade exact de la lésion n'a pu être
obtenu à cause des artefacts de coupes tangentielles (un cas) ou d'une inflammation très
importante et de la desquamation de l'épithélium de surface (2 cas). Ces 3 lésions ont été
exclues de l'analyse.
Une médiane (distribution) de 10 % (2-80 %), 20 % (5-70 %), 30 % (10-75 %) et 40 %
(30-70 %) de cellules positives pour Ki-67 a été trouvée respectivement dans les DL, DM, DS
et les CIS (tableau 20). L'augmentation de pourcentage de cellules positives pour Ki-67 de la
DL au CIS est statistiquement significative (p = 0,04) mais les distributions observées sont
trop étendues pour discriminer correctement les 4 groupes. Il n'y a pas de différence
significative en terme d’expression de Ki-67 lorsqu’on compare la combinaison du sous-
groupe de DL et de DM avec celle du sous-groupe de DS et des CIS .
Si l'on considère les amas de cellules positives pour Ki-67 dans le tiers supérieur de
l'épithélium, 31 % des DL, 77 % des DM, 91 % des DS et 100 % des CIS ont au moins un
amas Ki-67 en superficie de l'épithélium (tableau 21). Deux ou plus de 2 amas Ki-67 ont été
observés dans 15 % des DL et 22 % des DM, par rapport à 91 % des DS et 94 % des CIS (p <
0,01). Il n'y avait pas de différence entre les DL et les DM ni entre les DS et les CIS quand on
recherchait la présence de 2 ou plus de 2 amas Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium.
Une différence statistiquement significative (p < 0,01) en terme de distribution des amas Ki-
67 a été observée quand on combine les DL avec les DM et les DS avec les CIS. Cette
différence est accentuée quand les lésions sont évaluées pour la présence de 2 ou plus de 2
amas Ki-67.
62
Tableau 20: Etude de l’expression de Ki-67 en terme de pourcentage d’expression dans
les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: l'augmentation de
pourcentage de cellules positives pour Ki-67 de la dysplasie légère au CIS est statistiquement
significative (p = 0,04) mais les distributions observées sont trop étendues pour discriminer
correctement les 4 groupes.
Types de lésions
Nombre de cas
Moyenne de cellules positives pour Ki-67
Médiane de cellules positives pour Ki-67
Distribution
Dysplasies légères
17 16 % 10 % 2-80 %
Dysplasies modérées 9 28 % 20 % 5-70 % Dysplasies sévères 11 38 % 30 % 10-75 % Carcinomes in situ 15 45 % 40 % 30-70 %
Tableau 21: Etude de l’expression de Ki-67 en terme d’amas dans les lésions
bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: on ne trouvait pas de différence
entre les DL et les DM ni entre les DS et les CIS quand on recherchait la présence de 2 ou
plus de 2 amas Ki-67 dans le tiers supérieur de l'épithélium. Une différence statistiquement
significative (p<0,01) en terme de distribution des amas Ki-67 a été observée quand on
combine les DL avec les DM et les DS avec les CIS en 2 groupes. Cette différence est
accentuée quand les lésions sont évaluées pour la présence de 2 ou plus de 2 amas Ki-67.
Types de lésions
Nombre de cas Présence d’amas
1 amas 2 ou plusieurs
amas Dysplasies légères 17 31 % 15 % 15 %
Dysplasies modérées 9 77 % 55 % 22 % Dysplasies sévères 11 91 % 0 % 91 % Carcinomes in situ 15 100 % 6 % 94 %
Quand le score Ki-67 est calculé, 8 dysplasies légères (47 %), 6 modérées (67 %), 10
dysplasies sévères (91 %) et 15 (100 %) CIS ont un score supérieur ou égal à 4 (tableau 22).
A nouveau, il y a une différence statistiquement significative entre le groupe combinant les
dysplasies légères avec les modérées et le groupe combinant les dysplasies sévères plus les
CIS (p=0,05) mais il n'y a pas de différence entre les dysplasies légères et les dysplasies
modérées ni entre les dysplasies sévères et les CIS.
63
Tableau 22: Etude de l’expression de Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques
et néoplasiques précoces: en étudiant le score Ki-67 global qui est la somme du score de
proportion (1) et du score d’intensité (2), on trouve une différence statistiquement
significative entre le groupe combinant les dysplasies légères avec les modérées et le groupe
combinant les dysplasies sévères plus les CIS (p = 0,05) mais il n'y a pas de différence entre
les dysplasies légères et les dysplasies modérées ni entre les dysplasies sévères et les CIS.
Types de
lésions
Nombre
de cas
0 2 3 4 5 6 7 8
DL 17 0 % 18 % 12 % 24 % 29 % 12 % 5 % 0 %
DM 9 0 % 0 % 0 % 33 % 22 % 12 % 33 % 0 %
SD 11 0 % 0 % 0 % 9 % 27 % 27 % 37 % 0 %
CIS 15 0 % 0 % 0 % 0 % 13 % 40 % 47 % 0 %
Le score global est la somme du score (1) et du score (2) :
(1) Le score de proportion varie de 0 à 5 selon le nombre de cellules positives pour Ki-67:
0 = pas de cellule marquée 1 = <1/100 cellules marquées 2 = 1/100 à 1/10 cellules marquées 3 = 1/10 à 1/3 cellules marquées 4 = 1/3 à 2/3 cellules marquées 5 > 2/3 cellules marquées (2) Le score d'intensité varie de 0 à 3: 0 = pas de marquage 1 = marquage faible 2 = marquage modéré
3 = marquage intense
3.2.3.6. Conclusions
Cette étude montre que l'expression de Ki-67 change en fonction du grade des lésions
bronchiques prénéoplasiques en augmentant de la dysplasie légère au CIS. Il existe une
différence statistiquement significative entre le groupe des dysplasies légères et modérées par
rapport à celui des dysplasies sévères et des CIS. Ces résultats suggèrent que, lorsque l'on
64
considère l'activité proliférative, les dysplasies sévères ont un comportement similaire à celui
des CIS et non à celui des dysplasies de bas grade (28).
3.2.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et
néoplasiques précoces
La néoangiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de
l’endothélium de la vascularisation existante. Cette néoangiogenèse est fondamentale dans les
processus de croissance tumorale et de progression tumorale ainsi que dans le développement
de métastases. Quand une tumeur atteint une taille de 1 à 2 mm, sa croissance et son
expansion requièrent l’induction de nouveaux vaisseaux. L’angiogenèse tumorale est un
processus complexe impliquant des facteurs de croissance et des enzymes de la matrice extra-
cellulaire. Ainsi, l’activation d’EGF-R augmente la production de molécules angiogéniques
telles que VEGF. Il en résulte un effet indirect d’EGF-R sur l’angiogenèse. Nous avons voulu
étudier l’association entre les changements morphologiques de l’épithélium bronchique, le
statut angiogénique et l’expression d’EGF-R.
3.2.4.1. Population étudiée
Les critères d’éligibilité et la population étudiée étaient similaires à ceux pris pour
l’étude d’EGF-R (voir 3.2.1.1.).
3.2.4.2. Immunohistochimie
Nous avons utilisé la technique décrite pour EGF-R (voir 3.1.2.1.1.1.).
Pour le comptage des micro-vaisseaux (NMV), un anticorps monoclonal de souris
(IgG1; clone QBEND10 de Immunotech ; Marseille, France ) dirigé contre l’antigène CD34
présent sur les cellules vasculaires endothéliales a été choisi. Le démasquage de l’antigène a été
réalisé par chauffage des lames dans de l’acide citrique monohydrate 0,01 M pH 6, au four à
micro-ondes à 650 W pour 3 durées successives de 5 min. Elles ont ensuite été refroidies
pendant 25 minutes à température ambiante puis rincées deux fois dans du tampon TRIS-HCl
0,05 M NaCl 0,09 % pH 7,6 pendant 10 minutes. Toutes les autres étapes ont été réalisées
automatiquement à 37° C par le système NexES (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ,
USA). La peroxydase endogène a été inhibée par du peroxyde d’hydrogène pendant 4 minutes.
L’anticorps CD34 (titration finale 0,2 mg/ml) a été déposé et a incubé pendant 30 minutes. Le
complexe entre la protéine et l’anticorps a été fixé par du glutaraldéhyde NaCl 0,9 %.
L’anticorps secondaire biotinylé a incubé pendant 8 minutes. Les lames ont été marquées avec
le kit de détection diaminobenzidine (DAB) (Ventana Medical Systems, Tucson AZ, USA) et
65
contre-colorées avec de l’hématoxyline. Les contrôles négatifs ont été réalisés en omettant
l’anticorps primaire.
3.2.4.3. Interprétation de l’immunohistochimie
Pour EGF-R, les critères d’interprétation ont été décrits plus haut. Pour le NMV, un
micro-vaisseau a été défini comme toute cellule endothéliale immunomarquée séparée d’un
micro-vaisseau adjacent, d’une cellule tumorale et d’autres éléments du tissu conjonctif. Le
nombre de micro-vaisseaux CD34 positifs présents dans et sous la lésion a été compté à faible
grossissement (200x) selon la technique de Weidner. En cas de “hotspots” (zones les plus
vascularisées) multiples, la valeur moyenne de deux ou trois aires les plus vascularisées a été
considérée. Des exemples d’immunomarquage par CD34 sont présentés figure 10.
3.2.4.4. Statistiques
Des tests non paramétriques ont été utilisés pour comparer les distributions du NMV
selon l’histologie (tests de Mann-Whitney ou tests de Kruskal-Wallis). La comparaison de
l’expression d’EGF-R et du NMV a été réalisée grâce à des tests de Wilcoxon.
3.2.4.5. Résultats
Quatre-vingt-trois biopsies ont pu être évaluées pour le NMV : 4 épithéliums
bronchiques normaux, 23 hyperplasies, 26 métaplasies, 2 dysplasies légères, 5 dysplasies
modérées, 9 dysplasies sévères, 3 CIS, 6 carcinomes épidermoïdes micro-invasifs et 5
micropapillomatoses. Cette dernière lésion consiste en touffes de capillaires juxtaposées aux
cellules épithéliales métaplasiques. Ces capillaires se projettent dans la muqueuse bronchique
en formant des structures papillaires microscopiques (29). Dans aucun de ces 5 cas,
l’épithélium ne montrait de signes de dysplasie (figure 11).
La distribution du NMV selon l’histologie est rapportée tableau 23. En appliquant des
tests de Kruskal-Wallis à l’ensemble des lésions, nous avons mis en évidence une différence
statistiquement significative en terme de NMV (p = 0,006) avec une nette augmentation du
NMV dans les carcinomes micro-invasifs. En dichotomisant les sous-groupes histologiques,
nous avons observé une différence statistiquement significative entre les carcinomes micro-
invasifs et toutes les autres lésions et entre les micropapillomatoses et toutes les autres lésions.
Il y avait également une différence statistiquement significative entre les micropapillomatoses
et les carcinomes micro-invasifs. Les micropapillomatoses apparaissent comme les lésions les
plus vascularisées. Il n’y avait pas de différence significative en terme de NMV entre les
muqueuses normales, les métaplasies, les hyperplasies, les dysplasies et les CIS.
66
Figure 10: Exemple de marquage par le CD34 pour l’évaluation du nombre des micro-
vaisseaux des lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: les
micropapillomatoses et dans une moindre mesure les carcinomes micro-invasifs apparaissent comme
les lésions les plus vascularisées. Les autres lésions ne présentent que peu de micro-vaisseaux.
(A) Micropapillomatose (B) Dysplasie légère (C) Carcinome micro-invasif
67
Figure 11: Exemple de micropapillomatose (marquage HE): cette lésion consiste en touffes
de capillaires juxtaposées aux cellules épithéliales métaplasiques. Ces capillaires se projettent dans la
muqueuse bronchique en formant des structures papillaires microscopiques.
Tableau 23: Etude du nombre des micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques
prénéoplasiques et néoplasiques précoces: on ne trouve pas de différence significative en
terme de NMV entre les muqueuses normales, les métaplasies, les hyperplasies, les dysplasies
et les CIS mais bien entre les carcinomes micro-invasifs et toutes les autres lésions et entre les
micropapillomatoses et toutes les autres lésions. Il y a également une différence statistiquement
significative entre les micropapillomatoses et les carcinomes micro-invasifs. Les
micropapillomatoses apparaissent comme les lésions les plus vascularisées.
Types de lésions
Nombre de cas
NMV (médiane)
NMV (moyenne)
NMV (étendue)
No+H+Me 53 11 13 1-30 DL 2 22 22 22 DM 5 14 14 7-24 DS 9 8 13 5-24 CIS 3 15 13 5-19 CMI 6 27 31 16-71 MP 5 41 51 38-73
68
Pour 62 patients, nous avions assez de tissus biopsiques pour comparer le NMV et
l’expression d’EGF-R. Ces biopsies incluaient 3 épithéliums normaux, 15 hyperplasies, 20
métaplasies, 2 dysplasies légères, 2 dysplasies modérées, 7 dysplasies sévères, 3 CIS, 5
carcinomes micro-invasifs et 5 micropapillomatoses. La distribution d’EGF-R selon
l’histologie est rapportée tableau 24. EGF-R était plus exprimé dans les dysplasies sévères, les
CIS et les carcinomes micro-invasifs alors qu’il était très peu exprimé dans les
micropapillomatoses. On a retrouvé une différence statistiquement significative entre
l’expression d’EGF-R et le NMV (p < 0,001) dans ces catégories.
Tableau 24: Comparaison du nombre des micro-vaisseaux avec l’expression d’EGF-R
dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces: EGF-R est
surexprimé à partir du stade de la dysplasie sévère alors que le NMV ne s’élève réellement
qu’à partir du stade de CMI ; l’expression d’EGF-R semble donc précéder la néoangiogenèse.
Types de lésions Nombre des cas
NMV (médiane)
EGF-R grade (médiane)
EGF-R grade (étendue)
No+H+Me 38 12 1 0-6 DL 2 22 1 1-1 DM 2 19 2,5 0-5 DS 7 8 5 4-5 CIS 3 15 5 5-5 CMI 5 31 4 0-6 MP 5 41 0 0-3
3.2.4.6. Conclusions
A l’exception des micropapillomatoses, l’expression d’EGF-R est un facteur plus
précoce que le développement de la néoangiogenèse dans la carcinogenèse bronchique (30).
4. Synthèse, limitations des études et discussion Nos travaux ont permis de confirmer notre hypothèse : l’expression de certains
marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaît précocement, dès les stades prénéoplasiques, avec un
seuil se situant entre les lésions bronchiques de bas et de haut grade. La néoangiogénèse,
évaluée par le nombre des micro-vaisseaux, s’observe, quant à elle, à partir des cancers micro-
invasifs tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade invasif.
69
4.1. Revues systématiques de la littérature avec méta-analyses
La réalisation préalable de revues systématiques d’une littérature abondante et confuse
nous a permis de choisir une série de marqueurs à étudier dans les CBNPC. Les méta-analyses
des données de survie ont permis de démontrer l’intérêt potentiel de certains marqueurs grâce
à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. Cette approche nous a
conduits à sélectionner 4 marqueurs: le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-
R) et un autre récepteur de cette famille (c-erbB-2) ainsi que deux autres facteurs
potentiellement témoins de leur activité, Ki-67 (impliqué dans la prolifération) et le nombre
des micro-vaisseaux (témoins de la néoangiogenèse). Dans nos méta-analyses, c-erbB-2, Ki-
67 et le NMV sont des facteurs de mauvais pronostic pour la survie des patients atteints de
CBNPC. De plus, EGF-R présente un intérêt tout particulier en clinique .
Depuis ces méta-analyses, de nouvelles études sont parues et de nouvelles méta-
analyses ont été publiées. Nakamura (31;32) a aussi réalisé des méta-analyses des
observations publiées évaluant la survie des patients atteints des CBNPC. Il a également
montré que c-erbB-2 est un facteur de mauvais pronostic pour la survie. En ce qui concerne
EGF-R, il n’a pas trouvé d’impact sur le pronostic, même en ne considérant que les études
évaluant ce marqueur par IHC.
Il convient de discuter certains aspects liés à la méthodologie de l’approche que nous
avons choisie pour analyser la littérature. En effet, certains considèrent que les méta-analyses
basées sur les données individuelles des patients inclus dans les études doivent être préférées
à celles basées sur les publications. Il s’agit en fait de deux approches différentes. Une revue
systématique de littérature est une analyse de la littérature avec une méthodologie adéquate
qui peut être contrôlée par les lecteurs. Cette approche est uniquement basée sur les études
publiées et permet une analyse exhaustive et critique du sujet avec agrégation des résultats
(méta-analyse) si possible. Les méta-analyses des données individuelles sont quant à elles de
nouvelles études prenant en compte tous les travaux sur le sujet qu’ils soient publiés ou non et
avec une mise à jour des données individuelles des patients par les investigateurs.
Nos analyses ont été réalisées en agrégeant uniquement les résultats de survie rapportés
en analyse univariée. La décision de réaliser la méta-analyse était basée sur une évaluation
qualitative préalable de la méthodologie de ces études. Pour ce faire, une échelle spécifique
pour l’évaluation des facteurs pronostiques biologiques basée sur notre expérience dans le
domaine a été créée (33), dans le but de mettre en évidence d’éventuelles différences
suggérant un biais induit par la méthodologie des études. L’absence de différence de qualité
entre les études significatives et non significatives est un arguement en faveur d’une
70
agrégation interprétable des résultats. Malgré la méthode utilisée, tous les biais ne peuvent
être évités. Le plus important est le biais de publication. Les études rapportant des résultats
non significatifs sont moins souvent publiées et les études non significatives qui sont publiées
le sont avec des résultats moins bien détaillés. Un autre biais potentiel concerne la langue de
publication: nos revues sont limitées aux articles publiés en anglais ou en français ce qui peut
favoriser les études significatives, plus souvent publiées en anglais. Une autre source possible
de confusion est l’utilisation par les auteurs de cohortes similaires de patients dans des
publications différentes, au risque d’inclure les mêmes malades plusieurs fois dans la méta-
analyse, avec comme corrolaire une pondération plus forte des résultats de ces études. Nous
avons donc essayé d’écarter les études pour lesquelles nous pouvions avec certitude identifier
des cohortes de patients identiques. Nous avons tenté d’obtenir cette information des auteurs
le plus souvent sans obtenir de réponse. Une autre cause de biais potentiels concerne les
techniques utilisées par les auteurs pour identifier l’expression des facteurs biologiques. La
plupart utilisent des techniques d’IHC. Cependant les techniques de mise en évidence du
marqueur (type d’anticorps, dilution de celui-ci, démasquage de l’antigène…) sont variables
d’une étude à l’autre. Le seuil de positivité d’une tumeur pour un marqueur est souvent
arbitraire et varie d’un auteur à l’autre. Un seuil optimal n’a pas encore été déterminé. Des
biais peuvent également être dus à la méthode employée pour réaliser la méta-analyse
notamment pour estimer le HR. Régulièrement, le HR a été extrapolé à partir des courbes de
survie en imaginant le processus de censure comme constant au cours du temps et le choix
des intervalles de temps pour la lecture sur les courbes n’est pas consensuel. Finalement, nos
résultats sont basés sur une agrégation de données d’analyse univariée de la survie d’études en
majorité rétrospectives. C'est pourquoi ces résultats doivent être validés par des études
prospectives en tenant compte des facteurs pronostiques classiques et bien définis pour le
cancer bronchique dans une analyse multivariée.
4.2. Etude de marqueurs biologiques sur des pièces chirurgicales
Dans une deuxième phase, nous avons étudié au laboratoire diverses questions sur des
tumeurs bronchiques invasives.
4.2.1. Etude de l’expression protéique et génique d’EGF-R et de c-erbB-2
Nous avons investigué le mécanisme de surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 et
étudié si des anomalies géniques pouvaient prédire cette surexpression en recourant à des
techniques d’IHC et de FISH. Ceci nous a permis d’observer que, si la majorité des CBNPC
réséqués présentent des anomalies géniques d’EGF-R et/ou de c-erbB-2, une amplification de
ces gènes n’est présente que dans une minorité d’entre eux et n’est pas strictement corrélée à
71
l’expression protéique. Comme dans nos méta-analyses, nous avons observé que les patients
dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-erbB-2 et/ou présente une anomalie de ces gènes
avaient une survie plus courte. Ces différences n’étaient cependant pas statistiquement
significatives.
Nous avons observé 40 % de tumeurs positives pour l’expression protéique d’EGF-R.
Le mécanisme moléculaire exact de la surexpression d’EGF-R n’est pas connu. Cette
surexpression est probablement le résultat de différents mécanismes incluant l’amplification
génique, des mutations géniques, des événements transcriptionnels ou post-transcriptionnels.
Dans la littérature, 0 à 27 % d’amplifications du gène d’EGF-R sont observées (34-41). Le plus
souvent, la protéine est surexprimée quand le gène est amplifié (39;42;43). Cependant,
certaines tumeurs ont un statut génique normal mais surexpriment la protéine (43;44). Nous
n’avons pas retrouvé d’amplification du gène d’EGF-R et nous avons observé que seulement
38 % des tumeurs surexprimant EGF-R avaient des anomalies du nombre de gènes. Ceci
suggère que la surexpression d’EGF-R est probablement contrôlée par d’autres mécanismes tels
que des événements transcriptionnels ou postranscriptionnels (45-47). La surexpression d’EGF-
R pourrait également être la conséquence d’une polysomie du chromosome 7 (39) ou d’une
mutation (48).
Nous avons trouvé 22 % de surexpression de c-erbB-2. La surexpression de cette
protéine peut être la conséquence de différents mécanismes. Un mécanisme pouvant expliquer
la surexpression est l’amplification génique. Dans notre travail, nous n’avons mis en évidence
que 6 % d’amplification génique. Dans la littérature, 2 à 14 % d’amplifications du gène de c-
erbB-2 sont observées par FISH (40;49-52) et pour certains il existe une bonne corrélation
entre la surexpression et cette amplification (53). D’autres techniques ont également été
utilisées pour évaluer cette amplification. Un nombre normal de copies du gène de c-erbB-2 a
été retrouvé dans 94 % des cas de CBNPC évalués par PCR (41). Par une méthode
d’hybridation quantitative de l’ADN, Harpole (54) a observé 6% d’amplification dans des
tumeurs c-erbB-2 positives en immunohistochimie et Shiraishi (34) n’a trouvé qu’un cas
d’amplification sur 51 adénocarcinomes. Finalement, par analyse de type southern,
l’amplification du gène de c-erbB-2 est également rare: 2/60 CBNPC pour Schneider (55). La
surexpression de c-erbB-2 pourrait également être la conséquence d’une polysomie du
chromosome 17. Dans notre série, 73 % des tumeurs qui surexprimaient c-erbB-2 présentaient
une anomalie génique mais très peu une amplification. En particulier, nous avons trouvé 7 cas
de polysomie du chromosome 17 dont 4 surexprimaient la protéine. Une augmentation du
nombre de gènes sans réelle amplification a également été observée dans 13 cas dont 9
72
surexprimaient la protéine. Des anomalies chromosomiques plutôt qu’une réelle amplification
du gène de c-erbB-2 pourraient donc expliquer la surexpression de c-erbB-2. Une autre cause
de surexpression de c-erbB-2 pourrait être une activation de mécanismes transcriptionels ou
posttranscriptionels: nous avons observé que 27% des patients présentant une surexpression
avait une disomie balancée. En effet, une surexpression de l’ARN messager de c-erbB-2 serait
fréquente dans les CBNPC (56). Trois des six patients présentant une amplification en FISH
ne surexprimaient pas la protéine. Cette différence entre l’IHC et le FISH pourrait être due à
des perturbations des mécanismes de transcription. Finalement, des mutations du gène de c-
erbB-2 pourraient également jouer un rôle dans l’expression de cette protéine (57;58).
De nombreux problèmes peuvent être liés à la technique. Aucun protocole standard
d’immunohistochimie n’a été développé pour le cancer bronchique. Des variations dans la
fixation des tissus, dans la sensibilité et la spécificité des anticorps et des différences dans
l’interprétation du marquage peuvent modifier les résultats (59). Par exemple, seul le
marquage membranaire est pris en considération dans l’HercepTest® et non le marquage
cytoplasmique. De plus, l’anticorps utilisé peut modifier les résultats. Pour c-erbB-2, nous
avons choisi le clone CB11 qui est utilisé en routine dans notre laboratoire. Finalement, le
seuil utilisé pour déterminer la positivité d’une tumeur peut également affecter les résultats.
Le seuil de positivité d’une tumeur est une notion relative sans signification biologique. Pour
les méta-analyses nous avons utilisé le terme de « surexpression » dès qu’une tumeur
présentait un taux d’expression du marqueur plus élevé que le seuil choisi par les auteurs. En
ce qui concerne nos travaux, pour c-erbB-2, nous avons décidé d’utiliser le seuil approuvé
dans le cancer du sein. Pour EGF-R, le seuil de 1 % a été utilisé. En effet, pour EGF-R, il n’y
a pas de seuil validé. De plus, 1% semblait être le seuil le plus adéquat lorsque nous avons
étudié différentes valeurs en utilisant des courbes ROC. Le terme de « surexpression » a dès
lors été utilisé pour les tumeurs présentant plus de 1% de cellules positives même si une
expression faible au niveau notamment des cellules basales de l’épithélium est normale.
Les résultats obtenus par FISH sont plus reproductibles. C’est une méthode sensible et
spécifique mais plus chère et plus longue. Nous avons utilisé le kit PathVysion (approuvé par la
FDA) qui s’est montré très reproductible entre laboratoires pour l’évaluation de Her-2/Neu
dans le cancer du sein (60). Malheureusement, il n’existe pas de critère uniforme pour définir
l’amplification; un rapport gène/chromosome > 2 est le plus souvent considéré comme
amplification (43;49;51) mais d’autres paramètres peuvent être utilisés (50;52). Le FISH
permet une évaluation numérique des gènes. Dès lors, d’autres techniques sont nécessaires pour
mieux comprendre les anomalies de ces protéines/gènes. Par northern blot, Reissman (36) a
73
observé que 13% des CBNPC surexprimaient l’ARNm d’EGF-R dont un tiers ne présentaient
pas d’amplification mais tous surexprimaient la protéine.
La présence d’anomalies quantitatives des gènes d’EGF-R ou de c-erbB-2 n’explique
donc pas tous les cas de surexpression de ces protéines.
4.2.2. Corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67
Nous avons également recherché sur des tumeurs réséquées d’éventuels liens entre les
expressions d’EGF-R et de c-erbB-2 (2 récepteurs de facteurs de croissance appartenant à la
même famille de tyrosines kinases) et entre leur expression et celle de Ki-67, témoins de la
prolifération tumorale. Aucune corrélation n’a été mise en évidence entre l’expression de ces
trois facteurs. Ceci suggère qu’il n’y a pas d’interaction directe entre EGF-R ou c-erbB-2 et la
prolifération cellulaire évaluée par Ki-67. Un biais potentiel doit cependant être envisagé: Ki-
67 est un index de la prolifération cellulaire mais cet index n’est pas le seul paramètre
déterminant la prolifération tumorale. En effet, la durée du cycle cellulaire et le taux de mort
cellulaire sont d’autres facteurs importants pour la croissance tumorale. Ki-67 évalue
uniquement la prolifération cellulaire intrinsèque. D’autres marqueurs évaluant la
prolifération, telle la thymidine kinase 1 (TK1), une enzyme clé impliquée dans la synthèse
des précurseurs de l’ADN, pourrait être un marqueur plus fiable (61). Dazzi (44) a, quant à lui,
observé que les tumeurs avec un index de prolifération bas (évalué par cytométrie de flux)
étaient plus souvent positives pour EGF-R. Par contre, EGF-R et le PCNA (un autre marqueur
de prolifération) se comportent de façon similaire dans les carcinomes épidermoïdes (62).
L’expression de Ki-67 ne semble donc pas refléter la prolifération liée à EGF-R. Ceci a
également été observé plus récemment par Niemiec (63). De plus, l’implication d’EGF-R dans
les cancers ne se limite pas à la prolifération cellulaire, il joue également un rôle dans
l’angiogenèse, la motilité cellulaire et l’invasion. Ces éléments ne sont pas évalué par Ki-67.
L’impact d’EGF-R sur la prolifération cellulaire pourrait être plus important dans les
premières étapes de la carcinogenèse.
L’absence de corrélation entre EGF-R et c-erbB-2 dans les tumeurs pulmonaires a déjà
été mise en évidence par d’autres auteurs (41;64-66). Pour certains les patients porteurs d’une
tumeur surexprimant les deux récepteurs auraient un moins bon pronostic (67) mais ceci n’a
pas été confirmé par d’autres (68). Au cours de notre travail, nous n’avons pas mis en
évidence de différence de survie pour les patients dont les tumeurs expriment EGF-R ou c-
erbB-2. Ceci peut être dû au petit nombre de patients et/ou au fait que le poids pronostique de
ces facteurs est probablement faible. Par contre, chez ces malades, l’expression de Ki-67 dans
74
la tumeur s’est avérée être un facteur de mauvais pronostic pour la survie. Ceci doit cependant
être interprété avec prudence, seulement 3% des patients n’exprimant pas Ki-67.
4.3. Etude de marqueurs biologiques sur des tumeurs plus avancées
4.3.1. Corrélation biopsies/tumeurs
Dans la plupart des études, les paramètres biologiques sont évalués par
immunohistochimie sur des tissus obtenus au moment de la résection chirurgicale de la tumeur
primitive, fixés au formol et conservés en paraffine et non pas sur des biopsies. Nous avons
comparé l’expression immunohistochimique d’EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67 sur des biopsies et
sur le tissu chirurgical correspondant afin d’évaluer si les résultats obtenus sont similaires.
Nous avons observé plus de 80 % de résultats concordants en comparant les biopsies et les
pièces chirurgicales réséquées chez les mêmes patients avec un faible taux de faux positifs et
négatifs et de bonnes valeurs prédictives positive et négative. Ceci indique que les biopsies
bronchiques fournissent de bonnes informations sur le statut de ces facteurs biologiques malgré
la faible quantité de tissu analysé. Nous avons observé un taux d’expression d’EGF-R plus bas
sur les pièces chirurgicales en comparaison avec les biopsies. Cette différence peut provenir
d’un échantillonnage différent et des diverses techniques utilisées pour obtenir le matériel mais
pourrait aussi être due à des variations de marquage d’EGF-R selon la localisation dans la
tumeur. Premièrement, il peut y avoir des différences en terme de fixation dans le formol entre
les petites biopsies (rapidement fixées) et les prélèvements chirurgicaux plus grands (plus
lentement fixés) étant donné le temps nécessaire à la pénétration du formol. Deuxièmement,
certaines tumeurs peuvent être trop nécrotiques pour marquer correctement EGF-R. Nous avons
également observé que la distribution d’EGF-R est hétérogène dans la tumeur or nous n’avons
pas analysé toute la tumeur. Malgré l’hétérogénéité de la tumeur et la présence de zones
nécrotiques, les résultats obtenus sur les biopsies et les prélèvements chirurgicaux sont
concordants dans la majorité des cas, montrant que les biopsies peuvent fournir des
renseignements corrects sur les caractéristiques des CBNPC.
L’évaluation des marquages immunohistochimiques sur des échantillons biopsiques est
cliniquement important. Premièrement, une chimiothérapie néoadjuvante est actuellement
parfois administrée dans les CBNPC. Comme la chimiothérapie peut modifier les
caractéristiques biologiques d’une tumeur ou rendre cette tumeur trop nécrotique pour être
correctement évaluée, il peut être utile d’évaluer ces caractères biologiques avant résection
chirurgicale. De plus, les caractéristiques biologiques d’une tumeur obtenue avant chirurgie
pourraient aider dans le futur à identifier des sous-groupes de patients avec des tumeurs
résécables qui seraient le plus susceptibles de bénéficier d’un traitement (néo)adjuvant (69).
75
Deuxièmement, cette caractérisation pourrait aider à sélectionner des traitements pour les
cancers non opérables. Dans les tumeurs avancées, le seul matériel disponible se résume
souvent à de petites biopsies. Les inhibiteurs de fonction tyrosine kinase d’EGF-R (gefitinib,
erlotinib) semblent être d’un grand intérêt avec plus de 10 % de taux de réponse et 6 mois de
survie médiane dans les CBNPC avancés déjà traités par chimiothérapie. En Belgique, sur plus
de 500 patients atteints de CBNPC traités par gefitinib, le taux de réponse décrit est de 9% avec
une survie médiane de 5 mois (70). Le statut EGF-R d’une tumeur pourrait aider à sélectionner
des patients pour ces thérapeutiques ciblées. Comme la majorité des tumeurs n’a pas été
réséquée chirurgicalement, la seule manière de les évaluer est l’analyse des biopsies. Sur base
de l’étude BR21 qui a montré un avantage en terme de survie dans les CBNPC après une
première ou une deuxième ligne de chimiothérapie (71), l’erlotinib est actuellement enregistré
et remboursé en Belgique chez les patients atteints d’un cancer bronchique non à petites
cellules localement avancé ou métastatique progressant après une première ligne de
chimiothérapie et dont la tumeur exprime EGF-R dans plus de 10 % des cellules en
immunohistochimie. En effet, dans cette étude, en analyse multivariée la survie des patients
dont la tumeur surexprimait EGF-R était meilleure chez les patients traités par erlotinib que
chez les patients traités par placebo (72). Un traitement par inhibiteur de la tyrosine kinase
d’EGF-R est donc proposé comme thérapie de sauvetage dans les recommandations cliniques
(73;74). Il faut cependant noter, qu'à l'heure actuelle, il n'est pas certain que la surexpression
d'EGF-R (mise en évidence par immunohistochimie) puisse prédire la réponse aux inhibiteurs
des tyrosines kinases d'EGF-R, cette surexpression n’étant pas parfaitement corrélée à la
réponse observée avec les anti-EGF-R. Ainsi, dans les essais de phase 2 et 3 du gefitinib, de
remarquables réponses ont été obtenues dans les adénocarcinomes (particulièrement parmi les
bronchiolo-alvéolaires), où pourtant EGF-R est moins exprimé que dans les carcinomes
épidermoïdes. D’autres auteurs n’ont pas trouvé de corrélation entre l’expression protéique
d’EGF-R et la réponse au gefitinib (75). De nombreuses mutations du domaine tyrosine kinase
d’EGF-R ont été mises en évidence (76;77). Ces mutations hétérozygotes sont le plus souvent
de petites délétions ou des substitutions d’acides aminés dans les exons 21, 19, 20 ou 18. Elles
sont plus fréquentes chez les femmes, les non-fumeurs, les Asiatiques de l’Est et dans les
adénocarcinomes. Elles pourraient conférer au patient un avantage en termes de survie (78).
Certains auteurs ont observé que ces mutations expliquaient la majorité des réponses au
gefitinib (76;77;79-83) mais que la survie n’était pas influencée par l’existence de ces
mutations (82). Pour d’autres auteurs, les patients traités par gefitinib qui ont une mutation du
gène d’EGF-R auraient aussi une meilleure survie (83;84). En ce qui concerne l’erlotinib la
76
présence de mutations serait aussi un facteur prédictif de réponse mais pas d’une meilleure
survie (72). Selon Cappuzzo (85), bien que l’amplification /polysomie d’EGF-R, sa
surexpression protéique et l’existence de mutations soient prédictives d’une réponse au
gefitinib en analyse multivariée, seul un nombre élevé de copies du gène d’EGF-R (polysomie
ou amplification) mis en évidence par FISH serait prédictif d’une meilleure survie chez les
patients traités par cet inhibiteur d’EGF-R; ceci a été confirmé par Hirsh (86) dans les
carcinomes bronchioloalvéolaires. L’existence de mutations n’est cependant pas une condition
sine qua non pour avoir une réponse au gefitinib (87). Certaines molécules situées plus bas
dans la cascade d’activation d’EGF-R pourraient être importantes : les patients dont la tumeur
exprime p-AKT mais pas p-ERK auraient la meilleure réponse au gefitinib (80). De même,
ceux dont la tumeur exprime PIK3CA (qui régule positivement Akt) ou PTEN (qui le régule
négativement) en plus d’une mutation d’EGF-R ont une survie meilleure lorqu’ils sont traités
par gefitinib (88). Finalement, d’autres facteurs pourraient jouer un rôle dans la sensibilité aux
anti-EGF-R. Les mutations de K-ras seraient par contre un marqueur de résistance au gefitinib
(89). L’expression protéique de c-erbB-2 n’est pas prédictive de la réponse au gefitinib mais un
nombre élevé de copies de ce gène l’est chez les patients avec une tumeur EGF-R positive et
améliore leur survie (90). En résumé, certains facteurs biologiques pourraient donc aider à
cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier d’une thérapie par un agent anti-EGF-R.
Cependant, la technique la plus appropriée et surtout le ou les types d’anomalies biologiques à
rechercher ne sont pas encore clairement établis. Cette partie de la discussion nous a permis
d’insister sur les applications récemment introduites en pratique clinique réalisées à partir de
travaux sur la biologie du cancer.
4.3.2. EGF-R dans les stades III
Nous n’avons pas observé de différence significative en terme de survie entre les
patients ayant une tumeur qui surexprime EGF-R et ceux dont la tumeur ne le surexprime pas.
Dans notre méta-analyse, nous avons montré que l’impact d’EGF-R sur la survie est peu
important. En étudiant EGF-R dans un groupe plus homogène de patients tels que les stades III,
on élimine le facteur confondant du stade et on se met dans de meilleures conditions pour
essayer de détecter un impact de l’expression d’EGF-R. Toutefois, le nombre de patients inclus
dans cette étude est probablement trop faible pour démontrer un éventuel petit effet. D’autres
biais potentiels ont pu interférer avec nos résultats. Il s’agit d’une étude rétrospective et nous
n’avions pas assez de matériel pour étudier EGF-R chez certains patients. Comme déjà discuté,
la technique d’immunohistochimie et le seuil ne sont pas validés.
77
4.4. Lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
Dans la dernière partie, nous avons étudié des lésions représentatives des différents
stades prénéoplasiques et des néoplasies précoces radiooccultes. Ces lésions ont été prélevées
lors d’examens endoscopiques de photodétection. Les échantillons obtenus sont de très petite
taille de par la nature des lésions. EGF-R, c-erbB-2, Ki-67 ainsi que le nombre des micro-
vaisseaux ont été étudiés par immunohistochimie dans ces différents stades de lésions
prénéoplasiques et néoplasiques précoces. Nous avons observé qu’EGF-R et Ki-67 sont
statistiquement plus exprimés dans les dysplasies sévères et les carcinomes in situ (lésions de
haut grade) que dans les lésions de grade moins élevé (dysplasie légère et modérée) suggérant
que, au moins pour ces deux marqueurs, les dysplasies sévères se rapprochent plus des
carcinomes in situ que des dysplasies légères. Alors que l’expression d’EGF-R est présente
dès le stade de dysplasie sévère, une augmentation du nombre des micro-vaisseaux n’est
présente qu’au stade de tumeurs microinvasives. C-erbB-2 n’est quant à lui pas exprimé dans
ces lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces.
4.4.1. EGF-R dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
Nous avons observé qu’EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les dysplasies
sévères et les carcinomes in situ (lésions de haut grade) que dans les lésions de grade moins
élevé.
D’autres auteurs ont également montré que l’expression d’EGF-R augmente avec la
sévérité des lésions de la muqueuse bronchique. Yoneda a montré que des cellules positives
pour EGF-R se retrouvaient de plus en plus vers la périphérie de l'épithélium (tout comme les
anomalies cytogénétiques) évoluant de la métaplasie aux dysplasies et finalement aux CIS
(dans lesquels la totalité de l'épaisseur de l'épithélium comprend des atypies cytologiques avec
des cellules immunopositives pour EGF-R) (62). Rusch (91) a trouvé que l'expression d'EGF-
R n'est pas associée à un type particulier de lésion préinvasive. Dans cette étude, le marquage
EGF-R existe aussi bien dans les métaplasies que dans les dysplasies et les CIS, bien qu’il soit
plus intense et implique plus les couches superficielles de l'épithélium dans les dysplasies et
les CIS. Piyathilake (92) a décrit, dans 46 hyperplasies et 60 métaplasies, un taux d'expression
plus élevé d'EGF-R que dans l'épithélium normal avec une expression plus importante dans
les cellules basales que dans les cellules les plus proches de la lumière bronchique et plus
particulièrement un marquage cytoplasmique. De plus, il a observé que l'expression d'EGF-R
était plus importante dans la membrane cellulaire dans 8 lésions dysplasiques et dans 60
cancers bronchiques, ce qui suggère un déplacement du cytoplasme à la membrane à partir du
stade de dysplasie. Finalement, Kurie (93), dans une étude évaluant l'effet d'un traitement par
78
l’acide 13-cis rétinoïque, a démontré que l'expression d'EGF-R était plus importante dans les
métaplasies que dans l'épithélium normal et qu’une diminution de l'expression d'EGF-R était
associée dans 50% des cas à une réversibilité de la métaplasie. Dans les lésions préinvasives
de la muqueuse cervico-faciale, Grandis (94) a trouvé des résultats similaires aux nôtres: le
niveau d'expression d'EGF-R était relativement faible dans les dysplasies légères et
augmentait dans les grades plus sévères. Il existe donc, dans les lésions du tractus respiratoire,
une augmentation liée à leur sévérité du taux d'EGF-R en terme de pourcentage de cellules
immunomarquées et/ou en terme de localisation des cellules positives.
Notre étude est la première à mettre en évidence une différence entre les différents
grades de dysplasies. Il est cependant difficile de comparer les résultats de tous ces auteurs
avec les nôtres: premièrement, parce qu'ils n'utilisent pas la dernière classification
OMS/IASLC et qu'ils ont groupé les différents grades de dysplasies; deuxièmement, le seuil
de positivité d'EGF-R était différent selon les études
Certaines limitations spécifiques à notre travail doivent cependant être notées.
Premièrement, le nombre de patients est réduit. De plus, le nombre de dysplasies modérées est
bas et nous avons dû les exclure de notre analyse statistique. Notre analyse ne peut donc pas
examiner si le seuil se trouve entre dysplasie légère et sévère ou entre dysplasie modérée et
sévère. Deuxièmement, nous avons utilisé l'immunohistochimie pour détecter l'expression
d'EGF-R et il n'y a, à l'heure actuelle, aucune standardisation ni validation de cette technique
pour la détection d'EGF-R. Dans une étude précédente, Rusch et collaborateurs (95) ont montré
que seul un immunomarquage uniforme et intense de tumeurs bronchiques était corrélé à une
surexpression de l’ARN. C'est pourquoi nous avons choisi un seuil de 5 pour le score global
d'EGF-R afin d’avoir un nombre de cellules marquées et une intensité de marquage suffisant.
Une comparaison avec des techniques de biologie moléculaire serait intéressante car elles
permettraient d'interpréter correctement les résultats obtenus et de développer un test de routine
reproductible et fiable. De plus, l'immunohistochimie présente de nombreux avantages: la
préservation de l'architecture tissulaire, la possibilité de localiser l'antigène sur une petite lésion
prénéoplasique conservée en paraffine, la facilité de la technique et son faible coût (comparé à
d’autres méthodes) pour une éventuelle application en routine.
Finalement, alors que l'intensité et la distribution d'EGF-R augmente de l'épithélium
bronchique normal aux tumeurs microinvasives, toutes les lésions d'un groupe ne se comportent
pas de la même manière. Une telle hétérogénéité d’expression d’EGF-R dans un même groupe
peut refléter le fait que EGF-R n'est pas uniquement lié au degré de différenciation et de
79
prolifération mais aussi à d'autres paramètres biologiques impliqués dans l'oncogenèse et la
progression tumorale comme l’angiogenèse.
L’originalité de notre étude est donc d’utiliser la classification OMS/IASLC et d’avoir
trouvé un seuil de surexpression d’EGF-R à partir des dysplasies sévères.
4.4.2. c-erbB-2 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques
précoces
Nous n’avons pas observé dans notre étude de marquage pour c-erbB-2 dans les
lésions bronchiques prénéoplasiques à la différence d’autres auteurs. Piyathilake (92) a évalué
l’expression de c-erbB-2, EGF-R et TGF alpha dans des épithéliomas épidermoïdes, les
lésions précancéreuses associées ou non et dans l’épithélium bronchique normal. Il a observé
que l’expression de c-erbB-2 était significativement plus élevée dans les épithéliomas
épidermoïdes et dans les lésions précancéreuses associées aux cancers que dans l’épithélium
bronchique normal et que dans les lésions précancéreuses non associées à des tumeurs
invasives. Hirsch (96) cite dans un article de revue que c-erbB-2 est exprimé dans 70 % des
lésions bronchiques prénéoplasiques sans différence entre les lésions de bas et de haut grade
mais il ne donne pas le détail de ses résultats.
Les techniques d’IHC utilisées peuvent en partie expliquer les différences observées.
Nous avons utilisé le clone CB11 de Novocastra alors que Piyathilake (92) a utilisé les
anticorps d’Oncogene Products. Hirsch (96) ne mentionne pas l’anticorps utilisé. Les
techniques de démasquage de l’antigène peuvent également faire varier les résultats. La
méthode employée pour définir la positivité d’un échantillon est également différente et peut
entraîner des différences de résultats entre les études. Piyathilake (92) a considéré les
marquages membranaire et cytoplasmique alors que Hirsch (96) ne définit pas son marquage.
Comme recommandé dans l’HercepTest®, nous avons considéré uniquement le marquage
membranaire.
Finalement, le rôle de c-erbB-2 pourrait être plus important dans le développement des
adénocarcinomes que dans celui des épithéliomas épidermoïdes. Nos lésions étant des
précurseurs des épithéliomas épidermoïdes, ceci peut contribuer à expliquer pourquoi c-erbB-
2 n’est pas exprimé.
4.4.3. Ki-67 dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces
L'activité proliférative augmente dans la muqueuse prénéoplasique en parallèle avec le
grade de dysplasie. Ceci est un phénomène connu décrit dans différents organes comme le col
utérin, la vessie et le colon. Cette augmentation de la prolifération selon la gravité des lésions
80
a également été observée dans le poumon. Les investigations les plus anciennes évaluant la
prolifération ont utilisé le PCNA, une protéine nucléaire associée avec la polymérase delta de
l’ADN (97). Une augmentation significative de l’expression de PCNA est présente à partir du
stade de dysplasie (98). Cette augmentation significative dans le nombre de noyaux positifs
pour le PCNA a été observée par Pendleton (23) dans les dysplasies modérées et sévères mais
pas dans les dysplasies légères. De plus, un déplacement dans l'expression de l'antigène vers
la partie suprabasale de la muqueuse pour les lésions les plus sévères a été observé (23). A
cause de sa relative longue demi-vie, le PCNA peut persister dans des cellules non
proliférantes. Pour cette raison, le PCNA n'est pas très spécifique. Au contraire, Ki-67 est une
protéine nucléaire et nucléolaire exprimée spécifiquement au cours de tout le cycle cellulaire
des cellules proliférantes à l'exception de la phase G0 où son expression est absente. La
fonction exacte de cette protéine est inconnue mais elle serait un facteur important pour la
progression dans le cycle de division cellulaire. En utilisant l'anticorps MIB-1 dirigé contre
l'épitope plus spécifique Ki-67, Boers et collaborateurs (25) ont observé une augmentation
significative de l'activité proliférative dans l'épithélium “métaplasique” en comparaison avec
le groupe contrôle de muqueuse normale. Cependant, dans l'épithélium métaplasique, le
marquage MIB-1 était très hétérogène et des pourcentages similaires de marquage ont été
observés dans les dysplasies de grade I, II et III classifiées selon les critères de l'OMS de
1982. La distribution spatiale des noyaux positifs pour Ki-67 n'a pas été évaluée. Les auteurs
concluent que, bien qu'une augmentation de la prolifération puisse être une étape précoce dans
la carcinogenèse bronchique, elle n'est pas corrélée au grade de dysplasie et ne peut être
utilisée pour prédire l'existence d'un carcinome bronchique. Inversement, Tan et
collaborateurs (99) ont montré une augmentation progressive du pourcentage de cellules
positives et de l'intensité du marquage pour Ki-67 entre la muqueuse bronchique normale, la
métaplasie et la dysplasie. Une diminution du marquage de la dysplasie au CIS a été observée
mais le nombre de cas n'était pas assez élevé pour évaluer sa signification et pour en tirer des
conclusions. Dans cette étude, le grade des dysplasies n’était pas précisé. Une augmentation
significative du taux de Ki-67 dans les dysplasies par rapport aux métaplasies a aussi été mis
en évidence par Soini (100) mais là encore les différents grades de dyplasies n’étaient pas
comparés.
Notre travail est, à notre connaissance, le premier à évaluer l'activité proliférative des
lésions bronchiques prénéoplasiques en se basant sur le marqueur de prolifération Ki-67 et sur
la nouvelle classification OMS/IASLC. Les résultats du marquage immunohistochimique par
le MIB-1 ont été exprimés en fonction du pourcentage de cellules marquées mais aussi par
81
deux autres méthodes: l'une combinant la fréquence de cellules positives avec l'intensité de
leur marquage et l'autre évaluant la distribution spatiale des cellules positives dans la
muqueuse bronchique. En effet, la large distribution des pourcentages de cellules positives
pour Ki-67 ne nous a pas permis pas de faire la différence entre les DL, DM, DS et les CIS.
Des études plus récentes réalisées dans les métaplasies du col utérin (101) et dans les lésions
bronchiques prénéoplasiques (23) ont montré une association entre les grades de dysplasies et
l'expression du PCNA dans les couches les plus superficielles de l'épithélium. Un
comportement similaire a été décrit en utilisant un marquage immunohistochimique pour Ki-
67 dans les dysplasies de la cavité buccale (102) et dans les dysplasies apparentées à la
rectocolite ulcéro-hémorragique (103). Plus récemment, la positivité pour Ki-67 a été évaluée
dans les lésions intraépithéliales de bas grade du col utérin en utilisant le seuil d’amas d'au
moins deux noyaux de cellules épithéliales adjacentes fortement marquées pour Ki-67 (26).
Lorsque nos échantillons sont évalués pour la présence d'un ou plusieurs amas de cellules
superficielles positives pour Ki-67, une différence significative a été observée entre le groupe
des dysplasies légères et modérées par rapport à celui des dysplasies sévères et des CIS. Dans
le même but d'améliorer la précision de nos mesures, nous avons considéré l'intensité et la
fréquence du marquage pour Ki-67, en utilisant le schéma de gradation adopté pour des
mesures similaires pour les récepteurs aux stéroïdes dans le cancer du sein (27). Dans notre
série, le seuil de 4 correspond à au moins 10 % de cellules positives pour Ki-67 et une
intensité de marquage modérée ou forte. Les cas avec un marquage modéré ou fort avaient
toujours plus de 10 % de cellules positives et la plupart des études dans le cancer bronchique
utilisent un seuil d'au moins 10 % de cellules positives pour Ki-67 pour considérer la tumeur
comme positive (104;105). Les 2 méthodes d'évaluation donnent des résultats concordants et
montrent une augmentation de positivité de Ki-67 dans les dysplasies sévères et les CIS. Une
différence statistiquement significative a été observée entre ces lésions et le groupe des
dysplasies légères et modérées. Dans le nouveau système de classification de l'OMS/IASLC
des lésions bronchiques prénéoplasiques, les dysplasies sévères et les CIS doivent avoir (à la
différence des dysplasies légères et modérées) des atypies nucléaires significatives, une
chromatine condensée et une activité mitotique étendue dans les couches supérieures de la
muqueuse. D'un autre côté, les lésions de bas grade sont caractérisées par une chromatine
finement granuleuse et une activité mitotique plus faible, confinée au tiers inférieur de la
muqueuse. En utilisant l'immunomarquage pour Ki-67, nous n'avons pas trouvé de différence
statistiquement significative entre les dysplasies légères et modérées d’une part ni entre les
82
dysplasies sévères et les CIS d’autre part. Ceci nous a permis de conclure que l'activité
proliférative permet de séparer les lésions prénéoplasiques en deux grands groupes distincts .
La classification histologique de routine et l'évaluation immunohistochimique des
lésions prénéoplasiques et des carcinomes in situ de la muqueuse bronchique peuvent se
révéler difficiles sur de petites biopsies qui sont souvent fragmentées et peuvent être affectées
par des artéfacts de coupe tangentielle avec une perte de la partie superficielle de la
muqueuse. Dans les CIS, l'épaisseur de la muqueuse peut ne pas être augmentée; l'évaluation
de la maturation/orientation requise par la classification de l'OMS/IASLC est plus difficile
dans les épithéliums fins. De plus, des niveaux variables de dysplasies peuvent coexister dans
la même biopsie. Des cellules inflammatoires intraépithéliales positives pour Ki-67 peuvent
compliquer l'évaluation immunohistochimique. Pour minimiser les variations diagnostiques,
nous avons discuté collégialement les interprétations divergentes. Malgré cela, 3 cas (5,5 %)
ont dû être exclus de notre étude à cause de l'absence d'accord diagnostique suite à des
artefacts techniques ou de l'inflammation.
En conclusion, un marquage positif pour Ki-67, défini par un amas d'au moins deux
noyaux de cellules fortement marquées dans le tiers supérieur de l'épithélium ou par un score
global pour Ki-67 plus grand que 4, est associé à des lésions bronchiques de haut grade
(dysplasies sévères et CIS). Ces résultats suggèrent que les dysplasies sévères et les CIS ont
un comportement prolifératif similaire et que l'immunomarquage Ki-67 peut être un test
supplémentaire pour classifier correctement les lésions bronchiques prénéoplasiques et
néoplasiques précoces en lésions de bas et de haut grades.
Ces résultats peuvent avoir une implication clinique potentielle. Le concept de lésions
bronchiques prénéoplasiques de haut et de bas grades a déjà été introduit dans la littérature
(106) et a été utilisé pour trier les patients afin de sélectionner au mieux les procédures de
suivi. Bota (106) a montré qu’en l'absence de traitement, 3,5 % des dysplasies de bas grade
(légères et modérées) progressaient en lésions de haut grade à la différence des dysplasies
sévères et des CIS qui persistaient ou récidivaient à la même place après une régression
transitoire dans respectivement 37 et 87 % des cas. De plus, la progression d'une lésion de bas
grade apparaît seulement chez les patients présentant une lésion de haut grade dans un autre
site. Sur base de ces données, Bota recommande un suivi seul pour les lésions de bas grade
sans lésion de haut grade associée et un traitement immédiat pour les CIS et les dysplasies
sévères si les lésions persistent à 3 mois. En considérant cela, la détermination de l’expression
de Ki-67 et d’EGF-R peut aider à mieux discriminer les lésions bronchiques de haut et de bas
grade et donc à sélectionner la prise en charge la plus appropriée. Bien entendu, le
83
comportement biologique des dysplasies, y compris des formes sévères, est influencé par de
nombreux facteurs. D'autres études sont donc nécessaires afin d'élucider les mécanismes à la
base de la progression ou de la régression des lésions prénéoplasiques de la muqueuse
bronchique.
4.4.4. Nombre de micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques prénéoplasiques et
néoplasiques précoces
Nous avons observé que le pattern de néoangiogenèse était différent entre les lésions
bronchiques prénéoplasiques et néoplasiques précoces avec une expression différente des
micro-vaisseaux et d’EGF-R. EGF-R voit son expression s’accentuer de l’épithélium normal au
cancer micro-invasif essentiellement à partir du stade de la dysplasie sévère alors qu’une
augmentation significative du nombre de micro-vaisseaux n’apparaît qu’au stade du carcinome
micro-invasif. La micropapillomatose est un cas particulier.
D’autres études évaluant le nombre des micro-vaisseaux dans les lésions bronchiques
ont rapporté des résultats un peu différents. Fisseler (107) a observé que l’augmentation de la
néovascularisation (évaluée par le facteur VIII) était corrélée à une augmentation du degré de
dysplasie (n=11). Fontanini (108) a montré que le NMV (évalué par CD34) était bas dans les
lésions de métaplasie/hyperplasie (n=7) mais que les dysplasies à partir du stade modéré
(n=4) et, de façon encore plus significative, les CIS (n=8) avaient un NMV plus élevé. Nous
n’avons observé de différence statistiquement significative qu’entre les carcinomes micro-
invasifs et tous les autres sous-groupes. Notre étude suggère que la formation de micro-
vaisseaux est un phénomène tardif dans l’oncogenèse bronchique. Les micropapillomatoses se
comportent différemment avec un haut taux de micro-vaisseaux en l’absence d’atypies et
d’augmentation d’expression d’ EGF-R. Certaines différences entre ces études pourraient être
expliquées par la sélection des cas et le système de classification utilisé. La méthode
employée pour compter les micro-vaisseaux variait. Comme Fontanini, nous avons utilisé une
technique similaire à celle décrite par Weidner alors que Fissler a utilisé un système d’analyse
automatique d’images. Les protocoles d’IHC étaient également différents. Trois anticorps ont
été utilisés pour évaluer le NMV: CD31, CD34 et le facteur VIII. Selon certains auteurs,
CD31 semble être le marqueur le plus sensible et marquerait plus de vaisseaux que le facteur
8 (109). Un consensus international sur la méthodologie et les critères d’évaluation de la
néoangiogenèse propose que l’anticorps anti-CD31 soit le standard (110). Cependant, d’autres
auteurs ont suggéré qu’il pourrait être utile de combiner CD34 et CD31 (111). Offersen (112)
a comparé dans des cancers bronchiques, les NMV obtenus par les 3 marqueurs: il a observé
que CD34 donnait le meilleur marquage des cellules endothéliales sans bruit de fond. Yano
84
(113) a montré que la corrélation entre le facteur VIII et le CD34 n’était pas très bonne et que
seul CD34 était corrélé à la survie des patients atteints d’adénocarcinomes. Nous avons choisi
d’utiliser CD34 car nous avons observé que CD34 marquait plus de vaisseaux sur les tissus
conservés en paraffine.
Nos constatations suggèrent que si EGF-R est nécessaire au développement de néo-
vaisseaux, ce phénomène est précoce et débute au stade de dysplasie. Il existe différents
arguments dans la littérature pouvant soutenir notre hypothèse. L’action oncogénique d’EGF-R
pourrait être partiellement la conséquence de la promotion de l’angiogenèse elle-même due à
VEGF. Une activation des voies de signalisation d’EGF-R augmente la production de
molécules angiogéniques dans de nombreuses cellules tumorales. Dans le cancer du sein, il
existe une association entre EGF-R et l’angiogenèse particulièrement dans les tumeurs de
moins de 2 cm (114). De plus, un blocage de la voie de signalisation d’EGF-R peut résulter en
une suppression partielle de l’angiogenèse (115;116), notamment par inhibition de VEGF
(117). Ciardiello (118) a observé que l’adjonction de gefitinib, entraîne une diminution de la
croissance cellulaire et de la production de VEGF. Dans cette même étude, le nombre de micro-
vaisseaux et VEGF sont également réduits dans des xénogreffes traitées par gefitinib.
4.4.5. Autres anomalies des lésions bronchiques prénéoplasiques décrites dans la
littérature
Nos travaux s’inscrivent dans le cadre de l’identification des anomalies biologiques
survenant au cours du développement des lésions prénéoplasiques et néoplasiques précoces
des épithéliomas épidermoïdes bronchiques. Nous avons délibérément mis de côté certains
marqueurs qui sont quasiment pathognomoniques de lésions cancéreuses et précancéreuses
d’autres sous-types histologiques de cancers bronchiques que les épithélioma épidermoïdes
(par exemple Ras pour les adénocarcinomes).
Bien que la littérature soit abondante dans les cancers bronchiques avérés, l’étude de
facteurs biologiques dans les lésions plus précoces est nettement moins étoffée. Outre les
pertes d’hétérozygotie (3p, 9p, 17p, 11p), l’aneuploïdie et les altérations des microsatellites
(119), seule une trentaine de facteurs ont été étudiés dont 7 notamment par notre équipe :
EGF-R (21), c-erbB-2 (22), Ki-67 (28), le NMV (30), p53 (120), CA IX (121) et cox-2 (122).
Si on considère les études ayant évalué de façon systématique les différents stades de lésions
prénéoplasiques, on peut retenir des anomalies aux niveaux d’oncogènes (EGF-R, c-erbB-2,
bcl-2, Ras, cox-2…), de gènes suppresseurs de tumeurs (p53, FHIT, cycline D1, Rb,…), de
85
facteurs liés à l’angiogenèse (VEGF, NMV), de facteurs liés à la prolifération (Ki-67, PCNA,
MCM2, CA IX,…), de protéines liées à l’invasion et à la sénescence (télomérases).
Ces altérations ont été observées, comme dans nos études, sur des biopsies prélevées
par bronchoscopie ou sur des pièces chirurgicales (moins fréquemment sur des prélèvements
cytologiques). L’immunohistochimie est la technique de détection des altérations biologiques
la plus souvent utilisée mais d’autres méthodes (PCR…) sont parfois employées. Il est
difficile de comparer les résultats de toutes ces études avec les nôtres: souvent la dernière
classification OMS/IASLC n’est pas utilisée, les différents grades de dysplasies ont été
regroupés, la technique d’immunohistochimie et le seuil de positivité utilisés ne sont pas les
mêmes. Il est donc malaisé de tirer des conclusions définitives.
L’apparition de ces anomalies dans la dynamique de progression des cancers
bronchiques est très variable selon le type de marqueur étudié (figure 12).
Figure 12 : Principales anomalies biologiques décrites selon les stade des lésions : En rouge : facteurs faisant l’objet de cette thèse En vert : autres facteurs étudiés par notre équipe En noir : autres facteurs discutés dans la littérature
Dans l’épithélium bronchique « normal » de fumeur, des délétions de certains gènes
sont déjà présentes (3p, 9p…) tout comme dans l’hyperplasie (11p, 5q).
Des anomalies moléculaires précises apparaissent dès le stade de métaplasie.
L’activité télomérase et l’expression d’ARN messager de hTERT (sous-unité catalytique de
télomérase) sont statistiquement plus élevées dans les biopsies métaplasiques ou dysplasiques
que dans l’épithélium bronchique normal mais moindres que dans les cancers invasifs
(123;124). Aucune expression de télomérases n’a cependant été retrouvée dans des
3p 9p 17p
11p 5q
P53 EGF-R Ki-67 PCNA BAX/bcl-2 FHIT Cox-2
CA IX c-erbB-2 NMV Rb
Télomérase P21WAF C-JUN CD44 Hyaluronan
Hyperplasie Epithélium bronchique normal de fumeur
Métaplasie Dysplasie CIS Tumeur
86
prélèvements cytologiques correspondant à de la métaplasie/dysplasie (125). Des anomalies
de p21WAF-1 (126), c-JUN (127) et de certaines molécules d’adhérence telles que CD44, un
récepteur à l’hyaluronan (128;129) ont été rapportées de façon ponctuelle dans la littérature.
Bien que parfois présentes plus tôt dans l’évolution des lésions, les anomalies
biologiques peuvent fortement varier selon le grade de dysplasie. Malheureusement, dans
beaucoup d’études, toutes les dysplasies (légères, modérées, sévères) sont regroupées en une
seule catégorie ou définies de manière peu claire.
Pour les anomalies les plus fréquement décrites, la situation pourrait être résumée
comme suit :
1) p53 : est plus exprimé à partir du stade de dysplasie (n=17) et de CIS (n=5) (98). Un travail
réalisé par notre équipe a montré que l’expression de p53, déjà présente dans les métaplasies
(n=14), était plus nette dans les dysplasies sévères (n=14) (120). Ceci a également été
retrouvé dans une étude japonaise : à l’absence d’expression de p53 dans 14 dysplasies de bas
grade succède une expression à partir des dysplasies de haut grade (130). Dans une étude
anglaise, l’expression de p53 était plus élevée dans les dysplasies sévères (n=7) que dans les
modérées (n=12) et les légères (n=41) (131). Dans une étude finlandaise, son expression était
plus importante dans les dysplasies sévères et les CIS (n=11) que dans les dysplasies légères
et modérées (n=6) (132). Cette différence d’expression de p53 entre les différents groupes de
51 dysplasies de « grades » différents n’a cependant pas été retrouvée par d’autres auteurs
(25). Dans les lésions adjacentes à des cancers invasifs, une expression concomitante de p53
dans les dysplasies sévères et les CIS (n=31) est beaucoup plus fréquente que dans les
dysplasies légères (n=10) (133). Tout comme p53, les cyclines D1 et E sont plus souvent
exprimées dans les dysplasies de haut grade que dans celles de bas grade (134).
2) EGF-R : nous avons observé qu’EGF-R est statistiquement plus exprimé dans les
dysplasies sévères et les carcinomes in situ que dans les lésions de grade moins élevé
dysplasies légères (21). Rappelons qu’à l'opposé, Rusch (91) a trouvé que l'expression d'EGF-
R n'était pas associée à un type particulier de lésion préinvasive.
3) Ki-67 : nous avons observé une expression plus importante dans les dysplasies sévères et
les CIS versus les dysplasies légères et les modérées (28). Une expression plus importante de
Ki-67 dans les dysplasies a également été rapportée par d’autres auteurs (99;100). Une
augmentation significative a aussi été observée dans les dysplasies modérées et sévères mais
pas dans les dysplasies légères (23) pour un autre facteur de prolifération (le PCNA). Une
étude va à l’encontre de ces résultats, avec l’observation de pourcentages similaires de
87
marquage Ki-67 dans les dysplasies de grade I, II et III classifiées selon les critères de l'OMS
de 1982 (25).
4) BAX/bcl-2 : dans une étude incluant 12 dysplasies légères, 9 modérées et 9 sévères, une
inversion du rapport BAX/Bcl-2 (normalement >1) est plus fréquente dans les dysplasies de
haut grade (134). Cette inversion du rapport pourrait être principalement liée à une
augmentation de Bcl-2 (126;131) sans réel changement en terme d’expression de BAX (135).
5) Cox-2 : cette cyclo-oxygénase n’est exprimée qu’à partir de la dysplasie sévère. Une
différence (statistiquement significative) a également été retrouvée entre les lésions
dysplasiques de bas grade (n=28) et celles de haut grade (n=12) dans une étude de notre
équipe (122).
6) FHIT : bien que déjà présente dès la métaplasie (136), une perte progressive de FHIT
semble également survenir entre les dysplasies légères (n=1), modérées (n=5) et sévères
(n=14) (137).
Une étude de notre équipe a montré que l’expression de CA IX, n’est présente qu’au
stade de CIS et pas dans les lésions de plus bas grade (121).
Certaines anomalies n’apparaissent qu’au stade invasif. Selon notre étude et comme
discuté auparavant, contrairement à ce qu’a observé Piyathilake (92), c-erbB-2 ne serait
exprimé que dans les lésions invasives (22). Au contraire d’autres équipes (107;108), nous
avons montré qu’une augmentation significative du nombre des micro-vaisseaux, témoins de
la néoangiogenèse, n’apparaît qu’au stade du carcinome micro-invasif. La perte d’expression
de Rb n’est présente que dans les cancers invasifs alors que les lésions bronchiques
prénéoplasiques (y compris les CIS) sont toutes positives pour son expression (138).
La difficulté majeure de l’étude de ces lésions réside dans leur rareté et dans leur petite
taille, imposant d’être très économe dans leur utilisation en recherche et expliquant le faible
nombre d’études publiées souvent avec un nombre relativement restreint de cas. Si on
considère le nombre de marqueurs étudiés convenablement, on en retient actuellement moins
de 20. Dans toutes les études évaluant les anomalies biologiques des lésions prénéoplasiques,
le nombre de lésions étudiées est faible (parfois 1 ou 2 , le plus souvent moins de 15 lésions
par grade).
88
5. Conclusions Par l’étude de différents aspects biologiques du cancer bronchique non à petites
cellules, nous avons pu montrer que le processus de carcinogenèse dans l’épithélium
bronchique est complexe et fait intervenir différents mécanismes à des stades variables.
Premièrement, grâce aux méta-analyses de la littérature, nous avons observé qu’EGF-
R, c-erbB-2, Ki-67 et le nombre des micro-vaisseaux s’avèrent des facteurs de mauvais
pronostic dans les CBNPC. Ceci pourrait être cliniquement important pour mieux sélectionner
les patients devant bénéficier d’une chimiothérapie adjuvante.
Deuxièmement, nous avons montré que la surexpression d’EGF-R et de c-erbB-2 dans
les cancers réséqués résulte très rarement d’une amplification génique et nous n’avons pas
trouvé dans ces tumeurs de corrélation entre EGF-R, c-erbB-2 et Ki-67. Comme dans nos
méta-analyses, nous avons observé que les patients dont la tumeur surexprime EGF-R et/ou c-
erbB-2 et/ou présente une anomalie de ces gènes avaient une survie plus courte. Ces
différences n’étaient cependant pas statistiquement significatives. L’expression de Ki-67 dans
la tumeur s’est avérée être un facteur significatif de mauvais pronostic pour la survie.
Nous avons aussi montré que l’évaluation des marqueurs biologiques sur biopsie ne différait
pas de celle réalisée sur des tumeurs réséquées.
Finalement, nos travaux ont surtout permis de montrer que l’expression de certains
marqueurs (EGF-R et Ki-67) apparaît précocement dans le processus de carcinogenèse
bronchique dès les stades prénéoplasiques, avec un seuil se situant entre les lésions
bronchiques de bas et de haut grade. La néoangiogénèse s’observe, plus tardivement, à partir
des cancers micro-invasifs tandis que c-erbB-2 n’apparaît qu’au stade de tumeur clinique.
Ces observations peuvent avoir une implication clinique : les lésions de haut grade ont
une évolution spontanée très fréquement défavorable et il est recommandé un simple suivi
pour les lésions de bas grades et un traitement immédiat pour les CIS et les dysplasies sévères
si les lésions persistent à 3 mois (106). Dans ces conditions, la détermination de l’expression
de Ki-67 et d’EGF-R peut aider à mieux discriminer les lésions bronchiques de haut et de bas
grade et donc à sélectionner la prise en charge la plus appropriée.
6. Perspectives La compréhension des mécanismes sous-jacents à l’initiation de la carcinogenèse
bronchique mérite d’autres d’investigations. D’autres marqueurs (tels que c-erbB-3, un autre
membre de la famille d’EGF-R et TGFα, un des ligands principaux d’EGF-R) sont en cours
89
d’évaluation dans notre laboratoire. Les modifications de la matrice extracellulaire,
nécessaires à l’invasion, seront investigués ultérieurement, de même que les mécanismes
d’apoptose.
L’utilisation à large échelle des nouvelles techniques d’analyse des facteurs
biologiques devrait nous renseigner sur les mécanismes des voies métaboliques impliquées
dans l’évolution tumorale. Ces nouvelles techniques prometteuses sont l’hybridation
génomique comparative (ou CHG) qui étudie l’ADN, les microdamiers à ADNc qui étudient
ARN et la protéomique pour l’étude des protéines. Des premiers résultats intéressants ont été
décrits en protéomique. Deux études ont déjà permis d’observer, sur de petits échantillons de
lésions, des différences protéiques entre les métaplasies (n=8) et les dysplasies (n=8) et entre
les dysplasies et les cancers invasifs (n=8) (139) et des profils d’expression différents entre les
lésions de bas et de haut grade (n=20) (140). Actuellement, dans notre laboratoire, les
techniques d’extraction d’ARN sont en fin de mise au point. Les méthodes actuellement
employées telles que l’immunohistochimie continueront à être utilisées pour la
compréhension ultérieure des anomalies détectées par ces nouvelles technologies.
90
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