0macro part miquel
Post on 22-Jan-2016
48 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
1. Macromolècules a l’entorn cel·lular
Les principals macromolècules de l’entorn cel·lular són les proteïnes, els àcids nucleics i
els polisacàrids. Aquest curs té per objectiu aprendre a “llegir-les”, és a dir, identificar-
les (per exemple, una proteïna = tres lletres) i entendre quina funció fan. Si ho assolim,
en Miquel Pons considera que hem triomfat.
L’interior de la cèl·lula es pot considerar compacte i, per tant, sense forats. Del 30 al
50% del seu volum total està ocupat per macromolècules i la resta aigua (també una
molècula, però més petita). Per exemple, E. coli té de 3000 a 6000 espècies químiques
diferents, que resulta en una concentració total de 300 a 400 g de macromolècules per
L ‘entorn cel·lular. Per tant, del 30 al 40% del pes total d’E. coli es deu a les
macromolècules. Una esfera d’E.coli fa aproximadament 1 μm de diàmetre, la qual cosa
resulta en 5,32·10-16L per organisme. Per una longitud força gran tenim un volum molt
petit. Per tenir una concentració 1 μM (μmols/L) ens caldrien 317 molècules.
Les macromolècules estan formades sempre per uns components freqüents units d’una
manera determinada. Hi ha diverses maneres d’unir-se i estructurar-se:
Estructura covalent (primària): Consisteix en els diferents monòmers units per
enllaços covalents. Determina un alfabet limitat.
o Àcids nucleics (4 bases nitrogenades)
o Proteïnes (20 aminoàcids)
o Polisacàrids (gran diversitat de monosacàrids)
Estructures tridimensionals: Són necessàries per tal que la macromolècula pugui
dur a terme la seva funció. S’estableix una jerarquia estructural.
o Regularitats locals (estructura secundària)
o Plegament global (estructura terciària)
o Contactes intermoleculars (estructura quaternària)
Dinàmica i heterogeneïtat estructural:
o “Cicle vital” de les bio-macromolècules: Neixen, es modifiquen, fan la
seva funció i es degraden en la mesura requerida (ni massa ni massa
poc). Si no es regula correctament apareixen problemes: o bé no fa la
seva funció, o bé no és al lloc que i toca o bé s’acumula i no es degrada
(amiloïdosis). Hi són on i quan toca, i moren on i quan els toca.
o Moviments a diferents escales de temps: La funcionalitat es basa en el
moviment i la forma. No serveix de res fer una “fotografia” de la
molècula, perquè amb el temps es mou i canvia.
o Col·lectius estructurals (ensembles): les macromolècules s’agrupen per
formar col·lectius que duen a terme funcions determinades.
La informació per a l’estructura i plegament de la macromolècula està continguda a
l’estructura primària. Per exemple, en el cas dels monosacàrids, que tenen llocs d’unió
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
determinats per formar polisacàrids, observem que el nombre de possibles
combinacions d’entre 4 sucres diferents augmenta de manera exponencial si
augmentem el nombre de residus (mono, di, tri, tetra, penta, hexa) amb possibilitat de
repetició. En canvi, en proteïnes, les possibles combinacions són més limitades, perquè
la possibilitat d’enllaços és més limitada. Si afegim possibilitat de ramificació de la
molècula (no lineal) el nombre combinacions encara és més gran.
Les macromolècules de l’entorn cel·lular es comuniquen entre elles i desenvolupen la
seva informació en contacte i dependència de l’entorn. Entre unes i les altres,
transfereixen informació (per exemple: transcripció, traducció).
D’ara en endavant, parlarem de les proteïnes. La idea que tenim en ment d’una
proteïnes és la d’una macromolècula perfectament ordenades. Tanmateix, les proteïnes
eucariotes també poden trobar-se desordenades. En general, tenim tres formes d’ordre
de les proteïnes que, en llevat, correspon aproximadament a una tercera part de les
proteïnes totals en cada cas.
Proteïnes altament estructurades (S)
Proteïnes moderadament desdestructurades (M)
Proteïnes altament desestructurades (U)
Aquest curs estudiarem les proteïnes S, però cal tenir en compte que no són les
úniques. Els enzims, per exemple, han de ser proteïnes altament estructurades per tal
de dur a terme una funció específica en relació a altres macromolècules.
Les proteïnes són polímers formats per la unió d’aminoàcids mitjançant enllaços amida
(COOH + NH2 -CONH-). En aquest enllaç tots els àtoms es troben al mateix pla i,
respecte a aquest, surten els H i les cadenes laterals, R). Ho veurem amb més detall a
temes posteriors). En general, els biopolímers consten de parts comunes (cadena
principal de la proteïna o sucre i fosfat en els àcids nucleics) i parts variables (cadena
lateral o base nitrogenada). Això ens genera la necessitat de classificar els diferents
monòmers en funció de criteris determinats.
Els aminoàcids, per exemple, són 20 diferents. Hi ha molts criteris que ens permetrien
agrupar-los, per exemple: polaritat, basicitat, aromaticitat, pes molecular, formació de
ponts disulfur, quiralitat, abundància relativa, essencial o no, càrrega, grups funcionals,
etc.). Però serien criteris massa específics de cada cas, i cada aminoàcids pertanyeria a
grups diferents. Cal definir, doncs, uns paràmetres de classificació inequívoca.
POLARITAT: Observant l’estructura d’una molècula no podem determinar que
sigui polar o no. Per exemple, el dietil èter, aparentment sembla que doni dos
moments polars que s’anul·lin, però en realitat la polaritat global no és del tot
zero. Des del punt de vista pràctic, per determinar si una molècula és polar o
apolar podem veure si és o no dissolvent orgànics de components polars o
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
apolars, respectivament. Que una molècula es dissolgui en aigua no vol dir que
sigui polar, sinó que per tal que ho sigui s’ha de dissoldre més en aigua que no
en un component apolar. Cal tenir també en compte que no hi ha cap aminoàcid
que es dissolgui en èter, per la qual cosa no l’escollirem com a dissolvent apolar.
Si volem veure quin aminoàcid és més polar d’entre la leucina o la isoleucina,
per exemple, els dissolem en aigua i octanol i observem quina repartició
presenta cadascun. Això ens determinarà un coeficient, que és logP (coeficient
de repartiment), que és una mesura experimental que ens determina la relació
entre la concentració en octanol i en aigua que s’hi dissol de la molècula en
qüestió.
ÀREA D’EXPOSICIÓ AL DISSOLVENT: Volem determinar quins aminoàcids es
tronen a la superfície i quins a l’interior de la proteïna. Però , què vol dir estar
dins o fora? Cal establir un criteri de l’accessibilitat del dissolvent al nostre
aminoàcid. A grans trets, si acostem molècules d’aigua i poden accedir al nostre
residu, serà que es troben a la
superfície i viceversa. Una part
de la molècula serà accessible
al dissolvent i l’altra, no. Això
ho puc quantificar i establir un
criteri, que és el SEA (Solvent
Exposed Area), que es basa en
valors estadístics de
probabilitat a tal exposició. Per
exemple, observant la taula de
la dreta, veiem que la serina
(S) té una probabilitat del 70%
de tenir una superfície de 30 Å
exposada al dissolvent, un 20%
que aquesta sigui de menys de
10 Å i un 10% que estigui entre
ambdues superfícies.
Els aminoàcids polars (ho hem determinat
amb logP) coincideixen amb aquells que es
troben més exposats a la superfície. Per
exemple, el s aminoàcids més polars són
l’àcid glutàmic i la lisina (93% per 30 Å),
mentre que els menys polars o exposats
són la cisteïna, la isoleucina i la valina (32%,
39% i 40% respectivament). La cisteïna és
un cas especial, perquè tendeix a formar
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
ponts disulfur amb altres cisteïnes (té un grup tiol a l’extrem de la cadena lateral), que
ajuden al plegament global de la proteïna i, per tant, es troba dins de l’estructura
proteica.
A partir d’aquí podem establir escales d’hidrofobicitat, que segueixen els criteris
establerts. També es poden establir mapes del país dels aminoàcids (cito textualment),
que depenen de les similituds entre dues proteïnes. És a dir, imaginem que tenim dues
proteïnes que s’assemblen molt i conec quin aminoàcid hi ha a una posició determinada
de les proteïnes, però no l’aminoàcid a la mateixa posició de l’altre. Si s’assemblen tant,
puc afirmar que serà el mateix o un altre? Amb quina probabilitat puc dir-ho? Aquests
mapes m’informen en una taula de dues entrades de fins a quin punt puc substituir un
aminoàcid per un altre. Com més gran sigui el número, més probabilitat de substitució.
Evidentment, la substitució d’un aminoàcid per ell mateix és sempre del 100%.
Tot plegat ens porta a establir mapes de coordenades on se situen els aminoàcids en
funció de la mida i la polaritat. Sempre serà més fàcil establir la mida que la polaritat.
També disposem de mapes de substitució d’aminoàcids, ja sigui poc exposats a la
superfície (<10Å) o molt exposats (>30Å). Cal remarcar que la substitució dels
hidrofòbics (es troben dins la proteïna) ha de ser molt específica respecte la mida,
perquè si substitueixo un aminoàcid per un altre de més petit, deixaré buits i això pot
dur a un canvi de conformació de la proteïna, o viceversa, si fos més gran. Els polars, en
canvi, no tenen una substitució tan específica, perquè si es troben a la superfície, més o
menys mida no tindrà importància, però sí una substitució específica respecte la
polaritat, perquè determinarà les propietats de la proteïna.
Res en biologia no té sentit excepte sota la llum de l'evolució
(Theodosius Dobzhansky (1900–1975)
Aprèn els aminoàcids i les bases nitrogenades aquí:
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/aa/aaid/id.html
http://www.sporcle.com/games/sproutcm/amino-acids-from-structures
http://www.sporcle.com/games/ariana24/dnanucleotides
http://quizlet.com/23112797/test
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
2. Modificacions post-traduccionals
Les proteïnes són sintetitzades (traducció de l’mRNA) als ribosomes i un cop abandonat
aquest, una sèrie de mecanisme de modificació actuen sobre elles, en funció del que
se’n pretengui:
Modificacions que porten a la funcionalitat:
Modificació de les cadenes laterals: poden ser reversibles (R) o irreversibles
(IR).
Modificació de l’esquelet
Modificacions que porten a la degradació:
Transport i degradació: poliubiqüitinització i degradació al proteosoma.
A. MODIFICACIONS DE LES CADENES LATERALS
1) Fosforilació (R): tyr, ser, thr, his (les tres primers, al grup -OH)
2) Metilació (R): lys (mono, di, tri). Metilació de les histones!!
3) Acetilació (R en lisina): Lys (N-t). Histones, també!
4) Carboxilació (IR): glu
5) Hidroxilació (IR): pro, lys (hidroxiprolina). Està relacionada amb els primers
descobriments del que són les proteïnes, que es deuen a l’escorbut que patien
els mariners, que s’alimentaven a base de productes càrnics i no obtenien
vitamina, fins que van descobrir que enduent-se llimones no experimentaven la
malaltia. En absència de Vitamina C el teixit conjuntiu no pot mantenir-se, per
manca d’una modificació post-traduccional a la prolina del col·lagen. Per tant, la
hidroxilació modifica la molècula en tant que les seves propietats són totalment
diferents i funcionals).
6) Miristilació (àcid mirístic) (IR): cys, his
7) Addició de sucres (IR): asn
8) Addició de glucofosfolípids (IR): C-t
9) Prenilació (IR): cys
10) ADP-Ribosa (R)
11) Diptamida (IR): his
12) Ubiqüitinització (IR): lys, Senyal de transport cap al proteosoma i degradació.
Cada modificació es dóna a un compartiment diferent de la cèl·lula eucariota:
Citoplasma:
o Eliminació Me inicial
o Acetilació de l’amino
o Miristilació de l’amino
o O-glicosilació amb GlcNAc
o Àcids palmitoílics
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
o Processament de la poliproteïna vírica
Mitocondris i cloroplasts:
o Tall de la seqüència senyal
RE
o Tall de la seqüència senyal
o N-Glicosilació dels residus Asn
o Palmitoil i glicosil-fosfatidilinositol
o Carboxilació de glu
o Hidroxilació de procol·làgena, pro i lys
o Ponts disulfur
Golgi
o Modificacions dels grups N-glicosil
o O-glicosilació de ser i thr
o Sulfatació de tyr
Vesícules secretores i grànuls
o Amidació
o Processament proteolític de precursors
Edmond H. Fisher i Edwin G. Krebs van ser premiats amb el Premi Nobel del 1992 pel
descobriment de la reversibilitat de la fosforilació de proteïnes com a un mecanisme de
regulació biològic. Una tercera part de
les proteïnes humanes estan
fosforilades. En llevat, el 3% de les
proteïnes tenen funció de treure o
posar fosfats:
Cinases: posen fosfats
Fosfatases: treuen fosfats
La presència d’un grup fosfat canvia
totalment l’entorn de l’aminoàcid. Es
tracta d’un grup carregat
negativament. Els residus fosforilats
tenen una càrrega negativa a pH < 5.5,
1.5 càrregues negatives a un pH
aproximadament de 6.5 i 2 càrregues negatives a pH>7.5. (més àcid, menys càrrega).
A la cèl·lula es donen processos de fosforilació en cascada en què una cinasa posa un
fosfat a una segona cinasa i aquesta fa el mateix amb una tercera... i es dóna una
cadena de fosforilacions que donen com a resultat una cascada de senyalització
reversible.
B. MODIFICACIONS DE L’ESQUELET
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Es poden donar dues situacions:
Polipèptids precursors que contenen seqüències de múltiples proteïnes madures
o pèptids diferents. Per tant, d’una sola síntesi podem obtenir-ne diversos
productes (molta eficiència). Per exemple: el producte de traducció de la
propiomelanocortina és tallat i dóna lloc a diversos polipèptids madurs petits. Els
talls poden dur-se a terme de maneres diferents i donar així a productes
diferents.
Polipèptids precursors que contenen seqüències múltiples i idèntiques per petits
pèptids. Són exemples el precursor de l’enkephalina (6 còpies de Met-
enkephalina i 1 còpia de leu-enk) o el precursor del neuropèptid ELH.
El virus de la sida, per exemple (VIH), com ja hem vist extensament a genètica... fa un sol
transcrit que conté 3 gens: gag, pol i env. Gag es pot traduir directament, env també,
però després de gag hi ha un codó stop, de manera que cal un canvi de pauta de lectura
per a que es produeixi un producte gag-pol sencer. Aquest és després processat per una
proteasa. Cadascun dels productes són digerits per donar llocs a polipèptids petits
funcionals, que formaran proteïnes funcionals necessàries per al virus.
Un altre exemple és el cas de la insulina. Es tracta d’una proteïna que és producte de
diferents modificacions funcionals. Una d’elles és la formació de ponts disulfur entre
cisteïnes. Com saben quines
cisteïnes s’han d’emparellar? Al
principi, la insulina es plega
d’una manera determinada, en
tant que les cisteïnes quedin a
prop per formar els ponts
disulfur (recordem, al RE). El
pèptid precursor té un parell de
seqüències que seran eliminades
(en blanc) i un parell de
seqüències que formaran la
proteïna final (negre). Les
seqüències blanques són
tallades a N-t de la negra (talls
de l’esquerra) i a C-t (talls de la dreta). Aquestes seqüències eliminades són necessàries
per a la formació de l’estructura que permeti als ponts disulfur formar-se.
El procés de maduració de les proteïnes està relacionat amb el procés d’splicing de
l’mRNA (eliminació dels introns). En aquest cas parlem d’splicing de proteïnes. La
proteïna es traduïda, experimenta modificacions post-traduccionals i es processa
eliminant les inteïnes (=introns) i unint les exteïnes(=exons).
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Parlem concretament de N-exteïna
i C-exteïna, a banda i banda de la
inteïna, respectivament (figura).
Quina és la reacció química que
s’esdevé?
En primer lloc, els elements que ho
fan possible són les cadenes laterals
de certs aminoàcids: serines i
cisteïnes que es troben a banda i banda de la inteïna a eliminar. Les serines tenen un
grup hidroxil i les cisteïnes, un grup tiol, que actuen igualment en aquest procés.
El procés és el següent:
1) El grup OH de la serina a N-t
de la inteïna ataca el C=O a C-t de la
N-exteïna. No hi ha trencament, sinó
canvi de posició dels àtoms.
2) L’hidroxil de la serina a C-t
ataca l’enllaç format mitjançant una
transesterificació. Exteïnes queden
unides. N-t de la inteïna queda liure.
3) NH2 de la inteïna ataca C=O
propi i exieïnes queden alliberades i
unides.
4) Exteïnes recuperen forma
original per reversió de la reacció
anterior. Obtenim el pèptid madur.
Un exemple real és el cas de
l’autoprocessament de la proteïna
Hedgehog. Aquesta s’uneix a una
molècula de colesterol i duu a terme
l’autocatàlisi. En resum, es trenquen
enllaços, es formen enllaços
“estranys”, es dóna transesterificació
i s’obté un producte final madur de la
proteïna Hedgehog.
Al laboratori, això succeeix de manera espontània en un interval de temps donat,
perquè les inteïnes no tenen una seqüència qualsevol, sinó que la seva estructura és
adequada per a la reacció que hem vist. I com ho podem aprofitar, nosaltres, al
laboratori?
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Com puc fer una proteïna gran que tingui “coses rares”? (Per exemple, un
aminoàcid inventat amb una seria fosforilada).
Una síntesi química (versàtil) et permetrà fer productes no naturals. Em
permet fer coses rares.
Una síntesi biològica et permetrà fer productes naturals. Per exemple,
podrem fer que un bacteri ens expressi una proteïna determinada. Em
permet fer coses grans.
o Així, produïm per síntesi química la part “rara” i per síntesi biològica
la part “gran” i les unim aprofitant les reaccions que ho permetin
imposant les restriccions necessàries. Per exemple, a la imatge, per
síntesi química imposo que l’aminoàcid final tingui un grup tiol enlloc
d’un OH de la metionina (codó d’inici) per tal que es doni la reacció
entre tiols.
A continuació, ens deturarem a analitzar tres experiments que ens duen a l’establiment
d’hipòtesis empíriques per al transport de proteïnes i les seves modificacions. Cal
observar què passa i establir conclusions pertinents a les observacions:
TRANSPORT DE PROTEÏNES I (Albúmina i ferritina)
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Plantejament inicial: les cèl·lules del fetge generen dues proteïnes diferents. Una d’elles
(ferritina) es reté a la cèl·lula, mentre que l’altra (albúmina) és secretada.
Pregunta: Com sap la cèl·lula que una proteïna ha de ser secretada i l’altra retinguda?
Primer fet experimental: Un poliribosoma és un conjunt de ribosomes que tradueixen
un mateix fragment de mRNA. Es poden trobar lliures al citoplasma o units a
membranes. Ambdós tipus de poliribosomes poden separar-se per centrifugació i ser
analitzats independentment. Així, veiem que els poliribosomes lliures produeixen la
ferritina, mentre que l’albúmina és traduïda pels que es troben units a la membrana.
Segon fet experimental: Hi ha vesícules rugoses que contenen poliribosomes adherits
(del RER). Aquests poliribosomes poden alliberar-se de les vesícules si són tractats amb
puromicina. La puromicina fa la mateixa funció que un tRNA, malgrat no ser natural de
l’organisme. La molècula de puromicina s’introdueix al mRNA i bloqueja la síntesi de
proteïnes en tant que queda adherit a la cadena peptídica i aquesta no pot continuar
sent traduïda pels ribosomes.
Resultats: El tractament amb puromicina té dos efectes. En primer lloc, s’atura la síntesi
proteica i la molècula resultant (tros peptídic + puromicina) es desenganxa i queda a
l’interior de les vesícules. Però, a més, els poliribosomes també es desprenen de la
membrana de les vesícules, que passen a ser llises (del SER), i queden lliures al
citoplasma. Si ara analitzem els dos tipus de poliribosomes (els originalment lliures i els
lliures).
Conclusions: Els poliribosomes transcriuen proteïnes diferents en funció del lloc on es
troben de la cèl·lula en un moment determinat. No hi ha poliribosomes diferents que
produeixin proteïnes diferents.
TRANSPORT DE PROTEÏNES II (Ribosomes, RER i SER)
1)
Pregunta: Per què els ribosomes s’uneixen a les vesícules i en quin moment?
Fet experimental: Partim de cèl·lules plasmàtiques que segreguen immunoglobulines
(Ig). Si sotmetem aquestes cèl·lules a un xoc osmòtic (canvi sobtat de la força iònica, és
a dir, la concentració de sals), els polisomes (o poliribosomes) es disgreguen de l’mRNA
que transcrivien. En aquestes condicions, puc tenir ribosomes i mRNA sense que
estiguin junts fent la seva funció. Partint d’aquí, puc decidir començar la síntesi proteica
quan vulgui, mitjançant un canvi de la força iònica adequat. Per tant, la unió o no dels
dos components és un procés reversible.
Si canvio la força iònica i s’inicia la síntesi, el polisoma va produint una proteïna,
començant per l’N-terminal i anant-la fent créixer per unió d’aminoàcids. 30 segons
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
després d’això, quan uns 80 residus d’aminoàcids conformen el pèptid que s’està
formant, s’observa que els polisomes comencen a associar-se a vesícules. Les proteïnes,
aleshores, se sintetitzen cap a l’interior de les vesícules.
Conclusió: Els ribosomes adherits a vesícules (vesícules rugoses) s’hi han unit després
d’haver-se iniciat la síntesi proteica i, per tant, per algun motiu relacionat amb els
primers residus de la cadena.
3)
Pregunta: Què tenen els primers residus de la cadena peptídica que fan que el ribosoma
s’uneixi a les vesícules?
Plantejament inicial: Partim d’un sistema de translocació de cèl·lules lliures, és a dir, un
sistema que conté tots els components (els mínims) necessaris per a la síntesi de
proteïnes. Si en aquest sistema fem que els ribosomes sintetitzin una proteïna, aquesta
és més gran que quan el mateix ribosoma la sintetitza dins la cèl·lula. En concret,
l’extrem N-terminal conté una part addicional que la fa més llarga que la proteïna
nativa.
Fet experimental: Al sistema de translocació de cèl·lules lliures anterior hi afegim un nou
component, en aquest cas microsomes de cèl·lules de pàncrees de gos. Aquests
ribosomes produeixen la proteïna nativa (sense la part afegida a N-t).
4)
Pregunta: Depèn dels microsomes, que la proteïna sigui més o menys llarga?
Fet experimental: Afegim els microsomes en dos moments diferents: abans d’afegir
l’mRNA, just després. Veiem que, en el primer cas, la proteïna formada és directament
la proteïna nativa. En el segon cas, es produeix la proteïna més llarga.
Pregunta: Els microsomes tallen l’afegit proteic de la proteïna nativa?
Fet experimental: Afegim els microsomes un cop la proteïna ja ha estat sintetitzada
completament i observem que no hi passa res.
Conclusió: El que talla les proteïnes no són els microsomes.
Hi ha d’haver una partícula de reconeixement de senyal amb tendència a unir-se a
pèptids hidrofòbics (hidroxileucina). Si no hi poses aquesta partícula de reconeixement
(SRP), la proteïna s’avorta des del principi.
Explicació: Un ribosoma lliure conté unida a ell una SRP. Quan el ribosoma comença a
sintetitzar la proteïna, ho fa iniciant-se per un pèptid senyal (extrem N-t) que la proteïna
SRP reconeix. Aquest extrem queda enganxat al SRP mentre que la proteïna va essent
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
sintetitzada. El RE té receptors de membrana que s’uneixen a l’SRP del ribosoma i
aquest queda adherit a la membrana del RE. En aquest moment, el ribosoma es col·loca
sobre un canal de translocació (forat) i l’SRP s’allibera i es recicla al citosol. La proteïna
que està sent sintetitzada ho fa cap a l’interior del RE. Es tracta d’un cas de
TRANSLOCACIÓ COTRADUCCIONAL, perquè a mesura que va creixent la proteïna, és
empesa cap a l’interior del RE.
Així doncs, una sèrie d’estudis han conclòs que:
Les proteïnes estan distribuïdes desigualment dins les cèl·lules.
Les proteïnes que han de ser exportades són sintetitzades a ribosomes units al
reticle endoplasmàtic. El senyal de localització es troba en el pèptid naixent en
lloc de en la seqüència nucleotídica del mRNA.
La creació de fusions transcripcionals (quimeres polipeptídiques) ajuden a
determinar quina és la direcció i localització de cadascuna de les proteïnes.
Les proteïnes estan marcades per senyals complexos aminoacídics.
Una proteïna en absència del seu senyal és enviada a una destinació incorrecta.
Els senyals poden ser tallats abans d’assolir el compartiment diana.
Una gran varietat de molècules i estructures estan involucrades en la lectura de
les seqüències diana.
C. DEGRADACIÓ DE PROTEÏNES
La ubiqüitina és una proteïna de 76 residus que pot ser conjugada a proteïnes d’una
família d’enzims de sistemes en cascada. Les proteïnes que s’han de degradar són
poliubiqüitinitzades per ubiqüitines lligasa i això serveix de senyal per a dirigir-se i unir-
se a la subunitat 20 S del proteosoma. Aquest és un cilindre buit que té un centre actiu
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
responsable de la proteòlisi. Tanmateix, no és l’únic sistema de degradació. Les
proteïnes extracel·lulars es degraden, en canvi, als lisosomes.
Les accions són bones si es fan quan toquen
(Miquel Pons)
3. Caracterització de biomolècules
Imaginem que aïllem una proteïna desconeguda i volem saber de què es tracta. Per tal
de determinar-ho, disposem de diversos mètodes que la caracteritzaran via:
A) El pes molecular: Quant pesa? Quin volum té? Quina mida?
B) Mapes peptídics: Fem servir l’”empremta digital” de la molècula per identificar-
la.
C) Seqüenciació: Determinació de la seva seqüència.
A. CARACTERITZACIÓ DEL PES MOLECULAR
Les tècniques de determinació del pes molecular s’agrupen en dos grans grups:
1) Tècniques clàssiques:
a. Ultracentrifugació
b. Cromatografia d’exclusió molecular
c. Electroforesi SDS-PAGE
2) Tècniques avançades: Basades en l’espectrometria de masses (EM)
1) Tècniques clàssiques:
Si ja sé de quina proteïna es tracta, n’analitzo el pes molecular. Quin sentit té, si a en
conec la seqüència? Sí. La proteïna, a la cèl·lula o a les condicions experimentals, pot ser
que es trobi formant dímers o trímers. Experimentalment, doncs, determinarem un pes
molecular doble, triple... al que determinem mitjançant la seva seqüència. Així, aquests
mètodes ens aporten informació sobre les associacions i estat de les proteïnes en unes
condicions determinades.
a. Ultracentrifugació
Es basa en fer rotar una mostra, de manera que les partícules que es troben en solució
tendeixen a anar cap al costat exterior del tub en rotació (força centrípeta). Si no fes
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
servir centrifugació, la força de la gravetat causaria la sedimentació al fons del recipient,
però aquesta tècnica n’accelera el procés.
Tanmateix, no totes les coses se’n van al fons del tub, sinó que en funció de la seva
densitat, queden flotant (per exemple, el porexpan) o s’enfonsen (sorra). Aquestes
darreres sedimenten perquè pesen més que el volum del líquid que desplacen.
Si la densitat del líquid que hi ha al tub no és uniforme i es causa un gradient de densitat
(concentració), les partícules que hi dipositi se separaran en funció de la seva densitat,
tot situant-se a la fracció del tub que tingui la mateixa densitat que elles.
Si la proteïna té tendència a dimeritzar, on la concentració sigui més baixa, hi haurà
tendència a trobar la proteïna aïllada, perquè li costarà més trobar “parella” per a
dimeritzar. En canvi, allà on la concentració sigui més elevada, tindrem major nombre
de molècules dimèriques. Tot plegat ens determina dos fets claus:
Pes molecular de la proteïna
Constant d’equilibri del procés de
dimerització (pot ser determinada).
Es tracta doncs d’una centrifugació analítica
d’equilibri. Al gràfic s’observa que com més
t’acostes al fons del tub, més petita és
l’absorbància. Si l’absorbància és: A=Ɛ·c·ltub, vol
dir que l’absorbància és proporcional a la
concentració. Així, la concentració augmenta a
mesura que ho fa el radi. Com més t’apropes al
fons del tub (+ radi), major concentració i més dímers es formen.
b. Cromatografia d’exclusió molecular
Tant la cromatografia d’exclusió molecular com l’electroforesi en gel SDS són tècniques
semblants amb una base comuna. Es tracta de tècniques que separen partícules de
mides diferents i que requereixen algun tipus de filtre per a distingir molècules grans i
petites. La idea, però, s’aplica de maneres oposades.
En el cas de la cromatografia d’exclusió molecular s’omple una columna de boles d’un
polímer porós. Els pors consisteixen en espais buits plens d’aire, la mida dels quals és
coneguda i escollida per nosaltres. Els pors poden ser més grans o més petits.
Si fem passar una partícula gran, sortirà ràpid, perquè no s’introduirà als canals
del polímer i, per tant, tan sols travessarà la columna fins arribar al final.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Si fem passar una partícula petita, sortirà més tard, en funció de la seva mida,
perquè podrà entrar als pors del polímer i el seu “viatge”, doncs, serà més llarg.
La mida dels pors, doncs, determinarà en quin moment la partícula ens arriba al final de
la columna, on és recol·lectada. Això ens permet separar molècules en funció de la seva
mida, que serà proporcional a la massa molecular.
c. Electroforesis SDS-PAGE
Si en comptes de formar espais (polímer de la CEM), fem que el polímer formi una xarxa
contínua les que tenen més possibilitats de creuar són les petites, perquè les grans són
retingudes per la xarxa. I com puc “convèncer als peixos” perquè passin d’un costat a
l’altre de la xarxa? L’electroforesi aplica un camp elèctric per tal que les molècules
migrin cap al pol pel qual se senten atretes, és a dir, cap a la càrrega oposada. Però
també és cert que les proteïnes tenen càrregues molt dispars, i per tant, cal que
assegurem la càrrega d’alguna manera.
Per a homogeneïtzar la càrrega, fem servir SDS. SDS correspon a dodecildulfat sòdic, un
detergent (molècula de la imatge) amb una cua hidrofòbica i una càrrega negativa.
S’uneix no selectivament a proteïnes en proporció de 1 SDS cada 2 aminoàcids. Així
doncs, carrega negativament la proteïna fins al punt que les càrregues positives que hi
puguin haver deixen de tenir importància. Assegurem així que la proteïna migrarà cap al
pol positiu. SDS també desnaturalitza les proteïnes de manera que perden la seva
conformació. Així, s’obtindrà una gran correlació entre el pes molecular i la proteïna en
qüestió.
Ens podríem plantejar el dubte següent: com més gran sigui la proteïna, més càrregues
negatives tindrà. Aleshores, no serà més atreta pel camp elèctric i anirà més ràpid, tot i
ser més gran? Doncs NO. Farem un experiment per demostrar-ho.
Disposem 7 proteïnes diferents i les movem en SDS en camp elèctric en xarxes
de diferents porositats (com més xarxa, menys forats).
Observem el resultat següent:
Com major és la concentració del gel, major és la diferència entre les proteïnes
grans i les petites (menys mobilitat per les grans).
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Com més redueixes la concentració del gel, menys diferències hi ha.
Arriba un moment en què, sense gel, totes les proteïnes es mourien igual
(extrapolació). Però... si tenen més càrrega unes que d’altres... com pot
ser!!?¿?¿ Doncs sí! Es tracta d’una raó hidrodinàmica; moure una cosa més gran
és més difícil que moure una cosa petita. Per tant, la mida va per damunt de la
càrrega.
Què passa si tinc una proteïna gran i una proteïna molt gran? O una petita i una de molt
petita? Les podré separar? En principi, cap de les tècniques mencionades ens permet
diferenciar amb tanta precisió. Per a això ens caldrà fer servir tècniques més avançades,
basades en espectrometria de masses.
2) Tècniques clàssiques:
Les tècniques per espectrometria de masses es basen en:
Una proteïna que conté un cert nombre càrregues positives o negatives, de la
qual en mesurem el paràmetre m/z. Aquest és la relació entre la massa i la
càrrega de la proteïna. Si sabem la càrrega i el valor de la relació, podrem
determinar el pes molecular.
La tècnica fa servir proteïnes ionitzades en fase gas.
Aquestes tècniques ens aporten una sèrie d’avantatges:
Sensibilitat: mesuren masses de quantitats ínfimes (de l’ordre de nm, pm,...)
Precisió: podem distingir proteïnes molt semblants però que es diferenciïn per
petits detalls, com és un sol àtom de fòsfor, o d’hidrogen!!!!
Presenten una sèrie d’utilitats:
Seguiment de reaccions
Modificacions post-traduccionals
Identificació de proteïnes
Seqüenciació de l’ordre dels aminoàcids
Com ja hem dit, un dels requeriments és que la proteïna es trobi en fase gas. Una
molècula com el benzè és fàcilment ionitzable mitjançant un canó d’electrons, però si
seguim aquest procediment amb les proteïnes, se’ns desnaturalitzen. D’aquest
problema han sorgit solucions. Hi ha una sèrie de tècniques que ens permeten obtenir
proteïnes en fase gas. Destaquem les tècniques:
MALDI
ELECTROSPRY (ES)
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Aquestes corresponen a tècniques que permeten ionitzar i volatitzar la proteïna.
Tanmateix, també ens calen analitzadors d’ions:
TEMPS DE VOL (TOF, DE Time Of Flight)
QUADRUPOLS
1. MALDI + TOF
A la tècnica MALDI partim de la proteïna sòlida(purificada) i la mesclem amb una matriu.
Aquesta matriu està composta per molècules orgàniques petites que són capaces
d’absorbir una longitud d’ona que la proteïna no és capaç d’absorbir. A la matriu també
s’hi troben dispersos ions. Si aleshores donem energia a través d’un làser, les molècules
de la matriu absorbeixen l’energia a la longitud d’ona mencionada, des descomposen i
exploten. És tanta l’energia produïda en l’explosió que les proteïnes surten disparades i,
durant el vol, es troben amb ions que també han sortit disparats i se’ls enduen (Na+,
H+,...). Algunes proteïnes no hauran agafat cap càrrega, d’altres n’hauran agafat una,
dues... Aleshores, la massa molecular de la proteïna, en cas que els ions, per exemple,
siguin protons (m protó = 1), serà: Mo+n·1, on n és el nombre de càrregues que haurà
pres.
Fins aquí el fonament de MALDI. Per detectar les proteïnes ionitzades, em cal un
analitzador per temps de vol, TOF. Consisteix en tibar les proteïnes cap a un camp
elèctric i, per tant, només les espècies carregades “volaran” a través del camp.
L’analitzador funciona de la manera següent:
En una primera regió, sotmetem les proteïnes a una força constant i, per tant, la
seva acceleració anirà augmentant.
Deixem d’aplicar la força, de manera que al llarg d’una segona regió les
proteïnes seguiran una velocitat constant segons com s’havien accelerat.
Les proteïnes arriben al detector final en un moment determinat, segons la seva
velocitat
En funció del moment en què arribin al detector podem determinar la seva velocitat
perquè v=x/t. Coneixent la velocitat podem determinar la seva acceleració. I coneixent
l’acceleració podrem determinar la massa perquè F=m·a, i coneixem la força que hem
aplicat. Així doncs, haurem obtingut la massa de la molècula. De fet, el que determinem
realment mitjançant TOF és la relació m/z mitjançant l’equació següent:
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Nosaltres el que rebrem serà una sèrie de pics corresponents als ions de què s’hagin
rebut senyal, relacionant la seva relació m/z i la intensitat de l’ió. Per exemple, per
l’espectre de masses de la seroalbúmina rebrem:
Dels pics rebuts deduïm que:
Un pic 1: m/z=33,22
Un pic 2: m/z=66,43
El pic té una relació m/z doble que
la del pic 2. Per tant, el pic 1 ha agafat un
protó més que el 2 (dividim entre z). Així:
Pic 1: M+2H+
Pic 2: M+H+
Intensitat pic 3 = 4 x intensitat pic
1. Per tant, només pot ser que sigui 2M+H+ (pic 2 x 2)
Pic 4 = pic 1 x 6 o bé pic 2 x 3. Per tant: 3M + H+.
L’espectre té una sèrie de pics de fons que no corresponen a res, sinó a soroll aleatori
que, estadísticament sempre és diferent. Si fos igual podríem sospitar que es tracta
d’un... FRAU!
2. ELECTROSPRY + QUADRUPOL
L’electrospry (ES) parteix d’una proteïna en solució aquosa tampó. Si aleshores insertem
aquest tampó dins el sistema (capil·lar metàl·lic) sotmès a:
Pressió baixa
Camp elèctric molt intens
Quan torna a sortir es forma un spry, és a dir, petites gotetes de líquid que conté les
proteïnes. Les gotetes aleshores s’evaporen i a mesura que ho fan es van fent petites
progressivament. Arriba un moment en què són tan petites que exploten perquè els
ions del seu interior es repel·leixen. Generen noves gotes que repeteixen el procés
diverses vegades fins que obtenim la proteïna sense aire que ha arrossegat un
determinat nombre d’ions.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
El resultat és un espectre de m/z que
mostra l’abundància dels ions, tal
com en el cas de MALDI. En aquest
cas, però, la colla de pics tenen
números m/z molt més petits i les
espècies tenen moltes més
càrregues/pic. Obtenim, a més, tota
la sèrie (valors consecutius). Com
més gran és la proteïna, més
càrregues tindrà. Però, quina és la
massa? La massa l’obtindrem
mitjançant sistemes d’equacions. Per
exemple si sabem que:
(
)
(
)
ja podem resoldre tant el valor de la M com el de n. Automàticament, però, l’ordinador també
ho sap resoldre.
Quines aplicacions tenen ambdós mètodes?
Determinar la massa ens permet determinar el pes molecular. I, el PM, ens serveix per
diferenciar proteïnes diferents.
També, per exemple, podem predir quin seria el mecanisme d’una determinada proteasa en
una proteïna determinada. Incubo la proteïna amb la proteasa i després analitzo el pes dels
diferents fragments. Sabem que una proteasa és específica de seqüència i, per tant, em talla per
un lloc determinat, sempre igual. La màquina aleshores compara els fragments amb els que
s’esperaria d’una proteïna determinada coneguda. D’aquí podrem identificar seqüències de la
proteïna i, finalment, saber de què es tracta, en cas que aquesta es trobi a les bases de dades.
És difícil fer amics al mig del desert
(Miquel Pons)
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
4. Seqüenciació de proteïnes mitjançant espectrometria de masses.
Fins ara, mitjançant mètodes d’espectrometria de masses (MS) hem aconseguit
determinat el pes molecular de la proteïna en qüestió. Tanmateix, pot ser que es tracti
d’una proteïna desconeguda de la qual vulguem conèixer quins aminoàcids la formen i/o
en quin ordre es troben aquests residus al llarg del pèptid. És possible fer aquesta
seqüenciació proteòmica mitjançant espectrometria de masses.
Hi ha tres mètodes que ens permeten dur a terme una espectrometria de masses en
tàndem:
MS per quadrupol triple: El primer espectròmetre de masses selecciona els ions i
els traspassa a una cel·la de col·lisions. Els fragments obtinguts se separen a un
analitzador de masses.
MS per quadrupol amb trampa d’ions: Els ions són injectats a la trampa de
l’espectròmetre des d’una font externa d’ions. Un ió precursor és seleccionat
mitjançant el volum de la trampa. Un voltatge de ressonància és aplicat a la
trampa, resultant en diversos fragments de l’ió. Aquests fragments són
aleshores escanejats mitjançant el traspàs de la trampa a un detector.
MS per TOF: Els ions són accelerats mitjançant una força des de la font d’ions a
una regió de la cel·la. Quan deixa d’aplicar-se la força, continuen movent-se a
una velocitat constant gràcies a un camp elèctric fins a arribar al detector. Allà
es determina m/z en funció del moment d’arribada.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Com es duu a terme la seqüenciació per espectrometria de masses?
En primer lloc, cal trencar la nostra proteïna mitjançant col·lisions amb gasos inerts.
Això ens servirà per generar tota una sèrie de fragments útils per a la seqüenciació.
1) Disposo d’una mostra de proteïnes diferents amb càrregues diverses. Em cal
aïllar la proteïna d’estudi. Això ho duc a terme per electroforesi. Finalment em
quedo amb un sol tipus de molècula subjecte d’estudi.
2) Introdueixo la meva molècula (ió) a una cel·la de col·lisions amb un gas noble. Es
generen fragments de diverses mides (totes les mides possibles entre residus si
considerem que només es dóna una col·lisió per proteïna). *El trencament
considerem que només es dóna via l’enllaç peptídic (enllaç amida).
3) Un segon analitzador rep els productes de la col·lisió i n’analitza la relació m/z. A
partir d’aquí calculo la massa de cada fragment.
4) Obtindrem un mapa peptídic com el següent:
S’observen una sèrie de pics anomenats com a Ynº. Aquests pics corresponen a
fragments de massa creixent que difereixen en una certa massa. Aquesta diferència
entre pics consecutius correspondrà a la massa d’un dels 20 aminoàcids existents. Al
gràfic s’observa també l’abundància relativa de cadascun dels pics, i això ens indica que
un major nombre de molècules s’han fragmentat just en aquell residu. Els pics que no
estan marcats amb Y no corresponen a cap aminoàcid, perquè la diferència respecte
l’anterior no difereix en la massa de cap dels 20 aminoàcids existents.
És possible que la proteïna a analitzar es tracti d’una molècula molt gran, és a dir, d’un
gran nombre de residus. En aquest cas, el nombre de fragments obtinguts seria molt
Cys Ala
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
gran. L’analitzador, però, imposa un nombre de fragments límit. Per tant, ens cal una
solució.
Per a analitzar proteïnes grans ens cal escindir-les en fragments per acció d’una
proteasa. Aleshores, se’ns generen una sèrie de fragments que podrem analitzar
independentment i, dels resultats obtinguts per a cada cas, podrem destriar-ne la
seqüència completa. Però, en aquest punt, com sabem quin dels fragments anava
primer? La proteasa que hem fet servir per tallar els fragments és un enzim que
reconeix i talla unes seqüències determinades. Per tant, tots els fragments hauran de
començar i acabar per una mateixa seqüencia (tret dels extrem N i C terminals). Per
tant, podrem anar solapant els diversos fragments per a obtenir seqüències molt
llargues (aquesta tècnica, aplicada al DNA, ens serveix per a seqüenciar un genoma
complet).
Avui dia, la seqüència de totes les proteïnes es coneix o es pot conèixer, sobretot
gràcies al fet que coneixem la seqüència del DNA complet (genoma) i les seves
seqüències codificants per a les proteïnes existents. Què és el que diferencia les anàlisis
de la seqüència de proteïnes respecte a les de DNA?
Proteïnes: Les anàlisis sempre es basen en trencaments aleatoris i en la
comparació dels pesos moleculars dels fragments obtinguts.
DNA: Es basa en la propietat de construcció del DNA i en la síntesi de la cadena
complementària d’allò que volem seqüenciar.
Seqüenciació de DNA:
La seqüenciació del DNA pot dur-se a terme mitjançant dos mètodes: la seqüenciació de
Sanger i la piroseqüenciació.
A) La seqüenciació de Sanger:
El primer pas és la separació de la doble hèlix de DNA per a donar dues cadenes
simples. Aleshores, les cadenes senzilles es disposen en 4 solucions buffer que contenen
desoxiribonucleòtids (algun d’ells marcat radioactivament), DNA polimerasa i primers
per iniciar la polimerització. A més, cadascun dels buffers conté didesoxiribonucleòtids
(desoxiribonucleòtid sense –OH a 2’ i 3’) d’una base determinada a cada solució (A, G,
C, T). El resultat és una sèrie de fragments de DNA que han pogut créixer fins que un
didesoxiribonucleòtid s’ha afegit a la cadena, moment en què l’elongació s’ha aturat
perquè en absència del 3’OH no es pot formar l’enllaç fosfodièster. Aquest pas es duu a
terme mitjançant PCR, que amplificarà els fragments d’estudi. S’hauran format
fragments de totes les possibles longituds (diferint en un nucleòtid cadascun). Els
fragments de cada buffer són aleshores disposats a quatre carrils diferents
d’electroforesi amb gel de poliacrilamida, en els quals s’obtenen diverses bandes que
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
poden observar-se per autoradiograma. A partir d’aquestes bandes, podrem determinar
la seqüència del fragment de DNA objecte d’estudi.
http://www.youtube.com/watch?v=91294ZAG2hg
B) La piroseqüenciació:
És un dels mètodes més emprats i simples per a analitzar SNIPS.
Es basa en la seqüenciació per síntesis i en l’alliberament d’un pirofosfat quan un
nucleòtid és incorporat a un extrem 3’ lliure de la cadena. Cal, en primer lloc, disposar
en una placa la cadena motlle, l’encebador i la DNA polimerasa. En aquest cas, però, en
lloc d’oferir 4 bases (A, G, C, T), n’ofereixo només una (G o C o T o A). Per exemple,
imaginem que comencem oferint només GTP. Aleshores, poden passar dues coses:
No toqui incorporar G i, per tant, no s’hi pugui addicionar cap nucleòtid. No es
dóna reacció química.
Toqui incorporar una G perquè la seqüència motlle llegida té una C. Es dóna
reacció química. En aquest moment, s’allibera un grup pirofosfat. D’aquest
grup, gràcies a un enzim ATP sulfurilasa i adenosina 5’ fosfosulfat (APS), se’n
forma ATP. Aquest ATP és aleshores utilitzat per un enzim luciferasa per a
produir llum (rebem senyal = pic). Finalment, l’enzim apyrasa, degrada els
nucleòtids GTP que hi ha al medi.
Un cop s’ha degradat el GTP o bé no s’ha donat reacció perquè no tocava, el sistema
introdueix un nou tipus de nucleòtid (C o T o A) i el procediment es duu a terme de la
mateixa manera. En el cas de l’addició d’ATP, com que aquest és el responsable que la
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
luciferasa emeti llum, cal afegir un nucleòtid modificat amb sofre, per tal que no l’utilitzi
però sí polimeritzi al DNA.
http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA
5. Seqüenciació de proteïnes sense espectrometria de masses.
Es basa en aquelles reaccions químiques que poden dur-se a terme sobre el primer
residu de la cadena, però no sobre els altres: reaccions selectives. Hi ha dos mètodes de
seqüenciació sense MS: reacció del residu N terminal i degradació d’Edman.
A) Reacció del residu N terminal:
Es basa el grup amino lliure d’aquest extrem, que a diferència de la resta, no es troba
formant l’enllaç peptídic. La reacció es dóna amb clorur d’àcid sulfònic (sulfonamida),
que “marca amb fluorescència” aquest extrem. Aleshores, s’hidrolitzen els enllaços
peptídics per tal d’obtenir els aminoàcids. Només un d’ells estarà marcat i correspondrà
al primer aminoàcid de la cadena (a N-t). Tanmateix, cal tenir en compte que hi ha
aminoàcids que també tenen grups amino (lisina en té dos) i, per tant, també quedaran
marcats. De la lisina, però, n’obtindrem una marca doblement visible, perquè estarà
doblement marcada. D’aquesta manera la podrem descartar, si és que no és el primer
aminoàcid. Per tal de fer aquesta anàlisi de l’aminoàcid marcat es duu a terme una
cromatografia.
B) Degradació d’Edman:
El procediment d’aquesta seqüenciació es basa en marcar i eliminar només el residu N
terminal de la cadena, deixant intacta la resta.
1) Mantenim “enganxada” la proteïna a un suport sòlid per l’extrem C
terminal.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
2) Es fa reaccionar la cadena a seqüenciar amb un reactiu PITC (fenil
isotiocianat). Aquest reacciona amb el grup amino terminal.
La reacció s’ha de dur a terme a pH bàsic (entre 9 i 9,5).
3) S’afegeix àcid (TTA, HCl,... pH= 1,2). Això facilita el trencament d’un
enllaç peptídic degut a l’adició anterior del PITC.
4) El residu N terminal s’analitza mitjançant HPLC (cromatografia líquida
d’alta resolució).
5) S’ha generat un nou residu N terminal, que pot ser analitzat de la
mateixa manera. I així consecutivament, anem repetint el procés.
Tanmateix, aquest sistema té limitacions. No podem analitzar una proteïna de número
indefinit de residus. Com que cada vegada tenim menys producte per analitzar, arriba
un moment (als 30-40 residus seqüenciats) en què no es pot continuar. Per tant, ens
caldrà generar un fragment que comenci més endavant per a continuar la seqüenciació
i unir els resultats de les diferents anàlisis (solapament).
Moltes vegades, la seqüenciació d’Edman s’utilitza per a saber per on s’ha degradat una
proteïna. Només cal seqüenciar uns 5 o 6 residus, perquè aleshores es compara amb la
proteïna, ja seqüenciada i coneguda, i es determina el lloc de trencament.
Per a què pot fer-se servir l’espectrometria de masses?
Molt sovint s’utilitza per determinar el pes molecular d’una proteïna.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
També per determinar l’accessibilitat d’una proteïna de la càpsida viral a un
reactiu petit concret (acetilació, aigua deuterada...) amb què volem tractar
aquest virus. Si es modifiquen els grups amino terminals (a l’analitzar-la la
proteïna pesa més) d’aquestes proteïnes significa que el reactiu sí que és
accessible a la càpsida.
* L’aigua deuterada és H2O modificada per D2O. La diferència es basa en el fet
que la massa de l’hidrogen és 1 i la del deuteri és 2. Aleshores, si la proteïna
abans pesava X, ara pesarà una unitat més per hidrogen que contenia. Però per
tal que això es doni, cal que aquest hidrogen sigui bescanviable i accessible. Si
coneixem l’increment de pes que s’ha donat respecte la proteïna inicial, sabem
quants hidrògens han estat bescanviats per deuteri i això significa que hi ha
tants hidrògens exposats a l’aigua deuterada.
5. Estructura de proteïnes
L’estructura secundària de les proteïnes implica regularitats locals. Aquestes regularitats
es deuen a les pròpies regularitats de la seva estructura primària.
L’enllaç peptídic és el resultat de la condensació del grup carboxil d’un aminoàcid amb
el grup amino d’un altre, amb l’alliberació d’aigua. Aquesta reacció no és espontània en
dissolució i, per tant, requereix un aportament d’energia (in vivo, gràcies a l’acoblament
a RNA de transferència). L’enllaç peptídic (amida) presenta ressonància entre dues
formes extremes. Aquest fet determina un híbrid de ressonància amb un enllaç que és
intermedi entre un de simple i un de doble. Això explica el fet que el C carbonílic amb el
seu hidrogen i carboni alfa, així com el nitrogen amb el seu hidrogen i carboni alfa,
siguin coplanars (respectivament). L’enllaç peptídic pot ser cis (els dos carbonis α es
troben al mateix semiplà definit pel l’eix de l’enllaç doble) o trans (es troben en
semiplans diferents, menor energia). La majoria dels enllaços peptídics de les
proteïnes són trans, tret del cas especial de la
prolina, perquè la seva cadena lateral es troba
unida al nitrogen de l’enllaç peptídic. En
aquest cas, trans és molt poc més estable
que cis, així que la podem trobar
indistintament d’una manera o altra.
L’enllaç peptídic, doncs, pel fet que té caràcter d’enllaç doble, no permet la rotació. Per
tant, l’angle de rotació al seu voltant pot ser o 0º (cis) o 180ª (trans). La resta
desestabilitzarien la molècula en gran mesura; es trencaria la ressonància i es
convertiria en un enllaç senzill ordinari.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Un pèptid és una successió de plans peptídics en què es troben els carbonis alfa. Cada
pla peptídic conté àtoms de dos residus consecutius. Cada carboni α forma part de dos
plans peptídics (anterior i posterior). L’orientació d’aquests dos plans respecte al pla
addicional format pel propi carboni alfa, el seu hidrogen i el primer àtom de R, està
determinada pels angles Φ (phi) i Ψ (psi).
Φ mesura el gir entorn de l’enllaç
que uneix el carboni α d’un residu i
el N del mateix residu i pertanyent
al pla peptídic anterior.
Ψ mesura el gir entorn de l’enllaç
que uneix el carboni α amb el
carboni del grup carbonil del mateix
residu i pla peptídic posterior.
http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/ep_spt/index.html
La conformació global d’una proteïna queda perfectament
definida per aquests dos angles. Aquests dos angles
no estan fixats a priori, perquè són senzills.
Tanmateix, no poden adoptar valors qualsevols
perquè en alguns d’ells es produeixen xocs estèrics
entre els plans anteriors i posteriors o amb les cadenes
laterals del residu. Ramachandran i col·laboradors van
determinar els valors permesos dels angles Φ i Ψ. La representació es coneix amb el
nom de mapa de Ramachandran. En aquest diagrama, les coordenades de cada punt
representen una parella de valors de Φ i Ψ. Les zones on apareixen parelles de valors
permesos es presenten ombrejades. Els aminoàcids solen tenir mapes molt semblants
entre ells, tret del de la glicina, la prolina i els residus X-prolina. Cada mapa consisteix en
dues grans zones permeses amb valors negatius de Φ, i una petita regió positiva
d’aquest angle. La glicina té més zones permeses des d’un punt de vista energètic,
perquè la seva cadena lateral es compon d’un sol hidrogen. A les proteïnes, els residus
adopten valors de Φ i Ψ de dins de la zona permesa. La denominació permesa i no
permesa no és gaire encertada. No es produeix un salt brusc d’energia a la frontera
d’ambdues regions, sinó un augment progressiu. I a més, el cost energètic d’adoptar
valors no permesos pot ser compensat per l’establiment de noves interaccions
estabilitzants.
De les restriccions conformacionals derivades dels enllaços peptídics, les proteïnes
veuen delimitades les seves conformacions perquè els angles de rotació dels enllaços de
les cadenes laterals adopten valors que condueixen a les formes més estables (no
atzarosament). Aquests enllaços són denominats X1, X2, etc. L’angle preferit és aquell
que situa els substituents al més allunyats possible (conformació alternada). Per l’angle
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
X1 hi ha tres conformacions alternades: gauche+, gauche- i trans. Les més estables són
la gauche+ i després la trans. Cadascuna de les conformacions rep el nom de rotàmer.
Com major la cadena lateral, major nombre de rotàmers. Malgrat el gran nombre de
restriccions, el número de possibles conformacions que pot adoptar una proteïna és
astronòmic.
Estructura secundària de proteïnes:
El mapa de Ramachandran mostra l’existència, a grosso modo, de dues zones d’angles
Φ i Ψ permesos, les dues amb valors negatius de Φ (phi) i que es diferencien pel valor
negatiu o positiu de Ψ (psi). Quan analitzem l’estructura tridimensional d’una proteïna
s’observa que hi ha regions en què els carbonis αconsecutius adopten angles de Φ i Ψ
molt similars, que cauen en una de les zones permeses del diagrama. Això determina
que la cadena peptídica adopti en aquestes regions, una disposició periòdica de les
seves unitats peptídiques. Les dues disposicions periòdiques tenen, forma d’hèlix (hèlix
alfa) o de cadena estesa (bri β). L’associació de bris β mitjançant ponts d’hidrogen dóna
lloc a les làmines β.
a) Les hèlixs α
Qualsevol estructura regular d’un polímer és una hèlix. Una hèlix és el resultat d’un gir i
una translació, lligats ambdós. Les hèlixs es caracteritzen per diversos paràmetres:
1) Radi/diàmetre
2) Pas de rosca: distància entre punts equivalents.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Pas
de
rosc
a
3) Avenç per residu: si l’hèlix està formada per
elements discontinus. (per exemple una
proteïna) cal que els residus vagin agafant els
mateixos valors de psi i phi, de manera que
anem generant “l’escala de cargol”.
A les proteïnes, les hèlix reben noms diversos en funció de
les seves propietats. Existeixen hèlixs alfa, làmines o fulls
beta (també són helicoïdals). Les hèlixs possibles estan
compostes per residus que es troben a regions permeses
del mapa de Ramachandran.
* Característiques de les hèlixs alfa:
Una hèlix alfa és qualsevol seqüència formada per
5 o més aminoàcids consecutius d’una proteïna
amb angles Φ d’aproximadament -57º i de Ψ d’aproximadament -47º. A
l’adoptar-los, el grup CO de l’aminoàcid i queda a la distància i orientació
adequades per formar un pont d’hidrogen amb el NH de l’aminoàcid i+4.
Els 4 grups CO de l’extrem C terminal de l’hèlix i els 4 grups NH de l’extrem
amino terminal no compleixen aquestes normes, perquè l’hèlix acaba amb ells.
Les hèlixs alfa donen una volta al voltant del seu eix cada 3,6 aminoàcids,
avançant 0,45 nm al llarg de l’eix.
Els plans peptídics queden disposats gairebé paral·lels a l’eix, de manera que els
seus dipols queden alineats.
Les cadenes laterals surten del cilindre apuntant cap a l’exterior de l’hèlix no
totalment perpendiculars, sinó inclinades lleugerament cap a l’extrem amino.
Les hèlix són objectes quirals no idèntics a les seves imatges especulars. Les hèlix
alfa de les proteïnes són de tipus R.
Els residus hidrofílics i hidrofòbics es
troben en costats oposats de l’hèlix
(amfipàtiques). Això els permet, per
exemple, empaquetar-se amagant les
parts hidrofòbiques en presència d’aigua.
El grau d’exposició a l’aigua es pot deduir
mitjançant la representació de “roda
helicoïdal”. Quan els residus polars
s’agrupen a una cara i els apolars a
l’altra, es tracta d’una hèlix amfipàtica. Si
la pràctica totalitat de l’hèlix consta de
residus apolars, es tracta d’una hèlix
enterrada a l’interior de l’estructura
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
proteica i si consta de residus polars, es tracta d’una hèlix totalment exposada.
L’estabilitat d’una hèlix depèn de:
o Els aminoàcids que la componen
o La posició que ocupen aquests aminoàcids
o Interaccions entre cadenes laterals disposades a i - i+4
o Interaccions d’empaquetament amb la resta de la proteïna
Com hem vist, els residus de les hèlixs alfa formen ponts d’hidrogen entre i – i+4 (per
exemple, entre els residus 1-5, 2-6 o 3-7, etc.). Això suposa un benefici. Si els enllaços
amida formen ponts d’hidrogen de manera regular es determina una estructura
estable. Tanmateix, hi ha tres hèlix de naturalesa diferent degut als ponts hidrogen que
formen:
Hèlixs 3-10: té un forat central. És molt més abundant que l’hèlix pi. 3 residus
per volta. i-i+3 (imatge: 1-4, 2-5, 3-6)
Hèlixs alfa: la més estable i abundant. Molt més compactada (interior total i
perfectament empaquetat). 3,6 residus per volta. Ponts d’hidrogen i-i+4.
(imatge: 1-5, 2-6, 3-7, 4-8, 5-9)
Hèlixs pi: té un radi molt més ample (genera un forat). 4,3 residus per volta. i-i+5
(imatge: 2-7, 3-8, 4-9)
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Cercles: residus hidrofílics, quadrats: residus hidrofòbic, triangles: residus molt carregats
negativament i pentàgons: positivament. Verd: els més hidrofòbics, groc: hidrofobicitat
zero, vermell: els més hidrofílics, blau: potencialment carregats.
Les hèlixs es dobleguen formant estructures de superhèlixs, de manera que la part
situada a l’interior sigui la regió hidrofòbica. Aquestes hèlixs es pleguen formant un cert
angle, en tant que les cadenes laterals s’han d’encaixar d’una determinada manera.
Com es forma una hèlix?
L’hèlix es forma perquè energèticament és més favorable que no pas estant
desplegada. Per tal de formar-la, la força determinant és la que generen els ponts
d’hidrogen. La formació d’un pont d’hidrogen comporta una despesa entròpica; una
cadena sense hèlixs alfa té molta llibertat d’angles psi i phi i, per tant, estar en forma
desplegada comporta un guany entròpic. Quan es forma l’hèlix, per contra, només es
poden adoptar uns angles psi i phi determinats (mapa de Ramachandran) i aleshores es
perd entropia. Però el guany de ponts d’hidrogen és més rellevant perquè:
El primer pont d’hidrogen necessita de molta energia per formar-se.
El segon ens comporta molta més estabilitat que l’energia que “paguem”.
Per tant, el guany és cooperatiu, i el balanç global entre fets favorables i desfavorables
és positiu, perquè costa molt començar, però un cop fet, es dispara!
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Hi ha fets claus que ajuden a iniciar el procés de formació de ponts d’hidrogen per a
l’establiment de l’hèlix. Les prolines són incompatibles amb l’hèlix alfa, per tant, poden
ser primeres en l’hèlix. Tanmateix, el problema es dóna quan formen part del seu
interior. Són els extrems N terminal i C terminal que ajuden a començar i acabar de
formar l’hèlix. L’extrem N terminal:
Ser-X-X-Glu es troba amb freqüència a l’extrem N-t. Aleshores aprofita la cadena
lateral de la serina per formar un pont d’hidrogen amb l’àcid glutàmic. A partir
d’aquí, el plegament s’esdevé amb facilitat i rapidesa.
* Característiques dels fulls beta:
També són hèlixs (polímer regular). Si ens fixem en un carboxil de referència, veiem que
una cadena plana, per cada 2 residus gira 360º. Aleshores, els carbonils miren amunt i
avall successivament. En aquest cas, els ponts d’hidrogen es formen entre fragments
distants de la cadena.
Hi ha dos tipus de cadenes:
Aquelles que corren en una mateixa direcció (full beta paral·lel)
Aquelles que corren en direccions oposades ( full beta antiparal·lel)
Els extrems del full beta representen un problema. D’aquesta manera, algunes
proteïnes ho solucionen formant un barril.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Una mateixa proteïna pot tenir regions en hèlix alfa i d’altres en làmina beta. Per
exemple, a la imatge següent s’observa com la làmina beta presenta una curvatura
perfecta per tal que s’hi posi una hèlix alfa al damunt. Les regions blanques són
segments de la proteïna que no es troben plegats.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Tècniques de determinació de l’estructura de proteïnes:
A continuació, parlarem de diverses tècniques que ens permeten determinar
l’estructura de proteïnes. Contestarem les següents qüestions:
a) Quina és la tècnica i quina informació ens dóna?
b) Com s’interpreta la informació?
c) Quines limitacions té?
d) Fins a quin punt aquest model és real?
És molt important tenir en compte que tota la informació que trobem a les bases de
dades fa referència a models basats en la interpretació d’un investigador determinat.
Per exemple, al PDB (Protein Data Bank) hi trobem gran quantitat de figures
estructurals que provenen d’anàlisis per difracció de raigs X i per ressonància magnètica
nuclear, i la posterior interpretació per part dels investigadors.
Des del 1993 fins a l’actualitat, l’augment de nombre d’estructures proteiques en bases
de dades ha augmentat exponencialment gràcies al desenvolupament de noves
tècniques com les que es tractaran a continuació.
1. DIFRACCIÓ DE RAIGS X
La difracció de raigs X té una sèrie de requeriments experimentals per poder-se dur a
terme:
Es necessita la proteïna en forma de cristalls (aproximadament de 0.2 mm3)
Es necessita una font de raigs X (actualment es fa servir la radiació de
sincrotrons).
Problema de la fase. Cal resoldre’l per experiments addicionals.
La tècnica de difracció de raigs X ens proporciona la informació següent:
Estructura de proteïnes globulars (només obtenim informació de proteïnes que
es puguin cristal·litzar (p. globulars); les proteïnes desordenades no es poden
cristal·litzar i caldrà analitzar-les per altres tècniques).
Permet estudiar estructures molt grans. El límit de mida per a RX és el més ampli
d’entre totes les tècniques.
La seqüència d’esdeveniments que segueix la cristal·lografia de raigs X és la següent:
1) Purificació de la proteïna d’estudi
2) Cristal·lització de la proteïna
3) Difracció de raigs X
4) Avaluació de les dades obtingudes
5) Resoldre el problema de les fases per càlculs de la densitat electrònica
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
6) Construcció i refinament
7) Validació
8) Construcció i obtenció del model final
El requeriment principal és disposar de cristalls únics, homogenis i de bona qualitat.
a. Com s’obtenen els cristalls?
Els cristalls de qualsevol substància s’obtenen a partir d’una solució sobresaturada,
mitjançant l’addició de molècules de solut a un nucli inicial de cristal·lització. Si la
solució no estigués saturada no es donaria canvi de fase.
La sobresaturació és una situació en la qual hem incorporat més solut del que admet la
solució. Per exemple, si disposem tant sucre com sigui possible en aigua, mesclem a alta
temperatura i deixem refredar, no succeirà cristal·lització. Però si hi afegim una
branqueta de canyella o anís, es formaran cristalls de sucre sobre la branca. Aquesta
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
intrusió ha aportat energia (energia d’activació de la formació de cristalls ordenats) i ha
proporcionar una superfície sobre la qual s’han generat nuclis inicials de cristal·lització.
L’objectiu, doncs, de la cristal·lització és disposar d’una dissolució sobresaturada que
generi nuclis de cristal·lització sobre els quals creixin uns pocs cristalls. Tanmateix, si la
concentració és massa elevada i es dona per un canvi brusc, es poden formar agregats
amorfs que no ens són útils per a les anàlisis. Per tant, la cristal·lització s’ha de dur a
terme molt a poc a poc per passar d’una situació metastable a una d’inestable.
L’estratègia consisteix en disposar d’una concentració inicial i anar-la augmentant per
eliminació d’aigua i per introducció de canvis que disminueixin la solubilitat de la
proteïna. D’entre aquests factors de canvi, els més habituals són:
1) Eliminació d’aigua
2) Ph (menor solubilitat a pH isoelèctric)
3) Temperatura (les proteïnes són més solubles a baixa temperatura. S’afegeix la
sal en fred i es deixa que s’assoleixi la T ambient per a la cristal·lització).
4) Baixa concentració salina (algunes proteïnes (globulines) requereixen la
presència de sal per a ser solubles; altres (albúmines), no).
5) Alta concentració salina
6) Solvents orgànics
7) Precipitants polimèrics
8) Lligands de proteïna
La tècnica més comuna es basa en l’assoliment de la sobresaturació mitjançant difusió
de vapor. Una petita gota preparada mesclant a parts iguals la solució de la proteïna i la
de cristal·lització es manté dins d’una cambra hermètica formada per un reservori que
conté un volum molt més gran de solució de cristal·lització, sense que la gota i la solució
entrin en contacte. La pressió de vapor de l’aigua és major en la gota que en el reservori
i, per tant, la gota per a poc a poc aigua fins que la concentració de precipitants a la
gota i la concentració del reservori són iguals. Hi ha dues modalitats principals per a
aquesta tècnica:
1) Gota penjant
2) Gota assentada
b. Com s’obtenen les condicions òptimes per a la cristal·lització?
Quan una proteïna no ha estat mai cristal·litzada, cal iniciar l’experiment amb una cerca
de les condicions òptimes per a la cristal·lització. El número de factors a controlar és
immens, de manera que s’han desenvolupat matrius que exploren l’espai de
cristal·lització. S’hauran de tenir en compte els següents fets:
Optimització de la construcció
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
– Eliminació de regions desordenades (que no cristal·litzen)
– Bon rendiment i solubilitat
Paràmetres de cristal·lització
– Combinació de dissolvent/precipitant
– Temperatura, etc.
– Robots de cristal·lització
Optimització i conservació dels cristalls
– Criopreservació
Obtenció del diagrama de difracció
– Grup de simetria, cel·la (mateixa proteïna pot cristal·litzar en diverses formes)
– Resolució
c. Com són els cristalls?
L’estructura cristal·lina està caracteritzada microscòpicament per l’agrupació de
components (ions, àtoms o molècules) segons un model de repetició periòdica,
tridimensional per translacions. La repetitivitat constitueix una xarxa cristal·lina. El
conjunt mínim de repetició ordenada en les tres dimensions de l’espai rep el nom de
cel·leta elemental o cel·leta unitat. Les tres translacions formen un prisma definit per
tres eixos i tres angles interaxials que serveixen de sistema de coordenades per definir
la posició dels àtoms.
També es donen elements de simetria que provoquen repeticions dins la cel·leta
elemental.
d. Què fem amb els cristalls?
La difracció de raigs X és la interacció dels raigs X amb els cristalls d’estudi. Quan hi
incideix, aquest raig interacciona amb els electrons dels àtoms del cristall, els fa vibrar
acobladament amb les variacions periòdiques del seu camp elèctric. Aleshores els
electrons donen lloc a un nova radiació, que pot ser per dispersió si s’interfereixen, o
per difracció si cooperen entre ells.
Sigui com sigui, els raigs X tenen una longitud d’ona molt petita per tal de poder
visualitzar unitats molt petites de l’ordre d’Å (veurem àtoms).
Els raigs X incidents a la nostra mostra i difractats, incideixen sobre un detector
electrònic que ens proporciona una imatge amb una sèrie de punts discrets que
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
reflecteixen la regularitat del cristall en funció de la intensitat dels punts. L’ordinador
ens preguntarà quina és l’amplitud de l’ona, que és coneguda, però també la fase.
Aquesta última no la podem conèixer experimentalment. Es tracta del problema de la
fase.
La informació experimental ve de la intensitat dels pics de difracció en diferents
posicions. Les posicions estan definides per les característiques del cristall i la seva
orientació. Els cristalls es fan girar per obtenir totes les orientacions possibles. La
intensitat del pic reflecteix l’amplitud de la ona de radiació que arriba a aquest punt
però no dóna informació sobre la seva fase. Calen experiments independents per a
determinar la fase (“el problema de la fase”).
Com que no tenim una lent que ens reconstrueixi la imatge (com ho faria un
microscopi) ens cal fer-ho mitjançant una transformació de Fourier. En ella intervenen
una sèrie de magnituds denominades factors d’estructura definits en cada punt de
l’espai i que contenen la resultant de la dispersió dels raigs X que cooperativament
emeten tots els àtoms de la cel·leta elemental.
La informació de la fase s’obté per:
* Cal fer experiments per desxifrar-la:
Per reemplaçament molecular: Depenent del
què sabem de la proteïna. Suposem que ja la
coneixem. Fem una aposta en funció de la
intensitat per obtenir la fase.
Per dispersió anòmala a diferents longituds
d’ona: no sabem l’estructura de la proteïna.
Comparem anomalies.
Per comparació amb derivats isomorfs amb
metalls pesants.
Per exemple. Imaginem que volem determinar
l’estructura d’un aneguet. Del diagrama de Fourier no
podem desxifrar-ne la forma, malgrat que conté tota la
informació necessària per tal que a l’aplicar la
transformada de Fourier obtinguem l’ànec.
Però com que els experiments mai són perfectes, a vegades podem obtenir un regió
molt més petita de la informació, de manera que ens donarà una transformada amb
molta menys resolució.
La resolució és en funció de la qualitat de les dades. Disminueix també amb la fiabilitat
de les dades.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Així doncs, els dos grans problemes a solucionar fins ara han estat la obtenció de cristalls
i la obtenció de la fase de les ones.
El resultat havent solucionat els dos problemes és un
mapa de densitat electrònica. Es tracta de regions on
hi ha molts electrons, indicador que hi ha molts
nuclis. Els elements de què podem estar rebent
senyal són el C, N i O, perquè tenen molts electrons.
L’H, per contra, es trobarà en regions clares. A partir
d’aquí és possible anar imaginat com es situen els
àtoms. Per tant, inferim una estructura a partir del
mapa de densitat electrònica. No vol dir que la
nostra estructura sigui correcta. Com més resolució
tinguin les nostres dades, més fiabilitat tindrà la nostra estructura. A partir de 2 Å cap a
menys tenim una resolució acceptable i cada vegada millor.
A partir de les imatges obtingudes podem anar imaginant com es troben situats els
àtoms en la molècula i, per tant, farem una inferència a partir del mapa de densitat
electrònica. Tanmateix, com ja hem dit, l’estructura final que s’obtingui serà en funció
del que l’experimentador infereixi. Per tant, cal passar una sèrie de controls.
Al principi teníem un diagrama amb punts i n’hem establert una estructura amb el 95%
dels punts que s’hi observen. Però, què passa amb el 5% dels punts restants? No es
tractarà de l’estructura sencera perquè cal tenir en compte que:
Hi ha regions invisibles: són regions desordenades. Al diagrama, ens semblarà
que la cadena desapareix a un punt i torna a aparèixer a un altre. Entremig hi ha
una seqüència desordenada.
Hi ha senyals duplicats: les cadenes laterals pot ser que es trobin mirant cap a
diferents orientacions en diferents molècules de la mateixa proteïna. Quan fas
l’anàlisi et surten les dues possibilitats perquè aproximadament el 50% es
troben en una posició i el 50% en l’altra.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Si el dissolvent és estàtic també hi observarem els seus àtoms. Si és mòbil, no els
observarem. En determinats punts haurem de dir que es troben coberts, per
exemple, per aigua. Malgrat això, ha de establir-se aquesta afirmació al mínim
de llocs possible.
Hi ha una sèrie de programes que ens determinen quina és la qualitat dels nostres
models estructurals. Per exemple: PROCHECK
http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html
Aquests programes ens permeten saber si una estructura és raonable o no. Si la nostra
estructura està d’acord amb el coneixement general. S’estableixen una sèrie de gràfics
de valors raonables a dins dels quals hauria de “caure” la nostra estructura. Un exemple
és el Mapa de Ramachandran, que ja hem vist anteriorment. En aquest tenim uns
angles Psi i Phi que determinen dues o tres grans regions raonables per a les proteïnes.
Els principals factors que determinen els programes com a raonables o no, són:
Geometria covalent: distàncies d’enllaç i angles
Planaritat
Angles diedres
Quiralitat
Interaccions de no enllaç
Ponts disulfur
Paràmetres estereoquímics
Anàlisis de residu per residu
A la presentació del tema es donen imatges per a diversos models de control.
2. RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR (RMN)
Els resultants que s’obtenen fent servir RMN poden ser molt similars als resulatst
obtinguts per RX, malgrat que les tècniques són molt diferents.
L’objecte que ens dóna informació, aquí, és el nucli de l’àtom. Concretament, l’àtom
d’hidrogen és el que ens dóna més informació, perquè només té un protó. També
podem estudiar el 13C, el 15N o el 31P, però de tots, el 1H és el que ens dóna més
informació. L’àtom de 12C, que és el més freqüent, és invisible a RMN. No tots els àtoms
es poden estudiar. Aleshores, la tècnica consisteix en fer créixer les proteïnes en
bacteris que s’alimentin de clorur amoni amb 15N i glucosa 100% amb 13C, de manera
que les seves proteïnes només tindran aquests tipus d’elements.
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
La tècnica es basa en l’spin nuclear, és a dir, les propietats magnètiques del nucli.
Aquestes només es manifesten si els posem amb un imant. Així doncs, la mostra
s’introdueix a un camp magnètic intens (imants immensos!).
Al metge, una ressonància es fa per RMN, però com que els pacients han
generat un cert tilín cap a la paraula Nuclear, perquè sembla que hagi d’induir
tumors, ara rep el nom de ressonància magnètica d’imatge, en medicina.
La diferència de la RMN de proteïnes respecte a la mèdica és que, a la primera,
volem determinar la posició dels àtoms d’hidrogen de la proteïna. En canvi, en el
segon cas, les imatges mostren en quines regions de l’objecte hi ha aigua (molts
protons). Això ens determina que la concentració d’aigua és diferent a regions
diferents i, per tant, determinarà propietats diferents.
Amb tot, el més important és que:
Cada nucli d’una macromolècula és potencialment distingible dels altres i proporciona
informació sobre el seu entorn.
Cada protó, doncs, ens dóna una informació en funció dels seus veïns. És a dir, d’alguna
manera, els protons faran “d’espies” que ens informaran sobre el seu entorn.
Els investigadors van trobar-se que cada àtom d’hidrogen no simètric o no equivalent
emetia una senyal diferent, perquè el seu entorn és diferent. Entenguem-ho amb un
exemple sobre la classe i els alumnes.
Imaginem que els alumnes, asseguts, som un conjunt de protons que formem
una estructura. Com a espies, hem de dir-li a en Miquel, cadascun de nosaltres,
quina és l’estructura en què ens trobem.
Si una proteïna té 50 residus, tindrà 270 àtoms d’Hidrogen. Si en té 200... en
tindrà 1080! Per tant, és difícilment distingible.
Cadascun de nosaltres té un número de telèfon diferent. En Miquel té una llista
que relaciona el nostre nom amb el telèfon que tenim.
Inicialment, l’únic que hem
de conèixer és l’estructura
primària. Un cop reculls els
espectres obtens un gràfic
com el següent:
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
Cadascun dels pics del gràfic significa el protó d’un residu determinat. Però normalment
obtenim un munt de pics que es troben sobreposats: problema de la dispersió. Com ho
solucionem?
Hem obtingut un gràfic en una dimensió en què dos senyals no poden sobreposar-se
per obtenir una estructura:
Per tant, ens cal fer un experiment en dues dimensions. Seguint amb l’exemple anterior:
És possible que els telèfons estiguin repetits. En Miquel trucarà a dos telèfons a
la vegada que segons l’experiment anterior, són de protons veïns. Només el
podrem agafar si sona el nostre i el del nostre veí! Així establirem el mateix en
dues dimensions:
O bé, fins i tot, podem fer l’experiment en tres dimensions (amb tres telèfons) i
obtindrem, encara amb més precisió, el següent:
Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica
I quina informació ens proporciona tot plegat?
La RMN ens informa sobre:
Distàncies entre protons en base a l’Efecte Nuclear Overhauser (NOE)
o Depèn de 1/r6 i ; només es detecten distàncies molt curtes (< 5 Å)
Angles diedres mesurant constants d’acoblament
o En cas de rotació ràpida es mesura un acoblament “promig”
Exposició al dissolvent dels protons làbils (NH) per bescanvi hidrogen - deuteri
o Al contrari dels experiments de masses, en aquest cas es coneix la
posició on es produeix el bescanvi.
Orientació relativa dels enllaços N-H encara que estiguin allunyats entre sí.
o Implica la orientació de la proteïna respecte al camp magnètic i la
mesura dels anomenats acoblaments dipolar residuals
Distància de un nucli determinat respecte a un centre paramagnètic natural
introduït per l’experimentador
A cada experiment trobo condicions en què a dos protons els passen les mateixes coses.
D’aquí, obtinc uns models:
Llocs on hi tinc molta informació:
models definits
Llocs on hi tinc poca informació: models
indefinits; tinc moltes possibilitats. Per
exemple, a les estructures reals, les
puntes o extrems estan esfilagarsats
(moltes possibilitats)... però totes són
possibles!
Com més gran és el conjunt de restriccions, més bona serà l’estructura resultant.
Finalment ens preguntem... què és millor, RX o RMN?
RX RMN
Proteïnes ordenades (globulars i cristal·litzades)
Proteïnes desordenades
Proteïnes molt grans Proteïnes més petites
Optimització de construccions per després fer raigs X
Disseny de fàrmacs amb unió forta a proteïnes.
Disseny de fàrmacs amb unió feble a proteïnes.
No es pot fer in vivo. Es pot fer in vivo a les cèl·lules.
Estudis funcionals en menys mesura. Estudis funcionals.
top related