1 caracterização do domínio péctico homogalacturonano na parede celular de cacau ( theobroma...

11

Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano naParede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e

análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos nas Reações de Reciclagem de Grupos Metil durante a

Doença Vassoura-de-Bruxa

Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira

Co-orientadora: Dra. Maria Carolina Sacatolin do Rio

Aluno: Gleidson Silva Teixeira

22

Tópicos da Apresentação

• Introdução– A Vassoura-de-bruxa– Parede celular primária– Homogalacturonano (HGA)– Reciclagem de metil via SAM (S-adenosil-L-metionina)

• Objetivos• Metodologia• Resultados preliminares• Próximos passos

33

Introdução

• A Vassoura-de-Bruxa• Agente etiológico: Moniliophthora perniciosa• Evolução e sintomas da doença

44

• Implicações no desenvolvimento vegetal• Defesa contra a invasão por microrganismos

IntroduçãoParede celular primária

Zeiger, T. Plant Physiology 3ed 2005.

55

Domínios pécticos

Willats, WGT et al. Plant Molecular Biology 2001a.

(1→2)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-D-galacturonic acid

(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid

Introdução

66

Homogalacturonano (HGA)

Ridley, BL et al. Phytochemistry 2001.

1

4

6

6

3

2

(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid

Introdução

77

Homogalacturonano (HGA)Introdução

Willats, WGT et al. Planta 2001b.

• Ocorrência de GalA não metilado na superfície de células epidermais e radícula

• Regiões de-metiladas restritas a junções celulares

88

IntroduçãoReciclagem de grupos metil

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

ACC

ACC Synthase

ACC Oxidase

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)

SAM Synthase

demethylesterificationPME

Índice de metil SAM:SAH

99

IntroduçãoAlterações na atividade de HGA-MT

Mouille, G et al., The Plant Journal 2007.

PAM1Qua2

Krupková, E et al., The Plant Journal 2007.

TSD2

1010

IntroduçãoReciclagem de grupos metil

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

(-)

ACC

ACC Synthase

ACC Oxidase

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)

SAM Synthase

demethylesterificationPME

1111

Alterações na atividade de SAHH Introdução

1212

IntroduçãoReciclagem de grupos metil

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

(-)(-)

ACC

ACC Synthase

ACC Oxidase

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)

SAM Synthase

demethylesterificationPME

1313

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

IntroduçãoAlterações na atividade de ADK

1414

Introdução

Pereira, LAR et al., Planta 2006b.

Alterações na atividade de ADK

(10% ADK activity)

LM7

1515

IntroduçãoAlterações na atividade de SAMS

• Aumento da atividade de SAMS• Acúmulo de SAM e SAH

SAMS

1616

IntroduçãoReciclagem de grupos metil

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

ACC

ACC Synthase

ACC Oxidase

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)

SAM Synthase

demethylesterificationPME

?

1717

SAM com precursor de etileno Introdução

Scarpari, LM et al. J Exp Bot 2005.

1818

IntroduçãoReciclagem de grupos metil

Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.

ACC

ACC Synthase

ACC Oxidase

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)

SAM Synthase

demethylesterificationPME

1919

Lionett, V et al., Plant Physiology 2007.

Alterações na atividade de PMEs Introdução

2020

• Caracterização do domínio péctico HGA;

• Análise da expressão de genes envolvidos nas reações de reciclagem de metil via SAM

Objetivos do projeto

2121

MetodologiaExperimento em

casa de vegetação

Hibridização in situ Imunolocalização

Fixação em Karnovsky Escolha dos epítopos

Desidratação e inclusão

Microtomia emontagem

Escolha das lâminas

Definição dosanticorpos primários

Síntese de anticorpossecundários

FotografiaFotografia

Interpretação dosresultados

Desidratação e Inclusão

Microtomia emontagem

Escolha das lâminas

Síntese de cDNA eamplificação

Clonagem eseqüenciamento

Linearização e transcrição in vitro

Escolha dos genes esíntese de primers Fixação em FAA

Extração de RNA

2222

ACC

SAM Synthase

demethylesterificationPME

QUA1 e QUA2

ACC Oxidase

JIM5 – JIM7

PAM1

Resultados preliminares

2323

28S rRNA

18S rRNA

T. c

acao

T. c

acao

M. m

uscu

lus

• Extração de RNA

Resultados preliminares

2424

Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 50bp

200bp

Resultados preliminares

• Síntese de cDNA e amplificação por PCR

2525

• Clonagem

Resultados preliminares

200bp

50bp PME 50bp ADK ADK

200bp

50bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox

200bp

200bp

2626

• Seqüenciamento

100bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox

400bp

Resultados preliminares

M13 F 2949

M13 R 197

2727

ER-Sp6 T7 (F) ER-T7 Sp6 (R) F B1 +R B4 -F C2 +R C4 -F D2 -R D4 +F E3 -R E4 +F F1 +R F4 -F G2 -R G4 +F A2 -R A5 +F x +R H4 -

SAMS

CaffMT

Accox

Qua1

Qua2

PME

SAHH

6

7

8

1

2

3

4

Linearização/TranscriçãoAmostra Frame (BLASTx)

Linearização/Transcrição

Nco I

Nco I

ASSal I

S AS

S AS

AS S

AS S

Nco I

Apa I

GENE

Sal I

Sal I

Sal I

Sal I

5 ADK

Sal I

Nco I

S

S

Nco I

Sal I AS Nco I

Sal I

AS

AS S

Nco I

S

Resultados preliminares

2828

λ hi

nd II

I

4361bp

2322bp

Não

dig

.

S (A

paI)

AS

(Sal

I)

~ 3233bp

Resultados preliminares

• Linearização do plasmídeo

λ hi

nd II

IS

AH

H N

ão d

ig.

SA

HH

AS

(Apa

I)

AD

K S

(Sal

I)

AD

K N

ão d

ig.

4361bp

2322bp

~ 3237bp ~ 3233bp

2929

Próximas etapas

• Transcrição in vitro (síntese da sonda)• Confecção das lâminas para a hibridização• Hibridização in situ• Real-Time PCR ou PCR semi-quantitativo• Confecção das lâminas para a imunolocalização• Imunolocalização

3030

Próximas etapas

Digoxigenin

BCIP/NBT