130833535 tugas uji preklinik metode uji antimikroba amelia febriani 1206179170
Post on 01-Jan-2016
82 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
TUGAS
Mata Kuliah
UJI PREKLINIK
METODE UJI ANTIMIKROBA
OBAT HERBAL
Oleh :
AMELIA FEBRIANI
1206179170
Program Magister HerbalFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Universitas Indonesia 2012 / 2013
1 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
METODE UJI ANTIMIKROBA OBAT HERBAL
I. PENGERTIAN
Antimikroba adalah senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan
mikroorganisme atau membunuh mikroorganisme, khususnya
mikroorganisme yang merugikan manusia. Mikroorganisme adalah setiap
organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop yaitu protozoa,
bakteri, jamur, dan virus adalah contoh dari mikroorganisme.
Berdasarkan sifat toksisitas selektif , ada anti mikroba yang bersifat
menghambat pertumbuhan mikroba , dikenal sebagai aktifitas bakteriostatik
dan ada yang bersifat membunuh mikroba , dikenal sebagai aktivitas
bakterisid.
Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti
bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang.
Seringkali, toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bukan absolut; ini
berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi
oleh inang, dapat merusak parasit.
Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut:
a. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic)
b. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme
pathogen
c. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada
host, seperti reaksi alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan
sebagainya
d. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti
flora usus atau flora kulit.
2 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
II. MEKANISME
Keefektifan penghambatan merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu
senyawa antimikroba pada obat herbal. Semakin kuat penghambatannya
semakin efektif digunakan. Kerusakan yang ditimbulkan komponen
antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik
(kerusakan sementara yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat
mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang
digunakan.
Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikroba dapat
disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain:
1. Gangguan pada senyawa penyusun dinding sel,
2. Peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan
kehilangan komponen penyusun sel,
3. Menginaktivasi enzim, dan
4. Destruksi atau kerusakan fungsi material genetik.
1. Menggangu pembentukan dinding sel
Mekanisme ini disebabkan karena adanya akumulasi komponen lipofilat
yang terdapat pada dinding atau membran sel sehingga menyebabkan
perubahan komposisi penyusun dinding sel. Terjadinya akumulasi
senyawa antimikroba dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi. Pada
konsentrasi rendah molekul-molekul phenol yang terdapat pada minyak
thyme kebanyakan berbentuk tak terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat
mengikat daerah hidrofobik membran protein, dan dapat melarut baik
pada fase lipid dari membran bakteri.
Beberapa laporan juga meyebutkan bahwa efek penghambatan senyawa
antimikroba lebih efektif terhadap bakteri Gram positif daripada dengan
bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan perbedaan komponen penyusun
dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Pada bakteri Gram posiitif 90 3 Amelia Febriani
S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
persen dinding selnya terdiri atas lapisan peptidoglikan, selebihnya adalah
asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya
mengandung 5-20 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein,
lipopolisakarida, dan lipoprotein.
2. Bereaksi dengan membran sel
Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas
membran sitoplasma, yang dapat mengakibatkan kebocoran materi
intraseluler, seperti senyawa phenol dapat mengakibatkan lisis sel dan
meyebabkan deaturasi protein, menghambat pembentukan protein
sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada
membran sel.
3. Menginaktivasi enzim
Mekanisme yang terjadi menunjukkan bahwa kerja enzim akan terganggu
dalam mempertahankan kelangsungan aktivitas mikroba, sehingga
mengakibatkan enzim akan memerlukan energi dalam jumlah besar untuk
mempertahankan kelangsungan aktivitasnya. Akibatknya energi yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan menjadi berkurang sehingga aktivitas
mikroba menjadi terhambat atau jika kondisi ini berlangsung lama akan
mengakibatkan pertumbuhan mikroba terhenti (inaktif).
Efek senyawa antimikroba dapat menghambat kerja enzim jika
mempunyai spesifitas yang sama antara ikatan komplek yang menyusun
struktur enzim dengan komponen senyawa antimikroba.
4. Menginaktivasi fungsi material genetik
Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (RNA
dan DNA), menyebabkan terganggunya transfer informasi genetik yang
selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak materi genetik sehingga
terganggunya proses pembelahan sel untuk pembiakan
III. KOMPONEN-KOMPONEN ANTIMIKROBA TUMBUHAN4 Amelia Febriani
S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Komponen antimikroba adalah suatu komponen yang bersifat dapat
menghambat pertumbuhan bakteri atau kapang (bakteristatik atau
fungistatik) atau membunuh bakteri atau kapang (bakterisidal atau
fungisidal). Zat aktif yang terkandung dalam berbagai jenis ekstrak
tumbuhan diketahui dapat menghambat beberapa mikroba patogen
maupun perusak makanan. Zat aktif tersebut dapat berasal dari bagian
tumbuhan seperti biji, buah, rimpang, batang, daun, dan umbi.
Komponen aktif yang terdapat pada bawang putih mempunyai efek
penghambatan terhadap beberapa mikroba patogen seperti
Staphylococcus aureus, E. coli, dan Bacillus cereus dan menghambat
produksi toksin dari Clostridium botulinum tipe A dengan menurunkan
produksi toksinnya sebanyak 3 log cycle.
C. Botulinum adalah bakteri berspora yang dapat memproduksi toksin
pada kondisi yang memungkinkan, dapat dihambat pertumbuhannya oleh
minyak bunga dan biji pala, minyak daun salam, minyak lada hitam dan
lada putih dengan konsentrasi 125 ppm. Laporan lain juga menyebutkan
bahwa ekstrak minyak lada dapat menghambat pertumbuhan S. aureus,
E. coli, dan Candida albicans.
Komponen aktif yang terdapat pada minyak thyme diantaranya thymol,
carvacrol, (ro)-cymene, dan (gamma)-terpiene diketahui mempunyai efek
sebangai senyawa antimikroba terhadapa pertumbuhan bakteri. Bakteri-
bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya antara lain Salmonella sp.,
S. aureus, E. coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, dan B.
cereus. Dari laporan tersebut dapat juga diperoleh informasi bahwa
bakteri gram positif lebih sensitif dibanding dengan bakteri gram negatif.
Efek penghambatan senyawa antimikroba dari rempah-rempah tidak
hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi dapat juga
menghambat pertumbuhan khamir seperti Candida albican dan
Sacharomyces cerevisiae. Komponen-komponen aktif pada minyak 5 Amelia Febriani
S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
thyme, minyak sage, minyak rosemary, minyak cumin, minyak caraway,
dan minyak cengkeh dapat menghambat khamir dengan konsentrasi 0,5-
2.0 (mg/mL).
Bakteri dalam bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding dalam bentuk
sporanya, hal ini dibuktikan oleh Ultee et al. (1998) yang meneliti efek
penghambatan komponen carvacrol yang terdapat pada minyak thyme
dan oregano terhadap pertumbuhan bakteri B. cereus.
Pada konsentrasi 1,75 mmol/L bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding
bentuk sporanya. Hal ini disebabkan struktur spora yang lebih komplek
dibanding bentuk sel vegetatif, seperti adanya komponen asam
dipikolinat yang dapat melindungi spora terhadap gangguan faktor
lingkungan (suhu dan pH ekstrim). Lebih lanjut Ultee et al. (1998)
menyebutkan bahwa pada konsentrasi 1.75 mmol/L dapat mneghambat
kecepatan pertumbuhan B. cereus sehingga fase lag diperpanjang.
Semakin lama fase lag maka aktivitas B. cereus sebagai penyebab
kerusakan bahan pangan dapat dicegah.
Komponen-komponen antimikroba yang terdapat pada minyak cengkeh,
minyak kayu manis, minyak oregano, minyak thyme, minyak bawang
putih, dan bawang merah dapat menghambat spesies kapang
diantaranya adalah Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. versicolor, A.
ochraceus, Candida sp., Crytococcus sp., Rhodotorulla sp., Torulopsis sp.,
dan Tricosporon sp.
Kapang adalah mikroorganisme penyebab kerusakan bahan pangan
terutama biji-bijian dan produk tepung-tepungan dengan kadar air
rendah. Beberapa spesies kapang dapat menghasilkan toksin
(mikotoksin) adalah Aspergillus sp., Penicllium sp., dan Fusarium sp., yang
dapat menghasilkan aflatoksin, patulin, okratoksin, zearalenon, dan
okratoksin. — (bersambung).
6 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
IV. UJI AKTIVITAS dan POTENSI ANTIMIKROBA
Potensi antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam
menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam
IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg
Prinsipnya yaitu membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap
percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding
(standar) atau zat uji. Baku standar yang digunakan adalah zat/senyawa yg
sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya.
Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui
metode turbidimetri (dilusi) dan metode difusi agar. Caranya sama dengan
penentuan potensi antibiotika, tetapi hanya 1 dosis, umumnya 50%.
Perbedaannya :
• uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya
aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu
kelompok bahan
• Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan
prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika
pembanding dari jenis yang sama
Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan
bila terpenuhi tiga syarat, yaitu:
a) Ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel
mikroorganisme,
b) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme
dapat tumbuh saat tidak ada bahan antimikroba, dan
c) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme
(Hostettmann, 1991).
Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja, cara kerja dan
ditentukan pula oleh konsentrasi hambat minimum (KHM). Konsentrasi
7 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi minimum dari suatu zat yang
mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme.
Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara yaitu
a) Cara cair
Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri atau jamur dengan pengenceran tertentu
kemudian diinokulasikan biakan bakteri atau jamur dalam jumlah yang
sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan atau kekeruhan pada
tabung setelah diinkubasi.
b) Cara padat
Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan
zat uji dengan berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri dapat
digores lebih dari satu jenis mikroba untuk memperoleh nilai KHM.
Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas
antimikroba dimana masing-masing metode memiliki kelebihan dan
kekurangan. Metode-metode yang digunakan antara lain metode difusi,
metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun, perlu
diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat
pertama dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya.
Preparasi sampel uji (ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti
minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat dilakukan dengan menggunakan
pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi dengan bahan
surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada
metode difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair
(dalam tabung). Dispersi air yang mengandung pendispersi dengan berat
molekul (BM) yang tinggi (>100.000) harus dihindari dalam metode difusi
8 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam media agar 1%
(Hostettmann, 1991).
V. METODE UJI ANTIMIKROBA
Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan
yang efektif dan efisien. Terdapat macam–macam metode uji antimikroba
seperti berikut:
1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods)
Prinsip metode difusi uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas
daerah hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri
dari titik awal pemberian kedaerah difusi. Metode difusi-agar cakram
kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan untuk
menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi.
Dalam metode ini, ada beberapa cara yaitu cara Kirby Bauer, cara
sumuran dan cara pour plate.
1) Metode Kirby-Bauer
Untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi
agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami
mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area
jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media
agar.
9 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer :
1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai.
Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri
kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris. Bakteri
ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi pada
suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan
menumbuhkan bakteri pada media cair Natrium Klorida
fisiologis dan diinkubasi pada suhu 370C
2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar
secara merata Biarkan cawan selama 5 menit.
10 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan
konsentrasi tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris,
selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar.
Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel
sempurna di permukaan agar.
4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.
11 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di
sekitar cakram, lubang, atau cangkir agar yang tidak
ditumbuhi miroba.
12 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong,
kemudian bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik.
Makin besar diameter hambatan pertumbuhan tersebut berarti
aktivitas bahan yang diuji (obat herbal) terhadap mikroba
makin baik.
13 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Tabel 1. Tabel Standar Sensitifitas Antibiotik
Faktor yang mempengaruhi metode difusi agar (Kirby-Bauer):
a. Ingredien / komposisi medium pertumbuhan
-Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi
pertumbuhan mo adalah ; pepton, tripton, ekstrak ragi,
agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)
-NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida
dan menahan aktivitas ferosidin
-KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas
nitrofurantoin atau ampisilin
14 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
b. Pemilihan medium pertumbuhan
- Pemilihan medium pertumbuhan; dimana diperlukan
persiapan medium yg cocok bagi pertumbuhan mo
demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata
pada medium agar
- Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan
oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium.
Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana
asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa
- Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn
menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn
penambahan NaOH 0,1N
c. Pengaruh pH
Perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan
perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan
jumlah molekul zat uji yang mengion. Selain itu pH
berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri.
d. Ukuran inokulum
- Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.
- Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum
semakin besar kandungan mikroorganismenya.
- Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan
mikroorganismenya homogen, misal 1-10%
- Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan
terjadinya penumpukan pada tempat tertentu
15 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
e. Stabilitas mikroba uji
Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi
dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu
regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan
sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.
f. Aktivitas antibiotika
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu
penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat
minimum (KHM) dari antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi
larutan antibiotik yangg terjadi sebelum inkubasi harus
dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian larutan
antibiotik ke dalam medium agar
g. Waktu inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal,
sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan
daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan
yang baik untuk pengukuran zona bening yang muncul
sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba,
biasanya antara 18-24 jam
Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat
antimikroba suatu zat sehingga metode ini tidak menjamin
diidentifikasinya bahan pembunuh antimikroba yang efektif untuk
terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan adanya
perbedaan kecepatan difusi dari senyawa antimikroba yang
dipengaruhi berat molekulnya. Ukuran zona untuk suatu zat dapat
dibandingkan dengan standar, asalkan perbenihan, ukuran
inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal ini 16 Amelia Febriani
S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat
minimum yang menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba.
Pada pengukuran standar seperti konsentrasi antimikroba
berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa digunakan
untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive,
susceptible), cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan
resisten (resistant.) Nilai kadar hambat minimum (KHM) berbanding
terbalik secara proporsional (linear) dengan diameter zona hambat
(Bauer et al., 1966)
2). Metode E- test
Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi
yang disebut E-test (Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik
yang mengandung gradien konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak
nilai konsentrasi yang memungkinkan secara langsung membaca
konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk menghambat
pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan
menunjukkan KHM untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik
yang diujikan.
17 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test
Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like
growth, non-mycelial growth) biasanya ditanam secara usapan atau
gores-coret (agar surface streak) Penanaman jamur berfilamen yang
tumbuh tidak merata pada media menggunakan teknik gores silang
3). Metode Ditch – plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal)
yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong
pada media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara
membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kea rah
parit yang berisi agen antimikroba
4). Metode Cup – plate technique (Metode sumuran)
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat
sumur pada media agar yang telah ditanami dengan
mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba
(obat herbal) yang akan diuji
5). Metode Gradient – plate technique
Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar
secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar
dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang
ke dalam cawan petri dan di letakkan dalam posisi miring. Nutrisi
kedua selanjutnya ditung di atasnya.
18 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen
antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji
(maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari kosentrasi
tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total
pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di
bandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan
2. Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods)
Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa
zat antimikroba secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal.
Metode ini memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai daya
antimikroba suatu zat . Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk
mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah yang
dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang
menunjukkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh
kejernihan media merupakan KHM. Data sifat kimia fisika dan data
aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik dengan uji regresi
liner dan non linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi
antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu
inokulum terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan
dilusi padat (solid dilution).
1). Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution)
Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar
hambat minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration
atau kadar bunuh minimum, KBM).
Cara kerja metode dilusi cair:
19 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
1. Buat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada
medium cair yang di tambahkan dengan mikroba uji. Cara
pengenceran dilakukan dalam tabung dengan mengencerkan
bahan uji (obat herbal) dengan media cair menjadi kelipatan dua
secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi dengan
kelipatan setengahnya
2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam
pada temperatur 36-37oC dan kemudian diamati hambatan
pertumbuhan mikroba dengan membandingkan kekeruhan atau
pertumbuhannya dengan kontrol yang mengandung media.
3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat
jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai
KHM.
4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya
dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan pada mikroba
uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18–24 jam.
5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan
sebagai KBM
2). Metode dilusi padat (solid dilution tes )
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan
media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen
antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa
mikroba uji.
Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena
sebagian besar jamur tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali
beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti ragi (yeast-like growth). Jamur
yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al., 1966).20 Amelia Febriani
S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
3. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)
Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau
senyawa yang belum diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi
kontak menggunakan prinsip difusi senyawa yang terpisah dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK). Lempeng
kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi
dengan mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan,
diinkubasi dan diamati, senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam
lapisan agar dan menghambat pertumbuhan mikroba. Pada bioautografi
langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada lempeng
kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi
mikroba dalam media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan
waktu yang sesuai. Sedangkan metode bioautografi pencelupan
dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam media
dan media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian
diinkubasi dan daerah hambatannya diamati.
4. Metode metode lain
Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas senyawa kemoterapi yaitu:
a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)
Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien
yang sedang menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba
21 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
(bakteri) kemudian ditambahkan pada serum pasien.
Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum setelah inkubasi
mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.
b. Metode otomatis (automated method).
Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang
dapat mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan
kepekaannya terhadap berbagai senyawa antimikroba.
5. Metode Gores Silang (Uji Antifungi)
Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku
untuk menguji aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur
T. mentagrophytes (Anonim, 1993).
Cara kerja metode gores silang:
1. Celupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan
di atas lempeng agar yang telah digores dengan inokulum jamur.
2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.
3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur
diukur sebagai zona hambat.
4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan
untuk antijamur pembanding.
DAFTAR PUSTAKA
22 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
Ultee A, Gorris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol toward the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol: 213-218
Corner, DE. 1995. Naturally occuring compounds in Antimicrobial in Food. Eds., by Davidson PM & Branen AL, Eds. Marcell Dekker, Inc., New York, pp. 441-468.
Palmer, SA., Stewart J., Fyfe, L. 1998. Antimikrobial properties of plant essential oils and essences againts five important food-borne pathogen. Letters Appl. Microbiol. 26: 118-122.
Ting, EWT & Deibel, KE. 1992. Sensitivity of Listeria monocytogenes to spices at two temperature. J. Food Safety 12: 19-137.
Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in Plant Biochemistry Vol 6
Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):493-6.
Rostinawati T, 2009. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Agar. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran , Jatinangor
23 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed
2013
24 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170
top related